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 JoVE Bioengineering

Una guida per Strutturato illuminazione TIRF Microscopia a alta velocità con colori multipli

1, 1, 1

1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge

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    Summary

    Cite this Article

    Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J. Vis. Exp. (111), e53988, doi:10.3791/53988 (2016).

    Abstract

    immagini super-risoluzione ottica con illuminazione microscopia strutturato (SIM) è una tecnologia chiave per la visualizzazione dei processi a livello molecolare nelle scienze biomediche e chimiche. Anche se i sistemi di SIM commerciali sono disponibili, i sistemi che sono progettati in laboratorio in grado di sovraperformare sistemi commerciali, questi ultimi in genere progettati per facilità d'uso e applicazioni di uso generale, sia in termini di immagini fedeltà e velocità. Questo articolo presenta una guida dettagliata per la costruzione di un sistema di SIM che utilizza illuminazione a riflessione interna totale (TIR) ​​ed è capace di immagini fino a 10 Hz in tre colori con una risoluzione di raggiungere 100 nm. Grazie alla combinazione di SIM e TIRF, il sistema fornisce una migliore contrasto dell'immagine rispetto alle tecnologie concorrenti. Per ottenere queste specifiche, diversi elementi ottici sono usati per attivare il controllo automatico sulla struttura stato di polarizzazione e spaziale della luce di illuminazione per tutti wav eccitazione disponibileelengths. I dettagli completi sulla attuazione e controllo dell'hardware sono dati per ottenere la sincronizzazione tra la generazione di luce di eccitazione modello, lunghezza d'onda, stato di polarizzazione e controllo della telecamera con l'accento sul raggiungimento massimo frame rate di acquisizione. Un protocollo passo-passo per l'allineamento del sistema e calibrazione viene presentato e il miglioramento risoluzione ottenibile è convalidato su provini ideali. La capacità per l'imaging super-risoluzione video-rate è dimostrato con cellule viventi.

    Introduction

    Nel corso dell'ultimo mezzo di un decennio, super-risoluzione microscopia è maturato e si è trasferito dai laboratori di ottica specializzati nelle mani del biologo. Esistono soluzioni microscopio commerciali per le tre varianti principali per il raggiungimento ottica super-risoluzione: singolo microscopio molecola di localizzazione (SMLM), stimolata esaurimento emissione di microscopia (STED), e strutturato illuminazione microscopia (SIM) 1,2. SMLM quali la microscopia fotoattivato localizzazione (PALM) e stocastico ricostruzione microscopia ottica (Storm) sono stati le tecniche più popolari, in gran parte dovuto alla semplicità della configurazione ottica e la promessa di alta risoluzione spaziale, facilmente fino a 20 nm. Tuttavia super-risoluzione microscopia tramite un'unica localizzazione molecola è dotato di una intrinseca trade-off: la risoluzione ottenibile spaziale dipende da accumulare un numero sufficiente di singole localizzazioni fluoroforo, limitando così la risoluzione temporale. processo dinamico Imaginges in cellule vive diventa quindi problematica come si deve adeguatamente campionare il movimento della struttura di interesse per evitare artefatti da movimento, mentre anche l'acquisizione eventi localizzazione abbastanza in quel momento per ricostruire un'immagine. Al fine di soddisfare tali esigenze, dimostrazioni dal vivo SMLM cellule hanno ottenuto l'aumento richiesto dei tassi di fluorophore photoswitching aumentando notevolmente la potenza di eccitazione, e questo porta a sua volta a fototossicità e lo stress ossidativo, limitando in tal modo i tempi di sopravvivenza del campione e rilevanza biologica 3.

    Un chiaro vantaggio di STED su SIM e SMLM è che può un'immagine con super-risoluzione in campioni spessi, per esempio risoluzione laterale di circa 60 nm è stata raggiunta in fettine cerebrali organotipica a profondità fino a 120 micron 4. Imaging a tali profondità con singole implementazioni oggettive di SMLM o SIM è irrealizzabile, ma diventa possibile con uno strato di luce singola molecola o reticolo foglio luce microscopy 5. Video-rate STED è stata dimostrata anche e utilizzato per mappare la mobilità delle vescicole sinaptiche, anche se finora è stato limitato a l'imaging piccoli campi di vista 6.

    Per applicazioni in biologia cellulare e reazioni molecolari auto-assemblaggio 7 - 12 che richiedono immagini ad alta risoluzione temporale di numerose punti di tempo, microscopia illuminazione strutturata (SIM) può essere molto adatta poiché non dipende dalle proprietà fotofisiche di un particolare fluorescente sonda. Nonostante il vantaggio intrinseco di SIM, fino ad ora il suo utilizzo è stato principalmente confinata l'imaging cellule fisse o processi in movimento lento. Ciò è dovuto alle limitazioni dei sistemi SIM disponibili in commercio: il frame rate acquisizione di questi strumenti è limitata dalla velocità di rotazione dei reticoli utilizzati per generare i pattern di illuminazione sinusoidali richieste nonché il mantenimento di polarizzazione ottica. La nuova generazione di SIM commercialegli strumenti sono in grado di immagini veloci, ma sono proibitivo per tutti, ma strutture di imaging centrali.

    Questo protocollo presenta una guida per la costruzione di un sistema SIM flessibile per l'imaging processi veloci in campioni sottili e vicino alla superficie basale delle cellule viventi. Impiega riflessione interna totale in fluorescenza (TIRF) per generare un pattern di illuminazione che penetra non più profondo di circa 150 nm nel campione 13 che riduce notevolmente il segnale di fuori fuoco sfondo. L'idea di combinare SIM con TIRF è quasi vecchia quanto SIM stessa 14, ma non è stato realizzato sperimentalmente entro il 2006 15. La prima in vivo immagini ottenute con TIRF-SIM sono stati segnalati nel 2009 16 hanno raggiunto un frame rate di 11 Hz per visualizzare tubulina e kinesin dinamica, e due sistemi TIRF-SIM colori sono stati presentati 17,18. Più recentemente, una guida per la costruzione e l'uso di un solo colore due raggi SIM sistema è stato presentato con frame-rate fino a 18 Hz 19,20.

    Il set-up qui presentato è in grado di immagini super-risoluzione SIM a 20 Hz in tre colori, due dei quali possono essere azionate in TIRF-SIM. L'intero sistema è costruito attorno ad un telaio microscopio invertito e utilizza una fase di traduzione xy motorizzato con un piezo-azionato fase z. Per generare i pattern di eccitazione sinusoidali necessari per TIRF-SIM, il sistema presentato utilizza un ferroelettrico modulatore spaziale di luce (SLM). modelli reticolo binari vengono visualizzati sul SLM e le conseguenti ± 1 ordini di diffrazione sono filtrati, inoltrati e concentrati sul ring TIR della lente dell'obiettivo. Gli sfasamenti necessari e rotazioni delle grate sono applicate cambiando l'immagine visualizzata SLM. Questo protocollo descrive come costruire e allineare tale percorso di eccitazione, dettagli l'allineamento del percorso di emissione, e presenta campioni per assicurare un allineamento ottimale. E 'anche De scribi i problemi e le sfide particolari ad alta velocità TIRF-SIM in materia di controllo della polarizzazione e la sincronizzazione dei componenti.

    Considerazioni sulla progettazione e vincoli

    Prima di montare il sistema TIRF-SIM presentato in questo protocollo, ci sono diversi vincoli progettuali da considerare che determinano la scelta dei componenti ottici. Tutte le abbreviazioni di componenti ottici riferimento alla Figura 1.

    Spatial luce modulatore (SLM)

    Un binario ferroelettrico SLM viene utilizzato in questa configurazione in quanto è in grado di commutazione modello sub-millisecondo. In scala di grigi SLMs nematici possono essere utilizzati, ma questi offrono notevolmente ridotti tempi di commutazione. Ogni o disattivare pixel in una fase binaria SLM impartirà sia una fase π o 0 offset per il fronte d'onda piana incidente, quindi se un modello di reticolo periodico viene visualizzato sul SLM opererà come un reticolo di fase di diffrazione.

    ent "> riflessione interna totale (TIR)

    Per raggiungere TIR e produrre un campo evanescente, l'angolo di incidenza dei raggi eccitazione all'interfaccia vetro-campione deve essere maggiore dell'angolo critico Equazione . Questo imposta l'angolo minimo incidente richiesto, e quindi anche la distanza massima, o il periodo, del pattern di illuminazione evanescente. L'angolo massimo incidente Equazione (L'angolo di accettazione) è limitata dalla apertura numerica (NA) della lente obiettivo che può essere calcolata dalla definizione Equazione . Questo determina il pattern minima spaziatura ottenibile secondo la formula Abbe Equazione che collega NA e lunghezza d'onda Equazione alla distanza minima del pattern (es. L'anello TIR) ed in cui il foci due eccitazione deve essere posizionato in modo accurato e preciso ruotato per generare ogni pattern di illuminazione.

    Ricostruzione di immagini TIRF-SIM richiede l'acquisizione di un minimo di tre sfasamenti per giro modello quindi il periodo di modello SLM deve essere divisibile per 3 (vedi figura 1). Per esempio, un periodo di 9 pixel per illuminazione 488 nm e 12 pixel per 640 nm illuminazione. Per una discussione completa di disegno del modello SLM, tra cui l'ottimizzazione sub-pixel del modello di spaziatura utilizzando griglie tranciati, Vedere il lavoro precedente di Kner et al. 16 e Lu-Walther et al. 20 La posizione dei due fuochi di eccitazione deve essere all'interno dell'anello TIR per tutte le lunghezze d'onda, tuttavia l'angolo di diffrazione di ± 1 ordini dal SLM è la lunghezza d'onda dipendente. Per SIM standard, immagini multicolore può essere raggiunto ottimizzando il periodo griglia per la lunghezza d'onda più lunga, e tollerare una perdita di prestazioni per i canali più brevi. Per TIRF-SIM tuttavia, l'ottimizzazione per una lunghezza d'onda che l'altra lunghezza d'onda foci più all'interno dell'anello TIR sono. Ad esempio, utilizzando un reticolo a passo di 9 pixel è sufficiente a fornire TIRF per 488 nm, come i fuochi sono al 95% del diametro della apertura posteriore e all'interno dell'anello TIR, ma per 640 nm questo periodo deve posizionare il foci esterno l'apertura. Per questo motivo diverse distanze modello di pixel devono essere utilizzati per ogni lunghezza d'onda di eccitazione.

    L'allineamento del percorso di eccitazione TIRF-SIMè estremamente sensibile a piccole variazioni della posizione dello specchio dicroico (DM4 in figura 1) nel corpo del microscopio, molto più che in SIM convenzionale. L'uso di un filtro rotante a torretta cubo non è consigliabile, invece utilizzare un unico, multi-banda specchio dicroico, che viene mantenuta in posizione fissa e progettato specificamente per le lunghezze d'onda di eccitazione utilizzati. È essenziale che solo i più alti specchi dicroici qualità vengono utilizzati. Questi richiedono substrati spessore di almeno 3 mm, e sono spesso indicati come "immagine piana" dal costruttore. Tutti gli altri substrati portano ad aberrazione intollerabile e degradazione dell'immagine in TIRF-SIM.

    controllo Polarizzazione

    Per raggiungere TIRF-SIM è essenziale per ruotare lo stato di polarizzazione della luce di eccitazione in sincronia con il pattern di illuminazione tale da rimanere azimutalmente polarizzata nel piano pupilla dell'obiettivo rispetto all'asse ottico (cioè. s-polarizzata). L'allineamento delle ottiche di controllo della polarizzazione dipenderà dell'elemento ottico specifico impiegato, per esempio una cella Pockels 21, o un piatto semionda in una fase di rotazione motorizzata 22. In questo protocollo viene utilizzato un cristallo liquido personalizzato rallentatore variabile (LCVR), progettato per fornire full-wave (2π) ritardata propagazione nella gamma di lunghezze d'onda 488-640 nm in quanto consente veloce (~ msec) di commutazione. Se si utilizza un rallentatore cristalli liquidi è indispensabile utilizzare un componente di alta qualità: componenti standard non sono in genere abbastanza stabile che invia un ritardo della costante su tutta la lunghezza del tempo di esposizione della fotocamera che porta ad una sfocatura fuori dal pattern di illuminazione e basso contrasto modulazione . ritardanti cristalli liquidi sono anche fortemente dipendente dalla temperatura e richiedono costruito nel controllo della temperatura.

    Sincronizzazione

    I laser devono essere sincronizzati con il SLM. SLMs ferroelettrici binari sono bilanciati internamente da switching tra un sullo stato e fuori dalla condizione. I pixel agiscono solo piastre onda come mezzo in entrambi loro o disattivare stato, ma non durante la commutazione interframe tempo. Pertanto i laser devono essere accesi solo durante gli stati on / off mediante il LED segnale di abilitazione dal SLM per impedire una riduzione del contrasto del modello a causa dello stato intermedio dei pixel. Un modulatore acusto-ottico (AOM) può alternativamente essere usato come un otturatore veloce se il laser non possono essere modulati digitalmente.

    Scelta di lenti

    Sulla base di questi vincoli, la demagnification dell'aereo SLM desiderata sul piano di campionamento per produrre gli schemi di illuminazione desiderati possono essere determinati. Questo permette di calcolare le lunghezze focali delle due lenti L3 e L4 nel telescopio relè immagine e la lente di eccitazione del condensatore L5. In questo sistema a / olio 1.49NA immersion lente obiettivo 100X viene utilizzato con 488 nm e 640 nm di eccitazione, quindi utilizza lunghezze focali di 300 e 140 millimetriper L4 e L3, e 300 mm per L5, dando un totale di demagnification 357X, equivalente ad una dimensione SLM pixel di 38 nm in corrispondenza del piano del campione. Utilizzando questa combinazione di lenti, SLM reticolo periodi di 9 per 488 illuminazione nm e 12 pixel per 640 nm indica spaziature reticolo di 172 e 229 nm a campione, corrispondenti ad angoli di incidenza di 70 ° e 67 °, rispettivamente. Per un'interfaccia bicchiere d'acqua, l'angolo critico è 61 °, ed è indipendente dalla lunghezza d'onda, quindi questi due spaziature modello permettono di eccitazione TIRF per entrambe le lunghezze d'onda. Una lente obiettivo dotato di un collare di correzione è utile per la correzione delle aberrazioni sferiche introdotti da variazioni di spessore coprioggetto, o se si opera a 37 ° C.

    immagine ricostruzione

    Una volta che i dati grezzi SIM è stata acquisita è una questione di sforzo computazionale per generare immagini super risolta in un processo in due fasi. In primo luogo, il pattern di illuminazione deve essere determinato perogni immagine e in secondo luogo, i componenti dello spettro SIM devono essere separati e ricombinati in modo appropriato per raddoppiare il supporto OTF effettiva (vedere Figura 6, inserti).

    la conoscenza precisa dei pattern di illuminazione proiettati è di primaria importanza, come i componenti di frequenza super risolti devono essere miscelato nel modo più accurato possibile per evitare artefatti causati dalle parti residue delle componenti sovrapposti. Noi determinare il pattern di illuminazione parametri a posteriori, sulla base dei dati immagine greggio a seguito del procedimento introdotto da Gustafsson et al. 23 In breve, una serie di parametri di illuminazione che descrive un normalizzato sinusoide bidimensionale deve essere trovato per ciascuno dei Equazione modelli di eccitazione Equazione :

    Equazione

    con la presente Equazione e Equazione descrivere il contrasto frangia e il modello di partenza, rispettivamente fase di ogni singola immagine m. Le componenti del vettore d'onda, Equazione e Equazione , Modificare solo con diversi orientamenti Equazione del modello e può presume essere altrimenti costante. Per determinare grossolanamente i componenti del vettore d'onda viene eseguita una correlazione incrociata di spettri immagine grezza, che si affina applicando shift subpixel una delle immagini cross-correlate da ottimizzare la sovrapposizione. Questo viene fatto attraverso la moltiplicazione dei gradienti di fase reale spazio Equazione che inducono un cambiamento di subpixel in frefrequenza-spazio. Si noti che è utile avere una buona stima dei vettori d'onda prima stima andamento reale e questo può essere trovata imaging di un livello branello fluorescente.

    Come passo di fase tra modelli spostato è Equazione , Vale a dire. Equazione , La separazione di componenti di frequenza può essere eseguita da una trasformata di Fourier lungo "l'asse di fase". La fase globale Equazione e il contrasto frange Equazione possono poi essere determinato utilizzando regressione lineare complessa di componenti diversi. I singoli componenti separati vengono poi combinati usando un filtro Wiener generalizzato. Per una descrizione dettagliata di entrambi estrazione di parametri e attuazione del filtro Wiener generalizzato rimandiamo al Gustafssonet al. 23 in cui viene utilizzato lo stesso algoritmo.

    Protocol

    1. Organizzazione e Allineamento del percorso di eccitazione

    1. Contrassegnare le posizioni dei componenti sul tavolo ottico (vedi Figura 1 per una panoramica della configurazione ottica). Separare l'obiettivo, lenti L3, L4, L5, e la SLM ciascuna dalla somma delle loro rispettive lunghezze focali tali che la superficie SLM verranno trasmesse sul piano focale dell'obiettivo.
    2. Inserire multi-edge specchio dicroico DM4 nella torretta del filtro cubo della stativo.
    3. Inserire la seconda DM3 specchio dicroico in uno specchio cinetica piazza 1 "monte, e posizionarlo una lunghezza focale di distanza dalla lente condensatore L5.
      Nota: Questo disegno percorso di eccitazione comprende due identici dicroiche rispecchia dm3 e DM4 che sono presi dallo stesso lotto di produzione al fine di garantire identiche proprietà ottiche. Lo specchio dicroico (DM4) è posizionato in modo tale che gli assi S- e p- vengono commutati rispetto al dicroico situato nel microscopio (DM3) annullando qualsiasiellitticità polarizzazione introdotto dal proprio birifrangenza (Figura 1). Questa compensazione funziona altrettanto bene per ogni lunghezza d'onda illuminazione. Questo passaggio è essenziale per mantenere un elevato contrasto di modulazione.
    4. Prima di inserire le lenti nel percorso di eccitazione, definire con precisione l'asse ottico del sistema.
      1. Rimuovere la lente obiettivo (OB) dalla torretta e invece avvitare uno strumento di allineamento. Questo consiste in un sistema di gabbie ottica lunga 500 mm con due dischi di allineamento a entrambe le estremità.
      2. Utilizzare la DM3 specchio dicroico e uno specchio allineamento temporanea posizionato nella posizione approssimativa successiva del SLM per dirigere un fascio di riferimento collimato dal laser 1 attraverso il centro dei fori dei due dischi di allineamento. Dirigere il fascio laser da 1 a specchio temporaneo come illustrato nella figura 1 utilizzando tre specchi e DM2 specchio dicroico. Lo specchio temporanea nella posizione SLM deve essere vicino alla perpendicolare all'asse ottico.
      3. Rimuovere lo strumento di allineamento volta l'asse ottico grossolana è stata determined.Insert un iride nel percorso ottico prima che entra nel corpo microscopia e centrarlo sulla trave. Fissare un pezzo di carta bianca con un piccolo foro centrata sulla iris.Reinsert lente dell'obiettivo (OB).
        Nota: Il fascio lasciando l'obiettivo sarà ora altamente divergenti, ma ci sarà una riflessione molto debole dalla superficie posteriore della lente che sarà visibile sulla carta bianca. Tutte le lenti, anche se sono antiriflesso, avranno riflessioni posteriori deboli che possono essere utilizzati per garantire l'allineamento coassiale. Se il fascio è esattamente perpendicolare alla lente allora la retroriflessione ritornerà attraverso il centro dell'iride
      4. Effettuare iterativi regolazioni angolari ai due specchi (dm3 e specchio di allineamento alla posizione SLM) per centrare la riflessione sulla schienala scheda con il fascio in ingresso. Rimuovere temporaneamente la lente dell'obiettivo (OB) e segnare il punto laser sul soffitto per creare una posizione di riferimento.
      5. Inserire una coppia di iridi all'altezza del fascio di riferimento lungo i fori filettati del tavolo. Il fascio deve essere parallelo alla superficie del tavolo ottico. L'asse ottico è ora definito.
    5. Inserire il condensatore ottico (L5) circa un lunghezza focale distanza dall'obiettivo. Montare questo obiettivo su un palcoscenico traslazione lineare a traslare lungo la direzione del fascio di riferimento.
    6. Regolare la posizione della lente condensatore e angolo tale che il fascio lasciando l'obiettivo è collimato e vince riferimento sul soffitto. Verificare che la lente sia perpendicolare al fascio dal nuovo controllando il riflesso indietro con l'iride e carta bianca. Rimuovere la lente dell'obiettivo (OB) e inserire la seconda lente del telescopio relè immagine (L4).
      Nota: Garantire una corretta collimazione e non deflessione del esseream è facilitato quando vi è un numero pari di lenti nel percorso del fascio.
    7. Regolare la posizione e l'angolo della lente con una fase di traslazione lineare di mantenere collimazione e garantire il fascio di riferimento colpisce ancora punto marcato sul soffitto.
    8. Sostituire la lente dell'obiettivo (OB) e inserire la prima lente del cannocchiale (L3). Regolare la posizione e l'angolo di questo obiettivo di garantire collimazione e non deflessione, come descritto nelle fasi precedenti.
    9. Montare il chip SLM su una staffa di montaggio che prevede la rotazione senza traduzione attorno al centro della superficie del chip.
      Nota: Il design di montaggio specifica dipende dalla SLM utilizzato. Se il SLM viene fornito senza montaggio, deve essere fissato ad una piastra di alluminio lavorato consuetudine che è poi collegato a un obiettivo cardanico montaggio.
    10. Con le lenti allineate, inserire il SLM al posto dello specchio. Regolare la posizione del SLM tale che il fascio di riferimento si trova al centro del chip SLM, e regolare l'unaGLE tale che il fascio passa attraverso le due lenti relè (L3 e L4). Verificare che il raggio di riferimento è ancora incentrato sul posto marcato.
    11. Espandere e collimare il fascio di riferimento utilizzando un espansore fascio kepleriana.
      1. Montare le due lenti (L1 e L2) in un sistema di gabbie per facilità di regolazione.
      2. Centro il sistema gabbia sul fascio di riferimento rimuovendo le lenti e la loro sostituzione con le iridi.
      3. Inserire le due lenti e regolare la posizione assiale della L2 per collimare il fascio espansa utilizzando un interferometro di taglio. L2 dovrebbe essere una lunghezza focale dalla superficie della SLM.
      4. Verificare che il fascio espansa è ancora collimata dopo le due lenti relè L3 e L4. Utilizzare l'interferometro taglio subito dopo DM3 per verificare la presenza di collimazione.
    12. Una volta che il percorso di eccitazione è stata allineata per una singola lunghezza d'onda, coppia gli altri due laser nel percorso ottico. Steer ogni raggio attraverso due iridi centrate sul percorso di eccitazione utilizzandoi fasci combinando specchi dicroici (DM1 e DM2).

    2. Allineamento di polarizzazione Rotator

    1. Montare il LCVR con asse veloce a 45 ° la polarizzazione incidente.
    2. Angolo di sintonia di polarizzazione fine del fascio incidente al LCVR usando una piastra semi onda acromatica (HWP) inserendo il HWP e la LCVR tra i polarizzatori incrociati. Ruotare il HWP per minimizzare la potenza trasmessa.
      Nota: Al fine di agire come un rotatore di polarizzazione variabile, l'asse veloce del retarder cristalli liquidi (LCVR) deve essere allineato esattamente a 45 ° rispetto alla polarizzazione del fascio incidente verticale. Il LCVR è montato fisicamente a 45 °, ma questo è solo un allineamento grossolano. Il HWP viene utilizzato per garantire un perfetto allineamento della polarizzazione incidente 45 ° rispetto all'asse veloce LCVR. La piastra a quarto d'onda (QWP) converte la polarizzazione ellittica inclinata indotta dalla LCVR torna a polarizzazione lineare ad angolo controllato dalla tensione applicata24.
    3. Inserire il QWP dopo la LCVR e ruotarlo per allineare il suo asse lento per la polarizzazione in ingresso, riducendo al minimo la potenza trasmessa tra polarizzatori incrociati.

    3. Allineamento del percorso di emissione

    1. Grossolanamente posizionare la fotocamera utilizzando un vetrino micrometrico e luce trasmessa.
      1. Focus sul reticolo usando gli oculari del microscopio e fissare la lente obiettivo in questa posizione.
      2. Circa centrare la telecamera e spostare la posizione della telecamera per portare l'immagine del reticolo a fuoco osservando l'immagine sullo schermo.
        Nota: Se una ruota filtro esterno è utilizzato allora il cubo filtro non conterrà un filtro per le emissioni, pertanto gli oculari non devono essere utilizzati quando i laser sono accesi.
    2. Regolare con precisione la posizione della telecamera utilizzando un campione tallone fluorescente.
      1. Preparare un monostrato di perline fluorescenti diffondendo una goccia di 100 perline multicolore nm su un coprioggetti # 1.5. Lasciare dry per adsorbire le perline al coprioggetti e poi ri-immergere in acqua.
      2. Posizionare il campione tallone sul oggettivo con olio di immersione. Finemente regolare la posizione della telecamera in modo tale che lo strato tallone fluorescente è a fuoco. Non regolare la posizione della lente dell'obiettivo una volta trovata la messa a fuoco.
        Nota: Poiché il SLM deve essere in un coniugato aereo al piano di esempio, la posizione del SLM, relè lenti e obiettivo deve essere fissato. Per regolare la messa a fuoco, spostare il campione assialmente anziché l'obiettivo con un piezo z-stage.
    3. Generare le opportune SIM modelli grata binari come file bitmap.
      1. Per 2D / TIRF-SIM, generare una serie di 9 immagini grata binarie: orientamenti 3 modello ciascuna con 3 turni di fase equidistanti. Generare questi numerico (utilizzando MATLAB per esempio) da una sinusoide 2D ruotata con un offset di fase applicata, quindi thresholding per produrre un'immagine binaria. Vedere file di codice supplementare per esempio di codice.
      2. per alignmenscopi t, generano anche modelli grata che sono stati finestrate da una piccola apertura circolare per ciascuno dei 3 orientamenti, come mostrato in Figura 2. Le griglie di allineamento finestrate non devono essere attivati ​​dall'esterno, ma possono essere attivati ​​manualmente dall'utente tramite la software di SLM.
        Nota: Vedere riferimenti per una discussione degli angoli di rotazione ottimale e un esempio di modello di reticolo codice generazione 16,20.
    4. Carica le immagini bitmap al SLM utilizzando il software del produttore (ad esempio MetroCon).
      1. Caricare il software di controllo SLM e fare clic su "Connect".
      2. Nella scheda "Repertorio", fai clic su "Carica" ​​per aprire il file repertorio e controllare il numero di ordini contenuti nel file in esecuzione. Nel file Esempio di repertorio dato ci sono cinque gli ordini in corso.
      3. Fai clic su "Invia ad Board" per caricare il file repertorio al SLM.
      4. Attendere che le immagini bitmap in carica unaND per il riavvio del dispositivo automaticamente.
        Nota: Un file repertorio esempio, che contiene immagini bitmap grata e di un file che definisce l'ordine, è incluso come un file di codice supplementare. Il file ".repz" può essere aperto utilizzando il software di archiviazione file ZIP.
    5. Visualizzare un allineamento finestrato reticolo sul SLM per il primo orientamento (ad esempio 0 °).
      1. Nel software di controllo SLM, selezionare la scheda "Stato", inserire il numero del ordine di marcia (nel caso di file di esempio, questo è in esecuzione ordine "1").
      2. Fai clic su "Seleziona" per cambiare l'ordine di marcia per la griglia di allineamento.
        Nota: Questo illuminare una piccola regione circolare nel piano campione. Se la superficie SLM sia correttamente coniugato al piano campione e poi i bordi di questa regione sarà perfettamente a fuoco. Il pattern reticolo produrrà più ordini di diffrazione al centro della L3: riflessione di ordine zero dal backplane riflettente delSLM, il -1 e +1 ordini corrispondenti alla grata, e anche più deboli ordini superiori che derivano dalla diffrazione elementi interni specifici al dispositivo SLM (es. Riflessioni dei cablaggi interni dei pixel SLM e irregolarità ai bordi dei pixel) . Tutti ma i -1 e +1 ordini devono essere filtrati.
    6. Inserire una maschera spaziale (SM) montato in un x, y fase nel percorso ottico nella posizione focale di L3 e tradurre la sua posizione rispetto all'asse ottico in modo che solo i primi ordini desiderati sono passati. Subito dopo il filtro spaziale, solo due fasci circolari saranno visibili.
      Nota: La maschera spaziale è fabbricata punzonatura 6 fori in un foglio di alluminio con un ago. I fori devono essere abbastanza grandi per passare i primi raggi di ordine per tutte le lunghezze d'onda laser. Un'analisi dettagliata della maschera spaziale è dato in riferimento 20.
    7. Visualizzare il successivo orientamento del reticolo allineamento (60 °, correndo ordine 2) e di nuovogarantire che solo i primi ordini vengono lasciate attraverso la maschera spaziale regolare la sua posizione, se necessario.
    8. Ripetere l'operazione per l'orientamento finale (120 °, in esecuzione ordine 3).
    9. Controllare l'immagine dello strato branello fluorescente della fotocamera. Se i due fasci circolari non sono sovrapposte come illustrato nella Figura 2, poi riposizionare il piano campione iterativamente regolando la posizione della lente e la fotocamera obiettivo.
    10. Regolare la posizione obiettivo di sovrapporre i due fasci che porterà l'immagine fuori fuoco. Riposizionare la fotocamera per portare l'immagine di nuovo nel fuoco e mettere a punto l'obiettivo nel caso in cui due cerchi sono ancora visibili. Ripetere questa operazione fino a quando i due fasci si sovrappongono e una singola regione circolare è a fuoco.
    11. Una volta che la posizione del piano di campionamento è stato impostato, mantenere la posizione obiettivo fissa.
    12. Per confermare illuminazione TIRF, un'immagine di soluzione di colorante fluorescente, ad esempio per una lunghezza d'onda di eccitazione 488 nm, utilizzare una soluzione di 1081; M rodamina 6G.
      1. Portare il campione tintura a fuoco. Se i due fasci sono incidente con l'angolo TIRF corretto allora singole molecole saranno visibile senza elevato background, ei bordi dell'apertura circolare risulterà a fuoco. Vedere la Figura 2B-D per gli esempi di travi TIRF allineati e non allineati.
      2. Visualizzare ogni orientamento delle griglie finestrate a sua volta, e garantire che tutti i tre orientamenti forniscono l'illuminazione TIRF e che i due raggi si sovrappongono in corrispondenza del piano di campionamento. regolare con esattezza la posizione delle travi possono essere effettuate regolando DM3 specchio dicroico.
        Nota: Sebbene diverse lunghezze d'onda sono focalizzati a leggermente diverse posizioni causa assiale aberrazione cromatica, questo non è critica e può essere corretto applicando una costante z-offset alla posizione campione prima all'eccitazione con la seconda lunghezza d'onda.

    4. Sistema di sincronizzazione e calibrazione

    1. Posizionare il tallone monostrato sampio sull'obiettivo e mettere a fuoco.
    2. Programmare SLM utilizzando il software di controllo per visualizzare ciascuna delle immagini spostamento fase 3 a sua volta, per il primo orientamento pattern (0 °).
      1. Utilizzando il software di controllo SLM, passare a Ordine 4 dell'esempio repertorio di esecuzione.
      2. Configurare la fotocamera utilizzando il software di acquisizione (ad esempio HCImage) per l'uscita due segnali: uno positivo e uno negativo segnale di trigger TTL durante il periodo di esposizione globale. Nel software della fotocamera, in "Proprietà telecamera avanzate", impostare Uscita trigger Tipo 1 e 2 di "esposizione", e Output trigger Polarità 1 e 2 per "positivo" e "negativo", rispettivamente.
      3. Collegare l'uscita 1 e 2 della fotocamera al "Trigger" e gli ingressi "finire" del SLM, rispettivamente, utilizzando cavi coassiali. Il SLM è ora sincronizzato alla fotocamera.
    3. Acquisire una serie di 3 immagini.
      1. Nel riquadro "Sequenza", selezionare &# 34; Hard Disk Record ", come il tipo di scansione, e impostare il conteggio dei fotogrammi a 3.
      2. Fare clic su "Start" per acquisire 3 fotogrammi. Il modello SLM cambierà ad ogni esposizione. Le perline fluorescenti nell'immagine appariranno lampeggerà tra ciascuno dei 3 immagini. La quantità di lampeggio è una lettura fuori dal contrasto modulazione del pattern di illuminazione sinusoidale.
    4. Ruotare la polarizzazione del laser di eccitazione con il LCVR utilizzando software personalizzato per ottenere la polarizzazione azimutale e quindi il massimo contrasto di modulazione per l'orientamento determinato modello.
      1. Caricare il software di calibrazione LCVR.
      2. Immettere 0 e 8 per, rispettivamente, la tensione minima e massima.
      3. Fai clic su "Sweep LCVR tensione" per ruotare la polarizzazione.
        Nota: Il ritardo di LCVR è una funzione della temperatura e può spostarsi giorno per giorno, anche con controllo della temperatura. In questa fase, la polarizzazione azimutale ottimale si trova empiricamente Sweeping la tensione applicata tra il suo minimo e massima tensione che ha l'effetto di rotazione dell'incidente polarizzazione del campione. Il contrasto modulazione è calcolato per ciascuna tensione 25 e la tensione di picco che raggiunge contrasto viene utilizzata nelle seguenti procedure.
      4. Attendere che il processo di calibrazione per completare, e annotare la tensione misurata.
    5. Ripetere questo processo di calibrazione per i restanti due orientamenti reticolo (60 ° e 120 °) e ciascuna delle lunghezze d'onda di eccitazione.
    6. Sincronizzare l'esposizione della fotocamera con il LCVR, laser, ruota portafiltri emissioni e piezo Z-fase 26. Per fare questo, utilizzare una scheda di acquisizione dati ad alta velocità (DAQ) come sorgente di clock master per il sistema, e l'uso del SLM LED di abilitazione segnale di uscita per modulare i laser (vedi Figura 3B).
      Nota: L'implementazione specifica dipende dai componenti utilizzati, ma l'uso di un dispositivo DAQ ad alta velocità tri digitalla sincronizzazione e controllo del LCVR utilizzando una tensione analogica, controllato via software gger, è raccomandato. Il software di controllo utilizzato in questo protocollo è disponibile su richiesta.
    7. A causa assiale aberrazione cromatica, per ogni lunghezza d'onda, anche applicare un z-offset alla fase di campionamento.
      1. Determinare l'offset sperimentalmente, concentrandosi su un campione monostrato multicolore tallone alla prima lunghezza d'onda (ad es. 488 nm), poi il passaggio al secondo (ad es. 640 nm). Le perle saranno ora fuori fuoco.
      2. Ridefinire le perline e misurare il cambiamento di posizione z che era necessario. Questo offset può poi essere applicata al piezo z stadio ogni volta la lunghezza d'onda di eccitazione è cambiato.
    8. Utilizzando il software di controllo SLM, accendere il ordine di marcia SLM per la serie completa di 9 immagini grata binari necessari per TIRF-SIM. Questo è Order 0 Esecuzione nell'esempio repertorio.
    9. Utilizzando il software di controllo della fotocamera, acquisire 9 immagini del campione tallone. Nel riquadro "Sequenza" del software della fotocamera, selezionare "Disco Record hard", come il tipo di scansione, e cambiare il conteggio dei fotogrammi a 9.
    10. Fai clic su "Start" per acquisire le immagini.
    11. Salvare le immagini acquisite come file TIFF selezionando "TIFF", come il tipo di immagine nella finestra "Salva Buffered Images", e fare clic su OK.
  • Ricostruire una immagine super-risoluzione delle immagini TIFF prime utilizzando il software commerciale o personalizzato per convalidare il miglioramento della risoluzione su TIRF standard.
    Nota: Per il nostro microscopio usiamo ricostruzione del codice personalizzato sviluppato sia in-house e dal Dr. Lin Shao 27.
  • Representative Results

    Perline fluorescenti multicolore di diametro 100 nm sono stati ripresi per confrontare TIRF standard per TIRF-SIM e quantificare il miglioramento ottenibile nella risoluzione laterale (Figura 4A - B). Ricostruzione dei telai grezzi in immagini super-risoluzione è stata effettuata utilizzando algoritmi standard come descritto in letteratura 27,28. Si può notare che TIRF-SIM ha chiaramente significativamente superiore laterale risoluzione rispetto a TIRF. La funzione di diffusione di punto (PSF) di un microscopio è ben approssimata dalla immagine di una singola perlina fluorescente dimensioni sub-diffrazione, quindi la PSF e la risoluzione può essere quantificato sagomata funzioni gaussiane 2D alle singole perline per ciascuna lunghezza d'onda. La risoluzione stimata del microscopio in base al valore medio della larghezza a metà massimo (FWHM) è 89 nm e 116 nm per 488 e 640 nm TIRF-SIM rispettivamente (Figura 4C). Ciò corrisponde ad un impro duplicevimento in risoluzione laterale per entrambe le lunghezze d'onda rispetto al caso limite di diffrazione teorico. Fibrille amiloidi fluorescente sono anche un campione di prova eccellente per dimostrare risoluzione raddoppiata (Figura 4D). Fibrille amiloidi sono formati in vitro incubando β-amiloide marcato con 10% coloranti rodamina derivati ​​(488 nm di eccitazione) per 1 settimana e, successivamente, di imaging con TIRF-SIM. Vedi riferimento 12 per ulteriori informazioni.

    Strutture subcellulari con elevato contrasto, come emGFP etichettati microtubuli (Figura 5B, G) o LifeAct-GFP (Figura 5D) sono ideali per l'imaging TIRF-SIM e la resa ad alto contrasto immagini super-risoluzione. immagini TIRF-SIM utilizzando il setup descritto in questo protocollo permette l'osservazione di una sotto-popolazione di microtubuli si trovano in prossimità della corteccia cellule basali, e microtubuli polimerizzazione e depolimerizzazione può be visto nel corso del tempo (figura animata 1). Non tutti i campioni sono suscettibili di l'imaging con TIRF-SIM, in particolare, i campioni a basso contrasto, senza strutture discrete. Le cellule che esprimono GFP citosolico mancano di informazioni ad alta risoluzione a parte ai bordi della membrana plasmatica (Figura 5F, H e animata Figura 2) e sono quindi non ottimale per l'imaging TIRF-SIM come le ricostruzioni risultanti sono immagini essenzialmente TIRF sovrapposte con artefatti. In tali campioni, l'aumento di contrasto può spesso essere attribuita alla fase deconvoluzione dell'algoritmo di ricostruzione.

    Alto contrasto modulazione è essenziale per l'imaging SIM successo. La trasformata di Fourier dell'immagine ricostruita permette la visualizzazione della funzione di trasferimento ottico SIM (OTF) (Figura 6A, riquadro). Senza massimizzare il contrasto di modulazione per ciascun orientamento garantendo azimutale polarezione con un rotatore di polarizzazione, vi è molto poco modulazione delle informazioni ad alta risoluzione nel campione porta ad un basso rapporto segnale-rumore nelle bande passanti SIM. Algoritmi di ricostruzione che utilizzano l'approccio filtro standard Wiener semplicemente amplificare il rumore nelle bande passanti SIM e cedere un'immagine che è essenzialmente un'immagine TIRF serie sovrapposte con esagonale (o "honeycomb") suoneria artefatti (Figura 6A, pannello di destra). Un eventuale potenziamento potrebbe essere l'uso di iterativi 29,30 o ciechi algoritmi di ricostruzione 31,32 per ridurre questi artefatti seconda del tipo di campione. Si consiglia l'uso del plug ImageJ SIMcheck per controllare la qualità dei dati di SIM, prima e dopo la ricostruzione 33.

    Figura 1
    Figura 1:. Layout della Setup Multicolor TIRF-SIM La TIRF-SIM microscope compone di tre parti principali, l'unità di generazione del fascio, l'unità di proiezione del modello, e l'unità di rilevamento. Nell'unità di generazione del fascio, tre diversi laser sono allineati sullo stesso percorso ottico con specchi dicroici (DM1 e DM2) e diretto attraverso quattro elementi ottici per il controllo di polarizzazione. Innanzitutto, un polarizzatore (P) assicura la purezza dello stato di polarizzazione lineare di ciascuno dei fasci laser. I seguenti tre elementi ottici sono necessari per ruotare la polarizzazione in maniera automatizzata veloce come descritto in dettaglio nel testo. Successivamente, due lenti (L1 e L2) in una configurazione telescopio espandere il fascio per abbinare la superficie attiva della luce spaziale del modulatore (SLM) e sono diffratti in tre fascetti da modelli grata binari proiettati del SLM (esempi sono mostrati in piastrelle 1- 9). Lo stato di polarizzazione della luce di illuminazione rispetto al modello SLM è mostrato come una freccia. Un secondo telescopio (L3 e L4) de-ingrandisce il modello e offre accesso a the Fourier piano del modello SLM. In questo piano una maschera spaziale (SM) è utilizzato per filtrare il componente centrale e gli altri componenti di diffrazione indesiderate dalla struttura del pixel SLM e il suo cablaggio interno. Prima che i due fasci rimanenti sono focalizzati sul piano focale posteriore dell'obiettivo (OB) attraverso il condensatore ottico (L5), due specchi dicroici (DM3 e DM4) sono inclusi nel setup. DM4 agisce come uno specchio dicroico convenzionale in microscopia a fluorescenza per illuminazione separata dalla luce di emissione. Tuttavia, questo specchio induce inevitabilmente ellitticità nello stato di polarizzazione della luce di illuminazione che può essere compensata da DM3, uno specchio dicroico dalla posizione dello stesso lotto come DM4. L'obiettivo ad immersione TIRF ha una grande abbastanza NA per lanciare direttamente due onde contro-moltiplicazione sul vetrino che si riflettono totalmente e dare origine a un campo evanescente strutturata nel vetrino. Il campione è montato su una fase di traduzione xyz. La rilevazione è perfORMED attraverso lo stesso DM4 obiettivo e in trasmissione, più un ulteriore filtraggio dai filtri passa-banda di emissione, montato in una ruota portafiltri controllato dal computer (EFW). Infine, l'immagine viene proiettata su una telecamera sCMOS dalla lente del tubo del microscopio interna (L6). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    Figura 2:. L'allineamento di sovrapposizione Travi (A) Un reticolo modello SLM finestrato con un'apertura circolare è utile per l'allineamento. Se due fasci non sovrapposti sono visibili sulla fotocamera (sinistra), allora la posizione del piano campione deve essere riposizionata iterativamente la regolazione delle posizioni assiali della lente obiettivo e la telecamera che invia un singolo punto di illuminazione circolare (destra). Le travi devono sovrapporsi in order per produrre il modello di eccitazione sinusoidale richiesto per TIRF-SIM. Se il fascio non pienamente sovrappongono questo riduce il campo visivo sul quale si forma la figura di interferenza. (B e C) Il valore preciso di incidenza dei fasci è importante per TIRF-SIM. Se l'angolo è corretto, una delle travi non sarà l'angolo richiesto per TIRF e questo è facilmente visibile quando l'imaging una soluzione colorante fluorescente. Un fascio ha un angolo di incidenza maggiore dell'angolo critico che produce il punto circolare, e l'altro non, che porta alla striscia luminosa a sinistra dell'immagine in (B). (D) Regolazione dell'angolo di specchio DM3 assicura entrambi i fasci sono incidente allo stesso angolo, e questo può essere convalidato dal defocalizzazione dell'obiettivo: se è allineato correttamente, la proiezione xz di z pila di un campione colorante fluorescente dovrebbe mostrare due simmetricamente intersecano travi con sfondo trascurabili almessa a fuoco. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3:. Sincronizzazione dipendenze delle diverse componenti del sistema (A) per l'acquisizione veloce di SIM, la sincronizzazione dei componenti del sistema utilizzando una soluzione basata su hardware è essenziale. (B) Una scheda di acquisizione dati (DAQ) dovrebbe essere usato come un trigger master. Un segnale TTL dalla scheda DAQ viene inviato alla ingresso esterno sCMOS e utilizzato per attivare l'esposizione della fotocamera. L'uscita Esposizione globale telecamera attiva poi il SLM per visualizzare un modello reticolo, e SLM LED abilitazione uscita è usata per modulare digitalmente l'eccitazione laser in modo che il laser è unico emette quando i pixel SLM sono nello stato "on". Dopo l'esposizione è complete, l'uscita Esposizione globale telecamera viene usato per avanzare il modello SLM alla successiva fase di reticolo o angolazione. La scheda DAQ emette anche una tensione analogica al controllore LCVR per controllare lo stato di polarizzazione lineare del fascio di illuminazione. Questa tensione viene commutata dopo l'acquisizione delle immagini 3 di fase per ogni angolo di pattern. Dopo l'acquisizione di 9 immagini per una singola lunghezza d'onda, la scheda DAQ emette un segnale al controller ruota portafiltri emissioni, e passa a quello successivo lunghezza d'onda. La scheda DAQ si applica anche un z-offset al campione tramite emissione di una tensione analogica al controller Z-fase piezo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4: TIRF-SIM Imaging di test campioni di 100 nm perline multicolore e fluorescenti Labelled amiloidi fibrille. (A e B) Confronto di standard di TIRF rispetto alle ricostruzioni TIRF-SIM per i 488 nm e 640 nm di eccitazione. (C) Istogramma di mezza massimo full-width (FWHM) di gaussiana si adatta alle perline TIRF-SIM che mostrano il miglioramento risoluzione prevista. (D) TIRF rispetto TIRF-SIM di fibrille beta-amiloide marcati con 10% rodamina colorante derivato (488 nm di eccitazione). Scala bar = 1 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5:. Live Cell TIRF-SIM Imaging confronto di TIRF convenzionale e TIRF-SIM immagini di (B, A) microtubuli (tubulina emGFP-) in una cella di HEK293, (C, D (E, F) GFP citosolico in una cella HEK293. Immagini in B ed F sono punti di tempo singoli dai film. Aree in scatola sono mostrati ingranditi a (G, H). Scala bar = 3 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 6
    Figura 6:. Influenza della polarizzazione rotatore su immagini ricostruite branello (A) senza l'uso di un rotatore di polarizzazione come un LCVR, il rapporto segnale-rumore nelle bande passanti SIM è basso che si traduce in caratteristici manufatti esagonali ricostruito SIM immagini (a destra), (B) in 2D-SIM, gli schemi di illuminazione strutturati sono direttamente visibili nella Fouriertrasformare delle immagini prime (sinistra, eccitazione frequenza spaziale evidenziata) che cadono entro il raggio del supporto OTF emissioni, tuttavia in TIRF-SIM, sono al di fuori del supporto OTF e quindi non visibili (a destra). In questo caso, il contrasto di modulazione modello deve essere valutata utilizzando un monostrato tallone sparse, come indicato nel protocollo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 7
    Figura 7:. Spaziale luce modulatore Sulla base del modello Generazione consente l'implementazione di altre modalità di imaging, come multifocale SIM (A) In MSIM, un reticolo di piazza pointsdisplayed sulla SLM (nel riquadro) produce un reticolo di diffrazione di focolai limitata al piano dell'immagine. Un sottile strato di bassa concentrazione rodamina 6G è ripreso a visua Lize fuochi. Il modello è tradotto in tutto il campione (B) e l'immagine raw z-stack acquisita viene ricostruita per generare un'immagine con ridotta out-of-focus luce (C). Scala bar = 5 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Film 1 Telaio
    Animated Figura 1:. Time Series film di EmGFP-tubulina in una cella HEK293 polimerizzazione rapida e depolimerizzazione dei microtubuli emGFP etichettati possono essere osservate con TIRF-SIM. Immagini acquisite con 50 msec di tempo di esposizione al telaio grezzo (450 msec per fotogramma SIM) distanziati ad intervalli di 0,5 sec. Tempo di esposizione utilizzata è stata limitata dalla luminosità del fluoroforo, non dalla velocità della fotocamera o SLM. 3988movie1.mov "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare questo video.

    Movie 2 Telaio
    Animated Figura 2:. Time Series film di citosolico GFP in una cella HEK293 Campioni con basso contrasto di questo tipo non sono campioni ideale per l'imaging TIRF-SIM. flusso membrana retrograda si può vedere nelle immagini TIRF ma TIRF-SIM non fornisce tutte le informazioni supplementari a parte ai bordi delle celle. Immagini TIRF-SIM sono state acquisite utilizzando 50 msec tempo di esposizione al telaio grezzo (450 msec per fotogramma SIM) distanziati ad intervalli di 5 sec. Cliccate qui per vedere il video.

    Supplemental file di codice: file di repertorio Esempio SLM (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).d / 53988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_001.bmp) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_002.bmp) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_003.bmp) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplemental file di codice: Esempio SLM repertoire del file (period9_004.bmp). Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_005.bmp) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_006.bmp) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_007.bmp) Clicca qui per scaricare il file.

    Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_009.bmp) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_mask_1.bmp) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_mask_2.bmp) Clicca qui per scaricare il file. >

    Supplementare Codice File:. File di repertorio Esempio SLM (period9_mask_3.bmp) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. Esempio SLM file di repertorio (TIRF-SIM_example.rep) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. Esempio codice generazione grata (1 di 2) (generate_gratings.m) Clicca qui per scaricare il file.

    Supplemental file di codice: esempio di codice reticolo generazione (2 di 2) (circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> Clicca qui per scaricare il file.

    Supplementare Codice File:. Codice di esempio per calcolare il contrasto di modulazione (calculate_contrast.m) Clicca qui per scaricare il file.

    Discussion

    sistemi TIRF-SIM custom-built, come la messa a punto in dettaglio in questo protocollo sono in grado di immagini multicolore super-risoluzione ad alta velocità rispetto ai microscopi disponibili in commercio. Il vantaggio intrinseco di SIM come tecnica super-risoluzione è che la risoluzione temporale non è limitata dalle fotofisica del fluoroforo, rispetto ad altri metodi come singola molecola di localizzazione microscopia (SMLM) o metodi di scansione di punti come la microscopia esaurimento emissione stimolata ( STED). A differenza di queste altre tecniche, SIM non richiede fluorofori photoswitchable o esauribili così immagini multicolore è semplice. Sistemi non TIRF-SIM, come ottica sezionamento SIM e multifocale SIM solito possono ottenere miglioramenti risoluzione di 1,7 volte o meno in pratica rispetto al fattore di 2 miglioramento qui riportato, e sistemi commerciali sono spesso più lento e meno flessibile rispetto al sistema presentato in questo protocollo.

    "> Le due principali difficoltà di attuazione di questa tecnica sono in primo luogo la necessità di posizionamento preciso dei sei travi SIM all'interno della zona TIR di apertura posteriore del obiettivo, che richiede un tempo laboriosa e consumare procedura di allineamento ottico. In secondo luogo, per produrre alto contrasto del modello il campione, la rotazione polarizzazione è essenziale. per sistemi a bassa NA 2D-SIM, la rotazione polarizzazione può essere evitata da un'attenta scelta dell'orientamento polarizzazione lineare, ma questo diventa impossibile per TIRF-SIM 25. per l'imaging multicolore ad alta velocità, elettro controllo della polarizzazione ottica è necessario e questo aumenta la complessità ei costi di sistema.

    Limitazioni della tecnica

    TIRF-SIM, come TIRF convenzionale, è naturalmente limitato all'osservazione di strutture e processi situati sulla membrana cellulare basale che può essere illuminata dalla profondità di penetrazione 150-200 nm campo evanescente biologici. MentreSIM è spesso citato come meno photodamaging di cellule rispetto sia STED o SMLM, risoluzione raddoppio laterale fa ancora aumentare il numero di fotoni da almeno 4 volte 5 rispetto alla microscopia TIRF convenzionale. Per l'imaging ad alte frequenze di fotogrammi con esposizioni brevi tempi, questo aumento di fotoni richiede l'utilizzo di un aumento delle intensità di illuminazione. Mentre ogni fluoroforo può essere utilizzata per l'imaging SIM di campioni movimento fissi o lente, proteine ​​fluorescenti ad alta luminosità o di prossima generazione coloranti sintetici con maggiore fotostabilità sono raccomandati per l'imaging cellulare dal vivo.

    Sebbene questa implementazione è capace di imaging di un singolo colore alla SIM frame rate superiori a 20 Hz, imaging multicolore nel sistema presentato è limitata dal tempo di commutazione della ruota motorizzata filtro per le emissioni. A causa delle grandi dimensioni del chip fotocamera sCMOS, l'uso di un filtro di emissione multibanda e immagine ottica scissione sarebbe possibile e permettere i simultaneaMaging con più lunghezze d'onda a nessuna penalità velocità. Un'altra possibilità sarebbe quella di alternare i diversi laser di eccitazione e utilizzare un filtro notch multibanda per respingere la luce di eccitazione. L'uso di un SLM ferroelettrico binario in questa implementazione non è ottimale. L'efficienza di diffrazione di tale SLM è molto bassa, quindi la maggior parte della luce incidente è nella riflessione di ordine zero, che viene filtrato dalla maschera spaziale. Per applicazioni che richiedono molto elevati frame rate, la velocità di imaging è quindi limitata dalla potenza dei diodi laser. Il SLM introduce anche alcune ellitticità nella polarizzazione per lunghezze d'onda di distanza dalla lunghezza d'onda 550 nm disegno dove i pixel non operano piastre semionda come ideali. Sebbene questo potrebbe essere compensato utilizzando un LCVR aggiuntivo, la soluzione ideale può essere l'uso di un dispositivo di micro-specchio digitale (DMD) come generatore di pattern.

    eventuali modifiche

    Il Prese di installazionented qui è flessibile e più facilmente modificati rispetto agli strumenti commerciali in modo da altre modalità di imaging come il 3D-SIM, veloce 2D-SIM, multifocale SIM (MSIM) e SIM non lineare (NL-SIM) possono essere implementate 21,34,35.

    2D-SIM può essere adatto per l'imaging relativamente piatto, strutture in rapido movimento, come il reticolo endoplasmatico periferica. La ER periferico è più profondo all'interno della cellula che può essere illuminato con un campo evanescente TIRF, ma a causa della sua struttura piatta può essere ripreso con standard di 2D-SIM con trascurabile sfondo out-of-focus. Inoltre, l'uso di migliori algoritmi di ricostruzione sezionamento ottico per sopprimere out-of-focus luce estendere l'uso del 2D-SIM per otticamente campioni di spessore, sia pure in cui la risoluzione assiale raddoppio non è richiesto 21.

    In MSIM, il campione viene illuminato da un reticolo rada di eccitazione foci 36. Questa modalità può essere attuata semplicemente rimuovendo la maschera spaziale (SM) E la sua sostituzione con un polarizzatore. Il SLM ora funziona come un modulatore di ampiezza. Le griglie SIM binari visualizzate sul SLM possono essere sostituiti da un reticolo 2D di macchie, con la dimensione dei punti scelti per essere uguale alla dimensione di diffrazione limitata attenzione nel piano immagine. Nella Figura 7A, un reticolo di 4 x 4 pixel quadrati viene visualizzato sul SLM (riquadro) che quando demagnified sul campione genera diffrazione foci limitato di 150 x 150 nm, date le dimensioni SLM pixel fisica di 13,62 micron. La foci eccitazione può poi essere tradotto spostando il modello reticolare sulla SLM e questo si ripete più volte al fine di illuminare l'intero campo visivo. Le immagini vengono acquisite per ogni posizione schema tradotto e lo stack è post-elaborati per ottenere una immagine ricostruita con una migliore risoluzione fino a un fattore di Equazione e ridotto out-of-focus luce rispetto all'immagine widefield equivalente30. Questa modalità può essere utile per l'imaging spessi campioni, densi che SIM standard è inadatto, ad esempio strutture a basso contrasto come globuli rossi macchiati (figura 7C), anche se il tempo di acquisizione viene aumentato a causa del gran numero di fotogrammi prime richiesto per ogni campo di vista (in questo caso N = 168).

    Infine, la configurazione può essere modificato per consentire sia di alta NA lineare TIRF-SIM o l'attivazione fantasia non lineare SIM (PA NL-SIM), così come presentato di recente da Li et al., Mediante l'uso di un 1,7 oggettiva NA altissima o aggiunta di un laser fotoattivazione 405 nm e un'attenta ottimizzazione delle SLM modelli grata 35.

    Applicazioni future

    SIM è ancora una tecnica in rapida evoluzione e molte applicazioni nelle scienze della vita verrà attivato in futuro. La velocità, la risoluzione, e miglioramenti di contrasto della tecnica e la capacità di utilizzare fluorofori standard di mean che per bioimaging, SIM è impostato per sostituire molti sistemi microscopio convenzionali, quali le piattaforme campo confocale e larghezza. sistemi SIM commerciali sono già disponibili oggi con le specifiche tecniche eccezionali, tuttavia, sono al di là della portata finanziaria di molti laboratori di ricerca, e, soprattutto, sono inflessibili essere modificate e sviluppate per implementare i più recenti sviluppi della ricerca in questo campo. Mancano anche la capacità essenziale 'essere adattato per l'esperimento a portata di mano', spesso un collo di bottiglia critica nel taglio della ricerca delle scienze della vita bordo. Il sistema qui descritto sarà particolarmente adatto per lo studio dei processi dinamici vicino alla superficie delle cellule, per gli studi in vitro su sistemi doppio strato ricostituiti, per studiare chimica di superficie nei materiali e delle scienze fisiche, ad es. di materiali 2D, e molte altre applicazioni.

    Disclosures

    Acknowledgements

    Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Leverhulme Trust, l'Ingegneria e Scienze Fisiche Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089.703 / Z / 09 / Z] e Medical Research Council [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Ringraziamo E. Avezov e M. Lu per trasfezione del LifeAct-GFP e cellule citosolica-GFP, rispettivamente, e W. Chen per la preparazione della cultura HEK293. Ringraziamo anche K. O'Holleran per l'assistenza con il design del microscopio, e L. Shao e R. Heintzmann per le discussioni e suggerimenti utili.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    488 nm laser Toptica iBeam SMART with digital modulation
    561 nm laser Coherent OBIS LS with digital modulation
    640 nm laser Cobolt MLD with digital modulation
    Long-pass dichroic mirrors  Thorlabs for combining excitation beams
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc From same batch as above, 25 x 25 mm
    1" square kinematic mount Edmund Optics 58-860
    Glan-Taylor calcite polarizers Thorlabs GT5-A For alignment of LCVR
    Glan-Taylor mount Thorlabs SM05PM5
    Achromatic half wave plate Thorlabs AHWP05M-600 400-800 nm
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M For HWP
    Liquid Crystal Variable Retarder Meadowlark Optics SWIFT Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
    LCVR controller Meadowlark Optics D3060HV Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
    Achromatic quarter wave plate Meadowlark Optics AQM-100-0545
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1P/M For QWP
    10 mm achromatic doublet Thorlabs AC080-010-A-ML For beam expander
    200 mm achromatic doublet Thorlabs AC254-200-A-ML For beam expander
    Cage XY Translators Thorlabs CXY1
    Ferroelectric spatial light modulator Forth Dimension Displays M0787-00249     SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board
    SLM mounting frame Forth Dimension Displays M0787-10014 Fixed to custom built aluminium mount
    Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount Thorlabs GM200/M For SLM mounting
    Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform Thorlabs XYR1/M For SLM mounting
    Rail carrier Newport M-PRC-3 For SLM mounting
    Precision Optical Rail Newport PRL-6 For SLM mounting
    300 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 273 322  f = 300 mm, 31.5 mm diameter
    140 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 239 322 f = 140 mm, 31.5 mm diameter
    Precision XY Translation Mounts Thorlabs LM2XY
    Lens Mounting Adapters Thorlabs SM2AD32 For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
    Translation stages Comar 12XT65 Dovetail, side drive
    XY Translator with Differential Drives Thorlabs ST1XY-D/M for spatial filter
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M for spatial filter
    300 mm achromatic doublet Thorlabs AC508-300-A-ML Excitation tube lens
    Automated XY stage with Z-piezo top plate ASI PZ-2150-XYFT-PZ-IX71  with MS-2000 controller
    Inverted microscope frame Olympus IX-71
    Objective lens Olympus UAPON100XOTIRF 100X/1.49NA
    High speed filter wheel Prior Scientific HF110A with Prior ProScan III controller
    Bandpass emission filters Semrock FF01-525/30, FF01-676/29
    sCMOS camera Hamamatsu ORCA Flash v4.0
    Stage top incubator OKO Lab H301-K-FRAME For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
    Stainless steel optical posts Thorlabs TR series for mounting optical components
    Post holders Thorlabs PH series for mounting optical components
    Kinematic mirror mounts Thorlabs KM100 for mounting 1" mirrors
    Shearing interferometer Thorlabs SI100
    100 nm fluorescent microspheres Life Technologies T-7279 Tetraspeck
    Rhodamine 6G Sigma Aldrich 83697-250MG
    8 well glass bottom dishes ibidi 80827 with #1.5 coverglass
    Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155409 with #1.5 coverglass
    0.01 mm microscope reticle slide EMS 68039-22
    CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher Scientific C10613

    References

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