Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed ​​עם צבעים מרובים

1, 1, 1

1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    Cite this Article

    Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J. Vis. Exp. (111), e53988, doi:10.3791/53988 (2016).

    Abstract

    הדמיה סופר-רזולוציה אופטית עם מיקרוסקופיה תאורה מובנה (SIM) היא טכנולוגיית מפתח עבור הדמיה של תהליכים ברמה המולקולרית בתחומי הכימיה ומדעי ביו. למרות שמערכות ה- SIM מסחריות זמינות, מערכות שמיועדות מותאם אישית במעבדה יכולה להכות מערכות מסחריות, האחרונות בדרך כלל תוכננו עבור קלות שימוש ויישומים למטרות כלליות, הן מבחינת נאמנות הדמיה ומהירות. מאמר זה מציג מדריך מעמיק בבניית מערכת ה- SIM המשתמשת השתקפות פנימית מוחלטת (TIR) ​​תאורה והוא מסוגל הדמיה במהירות של עד 10 הרץ בשלושה צבעים ברזולוציה לרמה של 100 ננומטר. בשל השילוב של ה- SIM TIRF, המערכת מספקת ניגודיות תמונה טובה יותר מאשר טכנולוגיות מתחרות. כדי להשיג מפרטים אלה, כמה אלמנטים אופטיים משמשים כדי לאפשר בקרה אוטומטית על מבנה מדינת הקיטוב המרחבי של אור התאורה לכל wav העירור הזמיןelengths. פרטים נוספים על יישום חומרה ובקרה ניתנים להשיג סנכרון בין דור דפוס אור העירור, אורך גל, מדינת קיטוב, ושליטת מצלמה תוך שימת דגש על השגת קצב פריימי רכישה מרבית. צעד אחר צעד פרוטוקול ליישור מערכת כיול מוצג והשיפור ברזולוצית השגת מקבלת תוקף על דגימות מבחן אידיאליות. יכולת הדמיה סופר-רזולוציה וידאו שער מודגם עם תאים חיים.

    Introduction

    במהלך המחצית האחרונה עשור, מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה התבגר ועבר ממעבדות אופטיקה מומחה לידיהם של הביולוג. פתרונות מיקרוסקופ מסחרי קיימות שלוש גרסאות עיקריות להשגת ברזולוציה סופר אופטי: מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM), מגורה מיקרוסקופיה דלדול פליטה (STED), וכן במיקרוסקופ תאורה מובנית (SIM) 1,2. SMLM כגון מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) המיקרוסקופי שיקום אופטי סטוכסטיים (STORM) כבר הטכניקות הנפוצות ביותר, בעיקר בשל הפשטות של ההתקנה האופטית וההבטחה של רזולוציה מרחבית גבוהה, למטה בקלות ל -20 ננומטר. עם זאת מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה באמצעות לוקליזציה מולקולה בודדת מגיע עם trade-off מהותי: מה שניתן להשיג רזולוציה מרחבית תלויה צבירת מספר מספיק של localizations fluorophore הפרט, ומכאן הגבלת רזולוציה טמפורלית. תהליך ההדמיה דינמיes בתאים חיים ולכן הופך להיות בעייתי כאחד כראוי חייב לטעום את התנועה של מבנה ריבית כדי למנוע חפצי תנועה תוך רכישת אירועי לוקליזציה מספיק זמן כדי לשחזר את תמונה. על מנת לעמוד בדרישות אלה, הפגנות SMLM התא חיות שהשיגו הגידול הנדרש בשיעורי photoswitching fluorophore על ידי הגדלת כוח העירור מאוד, וזה מוביל בתורו phototoxicity סטרס חמצונים, וכך להגביל פעמי הישרדות מדגם ו -3 הרלוונטיות ביולוגיות.

    יתרון ברור של STED על שני ה- SIM SMLM הוא שזה תמונה יכולה עם ברזולוציה סופר בדגימות עבות, לפתרון לרוחב דוגמא סביב 60 ננומטר הושג פרוסות מוח organotypic בעומקים של עד 120 מיקרומטר 4. הדמיה בעומקים כאלה עם הטמעות מטרה אחת של SMLM או SIM הוא אינו עומד על הפרק, אבל הופך אפשרי עם או גיליון אור מולקולה בודדת או מיקרופון סריג גיליון אורroscopy 5. וידאו-שיעור STED גם הודגמה והשתמשה למפת ניידות שלפוחית ​​סינפטית, למרות שעד כה זה הוגבל הדמית שדות קטנים מבט 6.

    עבור יישומים בביולוגיה של התא ותגובות הרכבה עצמית מולקולרית 7 - 12 הדורשים הדמיה עם רזולוציה גבוהה הזמני על מועדים לפי שעון רבים, מיקרוסקופיה תאורה מובנה (SIM) יכול להיות מתאים-גם זה לא תלוי את המאפיינים photophysical של פלורסנט בפרט בְּדִיקָה. למרות יתרון טמון זה של ה- SIM, עד עכשיו השימוש בו היה מוגבל בעיקר הדמית תאים קבועים או תהליכים זזים לאט. זאת בשל המגבלות של מערכות SIM זמינות מסחרי: שער מסגרת הרכישה של מכשירים אלה היה מוגבל על ידי מהירות הסיבוב של לגדרות השתמשו כדי ליצור את דפוסי תאורה סינוסי הדרושים, כמו גם את קיטוב שמירת אופטיקה. הדור החדש של ה- SIM המסחרימכשירים מסוגלים הדמיה מהר אבל הם יקרים לכל אבל מתקני הדמיה מרכזיים.

    פרוטוקול זה מציג מדריך לבניית מערכת SIM גמישה הדמית תהליכים מהר בדגימות דקות סמכו לפני השטח הבסיסי של תאי חיים. היא מעסיקה קרינת השתקפות הפנימית מוחלטת (TIRF) כדי ליצור דפוס תאורה חודר לא עמוק יותר מאשר כ 150 ננומטר לתוך המדגם 13 אשר בהרבה מפחית את מתוך אות רקע מוקד. הרעיון של שילוב SIM עם TIRF הוא זקן כמעט כמו SIM עצמו 14 אך לא מומש באופן ניסיוני לפני 2006 15. הראשון in vivo תמונות שהושג עם TIRF-SIM דווחו בשנת 2009 16 מסגרת חליפין השגת של 11 הרץ לדמיין טובולין ו kinesin דינמיקה, ושתי מערכות צבע TIRF-SIM הוצגו 17,18. לאחרונה, מדריך לבנייה ושימוש SIM שני-קורה צבע יחיד שלystem הוצג שמציע מסגרת בקצבים של עד 18 רץ 19,20.

    את ההגדרה המוצגת כאן היא מסוגלת הדמית SIM סופר-רזולוציה של 20 הרץ בשלושה צבעים, שתיים מהם יכול להיות מופעל TIRF-SIM. המערכת כולה בנויה סביב מסגרת מיקרוסקופ הפוכה ומשתמש הבמה תרגום XY ממונע עם במה z פייזו-ומונעת. כדי ליצור את דפוסי עירור סינוסי הנדרשים TIRF-SIM, המערכת הציגה משתמשת מאפנן אור מרחבי ferroelectric (SLM). דפוסי צורמת בינארי מוצגים על SLM והצווים העקיפים ± 1 וכתוצאה מכך מסוננים, העבירו וממוקדים לזירת TIR של העדשה האובייקטיבית. משמרות השלב הכרח הסיבובים של לגדרות מוחלות על ידי שינוי תמונת SLM מוצגת. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות וליישר נתיב עירור כזה, מפרט את היישור של נתיב הפליטה, ומציג דוגמאות בדיקה להבטחת יישור אופטימלי. זה גם לדה סופרים לנושאים ולאתגרים מיוחדים TIRF-SIM במהירות גבוהה בדבר בקרה וסנכרון של רכיבי קיטוב.

    שיקולים ואילוצים עיצוב

    לפני בניית מערכת TIRF-SIM שהוצגה בפרוטוקול זה, יש אילוצי עיצוב מספר לשקול הקובעים את הבחירה של רכיבים אופטיים. כל הקיצורים של רכיבים אופטיים לעיין ב איור 1.

    מאפנן אור מרחבי (SLM)

    SLM ferroelectric בינארי משמש התקנה זו כפי שהוא מסוגל מיתוג דפוס תת-אלפית השנייה. SLMs Nematic Grayscale ניתן להשתמש אך אלה מציעים הקטינה באופן משמעותי פעמים מיתוג. כל או ביטול פיקסל בשלב בינארי SLM יהיה להקנות גם שלב π או 0 בקיזוז מסעיף Wavefront מטוס אירוע, ולכן אם דפוס צורם תקופתי מוצג על SLM זה יפעל כמו עקיפת שלב צורמת.

    אף אוזן גרון "> סך פנימית השתקפות (TIR)

    כדי להשיג TIR ולהפיק שדה חלוף, זווית האירוע של קורות עירור על ממשק זכוכית המדגם חייבת להיות גדולה יותר מאשר הזווית הביקורתית משוואה . זו מגדירה את זווית האירוע המינימלי הנדרש, ומכאן גם את המרווח המרבי, או תקופה, של דפוס תאורה חלוף. זווית האירוע מקסימלית משוואה (זווית הקבלה) היא מוגבלת על ידי הצמצם המספרי (NA) של העדשה האובייקטיבית אשר ניתן לחשב מההגדרה משוואה . זו קובעת את דפוס המינימום מרווח השגה לפי הנוסחא אבה משוואה המקשרת NA ואורך גל משוואה אל מרווח דפוס המינימום (כלומר. טבעת TIR) ושבהם שני מוקדי העירור חייבים להיות ממוקמים במדויק וסובב בדיוק כדי ליצור כל תבנית תאורה.

    שחזור תמונות TIRF-SIM נדרש לרכישת מינימום של שלוש משמרות שלב בכל סיבוב דפוס ולכן בתקופת דפוס SLM חייבת להתחלק 3 (ראה איור 1). לדוגמא, לתקופה של 9 פיקסלים לתאורת 488 ננומטר ו -12 פיקסלים 640 תאורת ננומטר. לדיון מקיף של עיצוב דפוס SLM, כולל אופטימיזציה תת פיקסלים של דפוס ריווח באמצעות לגדר טעונה, לראות את העבודה הקודמת של קנר ואחות '. 16 ו Lu-ולטר et al. 20 עמדת מוקדי העירור השנייה חייבים להיות בתוך טבעת TIR עבור כל אורכי הגל, אולם הזווית העקיפה של ההזמנות ± 1 מן SLM הוא אורך גל תלוי. לקבלת SIM הסטנדרטי, הדמית ססגוניות יכולה להיות מושגת על ידי אופטימיזציה של התקופה הצורמת עבור אורך הגל הארוך ביותר, לסבול פסד בביצועים עבור ערוצים הקצרים. עבור TIRF-SIM עם זאת, אופטימיזציה עבור אורך גל אחד אומר כי מוקדים אחרים גל כבר לא בתוך הטבעת טיר. לדוגמא, על ידי שימוש בנקודה צורמת של 9 פיקסלים מספיק כדי לספק TIRF לבניית 488 ננומטר, כמו המוקדים נמצאים 95% מהקוטר של הצמצם הלוך בתוך טבעת טיר, אבל עבור 640 ננומטר תקופה זו הייתה למקם את המוקדים מחוץ הצמצם. מסיבה זו spacings השונה דפוס פיקסל חייבת לשמש עבור כל גל עירור.

    היישור של נתיב עירור TIRF-SIMהוא רגיש מאוד לשינויים קטנים בעמדת המראה dichroic (DM4 באיור 1) בגוף מיקרוסקופ, הרבה יותר מאשר ב SIM קונבנציונאלי. שימוש צריח קוביית מסנן מסתובב אינו מומלץ, במקום להשתמש במראה dichroic יחיד, רב-band, אשר נשמר בתנוחה קבועה ועוצב במיוחד עבור אורכי גל העירור בשימוש. זה חיוני כי רק במראות dichroic באיכות הגבוהה ביותר משמשים. אלה דורשים מצעים עבים של 3 מ"מ לפחות, ולעתים קרובות מיועדים "שטוח הדמיה" על ידי יצרנים. כל המצעים האחרים להוביל סטייה בלתי נסבלת ושפלת תמונת TIRF-SIM.

    בקרת קיטוב

    כדי להשיג TIRF-SIM זה הכרחי כדי לסובב את מדינת הקיטוב של אור העירור בתאום עם דפוס התאורה כזה שהוא נשאר azimuthally מקוטב במישור התלמיד האובייקטיבי בנוגע לציר האופטי (כלומר. s-מקוטב). מערך של אופטיקה שליטת הקיטוב יהיה תלוי האלמנט האופטי המסוים המועסק, למשל תא Pockels 21, או צלחת גל חצי בשלב סיבוב ממונע 22. בפרוטוקול זה retarder משתנה גביש נוזלי מותאם אישית (LCVR) משמש, נועדו לספק מלא גל (2π) retardance מעל טווח אורך הגל 488 עד 640 ננומטר שכן היא מאפשרת מהר (~ msec) מיתוג. אם באמצעות retarder גביש נוזלי זה הכרחי להשתמש מרכיב באיכות גבוהה: רכיבים סטנדרטיים הם בדרך כלל לא יציבים מספיק כדי לתת retardance קבוע לאורך כל אורכו של זמן חשיפת מצלמה אשר מוביל טשטוש מתוך תבנית התאורה וניגודיות אפנון נמוכה . retarders גביש נוזלי גם הטמפרטורה מאוד תלוי ודורשים מובנה בקרת טמפרטורה.

    סִנכְּרוּן

    הלייזרים חייבים להיות מסונכרנים עם SLM. SLMs ferroelectric בינארי מאוזן באופן פנימי על ידי היםהכישוף בין על המדינה לסירוגין המדינה. ככל שמספר הפיקסלים לפעול רק חצי צלחות גל בשני שלהם דולק או כבוי, אבל לא בזמן מיתוג interframe. לכן הלייזרים צריכים להיות מופעלים רק במצבי הפעלה / כיבוי באמצעות LED אפשר אות מ SLM למנוע הפחתה בניגוד דפוס בשל מצב הביניים של פיקסלים. אפנן acousto האופטי (AOM) יכול לחלופין לשמש תריס מהר אם הלייזרים לא יכולים להיות מווסתים באופן דיגיטלי.

    בחירה של עדשות

    בהתבסס על המגבלות הללו, demagnification הנדרש של המטוס SLM למטוס מדגם לייצר דפוסי תאורה הרצוי ניתן לקבוע. זה מאפשר חישוב של אורכי המוקד של שתי העדשות L3 ו L4 ב הטלסקופ תמונת הממסר ואת עדשת קבל עירור L5. במערכת זו עדשה אובייקטיבית טבילת שמן 100X / 1.49NA משמשת עם 488 ננומטר ו 640 עירור ננומטר, ולכן משתמש אורכי מוקד של 300 ו -140 מ"מימעבור L4 ו L3, ו -300 מ"מ עבור L5, נותן demagnification הכולל של 357X, שווה ערך ל גודל פיקסל SLM של 38 ננומטר על המטוס מדגם. באמצעות השילוב הזה של עדשות, SLM צורמת תקופות של 9 עבור 488 תאורת ננומטר ו -12 פיקסלים עבור 640 ננומטר לתת spacings דפוס של 172 ו -229 ננומטר על המדגם, מתאימה זוויות פגיעות של 70 מעלות ו -67 מעלות בהתאמה. עבור ממשק זכוכית-מים, את הזווית הקריטית היא 61 מעלות, ואינה תלויה באורך הגל, ולכן שני אלה spacings דפוס לאפשר עירור TIRF לשני אורכי גל. עדשה אובייקטיבית מצוידת עם צווארון תיקון שימושית עבור תיקון של אברציה כדורית שהנהיגה וריאציות עובי coverslip, או אם הפעלה על 37 מעלות צלזיוס.

    שחזור תמונה

    לאחר ה- SIM נתוני גלם כבר נרכשו זה עניין של מאמץ חישובים ליצור תמונות סופרות-על פתרונו תהליך בן שני שלבים. ראשית, דפוס תאורה יש לקבוע עבורכל תמונה ושנית, מרכיבי ספקטרום SIM חייבים להיות מופרדים recombined כראוי כפי להכפיל את תמיכת OTF היעילה (ראה איור 6, ריבועים).

    הידיעה מדויקת של תבניות תאורה המוקרנות היא בעל חשיבות עליונה, כמו רכיבי תדר נפתר-סופר צריך להיות מעורבב בצורה מדויקת ככל האפשר כדי למנוע חפצים הנגרמים על ידי החלקים שיורית של רכיבים חופפים. אנו קובעים את דפוס תאורת פרמטרים בדיעבד מנתוני התמונה גלם ביצוע ההליך שהנהיג גוסטפסון et al. 23 בקיצור, סט של פרמטרי תאורה מתאר סינוסואידה דו ממדי מנורמל צריך למצוא עבור כל אחד משוואה דפוסי העירור משוואה :

    משוואה

    בְּזֹאת משוואה ו משוואה לתאר את הניגוד השולי ואת התבנית החלה שלב של כל תמונה בנפרד מ בהתאמה. הרכיבים של וקטור הגל, משוואה ו משוואה , לשנות עם אוריינטציות רק שונה משוואה של הדפוס ואת הפחית הניח להיות קבוע אחר. כדי גס לקבוע את מרכיבי וקטור גל מתאם צולב של ספקטרה תמונת גלם מבוצע, אשר הוא מעודן ידי החלת משמרות subpixel לאחד התמונות הצולבות בקורלציה כדי לייעל את החפיפה. הדבר נעשה באמצעות הכפלה של הדרגתיים שלב אמת שטח משוואה משרי משמרת subpixel ב frequency-שטח. שים לב כדאי לקבל הערכה טובה של-הווקטור הגל טרם אמיד דפוס המעשי המוכח וזה ניתן למצוא על ידי הדמית שכבת חרוז ניאון.

    כצעד המופע בין דפוסי מוזז הוא משוואה , כלומר. משוואה , הפרדת רכיבי תדר יכול להתבצע על ידי התמרת לאורך "ציר שלב". השלב העולמי משוואה והניגוד השולי משוואה לאחר מכן ניתן לקבוע באמצעות רגרסיה ליניארית המורכבת של מרכיבים שונים. הרכיבים מופרדים בודדים מצורפות יחד בשימוש מסנן וינר כללית. לתיאור מפורט של שני חילוץ הפרמטר והיישום של מסנן וינר הכללית אנו מפנים את הקורא גוסטפסוןet al. 23 שם באותו האלגוריתם משמש.

    Protocol

    1. סידור יישור נתיב העירור

    1. סמן את עמדותיהם של הרכיבים על השולחן האופטי (ראה איור 1 עבור סקירה של ההתקנה האופטית). הפרד את המטרה, עדשות L3, L4, L5, ואת SLM כל בסכום של אורכי המוקד שלהם כזה שמשטח SLM שיועבר על מטוס המוקד של המטרה.
    2. הכניס DM4 מראה dichroic רב-קץ לתוך צריח הקובייה המסננת של מסגרת מיקרוסקופ.
    3. הכנס את dm3 מראה dichroic השני לתוך 1 "מראה הקינטית מרובע הר, ולמקם אותו אורך מיקוד אחת מן עדשת קבל L5.
      הערה: עיצוב נתיב עירור זה משלב השני dichroic זהה מראות dm3 ו DM4 אשר הלקוחים יצוו הייצור אותו כדי להבטיח תכונות אופטיות זהות. מראה dichroic (DM4) ממוקם כך צירי s- ו p- מוחלפים לעומת dichroic ממוקם המיקרוסקופ (dm3) ובכך מבטל כלקיטוב הציג סְגַלגַלוּת ידי השבירה הכפולה שלה (איור 1). פיצוי זה עובד באותה מידה עבור כל אורך גל תאורה. צעד זה חיוני לשמירה בניגוד אפנון גבוה.
    4. לפני הכנסת עדשות לתוך נתיב העירור, להגדיר במדויק לציר האופטי עבור המערכת.
      1. הסר את העדשה האובייקטיבית (OB) מהצריח ובמקום לדפוק כלי יישור. זה מורכב של מערכת כלוב אופטית ארוכה 500 מ"מ עם שני דיסקי יישור בשני קצותיו.
      2. השתמש dm3 מראה dichroic ומראת יישור זמני ממוקם במיקום מאוחר המשוער של SLM לנווט קרן התייחסות collimated מן לייזר 1 דרך מרכזי החורים בשני הדיסקים יישור. לכוון את אלומת האור מן לייזר 1 אל המראה זמני כמתואר באיור 1 באמצעות שלוש מראות DM2 במראה dichroic. מראה הזמני במיקום SLM חייב להיות קרוב בניצב לציר האופטי.
      3. הסר את כלי יישור פעם לציר האופטי גס כבר determined.Insert אירוס לתוך נתיב קרן לפני שהוא נכנס לגוף מיקרוסקופיה ומרכז אותו על הקורה. צרף פיסת הקרטון לבן עם חור קטן המרוכז על iris.Reinsert העדשה האובייקטיבית (OB).
        הערה: הקרן עוזבת את המטרה עכשיו תהיה מסתעפת מאוד, אבל תהיה השתקפות חלשה מאוד מפני השטח האחורי של העדשה כי תהיה גלויה על הכרטיס הלבן. כל העדשות, גם אם הם נגד השתקפויות מצופות, תצטרכנה השתקפויות חזרה חלשות, שניתן להשתמש בם כדי להבטיח יישור קואקסיאליים. אם הקרן היא בדיוק בניצב העדשה אז ההשתקפות חזרה תחזור דרך המרכז הקשתי
      4. בצע התאמות זוויתי איטרטיבי לשני מראות (dm3 ומראת יישור במיקום SLM) כדי למרכז את ההשתקפות חזרה עלהכרטיס עם אלומת האור הנכנס. זמני להסיר את העדשה האובייקטיבית (OB) ולסמן את מקום הליזר על התקרה ליצור במצב ייחוס.
      5. הכנס זוג האירוסים בשיא של קורה ההתייחסות לאורך החורים המושחלים של הטבלה. אלומת האור צריכה להיות מקביל את פני השטח של השולחן האופטי. הציר האופטי מוגדר כעת.
    5. הכנס את עדשת הקבל (L5) בערך אורך מיקוד אחת מן המטרה. הר עדשת תפאורה על במת התרגום ליניארי לתרגם יחד לכיוון קורה ההתייחסות.
    6. לשנות את מיקום עדשת קבל זווית כך הקורה עוזב המטרה הוא collimated ומכה במקום הפניה על התקרה. בדוק שהעדשה בניצב הקורה ידי שוב לבדיקת שיקוף בחזרה עם איריס וכרטיס לבן. הסר את העדשה האובייקטיבית (OB) ולהכניס את העדשה השנייה של טלסקופ תמונת הממסר (L4).
      הערה: הבטחת collimation נכונה-סטיה אי להיותבבוקר נעשה קל יותר כאשר יש מספר זוגי של עדשות בנתיב הקרן.
    7. להתאים את המיקום ואת זווית העדשה באמצעות במת תרגום ליניארי לשמור collimation ועל מנת להבטיח את קרן ההתייחסות עדיין יושבים בול ניכר על התקרה.
    8. החזר את העדשה האובייקטיבית (OB) ולהכניס את העדשה הראשונה של הטלסקופ (L3). להתאים את המיקום ואת זווית העדשה כדי להבטיח collimation ולא סטייה, כמתואר בשלבים קודמים.
    9. הר שבב SLM על gimbal הר המספק סיבוב ללא תרגום על במרכז משטח השבב.
      הערה: עיצוב ההרכבה הספציפי תלוי SLM בשימוש. אם SLM מסופק ללא הר, זה צריך להיות קבוע לצלחת אלומיניום במכונה מנהג אשר מחוברת אז עדשה gimbal הר.
    10. עם העדשות מיושרות, הכנס את SLM במקום המראה. התאם את המיקום של SLM כך קורה ההתייחסות ממוקם במרכז של שבב SLM, ולהתאים אתGLE כך הקורה עובר דרך שתי עדשות ממסר (L3 ו L4). בדוק כי קרן ההתייחסות עדיין מרוכזת על המקום המסומן.
    11. הרחב collimate קורה ההתייחסות באמצעות הרחבת קורה קפלרי.
      1. הר שתי עדשות (L1 ו- L2) במערכת כלוב על מנת להקל על הסתגלות.
      2. מרכז מערכת הכלוב על קורה ההתייחסות ידי הסרת העדשות והחליף אירוסים.
      3. הכנס את שתי העדשות ולהתאים את המיקום הצירי של L2 כדי collimate הקורה המורחב באמצעות אינטרפרומטר גז. L2 צריך להיות אורך מיקוד אחת מהמשטח של SLM.
      4. בדוק כי הקרן המורחבת עדיין collimated לאחר שתי עדשות ממסר L3 ו L4. השתמש אינטרפרומטר הגז רק לאחר dm3 לבדוק collimation.
    12. לאחר נתיב העירור כבר מיושר עבור אורך גל יחיד, זוג שני לייזרים האחרים לתוך נתיב הקרן. לנווט בכל קרן דרך שני אירוסים המרוכזים על נתיב העירור באמצעותמראות dichroic שילוב הקרן (DM1 ו DM2).

    2. מערך של מסובבי קיטוב

    1. הר LCVR עם הציר המהיר שלה ב 45 ° לקיטוב האירוע.
    2. זווית קיטוב לכוונן אירוע אלומת LCVR באמצעות לוחית גל חצי אכרומטית (HWP) על ידי החדרת HWP ואת LCVR בין מקטבים חצו. סובב את HWP כדי למזער את הכוח המועבר.
      הערה: כדי לשמש מסובבי קיטוב משתנה, ציר מהיר של retarder גביש נוזלי (LCVR) חייב להיות מתואם בדיוק ב 45 מעלות הקיטוב קרן אנכי האירוע. LCVR מותקן פיזי על 45 מעלות אבל זה רק יישור גס. HWP משמש כדי להבטיח יישור 45 ° מושלם של קיטוב התקרית עם ביחס לציר LCVR מהר. הרבע גל הצלחת (QWP) ממירה את קיטוב אליפטי המוטה המושרה על ידי LCVR חזרה קיטוב ליניארי בזווית בשליטת המתח מיושם24.
    3. הכנס את QWP לאחר LCVR ולסובב אותו כדי ליישר הציר האיטי שלה לקיטוב נכנס על ידי מזעור את הכח המועבר בין מקטבים חצו.

    יישור 3. נתיב הפליטה

    1. גס למקם את המצלמה באמצעות שקופיות מיקרומטר במת אור מועבר.
      1. דגש על reticle באמצעות oculars מיקרוסקופ ולתקן את העדשה האובייקטיבית על עמדה זו.
      2. בערך למרכז את המצלמה ולהעביר את מיקום המצלמה כדי להביא את התמונה של reticle אל המוקד על ידי התבוננות בתמונה על המסך.
        הערה: אם גלגל מסנן חיצוני משמש אז הקובייה למסנן לא מכילה מסנן פליטה, ולכן oculars אסור לשמש כאשר לייזרים מופעלים.
    2. דק להתאים את מיקום המצלמה באמצעות מדגם חרוז ניאון.
      1. כן בשכבה של חרוזי ניאון על ידי הפצת ירידה של 100 חרוזים ססגוניים ננומטר על coverglass 1.5 #. השארתי דר"י כדי לספוג את החרוזים על coverglass ולאחר מכן מחדש לטבול במים.
      2. מניחים את המדגם חרוז על המטרה עם שמן טבילה. דק להתאים את המיקום של המצלמה כך שכבת חרוז הניאון היא בפוקוס. אל להתאים את מיקום העדשה האובייקטיבי פעם התעסק כבר מצא.
        הערה: ככל SLM חייב להיות המצומד מטוס למטוס מדגם, עמדת SLM, ממסר עדשות, ואובייקטיבי חייב להיות קבוע. כדי לשנות את הפוקוס, להזיז את המדגם axially במקום המטרה באמצעות z בשלב piezo.
    3. צור את דפוסי צורמת בינארי SIM המתאימים כקבצי מפה סיביים.
      1. עבור 2D / TIRF-SIM, ליצור סדרה של 9 תמונות צורמת בינארי: 3 אוריינטציות דפוס כל אחד עם 3 בשלב משמרות ברווחים שווים. צור אלה מספריים (באמצעות MATLAB למשל) מ סינוסואידה 2D בסיס מתחלפת עם שלב לקזז מיושם, אז thresholding לייצר תמונה בינארית. ראה קבצי קוד משלים קוד לדוגמא.
      2. לקבלת alignmenלמטרות t, גם ליצור דפוסים צורמים כי כבר חלונות ידי פתח עגול קטן עבור כל אחד 3 האוריינטציות, כפי שמוצג באיור 2. בסורגי היישור חלונות לא צריכים להיות מופעלים כלפי חוץ אך ניתן להעביר באופן ידני על ידי המשתמש באמצעות התוכנה של SLM.
        הערה: ראה אזכור לדיון של זוויות סיבוב האופטימליות דוגמא קוד דור דפוס צורם 16,20.
    4. העלה את התמונות מפת סיביות על SLM באמצעות התוכנה של היצרן (עבור MetroCon למשל).
      1. טען את תוכנת בקרת SLM ולחץ על "חבר".
      2. בלשונית "הרפרטואר", לחץ על "טען" כדי לפתוח את קובץ הרפרטואר ולבדוק מספר ריצת הזמנות הכלולות בקובץ. בקובץ רפרטואר דוגמא שניתן ישנם חמש הזמנות ריצה.
      3. לחץ על "שלח ללוח" להעלות את קובץ הרפרטואר אל SLM.
      4. חכו תמונות מפת סיביות כדי להעלותnd עבור המכשיר לבצע אתחול אוטומטי.
        הערה: קובץ רפרטואר למשל, המכיל תמונות מפה סיביות צורמות וקובץ בהגדרת הסדר, נכלל בתור קובץ קוד משלימה. הקובץ ".repz" ניתן לפתוח באמצעות תוכנת Archiver קובץ ZIP.
    5. הצגת יישור חלונות צורמת על SLM עבור אוריינטציה הראשונה (למשל 0 °).
      1. בשנת תוכנות שליטת SLM, בחר את הכרטיסייה "סטטוס", הזן את מספר הזמנת הריצה (במקרה של קובץ לדוגמה, זה פועל להזמין "1").
      2. לחץ על "בחר" כדי לשנות את הסדר לרוץ כדי סורג היישור.
        הערה: זה יאייר אזור מעגלי קטן במישור המדגם. אם פני השטח SLM הוא מצומדות כראוי למישור מדגם אז את הקצוות של האזור הזה יהיה חד בפוקוס. הדפוס הצורם יפיק הזמנות עקיפות מרובות במוקד L3: השתקפות אפס ההזמנה ישירות האחורי הרעיונית שלSLM, את -1 +1 הזמנות מתאימות הסורג, וציווי גבוה גם חלש העולה עקיף של גורמים פנימיים ספציפיים למכשיר SLM (למשל. השתקפויות של החשמלית הפנימית של פיקסלים ואי סדרי SLM בקצוות פיקסל) . אבל כל -1 +1 חייבות תסוננה הזמנות.
    6. הכנס מסכה מרחבית (SM) רכובה x, y שלב לתוך נתיב הקרן במיקום המוקד של L3, ולתרגם את עמדתה ביחס לציר האופטי כך הצווים הראשונים הרצויים רק מועברים. מייד לאחר מסנן מרחבית, רק שתי אלומות עגולות תהיינה גלויות.
      הערה: המסכה המרחבי הוא מפוברק על ידי ניקוב 6 חורים לתוך רדיד אלומיניום באמצעות מחט. החורים צריכים להיות גדולים מספיק כדי לעבור את קורות ממדרגה ראשונה עבור כל אורכי גל הלייזר. ניתוח מפורט של המסכה מרחבית ניתן התייחסות 20.
    7. הצג את הכיוון הבא של סורג היישור (60 °, פועל באופן מלא 2) ושובלהבטיח כי הם נותנים את הצווים הראשונים מבעד למסיכה המרחבי בלבד, התאמת עמדתה במידת הצורך.
    8. חזור על הכיוון הסופי (120 °, פועל באופן מלא 3).
    9. בדוק את התמונה של שכבת חרוז הניאון על המצלמה. אם שתי הקורות העגולות אינן חופפות כמתוארות באיור 2 מכן מקם מחדש את המטוס מדגם ידי התאמת איטרטיבי לתפקיד העדשה במצלמה האובייקטיבי.
    10. לשנות את המיקום האובייקטיבי יש חפיפה בין שתי הקורות אשר תבאנה את התמונה מחוץ לפוקוס. שנו את מיקום המצלמה כדי להביא את התמונה בחזרה אל מוקד לכוונן המטרה במקרה שני עיגולים עדיין גלויים. חזור על תהליך זה עד שתי קורה חפיפת אזור עגול בודד הוא בפוקוס.
    11. לאחר המיקום של מטוס המדגם הוגדר, לשמור על העמדה האובייקטיבית קבועה.
    12. כדי לאשר תאורה TIRF, תמונה פתרון של צבע פלואורסצנטי, למשל עבור גל עירור 488 ננומטר, להשתמש בפתרון של 1081; M rhodamine 6G.
      1. להביא את המדגם צבען אל המוקד. אם שתי הקרנות הן אירוע בזווית TIRF הנכונה אז מולקולות בודדות תהיינה גלויות ללא רקע גבוה, ואת הקצוות של הפתח העגול יהיו בפוקוס. ראה איור 2 ב-ד לדוגמאות של קורות TIRF בציר מיושרים.
      2. צג כל כיוון של gratings חלונות בתור ולוודא שכל האוריינטציות השלוש לספק תאורת TIRF וכי שתי קורה חפיפה על המטוס המדגם. התאמות פיין לעמדת הקורות יכול להתבצע על ידי התאמת dm3 במראה dichroic.
        הערה: למרות באורכי גל שונים מתמקדים בנקודות שונות מעט בשל צירי אברציה כרומטית, זה לא קריטי וניתן לרפא זאת על ידי קבוע z-לקזז לתפקיד המדגם לפני עירור עם הגל השני.

    4. סנכרון כיול מערכת

    1. מניחים את ים בשכבה חרוזמספיק על המטרה ולהביא אל המוקד.
    2. לתכנת את SLM באמצעות תוכנות השליטה שלה על מנת להציג כל אחת מתמונות משמרת 3 שלב בתורו, עבור אורינטצית הדפוס הראשונה (0 °).
      1. באמצעות תוכנות שליטה SLM, לעבור ריצה להזמין 4 מהרפרטואר למשל.
      2. הגדר את המצלמה באמצעות תוכנת רכישתה (למשל HCImage) לפלט שני אותות: אחד איתות חיובית ושלילי אחד הדק TTL בתקופת החשיפה הגלובלית. ב תוכנת המצלמה, תחת "מאפייני מצלמה מתקדמים", להגדיר פלט טריגר סוג 1 ו -2 כדי "חשיפה", ותפוקת טריגר קוטביות 1 ו -2 כדי "חיובי" ו "שלילית" בהתאמה.
      3. חבר יציאה 1 ו -2 של המצלמה לכניסות "טריגר" ו "סיום" של SLM בהתאמה, באמצעות כבלים קואקסיאליים. SLM הוא עכשיו מסונכרן למצלמה.
    3. רוכשת סדרה של 3 תמונות.
      1. בחלונית "רצף", בחר &# 34; דיסק קשיח שיא "כסוג סריקה, ולהגדיר את ספירת מסגרת ל -3.
      2. לחץ על "התחל" כדי לרכוש 3 מסגרות. דפוס SLM ישתנה על כל חשיפה. חרוזי ניאון התמונה יופיעו למצמץ לסירוגין בין כל אחת מ -3 התמונות. הכמות מהבהבת הוא הקריא לי ניגוד האפנון של דפוס התאורה סינוסי.
    4. סובב את הקיטוב של ליזר העירור עם LCVR באמצעות תוכנות מותאמות אישית כדי להשיג קיטוב azimuthal ולכן ניגוד האפנון הגבוה ביותר עבור אורינטצית הדפוס הנתונה.
      1. טען את תוכנת כיול LCVR.
      2. הזן 0 ו -8 עבור מינימום ומקסימום מתח בהתאמה.
      3. לחץ על "טאטא מתח LCVR" כדי לסובב את הקיטוב.
        הערה: retardance LCVR הוא פונקציה של טמפרטורה יכול להיסחף היום-יום גם עם בקרת טמפרטורה. בשלב זה, הקיטוב azimuthal האופטימלי נמצא אמפירית ידי sweeping מתח להחיל בין המינימום שלה ומתח מרבי אשר יש לו את ההשפעה של סיבוב אירוע הקיטוב על המדגם. ניגוד האפנון מחושב לכל מתח 25 ואת המתח המשיגה בניגוד השיא משמש את השלבים הבאים.
      4. חכו תהליך הכיול כדי להשלים, ורושם את המתח הנמדד.
    5. חזור על תהליך כיול זה אוריינטציות שני דפוס הנותרים (60 ° ו -120 °) וכל אחד מן אורכי גל עירור.
    6. סנכרן את חשיפת המצלמה עם LCVR, לייזרים, piezo ההגה מסנן פליטת z-שלב 26. כדי להשיג זאת, להשתמש רכישת נתונים במהירות גבוהה (DAQ) לוח כמקור השעון אב במערכת, ולהשתמש של SLM LED הפעל אות פלט לווסת לייזרים (ראה איור 3 ב).
      הערה: היישום הספציפי תלוי רכיבים המשמשים אך שימוש לוח DAQ במהירות גבוהה עבור תלת דיגיטלייםסנכרון ובקרה gger של LCVR באמצעות מתח אנלוגי, נשלט באמצעות תוכנה, מומלץ. תוכנת השליטה בשימוש בפרוטוקול זה זמינה על פי בקשה.
    7. בשל אברציה כרומטית צירית, עבור כל אורך גל, גם להחיל z-לקזז הבמה מדגם.
      1. לקבוע את לקזז באופן ניסיוני על ידי התמקדות מדגם בשכבת חרוז ססגוניות על הגל הראשון (למשל. 488 ננומטר) ואחר עובר השני (למשל. 640 ננומטר). החרוזים עכשיו יהיו מחוץ לפוקוס.
      2. מקד מחדש את החרוזים ולמדוד את השינוי בעמדת z שהיה נחוץ. קיזוז זה יכול להיות מיושם על z-שלב פייזו בכל פעם גל העירור משתנה.
    8. באמצעות תוכנות שליטה SLM, להחליף את סדר SLM לרוץ כדי את הסדרה המלאה של 9 תמונות בינאריות צורמת הנדרשים TIRF-SIM. זוהי ריצה להזמין 0 ברפרטואר למשל.
    9. שימוש בתוכנת שליטה במצלמה, לרכוש 9 תמונות של המדגם החרוז. בחלונית "הרצף" של תוכנת המצלמה, בחר "דיסק קשיח שיא" כסוג הסריקה, ולשנות את ספירת המסגרת ל -9.
    10. לחץ על "התחל" כדי לרכוש תמונות.
    11. שמור את התמונות רכשו כקבצי TIFF על ידי בחירת "TIFF" כסוג התמונה בחלון "תמונות שמורות שנאגר", והלחיצה על אישור.
  • משחזר תמונה סופר-רזולוציה מתמונות TIFF גלם באמצעות תוכנה מסחרית או מותאמת אישית כדי לאמת את השיפור ברזולוציה מעל TIRF הסטנדרטי.
    הערה: מיקרוסקופ שלנו אנו משתמשים קוד שחזור התפתח מנהג הוא ללא צורך במיקור חוץ על ידי ד"ר לין שאו 27.
  • Representative Results

    ססגוניות בקוטר 100nm חרוזי ניאון הם צילמו להשוות TIRF רגיל TIRF-SIM ולכמת השיפור השגה ברזולוציה לרוחב (איור 4 א - ב). שחזור מסגרות גלם לדימויים סופר-רזולוציה בוצעה באמצעות אלגוריתמים סטנדרטיים כפי שמתואר בספרות 27,28. ניתן לראות כי TIRF-SIM בבירור יש גבוה משמעותית לרוחב ברזולוציה לעומת TIRF. פונקצית התפשטות נקודה (כוחות הביטחון הפלסטיני) של מיקרוסקופ היא מקורבת היטב על ידי הדימוי של חרוז ניאון תת עקיפה יחידה בגודל, ולכן כוחות הביטחון הפלסטיני לבין ברזולוציה ניתן לכמת על ידי התאמת פונקציות גאוס 2D ל חרוזים בודדים עבור כל אורך גל. ההחלטה המוערכת של המיקרוסקופ בהתבסס על השווי הממוצע של הערך החצי ברוחב מלא (FWHM) היא 89 ננומטר ו -116 ננומטר עבור 488 ו 640 ננומטר TIRF-SIM בהתאמה (איור 4C). זה מתאים אימפרו כפולvement ברזולוציה לרוחב לשני אורכי הגל לעומת המקרה המוגבל העקיפה התיאורטית. Fluorescently סיבי עמילואיד שכותרתו הם גם מדגם הבדיקה מצוין עבור הוכחת ברזולוציה הוכפל (איור 4D). סיבי עמילואיד נוצרו במבחנה על ידי דוגרים β עמילואיד שכותרתו עם צבעי נגזרת rhodamine 10% (עירור 488 ננומטר) עבור 1 בשבוע, ובהמשך הדמיה עם TIRF-SIM. ראה התייחסות 12 לקבלת מידע נוסף.

    מבנים subcellular עם ניגודיות גבוהה כגון emGFP שכותרתו microtubules (איור 5 ב, ז) או LifeAct-GFP (איור 5D) הם אידיאליים עבור הדמיה TIRF-SIM תשואה גבוהה לעומת תמונות סופר-רזולוציה. הדמית TIRF-SIM באמצעות ההגדרה המפורטת בפרוטוקול זה מאפשרת תצפית של אוכלוסיית משנה של microtubules ממוקם בקרבת הקורטקס של התאים הבזליים, ו פילמור depolymerization microtubule יכולים בדואר לראות לאורך זמן (אנימציה איור 1). לא כל הדגימות ניתנות הדמיה עם TIRF-SIM, בפרט, דגימות ניגודיות נמוכות ללא מבנים בדידים. תאים להביע GFP cytosolic חסרים מידע ברזולוציה גבוהה מלבד בקצוות של קרום הפלזמה (איור 5F, H ו אנימציה איור 2) והם ומכאן תת אופטימלית עבור TIRF הדמיה-SIM כמו שחזורים וכתוצאה מכך הם בעצם תמונות TIRF ועליהן חפצים. בדגימות כזה, הגידול לעומת לעתים קרובות ניתן לייחס לשלב deconvolution של אלגוריתם שחזור.

    בניגוד אפנון גבוה חיוני הדמית SIM מוצלחת. התמרת פורייה של התמונה המשוחזרת מאפשר הדמיה של פונקציית תמסורת אופטית SIM (OTF) (איור 6 א, הבלעה). ללא למקסם את ניגוד האפנון עבור כל כיוון ידי הבטחת azimuthal קוטבization עם מסובבי קיטוב, יש אפנון מעט מאוד מהמידע ברזולוציה גבוהה במדגם המוביל יחס אות לרעש נמוך passbands SIM. אלגוריתמי שחזור אשר להשתמש בגישה המסננת וינר סטנדרטית פשוט להגביר את רעש passbands SIM ו להניב תמונה שהיא בעצם תמונת TIRF תקן ועליהן משושה (או "חלת דבש") צלצול חפץ (איור 6 א, פנל מימין). שיפור אפשרי יכול להיות שימוש באלגוריתמים שחזור איטרטיבי 29,30 או עיוור 31,32 להפחית לכלוכים אלה בהתאם לסוג של המדגם. אנו ממליצים על השימוש של ImageJ תוסף SIMcheck כדי לבדוק את איכות נתוני SIM לפני ואחרי שיקום 33.

    איור 1
    איור 1:. פריסה של תכנית ההתקנה הססגונית TIRF-SIM TIRF-SIM המילcroscope מורכב משלושה חלקים עיקריים, יחידת דור קרן, יחידת הקרנת דפוס, ויחידת האיתור. ביחידת הדור הקורה, שלושה לייזרים שונים מיושרים על הנתיב קרן אותו באמצעות מראות dichroic (DM1 ו DM2) וביימו באמצעות ארבעה אלמנטים אופטיים לבקרת קיטוב. ראשית, מקטב (P) מבטיח את הטוהר של המדינה קיטוב ליניארי של כל אחת קרני לייזר. השלושה האלמנטים האופטיים הבאים נדרשים כדי לסובב את הקיטוב באופן מהיר ואוטומטי כמתואר בפירוט בטקסט. לאחר מכן, שתי עדשות (L1 ו- L2) בתצורה טלסקופ להרחיב את הקרן כדי להתאים את פני השטח הפעיל של מאפנן אור המרחבים (SLM) והם מתפזרים לשלוש beamlets ידי דפוסי הצורמת בינארי החזוי של SLM (דוגמאות מוצגות אריחי 1 9). מדינת הקיטוב של האור ביחס התאורה לדפוס SLM מוצגת כחץ. טלסקופ שני (L3 ו L4) דה-מעצים את הדפוס ומציע גישת thדואר פורה מטוס של דפוס SLM. במישור זה מסכה מרחבית (SM) משמשת כדי לסנן את המרכיב המרכזי ורכיבים עקיפים לא רצויים אחרים ממבנה pixelated של SLM-החוט הפנימי שלה. לפני שתי הקורות הנותרות הם התמקדו למטוס המוקד האחורי של המטרה (OB) דרך עדשת הקבל (L5), שתי מראות dichroic (dm3 ו DM4) כלולות ב- ההתקנה. DM4 מעשים כמו מראה dichroic קונבנציונלית מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי תאורה נפרדת מן אור הפליטה. עם זאת, המראה הזה המשרה סְגַלגַלוּת בלתי נמנע במדינת הקיטוב של אור התאורה אשר ניתן לפצות על ידי dm3, מראה dichroic מן אידיאלי באותו יצווה כמו DM4. מטרת טבילת שמן TIRF יש מספיק גדול NA להשיק ישירות בשני גלי הפצת מרשם על coverslip המשתקפים לחלוטין להצמיח שדה חלוף מובני coverslip. המדגם הוא רכוב על במת תרגום xyz. איתור הוא Performed דרך אותו ואת DM4 המטרה בהולכה, בתוספת סינון נוסף על ידי מסנני פליטת bandpass, מותקן בתוך גלגל מסנן מבוקרת מחשב (EFW). לבסוף, את התמונה מוקרנת על מצלמת sCMOS ידי עדשת צינור מיקרוסקופ הפנימי (L6). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    איור 2:. המערך של חופפים קורות (א) דפוס צורמת SLM חלונות עם פתח עגול שימושי יישור. אם שתי אלומות שאינן חופפות גלויות על המצלמה (משמאל), אזי המיקום של מטוס המדגם חייב להיות מיקומו איטרטיבי על ידי התאמת העמדות הציריות של העדשה האובייקטיבית והמצלמה לתת נקודת תאורה עגולה בודדת (מימין). קורה להיות חופפים ב יורדr ויוצר את תבנית עירור סינוסי הנדרשים TIRF-SIM. אם הקורות מלאים אינם חופפים זה מקטין את שדה הראייה, בן תבנית ההתאבכות נוצרת. (B ו- C) הזווית המדויקת של שכיחות של קורות חשוב TIRF-SIM. אם הזווית אינה נכונה, על אחת הקורות לא יהיה בזווית הדרושה TIRF וזה גלוי לכל מי שעובר כאשר הדמיה פתרון צבע פלואורסצנטי. יש קרן אחת בזווית של שכיחות גבוהה יותר מאשר הזווית הקריטית אשר מניבה את המקום העגול, והשני לא, מה שמוביל הפס הבהיר בצד השמאל של התמונה (B). (ד) כוונון זווית המראה dm3 מבטיח הם הקורות הן אירוע באותה הזווית, וזה יכול להיות מאומת על ידי defocusing המטרה: אם מיושר כראוי, היטל XZ של ערימת z של מדגם צבע פלואורסצנטי צריך להראות שני מצטלבים באופן סימטרי קורה עם רקע זניח בביתלהתמקד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3:. סנכרון תלות של רכיבי מערכת השונים (א) עבור רכישת SIM מהירה, סנכרון של מרכיבי המערכת באמצעות פתרון חומרה מבוסס חיוני. (ב) בכרטיס איסוף נתונים (DAQ) אמור לשמש כמפעיל מאסטר. אות TTL מלוח DAQ נשלחת הקלט החיצוני sCMOS והשתמשה כדי לעורר את חשיפת המצלמה. תפוקת החשיפה הגלובלית המצלמה ואז מפעילה את SLM להציג דפוס צורם, ואת SLM LED אפשר פלט משמש לווסת את עירור הליזר דיגיטלי כך הליזר הוא פולט רק כאשר פיקסלים SLM נמצאים במצב "על". בעקבות החשיפה הוא משלימהטה, פלט החשיפה הגלובלי המצלמה משמש לקדם את דפוס SLM אל השלב הבא הצורם או זווית. לוח DAQ גם פלטי מתח אנלוגי אל בקר LCVR לשלוט על מצב הקיטוב הליניארי של קורה התאורה. מתח זה מופעל לאחר רכישת 3 תמונות השלב עבור כל זווית דפוס. לאחר רכישת 9 תמונות עבור אורך גל יחיד, לוח DAQ פלטי אות אל בקר הגלגל לסנן פליטה, ומתגים כדי הגל הבא. לוח DAQ חל גם z-לקזז את המדגם על ידי פלט מתח אנלוגי אל בקר פייזו z-השלב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    איור 4: הדמיה TIRF-SIM של דוגמאות מבחן של 100 ננומטר ססגוניות מחרוזות fluorescently Labelled עמילואיד הסיבים. (A ו- B) השוואה לסטנדרטים TIRF לעומת שחזורים TIRF-SIM עבור 488 ננומטר ו 640 עירור ננומטר. (ג) היסטוגרמה של ברוחב מלא למחצה לכל היותר (FWHM) של גאוס מתאים את החרוזים TIRF-SIM מראה את השיפור ברזולוציה צפוי. (ד) TIRF לעומת TIRF-SIM של הסיבים-עמילואיד β שכותרתו עם 10% לצבוע נגזרת rhodamine (488 עירור ננומטר). ברי סולם = 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 5
    איור 5:. TIRF-SIM תא חי הדמיה השוואת TIRF קונבנציונאלי TIRF-SIM תמונות של (A, B) microtubules (emGFP טובולין) בתא HEK293, (C, D (E, F) GFP cytosolic בתא HEK293. תמונות ב B ו- F הן נקודות פעם אחת מהסרטים. באזורים בקופסאות מוצגים מוגדל (G, H). ברי סולם = 3 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 6
    איור 6:. השפעת הקיטוב Rotator על נבנה מחדש חרוז תמונות (א) ללא שימוש מסובב קיטוב כגון LCVR, את יחס אות לרעש של SIM passbands נמוך שתוצאתה חפצה משושה אופייני SIM משוחזר תמונות (מימין), (ב) 2D-SIM, דפוסי התאורה המובנים גלויות ישירות הפורהלהפוך של תמונות הגולמיות (משמאל, תדירות מרחבית עירור מסומנת) כפי שהם נופלים בתוך הרדיוס של תמיכת OTF הפליטה, אולם TIRF-SIM, הם מחוץ תמיכת OTF ולכן לא גלוי (מימין). במקרה זה, את ניגוד אפנון הדפוס חייב להיות הוערך באמצעות בשכבה חרוזה דלילה, כפי שמתואר בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 7
    איור 7:. תבנית בהתבסס מאפנן אור מרחבי הדור מאפשר הטמעה של שיטות הדמיה אחרות כגון SIM מולטיפוקלית (א) MSIM, סריג של כיכר pointsdisplayed על SLM (ההבלעה) מניב סריג של מוקדים מוגבלים עקיפים על תמונת המטוס. שכבה דקה של 6G rhodamine ריכוז הנמוך הוא צלם כדי visua Lize המוקדים. הדפוס מתורגם על פני המדגם (B) ואת Z- מחסנית תמונת גלם שנרכשה משוחזרת להפקת תמונה עם קטינה מחוץ מוקד אור (C). ברי סולם = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    מסגרת סרט 1
    אנימצית איור 1:. סרט סדרות עתיות של EmGFP טובולין בתא HEK293 פילמור המהיר depolymerization של emGFP שכותרתו microtubules ניתן לצפות באמצעות TIRF-SIM. תמונות שנרכשו באמצעות 50 זמן חשיפה msec לכל מסגרת גלם (450 msec לכל מסגרת SIM) במרווחים של 0.5 שניות. זמן חשיפה לשמש הוגבל על ידי הבהירות של fluorophore, לא על ידי המהירות של המצלמה או SLM. "Target =" 3988movie1.mov _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

    מסגרת סרט 2
    אנימציה איור 2:. סרט סדרות עתיות של Cytosolic GFP בתא HEK293 דוגמאות עם ניגודיות נמוכה כגון זה אינם דגימות אידיאלי עבור הדמיה TIRF-SIM. זרימת קרום מדרדר ניתן לראות את התמונות TIRF אבל TIRF-SIM אינו מספק כל מידע נוסף מלבד בקצוות התא. תמונות TIRF-SIM נרכשו באמצעות 50 זמן חשיפה msec לכל מסגרת גלם (450 msec לכל מסגרת SIM) במרווחים של 5 שניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

    קובץ קוד משלימה: קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).ד / 53,988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_001.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_002.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_003.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה: repertoi SLM דוגמהמחדש קובץ (period9_004.bmp). אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_005.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_006.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_007.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_009.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_mask_1.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_mask_2.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה. >

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (period9_mask_3.bmp) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קובץ רפרטואר הדוגמא SLM (TIRF-SIM_example.rep) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה:. קוד דור צורם דוגמא (1 מתוך 2) (generate_gratings.m) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    קובץ קוד משלימה: קוד הדור צורם דוגמא (2 מתוך 2) (circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    קובץ קוד משלימה:. קוד דוגמה לחישוב בניגוד אפנון (calculate_contrast.m) אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    Discussion

    שהותקנו מערכות TIRF-SIM כגון ההתקנה המפורטת בפרוטוקול זה מסוגלות הדמיה סופר-רזולוציה ססגונית במהירות גבוהה לעומת מיקרוסקופים זמינים מסחרי. היתרון הגלום של SIM כטכניקת סופר-רזולוציה הוא כי ההחלטה הזמנית אינה מוגבלת על ידי photophysics של fluorophore, בהשוואה לשיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM) או שיטות סריקת נקודה כגון מיקרוסקופיה דלדול פליטה מאולצת ( STED). שלא כמו טכניקות אחרות אלה, SIM אינו מחייב fluorophores photoswitchable או מתכלה כך ההדמיה ססגונית היא פשוטה. מערכות TIRF-SIM ללא, כגון אופטי חתך SIM ו- SIM מולטיפוקליות בדרך כלל ניתן להשיג שיפורים ברזולוציה של פי 1.7 או פחות בפועל בניגוד הגורם של שיפור 2 דיווחו כאן, ומערכות מסחריות הן גם בדרך כלל איטי יותר ופחות גמישה מאשר מערכת המובאים בפרוטוקול זה.

    "> שני הקשיים העיקריים ביישום הטכניקה הזו הם ראשית את הצורך עבור מיקום מדויק של שש קורה SIM בתוך אזור TIR של הצמצם האחורי של המטרה, מחייב הליך יישור אופטי מייגע זמן רב. שנית, לייצר בניגוד דפוס גבוה על מדגם, סיבוב הקיטוב חיוני. עבור מערכות NA 2D-SIM נמוך, סיבוב הקיטוב יכול להימנע על ידי בחירה זהירה של האוריינטציה קיטוב ליניארי, אבל זה הופך להיות בלתי אפשרי עבור TIRF-SIM 25. עבור הדמיה ססגוניות במהירות גבוהה, אלקטרו שליטת קיטוב אופטית יש צורך וזה מגדיל את מורכבות חשבון המערכת.

    מגבלות הטכניקה

    TIRF-SIM, כמו TIRF הקונבנציונלי, מוגבל באופן טבעי תצפית של מבנים ביולוגיים ותהליכים הממוקמים בקרום תאי הבסיס שיכול להיות מואר על ידי עומק חדירת 150-200 ננומטר של שדה החלוף. בזמןSIM מצוטט לעתים קרובות להיות פחות photodamaging לתאים מאשר כל אחד STED או SMLM, הכפלת רזולוציה לרוחב עדיין להגדיל את המספר הדרוש של פוטונים על ידי לפחות פי 4 5 לעומת מיקרוסקופיה TIRF קונבנציונאלי. עבור הדמית מסגרת חליפין גבוהים עם זמני חשיפות קצרים, עליית פוטון זה מחייבת שימוש בעוצמות תאורה מוגברת. בעוד כל fluorophore יכול לשמש הדמית SIM של דגימות מרגשות קבועות או איטיים, חלבוני ניאון בהירות גבוהה או צבע סינטטי הדור הבא עם photostability המשופרת מומלצי הדמית תא חי.

    למרות שיישום זה מסוגל הדמית צבע אחד מסגרת חליפי SIM העולה על 20 הרץ, הדמיה ססגונית במערכת הציגה מוגבלת על ידי זמן המעבר של גלגל מסנן פליטה הממונע. בשל גודלו של שבב המצלמה sCMOS, השימוש של אופטיקה פיצול תמונה מסנן ופליטה multiband יהיה אפשרי ולאפשר אני סימולטניmaging עם אורכי גל מרובים ללא עונש מהירות. אפשרות נוספת תהיה לסירוגין לייזרי העירור השונים ומשתמש מסנן חריץ multiband לדחות את אור העירור. השימוש SLM בינארי ferroelectric ביישום זה גם אינו אופטימלי. יעילות דיפרקציה של SLM כזה הוא נמוך מאוד, ולכן רוב לאור האירוע הוא בהשתקפות אפס הסדר, אשר סוננו על ידי מסכה מרחבית. עבור יישומים הדורשים שיעור גבוה מסגרת מאוד, מהירות הדמיה ולכן היא מוגבלת על ידי הספק של דיודות לייזר. SLM גם מציג כמה סְגַלגַלוּת בקיטוב עבור אורכי גל מן גל עיצוב 550 ננומטר שבו פיקסלים אינם פועלים כמו צלחות גל חצי אידיאליות. אמנם זה יכול להיות מתוגמל על ידי שימוש LCVR נוסף, הפתרון האידיאלי עשוי להיות השימוש בהתקן מייקרו-ראי דיגיטלי (DMD) כמחולל דפוס.

    שינויים אפשריים

    Prese ההתקנהnted כאן הוא גמיש ומשתנה בקלות רבה יותר מאשר מכשירים מסחריים כך שיטות הדמיה אחרות כגון 3D-SIM, SIM-2D מהר, SIM מולטיפוקליות (MSIM) ו- SIM שאינו ליניארי (NL-SIM) יכולות להיות מיושמות 21,34,35.

    2D-SIM יכול להיות גם מתאים הדמיה שטוח יחסית, זז מהר מבנים כגון reticulum endoplasmic הפריפריה. חדר המיון הפריפריה טמון עמוק בתוך התא מאשר אפשר להאיר באמצעות שדה TIRF חלוף אך בשל המבנה השטוח ניתן הדמיה באמצעות-SIM 2D רגיל עם רקע זניח מחוץ לפוקוס. בנוסף, השימוש של אלגוריתמי שיקום חתך אופטיים משופרים לדכא out-of-פוקוס אור להרחיב את שימוש 2D-SIM כדי דגימות עבות אופטי, אם כי שם הכפלת רזולוציה הצירית אינה נדרשו 21.

    בשנת MSIM, המדגם הוא מואר על ידי שריג דליל של מוקדי עירור 36. טיפול זה יכול להיות מיושם על ידי הסרת המסכה מרחבית (SM) והחלפתו על ידי מקטב. SLM החברה פועלת כמו אפנן משרעת. בסורגי SIM בינארי מוצגים על SLM יכולים להיות מוחלף על ידי שריג 2D של כתמים, עם הגודל של הכתמים נבחרו להיות שווה לגודל של יכולת מיקוד עקיף במישור התמונה. באיור 7 א, סריג של 4 x 4 ריבועים פיקסל מוצג על SLM (ההבלעה) אשר כאשר demagnified על המדגם מייצר מוקדים עקיפים מוגבלים של 150 x 150 ננומטר, בהתחשב בגודל פיקסל SLM הפיזי של 13.62 מיקרומטר. מוקדי העירור אז יכולים להיות מתורגמים על ידי העברת דפוס הסריג על SLM וזה חוזר על עצמו מספר פעמים על מנת להאיר את השדה כולו מבט. תמונות נרכשות לכל תפקיד דפוס תורגם בערימה היא שלאחר עיבוד להניב תמונה משוחזרת עם רזולוציה משופרת של עד בפקטור של משוואה והקטן מחוץ מוקד אור לעומת תמונת widefield המקבילה30. טיפול זה יכול להיות שימושי עבור הדמיה עבה, דגימות צפופות עבורו SIM סטנדרטי אינו מתאים עבור מבנים ניגודיות נמוכים למשל כגון תאי דם אדומים מוכתמים (איור 7C), אם כי פעם הרכישה גדלה בשל מספר הרב של מסגרות גלם נדרש לכל שדה הראיה (במקרה זה N = 168).

    לבסוף, ההתקנה יכולה להיות שונה כדי לאפשר או גבוה NA ליניארי TIRF-SIM או בדוגמת הפעלה שאינו ליניארי SIM (PA NL-SIM), כפי שהוצגה לאחרונה על ידי Li et al., על ידי שימוש אובייקטיבי ultrahigh 1.7 NA או תוספת של לייזר photoactivation 405 ננומטר ואופטימיזציה זהירה של דפוסי צורמת SLM 35.

    יישומים עתידיים

    SIM עדיין טכניקה המתפתחת במהירות ויישומים רבים במדעי החיים יופעלו בעתיד. מהירות, רזולוציה, ושיפורים הניגודיות של הטכניקה ואת יכולת השימוש מ fluorophores תקןEAN שעבור bioimaging, מוגדר SIM להחליף מערכות מיקרוסקופ רבות קונבנציונליות, כגון פלטפורמות שדה confocal ורחבות. מערכות SIM מסחריות זמינות כבר היום עם מפרט טכני יוצא מן הכלל, עם זאת, הם מעבר להישג ידם הכספי של מעבדות מחקר רבות, ואת, באופן מכריע, הם מאבדים את הגמישות להיות משונים פותח על מנת ליישם את התפתחויות המחקר העדכני ביותר בתחום. גם אין להם את היכולת החיונית "להיות מותאמת עבור הניסוי בהישג היד", לעתים קרובות צוואר בקבוק קריטי חיתוך מחקר מדעי חי קצה. המערכת המתוארת כאן יהיה מתאים במיוחד גם ללמוד תהליכים דינמיים ליד פני התא, עבור במבחנה של מערכות bilayer מחדש, ללמוד כימיה של פני השטח של חומרים מדעי הטבע, למשל. חומרי 2D, ויישומים רבים אחרים.

    Disclosures

    Acknowledgements

    עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של האמון Leverhulme, הנדסה המדעים הפיזיקליים מועצת המחקר [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; אלצהיימר Research UK [ערוק-EG2012A-1]; קרן Wellcome [089,703 / Z / 09 / Z] המועצה למחקר רפואי [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. אנו מודים E. Avezov ומ Lu עבור transfection של תאים LifeAct-GFP ו cytosolic-GFP בהתאמה, וו צ'ן להכנת התרבות HEK293. אנו מודים גם ק O'Holleran לסיוע עם העיצוב של המיקרוסקופ, ול 'שאו ור Heintzmann לדיונים והצעות שימושיים.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    488 nm laser Toptica iBeam SMART with digital modulation
    561 nm laser Coherent OBIS LS with digital modulation
    640 nm laser Cobolt MLD with digital modulation
    Long-pass dichroic mirrors  Thorlabs for combining excitation beams
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc From same batch as above, 25 x 25 mm
    1" square kinematic mount Edmund Optics 58-860
    Glan-Taylor calcite polarizers Thorlabs GT5-A For alignment of LCVR
    Glan-Taylor mount Thorlabs SM05PM5
    Achromatic half wave plate Thorlabs AHWP05M-600 400-800 nm
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M For HWP
    Liquid Crystal Variable Retarder Meadowlark Optics SWIFT Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
    LCVR controller Meadowlark Optics D3060HV Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
    Achromatic quarter wave plate Meadowlark Optics AQM-100-0545
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1P/M For QWP
    10 mm achromatic doublet Thorlabs AC080-010-A-ML For beam expander
    200 mm achromatic doublet Thorlabs AC254-200-A-ML For beam expander
    Cage XY Translators Thorlabs CXY1
    Ferroelectric spatial light modulator Forth Dimension Displays M0787-00249     SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board
    SLM mounting frame Forth Dimension Displays M0787-10014 Fixed to custom built aluminium mount
    Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount Thorlabs GM200/M For SLM mounting
    Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform Thorlabs XYR1/M For SLM mounting
    Rail carrier Newport M-PRC-3 For SLM mounting
    Precision Optical Rail Newport PRL-6 For SLM mounting
    300 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 273 322  f = 300 mm, 31.5 mm diameter
    140 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 239 322 f = 140 mm, 31.5 mm diameter
    Precision XY Translation Mounts Thorlabs LM2XY
    Lens Mounting Adapters Thorlabs SM2AD32 For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
    Translation stages Comar 12XT65 Dovetail, side drive
    XY Translator with Differential Drives Thorlabs ST1XY-D/M for spatial filter
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M for spatial filter
    300 mm achromatic doublet Thorlabs AC508-300-A-ML Excitation tube lens
    Automated XY stage with Z-piezo top plate ASI PZ-2150-XYFT-PZ-IX71  with MS-2000 controller
    Inverted microscope frame Olympus IX-71
    Objective lens Olympus UAPON100XOTIRF 100X/1.49NA
    High speed filter wheel Prior Scientific HF110A with Prior ProScan III controller
    Bandpass emission filters Semrock FF01-525/30, FF01-676/29
    sCMOS camera Hamamatsu ORCA Flash v4.0
    Stage top incubator OKO Lab H301-K-FRAME For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
    Stainless steel optical posts Thorlabs TR series for mounting optical components
    Post holders Thorlabs PH series for mounting optical components
    Kinematic mirror mounts Thorlabs KM100 for mounting 1" mirrors
    Shearing interferometer Thorlabs SI100
    100 nm fluorescent microspheres Life Technologies T-7279 Tetraspeck
    Rhodamine 6G Sigma Aldrich 83697-250MG
    8 well glass bottom dishes ibidi 80827 with #1.5 coverglass
    Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155409 with #1.5 coverglass
    0.01 mm microscope reticle slide EMS 68039-22
    CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher Scientific C10613

    References

    1. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).
    2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, (2), 82-87 (2000).
    3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (35), 13978-13983 (2012).
    4. Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophys. J. 101, (5), 1277-1284 (2011).
    5. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Mol. Cell. 58, (4), 644-659 (2015).
    6. Westphal, V., et al. Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement. Science. 320, (5873), 246-249 (2008).
    7. Davies, T., et al. CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation. PLOS Biol. 13, (4), e1002121 (2015).
    8. Laine, R. F., et al. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat. Commun. 6, 5980 (2015).
    9. Pinotsi, D., et al. Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy. Nano Lett. 14, (1), 339-345 (2014).
    10. Esbjörner, E. K., et al. Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation. Chem. Biol. 21, (6), 732-742 (2014).
    11. Michel, C. H., et al. Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology. J. Biol. Chem. 289, (2), 956-967 (2014).
    12. Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques. Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).
    13. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, (1), 141-145 (1981).
    14. Cragg, G. E., So, P. T. Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves. Opt. Lett. 25, (1), 46-48 (2000).
    15. Chung, E., Kim, D., So, P. T. Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy. Opt. Lett. 31, (7), 945 (2006).
    16. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6, (5), 339-342 (2009).
    17. Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (14), 5311-5315 (2012).
    18. Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks. Opt. Express. 21, (22), 26162-26173 (2013).
    19. Förster, R., et al. Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator. Opt. Express. 22, (17), 20663 (2014).
    20. Lu-Walther, H. W., et al. fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy. Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001 (2015).
    21. Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. High speed structured illumination microscopy in optically thick samples. Methods. (2015).
    22. von Olshausen, P. Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. University of Freiburg. (2012).
    23. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, (12), 4957-4970 (2008).
    24. Meadowlark Optics Inc. Basic Polarization Techniques and Devices. (2005).
    25. O'Holleran, K., Shaw, M. Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy. Opt. Lett. 37, (22), 4603 (2012).
    26. Brankner, S. Z., Hobson, M. Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf (2013).
    27. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, (12), 4957-4970 (2008).
    28. Wicker, K. Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space. Opt. Express. 21, (21), 24692 (2013).
    29. Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy. 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3, (1), 995-998 (2014).
    30. Ströhl, F., Kaminski, C. F. A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data. Methods Appl. Fluoresc. 3, (1), 014002 (2015).
    31. Mudry, E., et al. Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns. Nat. Photonics. 6, (5), 312-315 (2012).
    32. Ayuk, R., et al. Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm. Opt. Lett. 38, (22), 4723 (2013).
    33. Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Sci. Rep. 5, 15915 (2015).
    34. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
    35. Li, D., et al. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349, (6251), (2015).
    36. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter