Automatic Translation

This translation into Norwegian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

En guide til Strukturert Illumination TIRF Mikros i høy hastighet med flere farger

1, 1, 1

1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    Cite this Article

    Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J. Vis. Exp. (111), e53988, doi:10.3791/53988 (2016).

    Abstract

    Optisk super-oppløsning avbildning med strukturert belysning mikroskopi (SIM) er en viktig teknologi for visualisering av prosesser på molekylært nivå i den kjemiske og biomedisinsk vitenskap. Selv om kommersielle SIM-systemer er tilgjengelige, systemer som er tilpasset designet i laboratoriet kan utkonkurrere kommersielle systemer, sistnevnte vanligvis designet for enkel bruk og generelle applikasjoner, både når det gjelder bildegjengivelse og hastighet. Denne artikkelen presenterer en grundig guide til å bygge et SIM system som bruker total intern refleksjon (TIR) ​​belysning og er i stand til bildebehandling på opptil 10 Hz i tre farger med en oppløsning på 100 nm. På grunn av kombinasjonen av SIM og TIRF, gir systemet bedre bildekontrast enn konkurrerende teknologier. For å oppnå disse spesifikasjonene er flere optiske elementer som brukes til å aktivere automatisk kontroll over polarisasjonstilstand og romlig struktur av belysningslys for alle tilgjengelige eksitasjon WAVelengths. Full informasjon om maskinvare gjennomføring og kontroll er gitt for å oppnå synkronisering mellom eksitasjon lys mønster generasjon, bølgelengde, polarisering stat og kamerastyring med vekt på å oppnå maksimal oppkjøpet frame rate. En trinn-for-trinn-protokoll for systemet justering og kalibrering er presentert og den oppnåelige oppløsningen forbedringen er godkjent for ideelle testprøver. Muligheten for video-rate super-oppløsning avbildning er demonstrert med levende celler.

    Introduction

    I løpet av det siste halvt tiår, har super-oppløsning mikros modnet og flyttet fra spesialist optikk laboratorier i hendene på biologen. Kommersielle mikroskop løsninger finnes for de tre hovedvarianter for å oppnå optisk super-oppløsning: enkelt molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM), stimulert emisjon utarming mikroskopi (STED), og strukturert belysning mikroskopi (SIM) 1,2. SMLM som photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastisk optisk gjenoppbygging mikroskopi (STORM) har vært de mest populære teknikker, hovedsakelig på grunn av enkelheten i den optiske setup og løfte om høy romlig oppløsning, lett ned til 20 nm. Imidlertid super-oppløsning mikros via enkelt molekyl lokalisering har en iboende trade-off: romlig oppløsning oppnåe er avhengig av akkumulere et tilstrekkelig antall individuelle fluoroforen lokaliseringene, og dermed begrenser tidsmessig oppløsning. Imaging dynamisk prosesses i levende celler blir derfor problematisk som man må tilstrekkelig smake bevegelsen av strukturen av interesse å hindre bevegelsesartefakter og samtidig skaffe nok lokaliserings hendelser i den tiden til å rekonstruere et bilde. For å møte disse kravene, har levende celle SMLM demonstrasjoner fått den nødvendige økningen i fluorophore photoswitching priser ved i stor grad øke eksitasjon makt, og dette fører igjen til fototoksisitet og oksidativt stress, og dermed begrense utvalget overlevelsestider og biologisk relevans tre.

    En klar fordel med STED både over og SIM SMLM er at det kan bildet med super-oppløsning i tykke prøver, for eksempel lateral oppløsning på omkring 60 nm ble oppnådd i organotypiske hjernesnitt ved dybder opp til 120 pm 4. Imaging på slike dybder med ett mål implementasjoner av SMLM eller SIM er ugjørlig, men blir mulig med enten single-molekyl lys ark eller gitter lys ark microscopy 5. Video-rate STED har også blitt demonstrert og brukt til å kartlegge synaptic vesicle mobilitet, men så langt har dette vært begrenset til bildebehandling små synsfelt 6.

    For anvendelser i cellebiologi og molekylære egen montering reaksjoner 7 - 12 som krever avbildning med høy tidsoppløsning over mange tidspunkter, strukturert belysning mikroskopi (SIM) kan være godt egnet, da den ikke er avhengig av photophysical egenskapene til en spesiell fluorescerende sonde. Til tross for dette iboende fordel av SIM, inntil nå bruken har i hovedsak vært begrenset til bildebehandling faste celler eller saktegående prosesser. Dette er på grunn av begrensninger i kommersielt tilgjengelige SIM-systemer: oppkjøpet bildefrekvens på disse instrumentene ble begrenset av rotasjonshastighet rister brukes til å generere de nødvendige sinusbelysningsmønstre samt polariseringen opprettholde optikk. Den nyeste generasjonen av kommersielle SIMinstrumenter er i stand til rask bildebehandling, men de er veldig dyrt for alle, men sentrale bildetjenester.

    Denne protokollen presenterer en guide til byggingen av et fleksibelt SIM system for avbildning raske prosesser i tynne prøver og nær basal overflaten av levende celler. Den benytter total indre refleksjon fluorescens (TIRF) for å generere et belysningsmønster som trenger dypere enn omtrent 150 nm inn i prøve 13 som vesentlig reduserer ute av fokus bakgrunnssignal. Ideen om å kombinere SIM med TIRF er nesten like gammel som SIM seg 14, men ble ikke realisert eksperimentelt før 2006 15. Den første in vivo bildene oppnådd med TIRF-SIM ble rapportert i 2009 16 oppnå bildefrekvens på 11 Hz å visualisere tubulin og kinesin dynamikk, og to farge TIRF-SIM-systemer har blitt presentert 17,18. Nå nylig, en guide for bygging og bruk av en enkelt farge to-bjelke SIM system ble presentert med ramme-hastighet på opptil 18 Hz 19,20.

    Oppsettet presenteres her er i stand til SIM super oppløsning bildebehandling ved 20 Hz i tre farger, hvorav to kan betjenes i TIRF-SIM. Hele systemet er bygget opp rundt et invertert mikroskop ramme og bruker en motorisert xy oversettelsestrinnet med en piezo-aktivert z stadium. For å generere sinus eksitasjon mønstre som kreves for TIRF-SIM, bruker systemet presentert en ferroelektrisk romlig lys modulator (SLM). Binære grating mønstre vises på SLM og de resulterende ± 1 diffraksjon bestillinger blir filtrert, videresendt og fokusert inn i TIR ringen på objektivet. De nødvendige faseforskyvninger og rotasjonene til gitterne blir påført ved å endre det fremviste bildet SLM. Denne protokollen beskriver hvordan å bygge og justere slik eksitasjon bane, detaljer justeringen av utslipps banen, og presenterer testprøver for å sikre optimal justering. Det er også de skriftlærde problemstillinger og utfordringer spesielt for høy hastighet TIRF-SIM vedrørende polarisering kontroll og synkronisering av komponenter.

    Design Betraktninger og begrensninger

    Før du monterer TIRF-SIM-systemet som presenteres i denne protokollen, er det flere design begrensninger for å vurdere som bestemmer valg av optiske komponenter. Alle forkortelser av optiske komponenter se figur 1.

    Spatial Lys Modulator (SLM)

    En binær ferroelektrisk SLM er brukt i dette oppsettet som det er i stand til å undermillisekund mønster svitsjing. Gråtone nematiske SLMs kan brukes, men disse gir sterkt redusert koblingstider. Hver av eller på bildeelement i en binær fase SLM vil gi enten et π eller 0-faseforskyvning til den innfallende plan bølgefront, og derfor om en periodisk gittermønster blir vist på SLM den vil fungere som en fase diffraksjonsgitter.

    ent "> Total Internal Reflection (TIR)

    For å oppnå TIR og produsere et flyktig felt, må den innfallende vinkel på eksitasjon bjelkene på glassprøven grensesnitt være større enn den kritiske vinkel ligning . Dette angir den minste innfallsvinkelen som kreves, og følgelig også den maksimale avstand, eller periode, av den flyktige belysningsmønster. Den maksimale innfallsvinkelen ligning (Den åpningsvinkel) er begrenset av den numeriske apertur (NA) for objektivlinsen som kan beregnes ut fra definisjonen ligning . Dette bestemmer den minste avstanden mønster kan oppnås i henhold til formel Abbe ligning som knytter NA og bølgelengde ligning til et minimum mønsteravstanden (dvs.. TIR-ring), og hvor de to brennpunkter eksitasjon må plasseres nøyaktig og presist roteres for å generere hver belysningsmønster.

    Rekonstruksjon av TIRF-SIM-bilder krever kjøp av minimum tre fase skift per mønster rotasjon derfor SLM mønster perioden må være delelig med 3 (se figur 1). For eksempel vil en periode på 9 piksler for 488 nm lys og 12 piksler for 640 nm lys. For en omfattende diskusjon av SLM mønster design, inkludert underpiksel optimalisering av mønster avstand ved hjelp skåret gitter, Se tidligere arbeid av Kner et al. 16 og Lu-Walther et al. 20 Posisjonen av de to eksitasjon brennpunktene må være inne i TIR ring for alle bølgelengder, men diffraksjonsvinkelen av de ± en ordre fra SLM er bølgelengden avhengig. For standard SIM, kan flerfarget bildebehandling oppnås ved å optimalisere gitteret periode for lengst bølgelengde, og tolerer et tap i ytelse for de kortere kanaler. For TIRF-SIM imidlertid å optimalisere for en bølgelengde vil si at den andre bølgelengde brennpunktene ikke lenger er innenfor TIR ringen. For eksempel, ved bruk av et gitter periode på 9 piksler er tilstrekkelig til å gi TIRF til 488 nm, som foci er ved 95% av diameteren av ryggen åpning og inne i TIR ringen, men for 640 nm denne perioden vil posisjonere foci utenfor blenderåpningen. Av denne grunn ulike pikselmønsteravstander må brukes for hver eksitasjon bølgelengde.

    Justeringen av TIRF-SIM eksitasjon banener ekstremt følsomme for små endringer i stillingen av det dikroiske speilet (DM4 i figur 1) i mikroskop kroppen, mye mer enn i konvensjonell SIM. Bruk av en roterende filter kube turret anbefales ikke, i stedet bruke en enkelt, multi-band dichroic speil, som holdes i en fast posisjon og designet spesielt for eksitasjonsbølgelengdene brukt. Det er viktig at bare de høyeste kvalitet dikroiske speil er brukt. Disse krever tykke substrater på minst 3 mm, og er ofte betegnet som "bilde flat" av produsentene. Alle andre underlag føre til uutholdelig aberrasjon og bildekvaliteten i TIRF-SIM.

    polarisering kontroll

    For å oppnå TIRF-SIM det er nødvendig å rotere polarisasjonstilstanden av eksitasjonslyset i synkronitet med belysningsmønster slik at den forblir asimutalt polarisert i den objektive eleven planet i forhold til den optiske aksen (dvs.. s-polarisert). Justering av polarisasjonen kontroll optikk vil avhenge av den bestemte optiske elementet anvendes, for eksempel en Pockels-celle 21, eller en halv bølgeplate i en motorisert dreietrinn 22. I denne protokollen en tilpasset flytende krystall variabel retarder (LCVR) brukes, designet for å gi full-bølge (2π) retardance over bølgelengdeområdet 488-640 nm som det tillater rask (~ msek) veksling. Ved anvendelse av en flytende-krystall retarderer er det viktig å bruke en høy kvalitet komponent: standard komponenter er vanligvis ikke stabile nok til å gi en konstant retardance over lengden av kameraets eksponeringstid som fører til en tåkelegge ut av belysningsmønster og lav modulasjon kontrast . Flytende krystall retardere er også sterkt temperaturavhengig og krever bygget i temperaturkontroll.

    synkronisering

    Lasere må synkroniseres med SLM. Binære ferroelectric SLMs er internt balansert med switching mellom en på staten og av-tilstand. Pikslene bare fungere som en halv bølgeplater i enten deres på eller av staten, men ikke i løpet av inter bytte tid. Derfor lasere skal kun være slått på under på / av statene via LED Aktiver signal fra SLM å hindre en reduksjon i mønster kontrast på grunn av mellomliggende tilstand av pikslene. En akusto-optisk modulator (AOM) kan alternativt bli brukt som en hurtig lukker dersom lasere ikke kan digitalt modulert.

    Valg av linser

    Basert på disse begrensninger, i den nødvendige demagnification av SLM planet på prøven planet gir de ønskede belysningsmønster kan bestemmes. Dette gjør beregning av brennvidde på de to linsene L3 og L4 i bildet stafett teleskop og eksitasjon kondensatoren objektivet L5. I dette systemet en 100X / 1.49NA oljeneddyppingsobjektivet objektiv brukes med 488 nm og 640 nm eksitasjon, bruker dermed brennvidde på 300 og 140 mmfor L4 og L3, og 300 mm for L5, noe som gir en total demagnification av 357X, tilsvarende en SLM pikselstørrelse på 38 nm på prøven planet. Ved hjelp av denne kombinasjon av linser, SLM gitterperioder 9 for 488 nm lys og 12 piksler for 640 nm gi mønster avstander på 172 og 229 nm i prøven, tilsvarende anslagsvinkler på henholdsvis 70 ° og 67 °. For et glass-vann-grenseflaten, er den kritiske vinkel 61 °, og er uavhengig av bølgelengden, og derfor disse to mønster avstander tillate TIRF eksitasjon for begge bølgelengder. En objektivlinse er utstyrt med en korreksjon krage er anvendelig for korreksjon av sfæriske avvik som innføres ved variasjoner i dekktykkelse, eller hvis arbeider ved 37 ° C.

    Bilde Reconstruction

    Når rå SIM data har blitt kjøpt opp er det et spørsmål om beregnings innsats for å generere super-løst bilder i en to-trinns prosess. For det første må belysningsmønster som skal bestemmes forhvert bilde og for det andre, må komponentene i SIM-spekteret separeres og kombineres på riktig måte som for å doble den effektive OTF bæreren (se Figur 6, innfellinger).

    Presis kunnskap om de projiserte belysningsmønstre er viktig, som super-løst frekvenskomponenter må være ublandet så nøyaktig som mulig for å hindre gjenstander forårsaket av de gjenværende delene av overlappende komponenter. Vi bestemmer den belysningsmønster parametere a posteriori fra den rå bildedata ved å følge prosedyren innføres ved Gustafsson et al. 23 Kort sagt, et sett av belysningsparametre som beskriver en normalisert todimensjonal sinusoid har til å bli funnet for hver av de ligning eksitasjon mønstre ligning :

    ligning

    herved ligning og ligning beskrive frynse kontrasten og mønsteret startfasen av hvert enkelt bilde m hhv. Komponentene i bølgevektor, ligning og ligning Bare endres med forskjellige orienteringer ligning av mønsteret og kan antas å være konstant på annen måte. Til grovt bestemme komponentene i bølgevektor en krysskorrelasjon av rå bilde spektra er utført, som er raffinert ved å påføre underpiksel skifter til en av de kryss-korrelerte bilder som for å optimalisere overlapping. Dette gjøres via multiplikasjon av fast-plass fase gradienter ligning som induserer en underpiksel skifte i frekvens-plass. Legg merke til at det er nyttig å ha et godt estimat av bølge-vektorer før selve mønsteret estimering og dette kan bli funnet ved å avbilde et fluorescerende sjikt vulst.

    Som det fasetrinn mellom forskjøvet mønster er ligning , Altså. ligning , Separasjon av frekvenskomponenter kan utføres av en Fourier-transformasjon langs de "faseaksen". Den globale fase ligning og pannelugg kontrast ligning kan deretter bli bestemt ved anvendelse av lineær regresjon sammensatt av forskjellige komponenter. De enkelte separerte komponenter blir så kombinert ved hjelp av en generalisert Wiener filter. For en detaljert beskrivelse av både parameter utvinning og gjennomføring av generalisert Wiener filter øvrig henvises det til Gustafssonet al., 23 hvor den samme algoritmen blir brukt.

    Protocol

    1. Organisere og Justere Eksitasjon Sti

    1. Markerer posisjoner av komponentene på den optiske bordet (se figur 1 for en oversikt over den optiske oppsett). Separer objektiv, linser L3, L4, L5, og SLM hverandre ved summen av deres respektive brennvidder, slik at SLM overflate vil bli videresendt til fokalplanet til objektivet.
    2. Sett fler kant dikroisk speil DM4 inn i filteret kuben turret av mikroskopet rammen.
    3. Sett andre dichroic speil DM3 inn i en en "firkant kinetisk speil montere, og plassere det en brennvidde bort fra kondensatoren objektivet L5.
      Merk: Denne eksitasjon bane designen har to identiske dichroic speil DM3 og DM4 som er tatt fra samme produksjonsparti for å sikre like optiske egenskaper. Det dikroiske speil (DM4) er posisjonert slik at S- og P-aksene er byttet i forhold til den dikroiske lokalisert i mikroskopet (DM3) dermed avbryte enhverpolarisasjon elliptisitet innført ved sin dobbeltbrytning (figur 1). Denne kompensasjonen fungerer like godt for hver belysning bølgelengde. Dette trinnet er nødvendig for å opprettholde høy kontrast modulasjon.
    4. Før innsetting av linsene til magnetisering bane, nøyaktig definere den optiske akse for systemet.
      1. Fjern det objektiv (OB) fra dreieskiven og i stedet skrus inn et innrettingsverktøy. Denne består av en 500 mm lang optisk bur system med to justerings disker i begge ender.
      2. Bruk det dikroiske speilet DM3 og en midlertidig oppstilling speil anbrakt ved den omtrentlige senere plassering av SLM for å styre en kollimert referansestråle fra laser en gjennom sentrum av hullene i de to justerings disker. Dirigere strålen fra laser en til den midlertidige speilet som er vist på figur 1 ved hjelp av tre speil og det dikroiske speil DM2. Den midlertidige speilet på SLM posisjon må være nær vinkelrett på den optiske aksen.
      3. Fjern justeringsverktøyet når det grove optiske akse har vært determined.Insert en iris i strålegangen før det kommer inn i legemet mikroskopi og sentrere det på bjelken. Fest et stykke hvitt kort med et lite hull sentrert på iris.Reinsert objektiv (OB).
        Merk: bjelke forlater målet vil nå være svært avvikende, men det vil være en veldig svak refleksjon fra baksiden overflaten av linsen som vil være synlig på hvitt kort. Alle linser, selv om de er antirefleksjonsbelagt, vil ha svake refleksjoner som kan brukes for å sikre koaksial innretting. Hvis strålen er nøyaktig vinkelrett på linsen deretter tilbake refleksjon vil gå tilbake gjennom sentrum av iris
      4. Gjør iterative vinkel justeringer i to speil (DM3 og justering speil på SLM posisjon) for å sentrere tilbake refleksjon påkortet med den innkommende strålen. Midlertidig fjerne objektiv (OB) og merk laserpunkt på taket for å skape en referanseposisjon.
      5. Sette inn et par av iris på høyden av referansestrålen langs de gjengede hullene i tabellen. Strålen skal være parallell med overflaten av den optiske tabellen. Den optiske akse er nå definert.
    5. Sett kondensatoren objektivet (L5) omtrent en brennvidde bort fra målet. Montere denne linse på en lineær oversettelse trinn satt til å oversette langs retningen av referansestrålen.
    6. Juster samlelinse posisjon og vinkel, slik at strålen som forlater målet er kollimert og treffer referanse plass på taket. Sjekk at linsen er vinkelrett i forhold til bjelken ved igjen å kontrollere tilbake refleksjon med iris og hvit kartong. Ta av objektiv (OB) og sett den andre linsen på bildet relé teleskop (L4).
      Merk: Sikre riktig collimation og ikke-avbøyning av væream er gjort enklere når det er et likt antall linser i strålebanen.
    7. Juster posisjonen og vinkelen til denne linse ved anvendelse av en lineær oversettelse trinn for å opprettholde kollimering og for å sikre referansestrålen fremdeles hardt det markerte sted på taket.
    8. Sett på objektiv (OB) og sette den første linsen på teleskopet (L3). Juster posisjonen og vinkelen til denne linse for å sikre kollimering og ikke-avbøyning, som beskrevet i foregående trinn.
    9. Monter SLM chip på en slingrebøyle feste som gir rotasjon uten oversettelse om midten av brikken overflate.
      Merk: Den spesifikke montering utformingen avhenger av SLM benyttes. Dersom SLM leveres uten montering, bør det være festet til en tilpasset maskinert aluminiumplate som så blir festet til en linse slingrebøyle montere.
    10. Med linsene justert, setter du inn SLM i stedet for speil. Justere plasseringen av den SLM slik at referansestrålen er plassert i sentrum av den SLM chip, og justere enGle slik at strålen passerer gjennom de to relé linser (L3 og L4). Kontroller at referansestrålen fremdeles er sentrert på det markerte sted.
    11. Utvid og kollimere referansestråle ved hjelp av en Keplerian bjelke ekspander.
      1. Monter to objektiver (L1 og L2) i et bur system for enkel justering.
      2. Centre buret systemet på referansestrålen ved å fjerne linsene og erstatte dem med iriser.
      3. Sett de to linsene og justere den aksiale stilling til L2 for å kollimere den utvidede strålen ved hjelp av en skjær-interferometer. L2 bør være en brennvidde bort fra overflaten av SLM.
      4. Sjekk at den utvidede strålen er fortsatt kollimert etter de to relé linser L3 og L4. Bruk klipping interferometer like etter DM3 å sjekke for kollimering.
    12. Når eksitasjon banen er blitt justert for et enkelt bølgelengde, par de to andre lasere inn i strålebanen. Styr hver bjelke gjennom to iriser sentrert på eksitasjon bane medstrålen kombinere dikroiske speil (DM1 og DM2).

    2. Justering av Polarisering Rotator

    1. Monter LCVR med sin raske akse 45 ° til hendelsen polarisering.
    2. Finjuster polarisering vinkelen på innfallende strålen til LCVR bruker en akromatisk halv bølge plate (HWP) ved å sette inn HWP og LCVR mellom kryssede polarisatorer. Roter HWP for å minimalisere den utsendte effekt.
      Bemerk: For å virke som en variabel polarisasjon rotator, må den hurtig aksen av flytende-krystall retarderer (LCVR) må være nøyaktig innrettet i 45 ° til den innfallende stråle vertikale polarisasjon. Den LCVR er fysisk montert på 45 °, men dette er bare en grov innretting. Den HWP brukes for å sikre perfekt 45 ° innretting av den innfallende polarisasjon i forhold til LCVR fast akse. Den kvartbølgeplate (QWP) omformer den skrå elliptisk polarisasjon indusert ved LCVR tilbake til lineær polarisasjon med en vinkel som styres av spenningen24.
    3. Sett QWP etter LCVR og roter det til å justere sin langsomme aksen til den innkommende polarisering ved å minimere overført makt mellom kryssede polarisatorer.

    3. Justering av Emission Sti

    1. Grovt plassere kameraet ved hjelp av en scene mikrometer sklie og overført lys.
      1. Fokus på retikkel hjelp av mikroskop okulars og fikse objektiv i denne posisjonen.
      2. Grovt sentrere kameraet og flytte kameraposisjon for å bringe bildet av trådkorset i fokus ved å observere bildet på skjermen.
        Merk: Hvis et eksternt filter hjulet brukes deretter filteret kuben ikke vil inneholde et utslipp filter, derfor okulars må ikke brukes når lasere er slått på.
    2. Finjustere kameraposisjon ved hjelp av en fluorescerende perle prøve.
      1. Forbered et monolag av fluoriserende perler ved å spre et fall på 100 nm flerfarget perler på en # 1,5 dekkglass. La det dry å adsorbere perlene til dekkglass og deretter senkes ned i vann.
      2. Plassere vulsten prøven på målet med nedsenking olje. Finjustere posisjon av kameraet slik at det fluorescerende sjikt vulsten er i fokus. Ikke juster objektiv posisjon når fokus er funnet.
        Merk: Når SLM må være i et plan konjugert til prøven planet, posisjonen til SLM, relé linser, og objektiv skal være fast. For å justere fokus, flytter prøven aksialt i stedet for mål ved hjelp av en piezo z-scenen.
    3. Generere de aktuelle SIM binære grating mønstre som bitmap-filer.
      1. For 2D / TIRF-SIM, generere en serie av 9 binære grating bilder: 3 mønster orienteringer hver med 3 lik avstand faseskift. Generer disse numerisk (ved hjelp av MATLAB for eksempel) fra en rotert 2D sinussignal med en faseforskyvning anvendt, så terskel for å frembringe et binært bilde. Se Supplemental Kode filer for eksempel koden.
      2. for alignment formål, også generere gittermønster som er blitt vindusbaserte av en liten sirkulær åpning for hver av de 3 orientering, slik som vist i figur 2. vindusjusterings gitter behøver ikke å bli eksternt utløst, men kan være manuelt slått av brukeren via SLM programvare.
        Merk: Se referanser for en diskusjon av de optimale rotasjonsvinkler og et eksempel på gitter mønster generasjon kode 16,20.
    4. Last opp bitmap bilder til SLM ved hjelp av produsentens programvare (for eksempel MetroCon).
      1. Last inn SLM kontroll programvare og klikk "Connect".
      2. I "Repertoar" -kategorien, klikk på "Load" for å åpne repertoar filen og sjekke antall Kjører bestillinger i filen. I eksempelet repertoar filen gitt det fem Running bestillinger.
      3. Klikk "Send til styret" for å laste opp repertoaret filen til SLM.
      4. Vent til bitmap bilder å laste opp ennd for at enheten automatisk skal starte på nytt.
        Merk: Et eksempel repertoar fil, som inneholder grating bitmap bilder og en fil som definerer den rekkefølgen, inngår som en tilleggskode fil. Den ".repz" filen kan åpnes ved hjelp av ZIP-fil Archiver programvare.
    5. Vise en vindus justering rist på SLM for første orientering (for eksempel 0 °).
      1. I SLM kontroll programvare, velg "Status" -kategorien, angi antall Running Order (i tilfelle av eksempelet fil, dette er Running Order "1").
      2. Klikk på "Velg" for å endre kjøreklar stand til justeringen rist.
        Merk: Dette vil belyse en liten sirkulær region i prøven planet. Dersom SLM overflate er korrekt konjugert til prøven flyet da kantene på dette området vil være skarpt i fokus. Risten mønsteret vil produsere flere diffraksjon bestillinger i fokus for L3: null for refleksjon fra reflekterende bakplanet avSLM, -1 og +1 bestillinger som tilsvarer rist, og også svakere høyere bestillinger som oppstår fra diffraksjon av interne elementer som er spesifikke for SLM enhet (f.eks. Refleksjoner av de interne ledninger av SLM piksler og uregelmessigheter ved piksel kanter) . Alle men -1 og +1 bestillinger må filtreres ut.
    6. Sette inn en romlig maske (SM) som er montert i et x, y-fasen i strålegangen ved fokusposisjon L3, og oversette dens posisjon i forhold til den optiske aksen, slik at bare de ønskede første ordre er passert. Direkte etter det romlige filteret, vil bare to sirkulære bjelker være synlig.
      Merk: Den romlige Masken er fabrikkert ved punching 6 hull i aluminiumsfolie ved hjelp av en nål. Hullene bør være stor nok til å passere den første bestillingen bjelker for alle laserbølgelengder. En detaljert analyse av den romlige masken er gitt i referanse 20.
    7. Vise neste orientering av justeringen rist (60 °, kjører for to) og igjensikre at bare de første bestillingene blir sluppet gjennom den romlige masken, justerer sin posisjon om nødvendig.
    8. Gjenta for den endelige orientering (120 °, kjører for 3).
    9. Kontroller bildet av det fluorescerende sjikt vulsten på kameraet. Hvis de to sirkulære bjelker er ikke overlappende som vist i figur 2 så reposisjonere prøven planet ved iterativ justering av objektivlinsen og kameraposisjon.
    10. Juster målet stilling å overlappe de to stråler som vil bringe bilde ute av fokus. Flytt kameraet for å få bildet tilbake i fokus og finjustere mål i tilfelle to sirklene er fortsatt synlige. Gjenta denne prosessen til de to bjelker overlapper og en enkelt sirkulær region er i fokus.
    11. Når posisjonen av prøven planet er angitt, holde målet posisjon fiksert.
    12. For å bekrefte TIRF belysning, bilde en løsning av fluorescerende fargestoff, for eksempel for en 488 nm eksitasjonsbølgelengde, bruke en oppløsning av 1081; M rhodamine 6G.
      1. Bringe fargestoffet prøven i fokus. Hvis de to stråler er innfallende i riktig TIRF vinkel så enkle molekyler vil være synlig uten høy bakgrunn, og kantene av den sirkulære åpning vil være i fokus. Se figur 2B-D for eksempler på justert og forskjøvet TIRF bjelker.
      2. Vise hver orientering av de vindu-gitterne etter tur og sikre at alle tre orienteringer tilveie TIRF belysning og at de to bjelker overlapper hverandre ved prøven flyet. Finjusteringer til plasseringen av bjelkene kan gjøres ved å justere dichroic speil DM3.
        Merk: Selv om forskjellige bølgelengder er fokusert på litt forskjellige posisjoner på grunn av aksial kromatisk aberrasjon, er dette ikke kritisk, og kan korrigeres ved å bruke en konstant z-forskyvning til prøven stilling forut for eksitering med den andre bølgelengde.

    4. System Synkronisering og kalibrering

    1. Plasser perle mono srikelig på målet og bringe i fokus.
    2. Programmere SLM bruker sin kontroll programvare for å vise hver av de tre faseskift bilder i sving, for det første mønsteret orientering (0 °).
      1. Bruke SLM kontroll programvare, bytte til Running Order 4 av eksempelet repertoar.
      2. Konfigurere kameraet ved hjelp av oppkjøpet programvare (for eksempel HCImage) for å sende ut to signaler: en positiv og en negativ TTL trigger signal under den globale eksponering perioden. I kameraprogramvaren, under "Advanced Camera Properties", satt Utgang Trigger Kind 1 og 2 "Eksponerings", og Utgang Trigger Polaritet 1 og 2 til "positive" og "negative" hhv.
      3. Koble utgang 1 og 2 av kameraet til "Trigger" og "Finish" inngangene til SLM henholdsvis ved hjelp av koaksialkabler. SLM er nå synkronisert til kameraet.
    3. Erverve en serie på 3 bilder.
      1. I "Sequence" ruten velger &# 34; Hard Disk Record "som skannetype, og sette rammen teller til tre.
      2. Klikk "Start" for å skaffe seg 3 rammer. SLM mønsteret vil endre på hver eksponering. De fluoriserende perler i bildet vises å blinke av og på mellom hver av de 3 bildene. Mengden av blinkende er en lese ut av modulasjonen kontrasten i sinusformet belysningsmønster.
    4. Dreie polarisasjonen av magnetisering laser med den LCVR ved hjelp av tilpasset programvare for å oppnå asimut-polarisering og derfor den høyeste modulasjon kontrast for det gitte mønster orientering.
      1. Last inn LCVR kalibreringsprogramvare.
      2. Tast 0 og 8 for henholdsvis minimum og maksimal spenning.
      3. Klikk "Sweep LCVR Voltage" for å rotere polarisering.
        Merk: LCVR hemming er en funksjon av temperaturen og kan drive dag-til-dag selv med temperaturkontroll. I dette trinnet er optimal Azimuth polarisering funnet empirisk ved Sweeping den påtrykte spenningen mellom dens minimale og maksimale spenning som har den virkning å rotere innfallende polarisasjon ved prøven. Modulasjonen kontrasten blir beregnet for hvert spennings 25 og den spenning som oppnår maksimal kontrast brukes i de følgende trinn.
      4. Vent til kalibreringsprosessen for å fullføre, og notere den målte spenningen.
    5. Gjenta denne kalibreringsprosessen for de gjenværende to mønster orienteringer (60 ° og 120 °) og hver av de eksitasjonsbølgelengdene.
    6. Synkron kameraet eksponeringen med LCVR, lasere, utslipp filter hjul og piezo z-stage 26. For å oppnå dette, må du bruke en høyhastighets datafangst (DAQ) bord som master klokke kilde for systemet, og bruke SLM sin ​​LED Enable utgangssignal til å modulere lasere (se Figur 3B).
      Merk: Den spesifikke implementeringen er avhengig av komponentene som benyttes, men bruken av en høyhastighets DAQ styret for digital trigger synkronisering og styring av LCVR ved hjelp av en analog spenning, styres via programvare, er anbefalt. Kontrollen programvaren som brukes i denne protokollen er tilgjengelig på forespørsel.
    7. På grunn av aksial kromatisk aberrasjon, for hver bølgelengde, gjelder også en z-forskyvning til prøvetrinnet.
      1. Bestem offset eksperimentelt ved å fokusere på en flerfarget perle monolag prøven på første bølgelengde (f.eks. 488 nm) og deretter bytte til den andre (f.eks. 640 nm). Perlene vil nå være ute av fokus.
      2. Refokusere kulene og måle endringen i z-posisjon som var nødvendig. Denne forskyvning kan deretter påføres den piezo z-trinns hver gang eksitasjonsbølgelengden endres.
    8. Bruke SLM kontroll programvare, slår SLM Kjører Bestill til hele serien av 9 binære grating bilder som kreves for TIRF-SIM. Dette er Running Order 0 i eksempelet repertoar.
    9. Ved hjelp av kontrollprogramvaren kamera, erverve 9 bilder av vulsten prøven. I "Sequence" rute i kameraprogramvaren, velger du "Hard Disk Record" som skannetype, og endre ramme telle til ni.
    10. Klikk "Start" for å hente bilder.
    11. Lagre de oppkjøpte bilder som TIFF-filer ved å velge "TIFF" som bildetype i "Lagre bufret Images" -vinduet, og klikke på OK.
  • Rekonstruere en super-oppløsning fra rå TIFF-bilder ved hjelp av kommersielle eller tilpasset programvare for å validere forbedring i oppløsning i løpet av standard TIRF.
    Merk: For vår mikroskop vi bruke tilpassede rekonstruksjon kode utvikles både internt og av Dr. Lin Shao 27.
  • Representative Results

    Multicolor 100nm diameter fluoriserende perler ble fotografert for å sammenligne standard TIRF til TIRF-SIM og kvantifisere oppnåelige forbedringen i lateral oppløsning (Figur 4A - B). Rekonstruksjon av rå rammer til super-oppløsning ble utført ved anvendelse av standard algoritmer som er beskrevet i litteraturen 27,28. Det kan sees at TIRF-SIM klart har betydelig høyere lateral oppløsning sammenlignet med TIRF. Punktspredefunksjonen (PSF) av et mikroskop er godt tilnærmet ved bildet av en enkelt sub-diffraksjon størrelse fluorescerende vulst, derfor PSF og oppløsningen kan kvantifiseres ved å montere 2D Gaussiske funksjonene til individuelle perler for hver bølgelengde. Den estimerte oppløsning av mikroskopet basert på middelverdien av full bredde halvt maksimum (FWHM) er 89 nm og 116 nm for 488 og 640 nm TIRF-SIM henholdsvis (figur 4C). Dette tilsvarer en todelt improbedringer i lateral oppløsning for begge bølgelengder i forhold til den teoretiske diffraksjon begrenset saken. Fluorescensmerkede amyloidfibriler er også et utmerket testprøve for å demonstrere fordoblet oppløsning (figur 4D). Amyloidfibriler ble dannet in vitro ved inkubering β-amyloid som er merket med 10% rhodamin avledede fargestoffer (488 nm eksitasjon) i 1 uke og deretter avbildning med TIRF-SIM. Se referere 12 for mer informasjon.

    Subcellulære strukturer med høy kontrast som emGFP merket mikrotubuli (figur 5B, G) eller LifeAct-GFP (figur 5D) er ideelle for TIRF-SIM bildebehandling og gir høy kontrast super-oppløsning. TIRF-SIM avbildning ved hjelp oppsettet beskrevet i denne protokollen muliggjør observasjon av en sub-populasjon av mikrotubuli som ligger i nærheten av basalcelle cortex, og microtubule polymerisasjon og depolymerization kan be sett over tid (Animert figur 1). Ikke alle prøvene er mottagelig for bildebehandling med TIRF-SIM, spesielt med lav kontrast prøver uten diskrete strukturer. Celler som uttrykker cytosolisk GFP mangler høy informasjons oppløsning bortsett fra ved kantene av plasmamembranen (figur 5F, H og animert figur 2) og er derfor ikke optimal for TIRF-SIM avbildning som de oppnådde rekonstruksjoner er i det vesentlige TIRF bilder over hverandre med gjenstander. I slike prøver kan økningen i motsetning ofte tilskrives deconvolution trinn av algoritmen gjenoppbygging.

    Høy modulasjon kontrast er viktig for vellykket SIM bildebehandling. Fourier transform av det rekonstruerte bildet tillater visualisering av SIM optiske overføringsfunksjonen (OTF) (Figur 6A, innfelt). Uten å maksimere modulasjon kontrast for hver orientering ved å sikre Azimuth polariseringen med en polarisasjon rotator, er det svært liten modulasjon av høyoppløste informasjon i prøven fører til et lavt signal-til-støy-forholdet i SIM-passbåndene. Rekonstruksjon algoritmer som bruker standard Wiener filter tilnærming vil bare forsterke støy i SIM passbåndene og gi et bilde som er egentlig en standard TIRF bilde kledde med sekskantet (eller "honeycomb") ringing artefakter (Figur 6A, panel til høyre). En mulig forbedring kan være bruk av iterative 29,30 eller blindrekonstruksjonsalgoritmer 31,32 for å redusere disse gjenstandene avhengig av typen av prøven. Vi anbefaler bruk av ImageJ plugin SIMcheck å sjekke kvaliteten på SIM data før og etter ombygging 33.

    Figur 1
    Figur 1:. Oppsett av Multicolor TIRF-SIM Setup TIRF-SIM microscope består av tre hoveddeler, strålen generasjon enhet, mønsteret projeksjon enhet, og deteksjonsenheten. I strålen genererende enhet, blir tre forskjellige lasere på linje på den samme strålebanen via dikroiske speil (DM1 og DM2), og ledet gjennom fire optiske elementer for polarisering kontroll. Først, en polarisator (P) sikrer renheten av den lineære polarisasjonstilstanden til hver av laserstrålene. Følgende tre optiske elementer som er nødvendig for å dreie polarisasjonen på en rask og automatisert måte som beskrevet i detalj i teksten. Etterpå to objektiver (L1 og L2) i et teleskop-konfigurasjon utvide strålen for å samsvare med den aktive overflate av den romlig lysmodulator (SLM) og er diffraktert i tre beamlets av SLM største forventede binære gittermønster (eksempler er vist i fliser 1- 9). Polarisasjonstilstanden for belysningen lys i forhold til SLM mønster er vist som en pil. Et annet teleskop (L3 og L4) de-forstørrer mønster og tilbyr tilgang til the Fourier-planet til SLM mønster. I dette plan en romlig maske (SM) blir brukt til å filtrere ut den sentrale komponenten og andre uønskede komponenter diffraksjon fra den kornete struktur av SLM og dens interne ledninger. Før de to gjenværende bjelker er fokusert på ryggen fokusplanet av målet (OB) via kondensatoren objektivet (L5), er to dikroiske speil (dm3 og DM4) inkludert i oppsettet. DM4 fungerer som en konvensjonell dikroisk speil i fluorescens mikroskopi for å atskilt belysning fra utslipps lys. Men induserer dette speilet uunngåelig ellipticity i polarisering tilstand av belysning lys som kan kompenseres for ved DM3, en dichroic speil fra ideell samme parti som DM4. Oljeneddyppingsobjektivet TIRF objektiv har en stor nok NA til direkte å starte to seg motsatt utbredende bølger på dekkglass som reflekteres fullstendig og gi opphav til en strukturert flyktig felt i dekkglass. Prøven er montert på en xyz oversettelsestrinnet. Detection er performed gjennom samme objektiv og DM4 i overføring, pluss en ekstra filtrering av båndpassemisjonsfiltre, montert i en datastyrt filter hjul (EFW). Endelig er bildet projiseres på en sCMOS kamera med intern mikroskop tube linse (L6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Fig. 2: Innretting av overlappende bjelker (A) En SLM-gittermønster vindus med en sirkulær åpning er nyttig for innretting. Dersom to ikke-overlappende bjelker er synlige på kameraet (til venstre), deretter posisjonen til prøven flyet må omplasseres ved iterativt justere de aksiale posisjoner av objektiv og kamera for å gi en enkelt sirkulær belysning spot (til høyre). Bjelkene må overlappe in order for å frembringe sinusformet magnetisering mønsteret som kreves for TIRF-SIM. Dersom bjelkene ikke fullt ut overlapper dette reduserer synsfeltet over hvilke interferensmønsteret dannes. (B og C) Den nøyaktige innfallsvinkelen av strålene er viktig for TIRF-SIM. Hvis vinkelen er feil, vil en av bjelkene ikke være i den ønskede vinkel for TIRF og dette er lett synlig når avbildning av et fluorescerende fargestoff oppløsning. En bjelke har en innfallsvinkel som er større enn den kritiske vinkelen som gir den sirkulære sted, og den andre ikke gjør det, noe som fører til den lysende strek på den venstre side av bildet i (B). (D) Regulering av vinkelen på speilet DM3 sikrer begge bjelkene er hendelsen i samme vinkel, og dette kan valideres ved uskarp målet: Hvis riktig justert, bør xz projeksjon av en z stabel av et fluorescerende fargestoff prøven viser to symmetrisk kryssende bjelker med ubetydelig bakgrunn påfokusere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3:. Synkroniseringsavhengig av ulike systemkomponenter (A) For rask SIM oppkjøpet, er synkroniseringen av systemkomponenter ved hjelp av en maskinvarebasert løsning avgjørende. (B) En datainnsamlingskortet (DAQ) bør brukes som en mester trigger. En TTL signal fra DAQ styret sendes til sCMOS External Input og brukes til å utløse kameraet eksponeringen. Kameraet Global Exposure utgang deretter utløser SLM å vise et gitter mønster, og SLM LED Aktiver utgangen brukes til digitalt modulere laser eksitasjon slik at laseren er bare utslipp når SLM piksler er i "på". Etter eksponeringen er complete, er kameraet Global eksponering utgang anvendes for å fremme SLM mønster videre til den neste rist fase eller vinkel. Den DAQ styret utganger også en analog spenning til LCVR kontrolleren til å styre den lineære polarisering tilstand av belysning bjelke. Denne spenningen er slått etter oppkjøpet av de 3 fasebilder for hvert mønster vinkel. Etter oppkjøpet av 9 bilder for en enkelt bølgelengde, sender DAQ styret et signal til utslipp filter hjulet kontrolleren, og bytter til neste bølgelengde. Den DAQ styret gjelder også en z-offset til prøven ved å gi ut en analog spenning til z-scenen piezo-kontrolleren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4: TIRF-SIM Imaging av prøver på 100 nm Multi Perler og fluorescens-Labelled amyloidfibriler. (A og B) Sammenligning av standard TIRF sammenlignet med TIRF-SIM-rekonstruksjoner på 488 nm og 640 nm eksitasjon. (C) Histogram av full bredde halv maksimum (FWHM) av Gaussian passer til TIRF-SIM-perler som viser den forventede oppløsning forbedring. (D) versus TIRF TIRF-SIM av p-amyloid fibriller som er merket med 10% rhodamin-derivat fargestoff (488 nm eksitasjon). Skala barer = 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 5
    Fig. 5: Levende celle TIRF-SIM Imaging Sammenligning av konvensjonell TIRF og TIRF-SIM-bilder av (A, B) mikrotubuli (emGFP-tubulin) i en HEK293-celle, (C, D (E, F) cytosoliske GFP i en HEK293-celle. Bilder i B og F er enkelt tidspunkter fra filmene. Boxed områdene er vist forstørret i (G, H). Skala barer = 3 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6:. Influence of Polarization Rotator på rekonstruert Bead bilder (A) Uten bruk av en polarisasjon rotator slik som en LCVR, er lavt signal-til-støy-forholdet i en SIM-passbånd som resulterer i karakteristiske sekskantede artefakter i det rekonstruerte SIM bilder (til høyre), (B) i 2D-SIM, de strukturerte belysningsmønstre er direkte synlig i Fourier-transformasjonen av den rå-bilder (venstre, eksitasjon romlig frekvens markert) hvert som de faller innenfor radius av utslipps OTF støtte, men i TIRF-SIM, er de utenfor OTF støtte og derfor ikke synlige (til høyre). I dette tilfellet må mønsteret modulasjon kontrasten bli vurdert ved hjelp av en sparsom perle enkeltlag, som beskrevet i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 7
    Figur 7:. Spatial Lys Modulator Basert Pattern Generation Lar Gjennomføring av andre bildebehandlings modaliteter som multifokal SIM (A) I MSIM, et gitter av firkantet pointsdisplayed på SLM (innfelt) gir et gitter av diffraksjon begrenset foci i bildeplanet. Et tynt lag med lav konsentrasjon rodamin 6G avbildes til visua gående stabiliserer foci. Mønsteret er oversatt over prøven (B) og kjøpte rå bilde z-stack er rekonstruert for å generere et bilde med redusert ut av fokus lys (C). Skala barer = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Movie en ramme
    Animert Figur 1:. Time Series Movie av EmGFP-tubulin i en HEK293 Cell Rapid polymerisering og depolymerisering av emGFP merket mikrotubuli kan observeres ved hjelp TIRF-SIM. Bilder anskaffet ved hjelp 50 msek eksponeringstid per rå ramme (450 msek pr SIM ramme) plassert med jevne mellomrom på 0,5 sek. Eksponeringstid brukt var begrenset av lysstyrken av fluoroforen, og ikke av hastigheten på kameraet eller SLM. 3988movie1.mov "target =" _ blank "> Klikk her for å se denne videoen.

    Movie 2 Frame
    Animert Figur 2:. Time Series Movie av cytosoliske GFP i en HEK293 Cell Prøver med lav kontrast som dette er ikke ideelt prøver for TIRF-SIM bildebehandling. Retrograd membran strømning kan sees i TIRF bilder, men TIRF-SIM gir ikke noen ytterligere informasjon bortsett fra ved cellekantene. TIRF-SIM-bildene ble anskaffet ved hjelp 50 msek eksponeringstid per rå ramme (450 msek pr SIM ramme) plassert med jevne mellomrom av 5 sek. Klikk her for å se denne videoen.

    Supplemental File Kode: Eksempel SLM repertoar fil (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).d / 53988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_001.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_002.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_003.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental File Kode: Eksempel SLM repertoire fil (period9_004.bmp). Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_005.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_006.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_007.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_009.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_mask_1.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_mask_2.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen. >

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (period9_mask_3.bmp) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel SLM repertoar fil (TIRF-SIM_example.rep) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel rist generasjon kode (1 av 2) (generate_gratings.m) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental File Kode: Eksempel rist generasjon kode (2 av 2) (circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> Klikk her for å laste ned denne filen.

    Supplemental arkivkode. Eksempel kode for å beregne modulasjon kontrast (calculate_contrast.m) Klikk her for å laste ned denne filen.

    Discussion

    Spesialbygde TIRF-SIM-systemer som oppsettet beskrevet i denne protokollen er i stand til flerfarget super oppløsning bildebehandling i høy hastighet i forhold til kommersielt tilgjengelige mikroskoper. Den iboende fordel med SIM som en super-oppløsning teknikk er at den tidsoppløsningen ikke er begrenset av photophysics til fluoroforen, sammenlignet med andre metoder slik som enkelt molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) eller punkt skanning metoder slik som stimulert emisjon uttømming mikroskopi ( STED). I motsetning til disse andre teknikker, ikke SIM ikke krever photoswitchable eller depletable fluoroforer så flerfarget bildebehandling er grei. Ikke TIRF-SIM-systemer, for eksempel optisk seksjonering SIM og multifokal SIM kan vanligvis oppnå forbedringer av 1,7 ganger eller mindre oppløsning i praksis i motsetning til den faktor på to forbedring rapportert her, og kommersielle systemer er også ofte langsommere og mindre fleksibelt enn systemet presentert i denne protokollen.

    "> De to viktigste vanskeligheter med å gjennomføre denne teknikken er for det første nødvendigheten for nøyaktig posisjonering av de seks SIM bjelkene innenfor TIR sone av den tilsiktede rygg åpning, som krever en møysommelig og tidskrevende optiske innretningsprosedyre. For det andre, for å produsere høy mønster kontrast på prøven, er polarisering rotasjon avgjørende. for lave NA 2D-SIM-systemer, kan polarisering rotasjon unngås ved forsiktig valg av den lineære polarisering orientering, men dette blir umulig for TIRF-SIM 25. for høy hastighet flerfarget bildebehandling, elektro- optisk polarisasjon kontroll er nødvendig, og dette øker kompleksiteten og kostnadene av systemet.

    Begrensninger av teknikken

    TIRF-SIM, som konvensjonelt TIRF, er naturligvis begrenset til observasjon av biologiske strukturer og prosesser som ligger ved basalcellemembran som kan bli opplyst ved 150-200 nm penetrasjonsdybden av det svinnende felt. MensSIM-kortet er ofte sitert som mindre photodamaging til celler enn enten STED eller SMLM, betyr lateral oppløsning fordobling fortsatt øke det nødvendige antall fotoner med minst 4 ganger 5 sammenlignet med konvensjonelle TIRF mikroskopi. For bildebehandling ved høy bildefrekvens med korte eksponeringer ganger, nødvendiggjør dette foton økning bruk av økt belysning intensiteter. Mens noen fluorophore kan brukes for SIM avbildning av faste eller saktegående prøver, høy lysstyrke fluorescerende proteiner eller neste generasjons syntetiske fargestoffer med forbedret fotostabilitet er anbefalt for live celle bildebehandling.

    Selv om denne implementeringen er i stand til å avbilde en enkelt farge på SIM bildefrekvens på over 20 Hz, er flerfarget bildebehandling i fremlagt system begrenset av koplingstiden av den motoriserte utslipp filter hjulet. På grunn av den store størrelsen på sCMOS kamera brikken, ville bruk av et multibånd-utslipp filtrer og bildesplitte optikk være mulig og tillate samtidig jegmaging med flere bølgelengder på farts straff. En annen mulighet vil være å veksle de forskjellige eksitasjon lasere og bruke en multiband hakkfilter for å avvise eksitasjonslyset. Bruken av en binær ferroelektrisk SLM i denne utførelse er heller ikke optimal. Diffraksjonseffektiviteten av en slik SLM er meget lav, slik at mesteparten av det innfallende lys er i den nullte ordens refleksjon, som filtreres ut av den romlige masken. For applikasjoner som krever svært høy bildefrekvens, er bildehastigheten derfor begrenset av utgangseffekten av laserdioder. SLM introduserer også noen ellipticity i polarisering for bølgelengder unna 550 nm utformingen bølgelengde der pikslene ikke opererer som ideelle halvbølgeplater. Selv om dette kan kompenseres for ved hjelp av en ekstra LCVR, kan den ideelle løsningen være bruk av en digital mikro-speil-enhet (DMD) som en mønstergenerator.

    mulige endringer

    Oppsettet presented her er fleksibel og lettere modifisert enn kommersielle virkemidler slik at andre bildediagnostikk som for eksempel 3D-SIM, rask 2D-SIM, multifokal SIM (MSIM) og ikke-lineær SIM (NL-SIM) kan implementeres 21,34,35.

    2D-SIM kan være godt egnet for avbilding forholdsvis flat, raskt bevegelige strukturer, slik som omkrets endoplasmatiske retikulum. Den perifere ER ligger dypere inne i cellen enn det som kan bli opplyst ved bruk av en TIRF flyktig felt men på grunn av sin flate struktur kan avbildes ved hjelp av standard 2D-SIM med ubetydelig ut-av-fokus bakgrunn. I tillegg til bruken av forbedrede optiske snitterekonstruksjonsalgoritmer undertrykke ut-av-fokus lys utvide bruken av 2D-SIM til optisk tykke prøver, enskjønt der aksial oppløsning dobling er ikke nødvendig 21.

    I MSIM blir prøven opplyst av en sparsom gitter av eksitasjon foci 36. Dette modalitet kan implementeres ved å fjerne den romlige maske (SM) Og erstatte det med et polarisasjonsfilter. SLM fungerer nå som en amplitude modulator. De binære SIM-gitter som vises på SLM kan erstattes av en 2D gitter av flekker, med størrelsen av flekkene valgt å være lik størrelsen av en diffraksjon begrenset fokus i bildeplanet. I figur 7A er et gitter på 4 x 4 bildeelement kvadrater vist på SLM (innfelt) som når demagnified på prøven genererer diffraksjon begrenset foci av 150 x 150 nm, gitt den fysiske SLM pikselstørrelse på 13,62 um. Eksitasjon foci kan så oversettes ved å forskyve den gittermønsteret på SLM og dette gjentas flere ganger for å belyse hele synsfeltet. Bildene er kjøpt for hvert oversatt mønster posisjon og stack er post-behandlet for å gi et rekonstruert bilde med forbedret oppløsning på opptil en faktor på ligning og redusert ut av fokus lys sammenlignet med tilsvarende vidfelt bilde30. Dette modalitet kan være nyttig for avbildning tykke, tette prøver som standard SIM er uegnet, for eksempel lav kontrast strukturer som farget røde blodceller (figur 7C), selv om oppkjøpet tid er økt på grunn av det store antallet av rå rammer kreves per synsfelt (i dette tilfellet N = 168).

    Endelig kan oppsettet endres for å muliggjøre enten høy NA lineær TIRF-SIM eller mønstret aktivering ikke-lineær SIM (PA NL-SIM), som presenterte nylig av Li et al., Ved bruk av en ultrahøy 1,7 NA objektiv eller tillegg av en 405 nm fotoaktivering laser og forsiktig optimalisering av SLM gittermønster 35.

    fremtidige Applications

    SIM er fortsatt en rask utvikling teknikk og mange applikasjoner i biovitenskap vil bli aktivert i fremtiden. Hastigheten, oppløsning og kontrast forbedringer av teknikk og evnen til å bruke standard fluoroforer mean for det Bioimaging blir SIM satt til å erstatte konvensjonelle mange mikroskop systemer, for eksempel konfokale og brede feltplattformer. Kommersielle SIM-systemer er allerede tilgjengelig i dag med fremragende tekniske spesifikasjoner, men de er utenfor den økonomiske rekkevidden av mange forskningslaboratorier, og, viktigst, de er fleksible til å bli endret og utviklet for å implementere den nyeste forskningen utviklingen på feltet. De mangler også viktig evne til å "være tilrettelagt for forsøket på hånden", ofte en kritisk flaskehals i cutting edge life science forskning. Systemet er beskrevet her vil være spesielt godt egnet til å studere dynamiske prosesser nær celleoverflaten, for in vitro studier av rekonstituert bilags systemer, for å studere overflatekjemi i materialer og naturvitenskap, f.eks. 2D materialer, og mange andre programmer.

    Disclosures

    Acknowledgements

    Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Leverhulme Trust, Engineering og Fysisk Sciences Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] og Medical Research Council [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Vi takker E. Avezov og M. Lu for transfeksjon av LifeAct-GFP og cytosolic-GFP celler henholdsvis, og W. Chen for utarbeidelse av HEK293 kultur. Vi takker også K. O'Holleran for å få hjelp med utformingen av mikroskop, og L. Shao og R. Heintzmann for nyttige diskusjoner og forslag.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    488 nm laser Toptica iBeam SMART with digital modulation
    561 nm laser Coherent OBIS LS with digital modulation
    640 nm laser Cobolt MLD with digital modulation
    Long-pass dichroic mirrors  Thorlabs for combining excitation beams
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc From same batch as above, 25 x 25 mm
    1" square kinematic mount Edmund Optics 58-860
    Glan-Taylor calcite polarizers Thorlabs GT5-A For alignment of LCVR
    Glan-Taylor mount Thorlabs SM05PM5
    Achromatic half wave plate Thorlabs AHWP05M-600 400-800 nm
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M For HWP
    Liquid Crystal Variable Retarder Meadowlark Optics SWIFT Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
    LCVR controller Meadowlark Optics D3060HV Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
    Achromatic quarter wave plate Meadowlark Optics AQM-100-0545
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1P/M For QWP
    10 mm achromatic doublet Thorlabs AC080-010-A-ML For beam expander
    200 mm achromatic doublet Thorlabs AC254-200-A-ML For beam expander
    Cage XY Translators Thorlabs CXY1
    Ferroelectric spatial light modulator Forth Dimension Displays M0787-00249     SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board
    SLM mounting frame Forth Dimension Displays M0787-10014 Fixed to custom built aluminium mount
    Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount Thorlabs GM200/M For SLM mounting
    Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform Thorlabs XYR1/M For SLM mounting
    Rail carrier Newport M-PRC-3 For SLM mounting
    Precision Optical Rail Newport PRL-6 For SLM mounting
    300 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 273 322  f = 300 mm, 31.5 mm diameter
    140 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 239 322 f = 140 mm, 31.5 mm diameter
    Precision XY Translation Mounts Thorlabs LM2XY
    Lens Mounting Adapters Thorlabs SM2AD32 For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
    Translation stages Comar 12XT65 Dovetail, side drive
    XY Translator with Differential Drives Thorlabs ST1XY-D/M for spatial filter
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M for spatial filter
    300 mm achromatic doublet Thorlabs AC508-300-A-ML Excitation tube lens
    Automated XY stage with Z-piezo top plate ASI PZ-2150-XYFT-PZ-IX71  with MS-2000 controller
    Inverted microscope frame Olympus IX-71
    Objective lens Olympus UAPON100XOTIRF 100X/1.49NA
    High speed filter wheel Prior Scientific HF110A with Prior ProScan III controller
    Bandpass emission filters Semrock FF01-525/30, FF01-676/29
    sCMOS camera Hamamatsu ORCA Flash v4.0
    Stage top incubator OKO Lab H301-K-FRAME For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
    Stainless steel optical posts Thorlabs TR series for mounting optical components
    Post holders Thorlabs PH series for mounting optical components
    Kinematic mirror mounts Thorlabs KM100 for mounting 1" mirrors
    Shearing interferometer Thorlabs SI100
    100 nm fluorescent microspheres Life Technologies T-7279 Tetraspeck
    Rhodamine 6G Sigma Aldrich 83697-250MG
    8 well glass bottom dishes ibidi 80827 with #1.5 coverglass
    Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155409 with #1.5 coverglass
    0.01 mm microscope reticle slide EMS 68039-22
    CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher Scientific C10613

    References

    1. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).
    2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, (2), 82-87 (2000).
    3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (35), 13978-13983 (2012).
    4. Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophys. J. 101, (5), 1277-1284 (2011).
    5. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Mol. Cell. 58, (4), 644-659 (2015).
    6. Westphal, V., et al. Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement. Science. 320, (5873), 246-249 (2008).
    7. Davies, T., et al. CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation. PLOS Biol. 13, (4), e1002121 (2015).
    8. Laine, R. F., et al. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat. Commun. 6, 5980 (2015).
    9. Pinotsi, D., et al. Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy. Nano Lett. 14, (1), 339-345 (2014).
    10. Esbjörner, E. K., et al. Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation. Chem. Biol. 21, (6), 732-742 (2014).
    11. Michel, C. H., et al. Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology. J. Biol. Chem. 289, (2), 956-967 (2014).
    12. Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques. Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).
    13. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, (1), 141-145 (1981).
    14. Cragg, G. E., So, P. T. Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves. Opt. Lett. 25, (1), 46-48 (2000).
    15. Chung, E., Kim, D., So, P. T. Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy. Opt. Lett. 31, (7), 945 (2006).
    16. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6, (5), 339-342 (2009).
    17. Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (14), 5311-5315 (2012).
    18. Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks. Opt. Express. 21, (22), 26162-26173 (2013).
    19. Förster, R., et al. Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator. Opt. Express. 22, (17), 20663 (2014).
    20. Lu-Walther, H. W., et al. fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy. Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001 (2015).
    21. Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. High speed structured illumination microscopy in optically thick samples. Methods. (2015).
    22. von Olshausen, P. Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. University of Freiburg. (2012).
    23. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, (12), 4957-4970 (2008).
    24. Meadowlark Optics Inc. Basic Polarization Techniques and Devices. (2005).
    25. O'Holleran, K., Shaw, M. Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy. Opt. Lett. 37, (22), 4603 (2012).
    26. Brankner, S. Z., Hobson, M. Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf (2013).
    27. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, (12), 4957-4970 (2008).
    28. Wicker, K. Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space. Opt. Express. 21, (21), 24692 (2013).
    29. Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy. 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3, (1), 995-998 (2014).
    30. Ströhl, F., Kaminski, C. F. A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data. Methods Appl. Fluoresc. 3, (1), 014002 (2015).
    31. Mudry, E., et al. Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns. Nat. Photonics. 6, (5), 312-315 (2012).
    32. Ayuk, R., et al. Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm. Opt. Lett. 38, (22), 4723 (2013).
    33. Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Sci. Rep. 5, 15915 (2015).
    34. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
    35. Li, D., et al. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349, (6251), (2015).
    36. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter