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 JoVE Bioengineering

Un guide pour structuré Illumination FRBR Microscopie à haute vitesse avec plusieurs couleurs

1, 1, 1

1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge

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    Summary

    Cite this Article

    Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J. Vis. Exp. (111), e53988, doi:10.3791/53988 (2016).

    Abstract

    Optique imagerie super-résolution en microscopie d'éclairage structuré (SIM) est une technologie clé pour la visualisation des processus au niveau moléculaire dans le domaine des sciences biomédicales et chimiques. Bien que les systèmes SIM commerciaux sont disponibles, les systèmes qui sont conçus sur mesure dans le laboratoire peut surpasser les systèmes commerciaux, ce dernier généralement conçus pour une facilité d'utilisation et les applications générales, tant en termes d'imagerie fidélité et de la vitesse. Cet article présente un guide en profondeur à la construction d'un système qui utilise la carte SIM totale illumination réflexion interne (TIR) ​​et est capable de l'imagerie jusqu'à 10 Hz en trois couleurs à une résolution atteignant 100 nm. En raison de la combinaison de la carte SIM et la FRBR, le système offre un meilleur contraste de l'image que les technologies rivales. Pour atteindre ces spécifications, plusieurs éléments optiques sont utilisés pour permettre le contrôle automatisé sur la structure de l'état de polarisation et spatiale de la lumière d'éclairage pour toute excitation wav disponibleelengths. Tous les détails sur la mise en œuvre et le contrôle du matériel sont donnés pour réaliser la synchronisation entre la production de lumière d'excitation de motif, longueur d'onde, l'état de polarisation, et le contrôle de la caméra en mettant l'accent sur la réalisation de taux de trame maximale d'acquisition. Un protocole étape par étape pour l'alignement et l'étalonnage du système est présenté et l'amélioration de la résolution obtenue est validée sur des échantillons d'essai idéal. La capacité pour la vidéo à taux super-résolution imagerie est démontrée avec des cellules vivantes.

    Introduction

    Au cours de la dernière moitié d'une décennie, nanoscope a mûri et déplacé des laboratoires d'optique spécialisés dans les mains du biologiste. Solutions de microscope commerciales existent pour les trois principales variantes pour la réalisation optique super-résolution: seule la microscopie molécule de localisation (SMLM), stimulée microscopie émission d'épuisement (STED), et la microscopie illumination structurée (SIM) 1,2. SMLM telles que la microscopie photoactive de localisation (PALM) et la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) ont été les techniques les plus populaires, en grande partie en raison de la simplicité de la configuration optique et la promesse d'une résolution spatiale élevée, facilement jusqu'à 20 nm. Cependant nanoscope par localisation unique molécule est livré avec un compromis intrinsèque: la résolution spatiale atteignable dépend d' accumuler un nombre suffisant de localisations fluorophores individuels, ce qui limite donc la résolution temporelle. processus dynamique d'imageriees dans des cellules vivantes devient alors problématique car il faut échantillonner de façon adéquate le mouvement de la structure d'intérêt afin d'éviter des artéfacts de mouvement, tout en acquérant suffisamment d'événements de localisation en ce que le temps de reconstituer une image. Afin de répondre à ces exigences, en direct des démonstrations de SMLM cellulaire ont obtenu l'augmentation nécessaire des taux fluorophore de photocommutation en augmentant considérablement la puissance d'excitation, ce qui conduit à son tour à phototoxicité et le stress oxydatif, ce qui limite le temps de survie de l' échantillon et de la pertinence biologique 3.

    Un avantage évident de STED à la fois sur la carte SIM et SMLM est qu'il peut image avec super-résolution dans des échantillons d' épaisseur, par exemple la résolution latérale de l' ordre de 60 nm a été obtenue dans des tranches de cerveau organotypiques à des profondeurs allant jusqu'à 120 um 4. Imagerie à de telles profondeurs avec des implémentations objectifs uniques de SMLM ou SIM est irréalisable, mais devient possible avec soit la feuille de lumière seule molécule ou un treillis feuille de lumière microroscopie 5. Video taux STED a également été démontrée et utilisée pour cartographier la mobilité synaptique vésiculaire, bien que jusqu'à présent cela a été limité à l' imagerie de petits champs de vision 6.

    Pour les applications en biologie cellulaire et moléculaire des réactions auto-assemblage 7 - 12 qui nécessitent l' imagerie avec une résolution temporelle élevée sur de nombreux points de temps, la microscopie d'éclairage structuré (SIM) peut être bien adapté car il ne dépend pas des propriétés photophysiques d'un fluorescent particulier sonde. Malgré cet avantage inhérent de SIM, jusqu'à présent, son utilisation a été principalement confinée à l'imagerie des cellules fixes ou des processus lents. Ceci est dû aux limitations des systèmes SIM disponibles dans le commerce: le taux de trame d'acquisition de ces instruments est limitée par la vitesse de rotation des réseaux utilisés pour générer les modèles d'éclairage sinusoïdales requises ainsi que le maintien de la polarisation optique. La nouvelle génération de SIM commercialeinstruments sont capables d'imagerie rapide, mais ils sont trop coûteux à tous, mais les installations d'imagerie centrales.

    Ce protocole présente un guide pour la construction d'un système SIM souple pour imager des processus rapides dans des échantillons minces et à proximité de la surface de base des cellules vivantes. Elle emploie au total fluorescence à réflexion interne (FRBR) pour générer un modèle d'éclairage qui pénètre pas plus profond que d' environ 150 nm dans l'échantillon 13 qui réduit considérablement le signal hors focus fond. L'idée de combiner SIM avec FRBR est presque aussi ancienne que la carte SIM se 14 mais n'a pas été réalisé expérimentalement avant 2006 15. La premières images in vivo obtenus avec la FRBR-SIM ont été signalés en 2009 16 atteignant des taux de trame de 11 Hz pour visualiser tubuline et kinésine dynamique, et deux systèmes FRBR-SIM couleur ont été présentées 17,18. Plus récemment, un guide pour la construction et l'utilisation d'une seule couleur à deux faisceaux SIM système a été présenté avec cadre-débits allant jusqu'à 18 Hz 19,20.

    Le set-up présenté ici est capable de SIM super-résolution imagerie à 20 Hz en trois couleurs, dont deux peuvent être exploitées dans les FRBR-SIM. L' ensemble du système est construit autour d' un cadre de microscope inversé et utilise une table de translation xy z motorisé avec un étage piézo-actionné. Pour générer les modèles d'excitation sinusoïdale requis pour TIRF-SIM, le système proposé utilise un modulateur spatial de lumière ferroélectrique (SLM). motifs de réseau binaires sont affichés sur le SLM et les ± 1 ordres de diffraction résultant sont filtrés, relayées et concentrées dans l'anneau de TIR de l'objectif. Les déphasages et les rotations des grilles nécessaires sont appliqués en changeant l'image affichée SLM. Ce protocole décrit la façon de construire et d'aligner un tel trajet d'excitation, les détails de l'alignement du trajet d'émission, et présente des échantillons de test pour garantir un alignement optimal. Il a également dé scribes les enjeux et les défis particuliers à haute vitesse FRBR-SIM en matière de contrôle de polarisation et la synchronisation des composants.

    Considérations de conception et contraintes

    Avant de monter le système FRBR-SIM présenté dans ce protocole, il y a plusieurs contraintes de conception à considérer qui déterminent le choix des composants optiques. Toutes les abréviations des composants optiques se réfèrent à la figure 1.

    Lumière Modulator spatiale (SLM)

    Un ferroélectrique SLM binaire est utilisé dans cette configuration car il est capable de commutation de motif sous-milliseconde. MSL nématiques Grayscale peuvent être utilisées, mais elles offrent considérablement réduit les temps de commutation. Chaque sous ou hors tension pixel dans une phase binaire SLM va conférer soit une phase π ou 0 décalage au plan de front d'onde incident, donc si un motif de réseau périodique est affiché sur le SLM, il fonctionnera comme une diffraction de réseau de phase.

    ent "> réflexion interne totale (TIR)

    Pour y parvenir TIR et produire un champ évanescent, l'angle d'incidence des faisceaux d'excitation à l'interface verre-échantillon doit être supérieur à l'angle critique, Équation . Ceci définit l'angle minimum incident nécessaire, et donc aussi l'espacement maximal, ou de la période, du motif d'éclairage évanescent. L'angle d'incidence maximale Équation (L'angle d'acceptation) est limitée par l'ouverture numérique (NA) de l'objectif qui peut être calculé à partir de la définition Équation . Ceci permet de déterminer le motif d'espacement minimal réalisable d'après la formule d'Abbe Équation qui relie NA et longueur d'onde Équation à l'espacement de motif minimal (ie. L'anneau TIR) et dans lequel les foyers deux d'excitation doit être positionné de façon exacte et précise en rotation pour générer chaque configuration d'éclairage.

    Reconstruction d'images FRBR-SIM nécessite l'acquisition d'un minimum de trois décalages de phase par rotation de motif donc la période de motif SLM doit être divisible par 3 (voir la figure 1). Par exemple, une période de 9 pixels pour l'éclairage 488 nm et 12 640 nm pixels pour l'éclairage. Pour une discussion complète de conception de modèle de SLM, y compris l'optimisation sous-pixel de motif d'espacement en utilisant des réseaux cisaillées, Voir les travaux précédents de Kner et al. 16 et Lu-Walther et al. 20 La position des deux foyers d'excitation doit être à l' intérieur de l'anneau TIR pour toutes les longueurs d' onde, mais l'angle de diffraction des ± 1 ordres du SLM est la longueur d' onde dépendant. SIM standard pour l'imagerie multicolore peut être obtenue en optimisant la période de réseau la plus longue longueur d'onde, et de tolérer une perte de rendement pour les canaux plus courts. Pour FRBR-SIM cependant, l'optimisation pour une longueur d'onde signifie que les autres foyers de longueur d'onde plus dans l'anneau TIR sont. Par exemple, en utilisant une période de réseau de 9 pixels est suffisante pour fournir TIRF à 488 nm, comme les foyers sont à 95% du diamètre de l'ouverture arrière et à l'intérieur de l'anneau TIR, mais à 640 nm, cette période se positionner les foyers dehors l'ouverture. Pour cette raison, différents espacements de motif de pixels doivent être utilisées pour chaque longueur d'onde d'excitation.

    L'alignement du trajet d'excitation TIRF SIMest extrêmement sensible à de petits changements dans la position du miroir dichroïque (DM4 de la figure 1) dans le corps de microscope, beaucoup plus que dans la carte SIM classique. Utilisation d'un filtre rotatif cube tourelle est pas recommandé, au lieu d'utiliser un seul, multi-bande miroir dichroïque, qui est maintenu dans une position fixe et conçu spécifiquement pour les longueurs d'ondes d'excitation utilisées. Il est essentiel que seuls les miroirs dichroïques plus élevés de qualité sont utilisés. Ceux-ci exigent des substrats épais d'au moins 3 mm, et sont souvent désignés comme «plat d'imagerie" par les fabricants. Tous les autres substrats conduisent à l'aberration intolérable et la dégradation de l'image dans la FRBR-SIM.

    Contrôle de Polarisation

    Pour y parvenir TIRF-SIM , il est essentiel de faire tourner l'état de la lumière d'excitation de polarisation en synchronisme avec le motif d'illumination de telle sorte qu'il reste azimutal polarisé dans le plan de pupille de l' objectif par rapport à l'axe optique (c. -à-. s-polarisée). L' alignement de l'optique de commande de polarisation dépend de l'élément optique spécifique utilisé, par exemple une cellule de Pockels 21, ou d' une plaque demi-onde dans un étage motorisé de rotation 22. Dans ce protocole, une variable à cristaux liquides personnalisé ralentisseur (LCVR) est utilisé, conçu pour fournir pleine onde (2π) retardance sur la plage de longueur d'onde 640 nm à 488 car il permet rapidement (~ msec) commutation. Si l'on utilise un cristal Ralentisseur liquide, il est essentiel d'utiliser un composant de haute qualité: Les composants standards ne sont généralement pas suffisamment stables pour donner une retardance constante sur toute la longueur de la durée d'exposition de caméra qui conduit à un flou sur le motif d'éclairement lumineux et un faible contraste de modulation . retardateurs de cristaux liquides sont également fortement dépendante de la température et nécessitent construit dans le contrôle de la température.

    Synchronisation

    Les lasers doivent être synchronisés avec le SLM. MSL ferroélectriques binaires sont équilibrés en interne par switching entre un état et l'état bloqué. Les pixels agissent uniquement des plaques d'onde que la moitié soit dans leur état allumé ou éteint, mais pas pendant le temps de commutation inter. Par conséquent, les lasers ne doivent être allumés pendant on / off états via la LED Activer signal du SLM pour éviter une diminution du contraste du motif en raison de l'état intermédiaire des pixels. Un modulateur acousto-optique (AOM) pourrait aussi être utilisé comme un obturateur rapide si les lasers ne peuvent pas être modulés numériquement.

    Choix de lentilles

    Sur la base de ces contraintes, le démagnification requis du plan SLM sur le plan d'échantillon pour produire les modèles d'éclairage désirées peuvent être déterminées. Cela permet de calculer les longueurs focales des deux lentilles L3 et L4 dans le télescope de relais d'image et la lentille d'excitation du condenseur L5. Dans ce système a / 1.49NA immersion dans l'huile objectif 100X est utilisé avec 488 nm et 640 nm d'excitation, donc utilise des longueurs focales de 300 et 140 mmpour L4 et L3, et 300 mm pour L5, ce qui donne un total de démagnification 357x, ce qui équivaut à une taille de pixel de SLM 38 nm au niveau du plan de l'échantillon. Grâce à cette combinaison de lentilles SLM 9 périodes de réseau de diffraction à 488 nm éclairement et 12 pixels pour 640 nm donne des espacements de motif de 172 et 229 nm à l'échantillon, correspondant à des angles d'incidence de 70 ° et 67 °, respectivement. Pour une interface verre-eau, l'angle critique est de 61 °, et est indépendante de la longueur d'onde, par conséquent, ces deux espacements de motif permettent FRBR excitation pour les deux longueurs d'onde. Un objectif muni d'une bague de correction est utile pour la correction des aberrations sphériques introduites par les variations de l'épaisseur de la lamelle couvre-objet ou en cas de fonctionnement à 37 ° C.

    Reconstruction d'image

    Une fois que les données brutes SIM a été acquise est une question d'effort de calcul pour générer des images de super-résolue dans un processus en deux étapes. Tout d'abord, le modèle d'éclairage doit être déterminé pourchaque image et d' autre part, les composantes du spectre SIM doivent être séparés et recombinés de façon appropriée à doubler le soutien de la FTO efficace (voir Figure 6, empiècements).

    La connaissance précise des modèles d'éclairage projetés est primordiale, car les composantes de fréquence de super-résolus doivent être unmixed aussi précisément que possible pour éviter les artefacts causés par les parties résiduelles des composants qui se chevauchent. Nous déterminons le modèle d'éclairage paramètres a posteriori à partir des données d'image brute suivant la procédure introduite par Gustafsson et al. 23 En bref, un ensemble de paramètres d'éclairage qui décrit une sinusoïde à deux dimensions normalisées doit être trouvé pour chacun des Équation des motifs d'excitation Équation :

    Équation

    Par la présente Équation et Équation décrire le contraste des franges et le motif phase de démarrage de chaque image individuelle m respectivement. Les composantes du vecteur d'onde, Équation et Équation , Seulement changer avec des orientations différentes Équation du motif et peut être supposée par ailleurs constante. Pour déterminer grossièrement les composantes du vecteur d'onde d'une corrélation croisée des spectres d'image brute est réalisée, qui est raffiné en appliquant des changements de sous-pixels à l'une des images en coupe corrélées à optimiser le chevauchement. Cela se fait via la multiplication de l'espace réel gradients de phase Équation qui induisent un changement de sous-pixel dans frefré--espace. On notera qu'il est utile d'avoir une bonne estimation des vecteurs d'onde avant l'estimation de la configuration actuelle et ce qui peut être trouvé par l'imagerie d'une couche de billes fluorescentes.

    Comme l'étape de phase entre les modèles décalés est Équation , C. Équation La séparation des composants de fréquence peut être réalisée par une transformée de Fourier le long de l'axe "de phase". La phase globale Équation et le contraste des franges Équation peut ensuite être déterminée en utilisant une régression linéaire complexe de composants différents. Les différents composants séparés sont ensuite combinés à l'aide d'un filtre de Wiener généralisé. Pour une description détaillée des deux extraction de paramètres et de mise en œuvre du filtre de Wiener généralisé, nous renvoyons le lecteur à Gustafssonet al. , 23 où le même algorithme est utilisé.

    Protocol

    1. Organisation et alignement du chemin Excitation

    1. Marquez les positions des composants sur la table optique (voir la figure 1 pour un aperçu de la configuration optique). Séparer l'objectif, les lentilles L3, L4, L5 et le SLM chacune par la somme de leurs distances focales respectives telles que la surface de SLM sera relayée sur le plan focal de l'objectif.
    2. Insérer polygonal miroir dichroïque DM4 dans la tourelle filtre cubique du statif du microscope.
    3. Insérez la deuxième DM3 miroir dichroïque dans un «miroir cinétique carré 1 monter et positionner une longueur focale loin de la lentille de condenseur L5.
      Note: Cette conception de chemin d'excitation comporte deux miroirs dichroïque identiques DM3 et DM4 qui sont prises à partir du même lot de production pour garantir des propriétés optiques identiques. Le miroir dichroïque (DM4) est positionné de telle sorte que les axes s- et P- sont enclenchés par rapport à l'dichroïque situé dans le microscope (DM3), annulant ainsi touteellipticité de polarisation introduite par la biréfringence (figure 1). Cette compensation fonctionne aussi bien pour chaque longueur d'onde d'éclairage. Cette étape est essentielle pour maintenir un contraste élevé de modulation.
    4. Avant d'insérer les lentilles dans le trajet d'excitation, définir avec précision l'axe optique du système.
      1. Retirer l'objectif (OB) de la tourelle et visser à la place dans un outil d'alignement. Il est composé d'un long système de cages optique 500 mm avec deux disques d'alignement aux deux extrémités.
      2. Utiliser l'DM3 miroir dichroïque et d'un miroir d'alignement temporaire placé à l'emplacement approximatif de la suite du SLM pour diriger un faisceau de référence collimaté du laser 1 à travers le centre des trous dans les deux disques d'alignement. Diriger le faisceau de laser sur le miroir 1 temporaire comme cela est représenté sur la figure 1 en utilisant trois miroirs et miroir dichroïque MD2. Le miroir temporaire à la position du SLM doit être proche de la perpendiculaire à l'axe optique.
      3. Enlever l'outil d'alignement une fois que l'axe optique grossier a été determined.Insert un iris dans le trajet du faisceau avant qu'il ne pénètre dans le corps de microscope et le centrer sur la poutre. Attachez un morceau de carton blanc avec un petit trou centré sur la iris.Reinsert la lentille de l'objectif (OB).
        Remarque: Le faisceau quittant l'objectif sera désormais très divergentes, mais il y aura une réflexion très faible de la surface arrière de la lentille qui sera visible sur la carte blanche. Tous les objectifs, même si elles sont revêtues anti-reflet, auront de faibles réflexions arrière qui peuvent être utilisés pour assurer un alignement coaxial. Si le faisceau est exactement perpendiculaire à la lentille, puis la réflexion de retour ira à travers le centre de l'iris
      4. Faire des ajustements itératifs angulaires aux deux miroirs (DM3 et miroir d'alignement à la position du SLM) pour centrer la réflexion de retour surla carte avec le faisceau entrant. Retirez temporairement l'objectif (OB) et marquer le point laser sur le plafond pour créer une position de référence.
      5. Insérez une paire d'iris à la hauteur du faisceau de référence le long des trous filetés de la table. Le faisceau doit être parallèle à la surface de la table optique. L'axe optique est maintenant défini.
    5. Insérer la lentille de condenseur (L5) à peu près une longueur focale à une distance de l'objectif. Monter cet objectif sur un ensemble de platine de translation linéaire pour traduire le long de la direction du faisceau de référence.
    6. Ajustez la position de la lentille du condenseur et de l'angle de telle sorte que le faisceau quittant l'objectif est collimaté et atteint la place de référence sur le plafond. Vérifiez que la lentille est perpendiculaire à la poutre en vérifiant à nouveau le reflet de retour avec l'iris et carte blanche. Retirer l'objectif (OB) et insérer la seconde lentille du télescope image relais (L4).
      Remarque: Veiller à une bonne collimation et non-déviation de l'êtreh est facilitée quand il y a un nombre pair de lentilles dans le trajet du faisceau.
    7. Ajustez la position et l'angle de cet objectif en utilisant une étape de translation linéaire pour maintenir collimation et d'assurer le faisceau de référence frappe encore l'endroit marqué sur le plafond.
    8. Remplacer l'objectif (OB) et insérez la première lentille du télescope (L3). Régler la position et l'angle de cette lentille pour assurer la collimation et de non-déviation, comme décrit dans les étapes précédentes.
    9. Monter la puce SLM sur un cardan de montage qui assure une rotation sans translation autour du centre de la surface de la puce.
      Remarque: La conception de montage spécifique dépend du SLM utilisé. Si le SLM est livré sans support, il doit être fixé sur une plaque d'aluminium usiné sur mesure qui est ensuite fixé à une monture de cardan.
    10. Avec les lentilles alignées, insérez le SLM à la place du miroir. Ajuster la position du SLM de telle sorte que le faisceau de référence est située au centre de la puce SLM et une ajuster lagle de telle sorte que le faisceau passe à travers les deux lentilles relais (L3 et L4). Vérifiez que le faisceau de référence est toujours centrée sur l'endroit marqué.
    11. Développer et collimater le faisceau de référence en utilisant un élargisseur de faisceau Keplerian.
      1. Monter les deux lentilles (L1 et L2) dans un système de cage pour faciliter le réglage.
      2. Centre, le système de la cage sur le faisceau de référence en supprimant les lentilles et les remplacer par des iris.
      3. Insérer les deux lentilles et ajuster la position axiale de L2 à collimater le faisceau élargi à l'aide d'un interféromètre de cisaillement. L2 doit être une longueur focale à une distance de la surface du SLM.
      4. Vérifiez que le faisceau élargi est encore collimaté après les deux lentilles relais L3 et L4. Utilisez l'interféromètre de cisaillement juste après DM3 pour vérifier collimation.
    12. Une fois que le chemin d'excitation a été alignée à une seule longueur d'onde, coupler les deux autres lasers dans le trajet du faisceau. Diriger chaque faisceau à travers deux iris centré sur le trajet d'excitation avecmiroirs de faisceau combinant dichroïques (DM1 et DM2).

    2. Alignement de Polarisation Rotator

    1. Monter le LCVR avec son axe rapide à 45 ° par rapport à la polarisation incidente.
    2. angle de polarisation air fine du faisceau incident à la LCVR en utilisant une plaque demi-onde achromatique (HWP) en insérant le PLR ​​et le LCVR entre polariseurs croisés. Tourner le HWP pour minimiser la puissance transmise.
      Remarque: Afin d'agir en tant que dispositif de rotation de polarisation variables, l'axe rapide du retardateur à cristaux liquides (LCVR) doit être aligné avec précision à 45 ° par rapport à la verticale incidente de polarisation du faisceau. Le LCVR est physiquement monté à 45 °, mais cela est seulement un alignement grossier. Le PLR ​​est utilisé pour assurer un alignement parfait de 45 ° de la polarisation incidente par rapport à l'axe rapide de LCVR. La plaque quart d'onde (QWP) convertit la polarisation elliptique inclinée induite par la LCVR retour à polarisation linéaire à un angle contrôlé par la tension appliquée24.
    3. Insérez le QWP après la LCVR et le faire pivoter pour aligner son axe lent à la polarisation entrant en minimisant la puissance transmise entre les polariseurs croisés.

    3. Alignement de la voie d'émission

    1. positionner grossièrement la caméra en utilisant une lame de micromètre et de la lumière transmise.
      1. Focus sur le réticule en utilisant les oculaires du microscope et de fixer l'objectif à cette position.
      2. Environ centrer la caméra et déplacer la position de la caméra pour amener l'image du réticule au point en observant l'image sur l'écran.
        Remarque: Si une roue de filtre externe est utilisé, alors le cube de filtre ne contiendra pas un filtre d'émission, donc les oculaires ne doivent pas être utilisés lorsque les lasers sont allumés.
    2. ajuster finement la position de la caméra en utilisant un échantillon de billes fluorescent.
      1. Préparer une monocouche de billes fluorescentes en étalant une goutte de 100 perles multicolores nm sur une lamelle # 1.5. Laisser dry pour adsorber les perles à la lamelle et puis re-plonger dans l'eau.
      2. Placer l'échantillon de perle sur l'objectif avec de l'huile d'immersion. ajuster finement la position de l'appareil de telle sorte que la couche de bille fluorescente est mise au point. Ne pas régler la position de l'objectif, une fois la mise au point a été trouvé.
        Remarque: Comme le SLM doit être dans un plan conjugué au plan de l'échantillon, la position du SLM, le relais des lentilles, et l'objectif doit être fixé. Pour régler la mise au point, déplacer l'échantillon axialement au lieu de l'objectif en utilisant un piezo z-scène.
    3. Générer les SIM des motifs de réseaux binaires appropriés en tant que fichiers bitmap.
      1. Pour 2D / FRBR-SIM, générer une série de 9 images caillebotis binaires: orientations 3 de motif chacun avec 3 déphasages également espacés. Générer ces numériquement (en utilisant MATLAB par exemple) à partir d'une sinusoïde 2D tournée avec un décalage de phase appliqué, puis seuillage pour produire une image binaire. Voir Fichiers de code supplémentaire pour le code exemple.
      2. Pour alignment fins, génèrent également des motifs de réseau qui ont été divisés en fenêtres par une petite ouverture circulaire pour chacune des 3 orientations, comme le montre la figure 2. Les grilles d'alignement fenêtrés ne doivent pas être à l' extérieur déclenché , mais peut être commuté manuellement par l'utilisateur via le le logiciel de SLM.
        Note: Voir les références pour une discussion sur les angles de rotation optimale et un exemple de motif de réseau code de génération 16,20.
    4. Téléchargez les images bitmap au SLM en utilisant le logiciel du fabricant (par exemple MetroCon).
      1. Chargez le logiciel de contrôle de SLM et cliquez sur "Connect".
      2. Dans l'onglet "Repertoire", cliquez sur "Load" pour ouvrir le fichier de répertoire et vérifier le nombre de commandes contenues dans le fichier en cours. Dans le fichier exemple du répertoire donné, il y a cinq ordres de course.
      3. Cliquez sur "Envoyer à carte" pour télécharger le fichier du répertoire du SLM.
      4. Attendez que les images bitmap pour charger unend pour le périphérique à redémarrer automatiquement.
        Remarque: Un fichier de répertoire exemple, qui contient des images bitmap de réseau et un fichier définissant l'ordre, est inclus dans un fichier de code supplémentaire. Le fichier ".repz" peut être ouvert en utilisant le logiciel archiveur de fichier ZIP.
    5. Afficher une grille d'alignement fenêtré sur le SLM pour la première orientation (par exemple, 0 °).
      1. Dans le logiciel de contrôle de SLM, sélectionnez l'onglet "Etat", entrez le numéro de l'ordre de marche (dans le cas du fichier exemple, ceci est en ordre de marche "1").
      2. Cliquez sur "Sélectionner" pour changer l'ordre de marche à la grille d'alignement.
        Note: Ceci éclairer une petite région circulaire dans le plan de l'échantillon. Si la surface du SLM est correctement conjugué au plan d'échantillon, puis les bords de cette région seront fortement au point. Le motif de réseau va produire plusieurs ordres de diffraction au foyer de L3: l'ordre zéro de réflexion du fond de panier reflète laSLM, -1 et +1 commandes correspondant à la grille, ainsi que les plus faibles des ordres plus élevés qui résultent de diffraction d'éléments internes propres au dispositif SLM (par ex. Des réflexions des câblages internes des pixels de SLM et des irrégularités au niveau des bords de pixels) . Tous mais les -1 et +1 commandes doivent être filtrés.
    6. Insérer un masque spatial (SM) monté dans un x, le stade de y dans le trajet du faisceau à la position focale de L3, et de traduire sa position par rapport à l'axe optique de telle sorte que seules les premières commandes désirées sont passées. Directement après le filtre spatial, seuls deux faisceaux circulaires seront visibles.
      Remarque: Le masque spatiale est fabriqué par poinçonnage 6 trous dans une feuille d'aluminium à l'aide d'une aiguille. Les trous doivent être suffisamment grands pour passer les premiers faisceaux de commande pour toutes les longueurs d'onde laser. Une analyse détaillée du masque spatiale est donnée en référence 20.
    7. Afficher la prochaine orientation de la grille d'alignement (60 °, ordre de marche 2) et encoreveiller à ce que seules les premières commandes sont loués à travers le masque spatial, en ajustant sa position si nécessaire.
    8. Répétez l'opération pour l'orientation finale (120 °, ordre de marche 3).
    9. Vérifiez l'image de la couche de billes fluorescent sur l'appareil photo. Si les deux faisceaux circulaires ne se chevauchent pas comme cela est représenté sur la figure 2 , puis repositionner le plan d'échantillon en ajustant de manière itérative la position de la lentille et la caméra objectif.
    10. Ajustez la position objective pour chevaucher les deux faisceaux qui apporteront l'image de mise au point. Repositionner la caméra pour ramener l'image au point et d'affiner l'objectif dans le cas de deux cercles sont encore visibles. Répétez ce processus jusqu'à ce que les deux faisceaux se chevauchent et une seule région circulaire est mise au point.
    11. Une fois la position du plan de l'échantillon a été fixé, garder la position objectif fixé.
    12. Pour confirmer l'éclairage de la FRBR, l'image d'une solution de colorant fluorescent, par exemple pour une longueur d'onde d'excitation 488 nm, utiliser une solution de 1081; M rhodamine 6G.
      1. Amener l'échantillon de colorant dans le foyer. Si les deux faisceaux sont incidents à l'angle de la FRBR correcte, alors les molécules simples seront visibles sans bruit de fond élevé, et les bords de l'ouverture circulaire sera mise au point. Voir Figure 2B-D pour des exemples de faisceaux FRBR alignés et désalignés.
      2. Afficher chaque orientation des grilles fenêtrés à son tour, et faire en sorte que tous les trois orientations fournissent un éclairage TIRF et que les deux faisceaux se chevauchent au niveau du plan de l'échantillon. Un réglage fin de la position des poutres peut être faite par ajustement de miroir dichroïque DM3.
        Remarque: Bien que différentes longueurs d'onde sont centrées sur des positions légèrement différentes en raison de l'aberration chromatique axiale, ce ne soit pas critique et peut être corrigée en appliquant une constante z décalage à la position de l'échantillon avant l'excitation de la seconde longueur d'onde.

    4. Synchronisation du système et d'étalonnage

    1. Placer le cordon de monocoucheample sur l'objectif et mettre au point.
    2. Programmer le SLM en utilisant son logiciel de commande pour afficher chacune des images de décalage 3 phases, à son tour, pour la première orientation de motif (0 °).
      1. Utilisation du logiciel de commande SLM, passez en ordre de marche 4 de l'exemple du répertoire.
      2. Configurer la caméra en utilisant son logiciel d'acquisition (par exemple HCImage) à la sortie deux signaux: l'un positif et un signal négatif TTL de déclenchement pendant la période d'exposition globale. Dans le logiciel de la caméra, sous la rubrique «avancée Propriétés caméra", réglez Sortie Trigger Type 1 et 2 pour "Exposition", et sortie Trigger Polarité 1 et 2 à "positive" et "négative", respectivement.
      3. Connecter les sorties 1 et 2 de l'appareil photo à la "Trigger" et entrées "Terminer" du SLM respectivement, en utilisant des câbles coaxiaux. Le SLM est maintenant synchronisé à la caméra.
    3. Acquérir une série de 3 images.
      1. Dans le volet "Séquence", sélectionnez &# 34; Hard Disk Record "comme type de balayage, et définir le nombre d'images à 3.
      2. Cliquez sur "Démarrer" pour acquérir 3 cadres. Le motif de SLM va changer lors de chaque exposition. Les billes fluorescentes dans l'image apparaîtront à clignoter sur et en dehors entre chacune des 3 images. La quantité de clignotement est une lecture sur le contraste de la modulation du motif d'illumination sinusoïdale.
    4. Faire tourner la polarisation du laser d'excitation à la LCVR en utilisant un logiciel personnalisé afin d'obtenir une polarisation azimutale et donc le contraste de modulation la plus élevée pour l'orientation du motif donné.
      1. Chargez le logiciel d'étalonnage de LCVR.
      2. Entrez 0 et 8 pour respectivement le minimum et maximum de tension.
      3. Cliquez sur "Balayer LCVR Voltage" pour faire tourner la polarisation.
        Remarque: Le retardateur de LCVR est fonction de la température et peut dériver au jour le jour même avec contrôle de la température. Dans cette étape, la polarisation azimutale optimale est trouvée de façon empirique par Sweeping de la tension appliquée entre sa tension minimale et maximale qui a pour effet de faire tourner la polarisation incidente sur l'échantillon. Le contraste de modulation est calculée pour chaque tension 25 et la tension de crête qui permet d' obtenir le contraste est utilisé dans les étapes suivantes.
      4. Attendez que le processus d'étalonnage pour terminer, et notez la tension mesurée.
    5. Répéter ce processus d'étalonnage pour les deux orientations restantes de motif (60 ° et 120 °) et chacune des longueurs d'onde d'excitation.
    6. Synchronisez l'exposition de la caméra avec le LCVR, les lasers, les émissions roue de filtre et piezo z-étape 26. Pour ce faire , utilisez une carte d' acquisition de données à grande vitesse (DAQ) comme source d'horloge maître pour le système, et l' utilisation de la SLM LED Activer signal de sortie pour moduler les lasers (voir la figure 3B).
      Remarque: La mise en œuvre spécifique dépend des composants utilisés, mais l'utilisation d'une carte DAQ haute vitesse pour tri numériquela synchronisation et le contrôle du LCVR en utilisant une tension analogique, contrôlé par le logiciel gger, est recommandé. Le logiciel de contrôle utilisé dans ce protocole est disponible sur demande.
    7. En raison de l'aberration chromatique axiale, pour chaque longueur d'onde, appliquer aussi un décalage z à l'étage d'échantillon.
      1. Déterminer le décalage expérimentalement en se concentrant sur ​​un échantillon de monocouche multicolore de perles à la première longueur d' onde (par exemple. 488 nm) , puis de passer à la seconde (p. 640 nm). Les billes seront désormais hors foyer.
      2. Recentrer les perles et mesurer le changement de position z qui était nécessaire. Ce décalage peut alors être appliquée à l'élément piézo-z étape à chaque fois que la longueur d'onde d'excitation est changée.
    8. Utilisation du logiciel de contrôle de SLM, passer l'ordre de marche SLM à la pleine série de 9 images binaires de réseau nécessaires à la FRBR-SIM. Ceci est en ordre de marche 0 dans l'exemple répertoire.
    9. Utilisation du logiciel de contrôle de la caméra, acquérir 9 images de l'échantillon de perles. Dans la "séquence" volet du logiciel de la caméra, sélectionnez "Disque dur enregistrement" comme type de balayage, et de modifier le nombre d'images à 9.
    10. Cliquez sur "Démarrer" pour acquérir des images.
    11. Enregistrez les images acquises sous forme de fichiers TIFF en sélectionnant «TIFF» comme le type d'image dans le "Enregistrer Buffered Images" fenêtre, et en cliquant sur OK.
  • Reconstruire une image de super-résolution des images TIFF brutes en utilisant un logiciel commercial ou personnalisé pour valider l'amélioration de la résolution sur la FRBR standard.
    Note: Pour notre microscope , nous utilisons le code de reconstruction personnalisé développé à la fois en interne et par le Dr Lin Shao 27.
  • Representative Results

    Diamètre de 100nm Multicolor billes fluorescentes ont été imagées pour comparer FRBR standard pour FRBR-SIM et de quantifier l'amélioration réalisable dans la résolution latérale (Figure 4A - B). Reconstruction d'images brutes en images de super-résolution a été réalisée en utilisant des algorithmes standards tel que décrit dans la littérature 27,28. Il peut être vu que la FRBR-SIM a clairement significativement plus élevée par rapport à la résolution latérale FRBR. La fonction d'étalement de point (PSF) d'un microscope est bien approchée par l'image d'un seul sous-diffraction taille bille fluorescente, donc la PSF et la résolution peut être quantifiée en ajustant les fonctions 2D gaussiennes à des billes individuelles pour chaque longueur d'onde. La résolution du microscope estimée sur la base de la valeur moyenne de la moitié du maximum de grande largeur (FWHM) est de 89 nm et 116 nm pour 488 et 640 nm TIRF SIM respectivement (figure 4C). Ceci correspond à une double amélioDépla dans la résolution latérale pour les deux longueurs d'onde par rapport à la diffraction cas limitée théorique. Fibrilles amyloïdes marqués par fluorescence sont également un excellent échantillon de test pour démontrer la résolution doublé (figure 4D). Fibrilles amyloïdes ont été formés in vitro en incubant β-amyloïde marqué avec 10% de colorants dérivés de rhodamine (488 nm d'excitation) pendant 1 semaine et imagerie ensuite avec FRBR-SIM. Voir la référence 12 pour plus d' informations.

    Structures subcellulaires avec un contraste élevé tels que emGFP étiquetés microtubules (figure 5B, G) ou LifeAct-GFP (Figure 5D) sont idéales pour l' imagerie TIRF-SIM et le rendement contraste élevé des images super-résolution. l'imagerie TIRF-SIM à l'aide de la configuration détaillée dans ce protocole permet l'observation d'une sous-population de microtubules situés au voisinage du cortex basocellulaire, et la polymérisation des microtubules et dépolymérisation peut be vu au fil du temps (animée Figure 1). tous les échantillons ne se prêtent pas à l'imagerie avec la FRBR-SIM, en particulier, des échantillons de faible contraste sans structures discrètes. Les cellules exprimant GFP cytosolique manquent d' informations à haute résolution à part sur ​​les bords de la membrane plasmique (Figure 5F, H et Figure animée 2) et sont donc sous-optimale pour l' imagerie TIRF-SIM comme les reconstructions qui en résultent sont des images essentiellement FRBR superposées avec des artefacts. Dans ces échantillons, l'augmentation du contraste peut souvent être attribuée à l'étape de déconvolution de l'algorithme de reconstruction.

    Contraste élevé de modulation est essentiel pour l'imagerie SIM réussie. La transformée de Fourier de l'image reconstruite permet la visualisation de la fonction de transfert optique SIM (OTF) (figure 6A, encart). Sans maximiser le contraste de modulation pour chaque orientation en assurant azimutale polairesation avec un rotateur de polarisation, il y a très peu de modulation des informations à haute résolution dans l'échantillon conduisant à un faible rapport signal-bruit dans les bandes passantes SIM. Algorithmes de reconstruction qui utilisent l'approche standard du filtre Wiener vont simplement amplifier le bruit dans les bandes passantes SIM et donnent une image qui est essentiellement une image standard de la FRBR recouverte par hexagonale (ou «nid d' abeille») bourdonnements artefacts (figure 6A, panneau de droite). Une amélioration possible pourrait être l'utilisation d'itération 29,30 ou borgnes 31,32 algorithmes de reconstruction pour réduire ces objets en fonction du type d'échantillon. Nous recommandons l'utilisation du plug - in ImageJ SIMcheck pour vérifier la qualité des données SIM avant et après la reconstruction 33.

    Figure 1
    Figure 1:. Disposition de la configuration Multicolor FRBR-SIM La FRBR-SIM microscope se compose de trois parties principales, l'unité de génération de faisceau, l'unité de projection de motif et l'unité de détection. Dans l'unité de génération de faisceau, trois lasers différents sont alignés sur le même trajet de faisceau par l'intermédiaire de miroirs dichroïques (DM1 et DM2) et réalisé au moyen de quatre éléments optiques pour le contrôle de la polarisation. Tout d'abord, un polariseur (P) assure la pureté de l'état de polarisation linéaire de chacun des faisceaux laser. Les trois éléments optiques suivants sont nécessaires pour faire tourner la polarisation d'une manière rapide et automatisé, comme décrit en détail dans le texte. Par la suite, deux lentilles (L1 et L2) dans une configuration télescopique élargir le faisceau en fonction de la surface active du modulateur spatial de lumière (SLM) et sont diffractés en trois sous-faisceaux par projection des motifs de réseaux binaires du SLM (des exemples sont illustrés dans les carreaux 1- 9). L'état de la lumière d'éclairage par rapport au motif SLM de polarisation est représentée comme une flèche. Un second télescope (L3 et L4) de-magnifie le modèle et offre un accès à the plan de Fourier du motif de SLM. Dans ce plan un masque spatial (SM) est utilisé pour filtrer le composant central et d'autres composants de diffraction indésirables de la structure pixellisée du SLM et son câblage interne. Avant que les deux poutres restantes sont focalisés sur le plan focal arrière de l'objectif (OB) via la lentille de condenseur (L5), deux miroirs dichroïques (DM3 et DM4) sont inclus dans la configuration. DM4 agit comme un miroir dichroïque classique dans la microscopie par fluorescence à un éclairage séparé de la lumière d'émission. Cependant, ce miroir induit inévitablement ellipticité dans l'état de la lumière d'éclairage qui peut être compensée par DM3, un miroir dichroïque de idéalement du même lot que DM4 polarisation. L'objectif TIRF d'immersion dans l'huile a une assez grande NA pour lancer directement deux ondes contra-propagatives sur la lamelle couvre-objet qui sont totalement réfléchie et donnent naissance à un champ évanescent structuré dans la lamelle. L'échantillon est monté sur une platine de translation xyz. La détection est perfORMED à travers l'objectif et même DM4 dans la transmission, plus un filtrage supplémentaire par des filtres passe-bande d'émission, monté dans une roue de filtre contrôlé par ordinateur (EFW). Enfin, l'image est projetée sur une caméra sCMOS par le microscope interne lentille de tube (L6). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2:. Alignement des Chevauchement Beams (A) Un motif de réseau SLM fenêtré avec une ouverture circulaire est utile pour l' alignement. Si deux faisceaux non chevauchantes sont visibles sur l'appareil photo (à gauche), la position du plan d'échantillonnage doit être repositionné en ajustant de manière itérative les positions axiales de l'objectif et la caméra pour donner un point d'illumination circulaire unique (à droite). Les poutres doivent se chevaucher dans order pour produire le motif d'excitation sinusoïdale requise pour TIRF-SIM. Si les faisceaux ne se chevauchent pas complètement ce qui réduit le champ de vision sur laquelle le motif d'interférence est formé. (B et C) L'angle précis de l' incidence des faisceaux est important pour la FRBR-SIM. Si l'angle est incorrect, un des faisceaux ne sera pas à l'angle nécessaire pour la FRBR et cela est facilement visible lorsque l'image d'une solution de colorant fluorescent. Un faisceau a un angle d'incidence supérieur à l'angle critique qui donne la tache circulaire, et l'autre ne le fait pas, ce qui conduit à la série lumineuse sur la gauche de l'image (B). (D) Réglage de l'angle du miroir DM3 assure les deux faisceaux sont incidents au même angle, et cela peut être validé par défocalisation l'objectif: si elle est correctement aligné, la projection de xz d'un z pile d'un échantillon de colorant fluorescent devrait montrer deux croisant symétriquement poutres avec un fond négligeable aumise au point. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3:. Synchronisation Dépendances des composants de système différent (liste A) Pour l' acquisition SIM rapide, la synchronisation des composants du système en utilisant une solution basée sur le matériel est essentiel. (B) Une carte d'acquisition de données (DAQ) devrait être utilisé comme un maître déclencheur. Un signal TTL de la carte DAQ est envoyée à l'entrée externe sCMOS et utilisé pour déclencher l'exposition de la caméra. La production mondiale d'exposition de l'appareil photo déclenche alors le SLM pour afficher un motif de réseau, et le SLM LED Sortie de validation est utilisé pour moduler numériquement l'excitation laser de telle sorte que le laser est seulement émet lorsque les pixels SLM sont en état "marche". Après l'exposition est complete, la production mondiale d'exposition de l'appareil est utilisé pour faire avancer le motif de SLM à la prochaine phase de réseau ou de l'angle. La carte DAQ émet également une tension analogique au contrôleur LCVR pour contrôler l'état de polarisation linéaire du faisceau d'éclairage. Cette tension est commutée après l'acquisition des images de phase 3 pour chaque angle de motif. Après l'acquisition de 9 images pour une seule longueur d'onde, la carte DAQ émet un signal vers le contrôleur de roue de filtre d'émission, et passe à la prochaine longueur d'onde. La carte DAQ applique également un z-offset à l'échantillon en délivrant une tension analogique au contrôleur piézo z-étape. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4: FRBR-SIM Imaging d'échantillons de test de 100 nm Perles Multicolor et fluorescence Labelled amyloïdes fibrilles. (A et B) Comparaison de la norme FRBR par rapport aux reconstructions FRBR-SIM pour 488 nm et 640 nm d' excitation. (C) Histogramme de la moitié du maximum de pleine largeur (FWHM) de Gauss correspond aux billes FRBR-SIM montrant l'amélioration de la résolution attendue. (D) par rapport FRBR FRBR-SIM de fibrilles ß-amyloïde marqués avec 10% rhodamine colorant dérivé (488 nm d'excitation). Barres d'échelle = 1 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5:. Live Cell FRBR-SIM Imaging Comparaison des FRBR conventionnelle et FRBR-SIM images de (A, B) microtubules (emGFP-tubuline) dans une cellule HEK293, (C, D (E, F) cytosolique GFP dans une cellule HEK293. Images B et F sont des points de temps simples des films. Zones encadrées sont montrées amplifiées dans (G, H). Barres d'échelle = 3 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 6
    Figure 6:. Influence du rotateur de polarisation sur les perles Reconstructed d' images (A) sans l'utilisation d'un dispositif de rotation de polarisation tel qu'un LCVR, le rapport signal sur bruit dans les bandes passantes SIM est faible , ce qui conduit à des artefacts hexagonaux caractéristiques de la carte SIM reconstruit images ( à droite), (B) en 2D-SIM, les modèles d'éclairage structurés sont directement visibles dans le Fouriertransformer des images brutes (gauche, fréquence d'excitation spatiale mis en évidence), car ils entrent dans le rayon du support d'émission de la FTO, mais dans la FRBR-SIM, ils sont en dehors de l'appui de la FTO et donc pas visible (à droite). Dans ce cas, le motif de modulation de contraste doit être évaluée à l' aide d' un cordon monocouche clairsemée, comme indiqué dans le protocole. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 7
    Figure 7:. Modulateur spatial de lumière Motif Basé génération Permet la mise en œuvre d'autres modalités d'imagerie telles que multifocale SIM (A) Dans MSIM, un treillis de carrés pointsdisplayed sur le SLM (encadré) donne un réseau de diffraction des foyers limités au plan de l' image. Une mince couche de faible concentration rhodamine 6G est imagée à visua Lize les foyers. Le motif est traduit à travers l'échantillon (B) et l'image brute z-stack acquise est reconstruit pour générer une image réduite hors-focus lumière (C). Barres d'échelle = 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Film 1 Cadre
    Figure animée 1:. Time Series Film de EmGFP-tubuline dans une cellule HEK293 polymérisation rapide et dépolymérisation de emGFP marqué microtubules peuvent être observées en utilisant FRBR-SIM. Images acquises en utilisant 50 fois msec d'exposition par image brute (450 msec par image SIM) à des intervalles de 0,5 sec. Le temps d'exposition utilisée est limitée par la luminosité du fluorophore, et non par la vitesse de la caméra ou SLM. 3988movie1.mov "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

    Movie 2 Cadre
    Figure animée 2:. Time Series Film de cytosolique de la GFP dans une cellule HEK293 échantillons avec un faible contraste tels que ce ne sont pas des échantillons idéales pour l' imagerie TIRF-SIM. écoulement de la membrane Retrograde peut être vu dans les images TIRF mais FRBR-SIM ne fournit aucune information supplémentaire à part sur les bords de la cellule. Images FRBR-SIM ont été acquises à l' aide de 50 temps d'exposition msec par trame brute (450 msec par image SIM) à des intervalles de 5 secondes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

    Fichier de code supplémentaire: fichier de répertoire Exemple SLM (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).d / 53988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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    Fichier de code supplémentaire. Exemple SLM fichier répertoire (FRBR-SIM_example.rep) S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

    Fichier de code supplémentaire. Exemple code de génération de réseau (1 de 2) (de generate_gratings.m) S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

    Fichier de code supplémentaire: Exemple de code réseau de génération (2 de 2) (de circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

    Fichier de code supplémentaire. Exemple de code pour calculer la modulation contraste (calculate_contrast.m) S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

    Discussion

    systèmes FRBR-SIM construits sur mesure tels que la configuration détaillée dans ce protocole sont capables de multicolor super-résolution d'imagerie à grande vitesse par rapport aux microscopes disponibles dans le commerce. L'avantage inhérent à la carte SIM en tant que technique de super-résolution que la résolution temporelle ne soit pas limitée par la photophysique du fluorophore, par rapport à d'autres méthodes telles que la microscopie de molécule unique de localisation (SMLM) ou des méthodes de balayage de points, tels que la microscopie à déplétion d'émission stimulée ( STED). Contrairement à ces autres techniques, SIM ne nécessite pas fluorophores photoswitchable ou épuisables donc imagerie multicolore est simple. Les systèmes non TIRF-SIM, comme optique de sectionnement SIM et multifocale SIM peut généralement obtenir des améliorations de la résolution de 1,7 fois ou moins, dans la pratique, par opposition au facteur de 2 amélioration rapportée ici, et les systèmes commerciaux sont souvent plus lent et moins souple que le système présenté dans ce protocole.

    "> Les deux principales difficultés dans la mise en œuvre de cette technique sont d'une part la nécessité d'un positionnement précis des six faisceaux SIM dans la zone de TIR de l'ouverture arrière de l'objectif, ce qui nécessite un temps laborieux et consommer la procédure d'alignement optique. En second lieu, pour produire un contraste élevé de motif à l'échantillon, la rotation de polarisation est essentielle. pour les systèmes à faible NA 2D SIM, la rotation de polarisation peut être évitée par un choix judicieux de l'orientation de polarisation linéaire, mais cela devient impossible TIRF-SIM 25. pour multicolore imagerie à haute vitesse, électro - le contrôle de la polarisation optique est nécessaire, ce qui augmente la complexité et le coût du système.

    Limites de la technique

    FRBR-SIM, comme FRBR classique, est naturellement limitée à l'observation des structures et processus situés à la membrane cellulaire basale qui peut être éclairé par le 150-200 nm profondeur de pénétration du champ évanescent biologiques. Tandis queSIM est souvent cité comme étant moins photodamaging aux cellules que soit STED ou SMLM, latéral résolution doublement n'augmente encore le nombre de photons par au moins 4 fois 5 par rapport à la microscopie TIRF conventionnelle. Pour l'imagerie à des cadences élevées avec des expositions courtes durées, cette augmentation de photons nécessite l'utilisation d'une augmentation des intensités d'éclairage. Bien que tout fluorophore peut être utilisé pour l'imagerie SIM d'échantillons mobiles fixes ou lents, des protéines fluorescentes de haute luminosité ou la prochaine génération de colorants synthétiques avec photostabilité améliorée sont recommandés pour l'imagerie des cellules vivantes.

    Bien que ce mode de réalisation est capable d'imager une seule couleur à la carte SIM des taux de trame supérieur à 20 Hz, l'imagerie multicolore dans le système présenté est limité par le temps de commutation de la roue de filtre d'émission motorisé. En raison de la grande taille de la puce de la caméra sCMOS, l'utilisation d'un filtre multibande d'émission et de dédoublement d'image optique serait possible et permettre i simultanéeforgemagie avec de multiples longueurs d'onde à aucune pénalité de vitesse. Une autre possibilité serait d'alterner les différents lasers d'excitation et d'utiliser un filtre coupe-bande multibande pour rejeter la lumière d'excitation. L'utilisation d'un SLM ferroélectrique binaire dans cette mise en oeuvre est pas optimale. L'efficacité de diffraction d'un tel SLM est très faible, de sorte que la plupart de la lumière incidente est dans la réflexion d'ordre zéro, qui est filtré par le masque spatial. Pour les applications nécessitant des taux de trame très élevées, la vitesse de formation d'image est donc limitée par la puissance de sortie des diodes laser. Le SLM introduit également un certain aplatissement dans la polarisation des longueurs d'onde loin de la conception longueur d'onde de 550 nm où les pixels ne fonctionnent pas de plaques demi-onde comme idéales. Bien que ceci puisse être compensé en utilisant une LCVR supplémentaire, la solution idéale peut être l'utilisation d'un dispositif de micro-miroir numérique (DMD) en tant que générateur de motif.

    Les modifications possibles

    Le prese de configurationnted ici est souple et plus facile à modifier que les instruments commerciaux pour que d' autres modalités d'imagerie telles que 3D-SIM, rapide 2D-SIM, multifocale SIM (MSIM) et SIM non-linéaire (NL-SIM) peuvent être mises en œuvre 21,34,35.

    2D-SIM peut être bien adapté pour l'imagerie relativement plat, se déplaçant rapidement des structures telles que le réticulum endoplasmique périphérique. L'ER périphérique est plus profond au sein de la cellule que peut être éclairé à l'aide d'un champ évanescent FRBR mais en raison de sa structure plate peut être imagée en utilisant la norme 2D-SIM avec fond négligeable out-of-focus. En outre, l'utilisation de l' amélioration des algorithmes de reconstruction de tronçonnage optiques pour supprimer hors-focus lumière étendre l'utilisation de la 2D-SIM optiquement des échantillons épais, mais où la résolution axiale doublement ne sont pas nécessaires 21.

    Dans MSIM, l'échantillon est éclairé par un réseau clairsemé d'excitation 36 foyers. Cette modalité peut être mise en œuvre simplement en enlevant le masque spatial (SM) Et de le remplacer par un polariseur. Le SLM fonctionne maintenant comme un modulateur d'amplitude. Les réseaux SIM binaires affichés sur le SLM peuvent être remplacés par un réseau 2D de points, la taille des points choisis pour être égale à la taille d'une diffraction de focalisation limitée dans le plan de l'image. Sur la figure 7A, un réseau de 4 x 4 carrés de pixels est affiché sur le SLM (encadré) qui , lorsque demagnified sur l'échantillon génère diffraction des foyers limités de 150 x 150 nm, étant donné la taille de pixel SLM physique de 13,62 um. Les domaines d'excitation peut alors être traduite en décalant le motif en treillis sur le SLM et cela est répété plusieurs fois afin d'illuminer le champ de vision. Les images sont acquises pour chaque position de motif traduit et la pile est post-traitement pour donner une image reconstruite avec une résolution améliorée jusqu'à un facteur de Équation et réduit out-of-focus de lumière par rapport à l'image de grand champ équivalent30. Cette modalité peut être utile pour l' imagerie épais, des échantillons denses pour lesquels SIM standard est inadaptée, par exemple de faibles structures de contraste tels que les globules rouges colorés (Figure 7C), bien que le temps d'acquisition est augmentée en raison du grand nombre d'images brutes nécessaire par champ de vision (dans ce cas N = 168).

    Enfin, la configuration peut être modifiée pour permettre soit de haute-NA linéaire FRBR-SIM ou d' activation à motif non linéaire SIM (PA NL-SIM), tel que présenté récemment par Li et al., Par l' utilisation d'un 1,7 objectif ou addition NA ultravide d'un laser de photoactivation 405 nm et une optimisation minutieuse des motifs de réseau SLM 35.

    Les futures applications

    SIM est encore une technique en évolution rapide et de nombreuses applications dans les sciences de la vie sera activé à l'avenir. La vitesse, la résolution, et des améliorations de contraste de la technique et la capacité d'utiliser des fluorophores standards mean que, pour bio-imagerie, la carte SIM doit remplacer de nombreux systèmes de microscopie classiques, tels que des plates-formes de terrain confocale et larges. systèmes SIM commerciaux sont déjà disponibles aujourd'hui avec les spécifications techniques en suspens, cependant, ils sont hors de la portée financière de nombreux laboratoires de recherche, et, surtout, ils sont rigides pour être modifié et mis au point pour mettre en œuvre les derniers développements de la recherche dans le domaine. Ils manquent également de la capacité essentielle pour 'être adapté pour l'expérience à portée de main », souvent un goulot d'étranglement critique dans des recherches de sciences de la vie de bord. Le système décrit ici sera particulièrement bien adapté pour étudier les processus dynamiques à proximité de la surface de la cellule, pour des études in vitro de systèmes bicouches reconstitués, pour étudier la chimie de surface dans les matériaux et les sciences physiques, par exemple. des matériaux 2D, et beaucoup d'autres applications.

    Disclosures

    Acknowledgements

    Ce travail a été soutenu par des subventions du Leverhulme Trust, le génie et Conseil de recherches en sciences physiques [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] et Medical Research Council [MR / K015850 / 1 MR / K02292X / 1]. Nous vous remercions de E. Avezov et M. Lu pour la transfection de la LifeAct-GFP et les cellules cytosolique-GFP respectivement, et W. Chen pour la préparation de la culture HEK293. Nous remercions également K. O'Holleran pour l'assistance à la conception du microscope, et L. Shao et R. Heintzmann pour des discussions et des suggestions utiles.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    488 nm laser Toptica iBeam SMART with digital modulation
    561 nm laser Coherent OBIS LS with digital modulation
    640 nm laser Cobolt MLD with digital modulation
    Long-pass dichroic mirrors  Thorlabs for combining excitation beams
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc From same batch as above, 25 x 25 mm
    1" square kinematic mount Edmund Optics 58-860
    Glan-Taylor calcite polarizers Thorlabs GT5-A For alignment of LCVR
    Glan-Taylor mount Thorlabs SM05PM5
    Achromatic half wave plate Thorlabs AHWP05M-600 400-800 nm
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M For HWP
    Liquid Crystal Variable Retarder Meadowlark Optics SWIFT Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
    LCVR controller Meadowlark Optics D3060HV Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
    Achromatic quarter wave plate Meadowlark Optics AQM-100-0545
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1P/M For QWP
    10 mm achromatic doublet Thorlabs AC080-010-A-ML For beam expander
    200 mm achromatic doublet Thorlabs AC254-200-A-ML For beam expander
    Cage XY Translators Thorlabs CXY1
    Ferroelectric spatial light modulator Forth Dimension Displays M0787-00249     SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board
    SLM mounting frame Forth Dimension Displays M0787-10014 Fixed to custom built aluminium mount
    Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount Thorlabs GM200/M For SLM mounting
    Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform Thorlabs XYR1/M For SLM mounting
    Rail carrier Newport M-PRC-3 For SLM mounting
    Precision Optical Rail Newport PRL-6 For SLM mounting
    300 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 273 322  f = 300 mm, 31.5 mm diameter
    140 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 239 322 f = 140 mm, 31.5 mm diameter
    Precision XY Translation Mounts Thorlabs LM2XY
    Lens Mounting Adapters Thorlabs SM2AD32 For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
    Translation stages Comar 12XT65 Dovetail, side drive
    XY Translator with Differential Drives Thorlabs ST1XY-D/M for spatial filter
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M for spatial filter
    300 mm achromatic doublet Thorlabs AC508-300-A-ML Excitation tube lens
    Automated XY stage with Z-piezo top plate ASI PZ-2150-XYFT-PZ-IX71  with MS-2000 controller
    Inverted microscope frame Olympus IX-71
    Objective lens Olympus UAPON100XOTIRF 100X/1.49NA
    High speed filter wheel Prior Scientific HF110A with Prior ProScan III controller
    Bandpass emission filters Semrock FF01-525/30, FF01-676/29
    sCMOS camera Hamamatsu ORCA Flash v4.0
    Stage top incubator OKO Lab H301-K-FRAME For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
    Stainless steel optical posts Thorlabs TR series for mounting optical components
    Post holders Thorlabs PH series for mounting optical components
    Kinematic mirror mounts Thorlabs KM100 for mounting 1" mirrors
    Shearing interferometer Thorlabs SI100
    100 nm fluorescent microspheres Life Technologies T-7279 Tetraspeck
    Rhodamine 6G Sigma Aldrich 83697-250MG
    8 well glass bottom dishes ibidi 80827 with #1.5 coverglass
    Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155409 with #1.5 coverglass
    0.01 mm microscope reticle slide EMS 68039-22
    CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher Scientific C10613

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