من خلال المرآة: المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية من الخلايا واحدة لدراسة العلاج المضادة للسرطان

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

استجابة الخلايا وحيدة إلى الأدوية المضادة للسرطان تساهم بشكل كبير في تحديد استجابة السكان، وبالتالي تعتبر عاملا رئيسيا يسهم في النتيجة الإجمالية. Immunoblotting، التدفق الخلوي والتجارب خلية ثابتة وغالبا ما تستخدم لدراسة كيفية استجابة الخلايا للأدوية المضادة للسرطان. وهذه الأساليب هي مهمة، ولكن لديهم العديد من أوجه القصور. التباين في ردود المخدرات بين السرطان والخلايا الطبيعية، وبين خلايا المنشأ السرطانية المختلفة، وعابرة وردود نادرة من الصعب أن نفهم باستخدام فحوصات المتوسط ​​السكان ودون أن تكون قادرة على تتبع مباشرة وتحليلها بشكل طولي. المجهر بشكل خاص مناسبة تماما لصورة الخلايا الحية. التطورات في مجال التكنولوجيا تمكننا من روتيني خلايا الصورة في القرار الذي تمكن ليس فقط تتبع الخلية، ولكن أيضا مراقبة مجموعة متنوعة من الاستجابات الخلوية. وصفنا هذا النهج في التفاصيل التي تسمح للتصوير المستمر الوقت الفاصل بينالخلايا خلال الاستجابة للدواء لفي الأساس طالما رغبت في ذلك، عادة ما يصل إلى 96 ساعة. استخدام الاختلافات في النهج، وخلايا يمكن رصدها لأسابيع. مع توظيف المشفرة وراثيا أجهزة الاستشعار الفلورسنت العديد من العمليات، ومسارات والاستجابات يمكن اتباعها. وتبين لنا الأمثلة التي تشمل تتبع النوعي والكمي لنمو الخلايا وتقدم دورة الخلية، وديناميات كروموسوم، الحمض النووي من التلف، وموت الخلايا. نحن أيضا مناقشة الاختلافات في الأسلوب ومرونته، وتسليط الضوء على بعض المخاطر المشتركة.

Introduction

المجهر الخلية الحية وتتبع طولية من الخلايا واحدة ليست تقنية جديدة. من أقرب المجاهر، وقد لاحظ المتحمسين والعلماء ودرس الخلايا وحيدة والكائنات، تصرفاتهم، والتنمية 1-3. ومن الأمثلة الشهيرة من أواخر ديفيد روجرز في جامعة فاندربيلت في 1950s يظهر العدلات الإنسان في بقعة من الدم مطاردة بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية، وفي نهاية المطاف عملية البلعمة (4). هذا الفيلم الخلية الحية هو مثال ممتاز لكيفية عمليات متعددة يمكن ملاحظتها والمترابطة في تجربة واحدة: الاستشعار من التدرج الكيميائية، والميكانيكا وسرعة الحركة خلية، خلية الأشكال ديناميكية، التصاق، والبلعمة من العوامل المسببة للأمراض.

وقد أدى ظهور المجاهر مؤتمتة بالكامل والكاميرات الرقمية حساسة للغاية في أعداد متزايدة من المحققين باستخدام المجهر لطرح الأسئلة الأساسية في بيولوجيا الخلية تتراوح ومدمج كيف تتحرك خلايا 5،6 و 7،8 تنقسم إلى العضيم ديناميات والاتجار غشاء 9-11. غير الفلورسنت، المجهري brightfield، بما في ذلك على النقيض من المرحلة (PC)، الذي حصل على جائزة نوبل للفريتس زيرنيكه في عام 1953، وعلى النقيض تدخل الفرق (DIC) تسمح لمراقبة خلايا ونوى ولكن أيضا الهياكل الفرعية الخلوية بما في ذلك حزم أنيبيب ، الكروموسومات، نويات، وديناميات العضيم، وألياف الأكتين سميكة 12. المشفرة وراثيا البروتينات الفلورية وتطوير الأصباغ الفلورية ضد عضيات أثرت بشكل كبير الوقت الفاصل بين المجهري 13-15. في حين لم يكن التركيز في هذه المادة، والتصوير في الكروية خلية وفي الموقع (intravital المجهري) باستخدام متحد البؤر والفحص المجهري multiphoton تمثل توسع آخر لهذا النهج، وهناك مواد المعلقة التي تستخدم ومناقشة هذه النهج 16-19.

ردود الخلايا لمكافحة كانكونيتم تحديد المخدرات إيه أو المنتجات الطبيعية على المستوى الجزيئي والخلوي. العلاج فهم استجابات الخلايا ومصائر التالية غالبا ما ينطوي على المقايسات سكان المتوسط ​​(على سبيل المثال، immunoblotting، تدابير جيدا الكاملة)، أو الوقت نقطة ثابتة مع كشف مناعي والتدفق الخلوي، التي تقيس الخلايا وحيدة. الاختلاف في استجابة خلية واحدة إلى المخدرات ضمن مجموعة من السكان، ولا سيما في الأورام، قد يفسر بعض التباين في استجابة ينظر عبر خطوط الخلايا والأورام التي يتم التعامل مع نفس الدواء في التشبع. على المدى الطويل نهج طولية لمتابعة خلية واحدة معينة أو مجموعة من الخلايا هو نهج أقل شيوعا ولكنها قوية جدا التي تسمح للدراسة مباشرة لمسارات استجابة الجزيئية، الظواهر المختلفة (على سبيل المثال، موت الخلية أو انقسام الخلية)، ومراقبة تقلب الخلية الى خلية ضمن مجموعة من السكان، وكيف أن هذه العوامل تساهم في ديناميات استجابة السكان 20-22. بتفاؤل، أن تكون قادرةلمراقبة وقياس ردود خلية واحدة سوف تساعد على تحسين فهمنا لكيفية عمل الأدوية، لماذا فشلوا في بعض الأحيان، وكيفية استخدامها أفضل.

تقنية طويلة الأجل الوقت الفاصل بين المجهري، وتتبع الطولي، وتحليل استجابات المخدرات هي متاحة لكثير من المحققين ويمكن أن تكون بسيطة، وذلك باستخدام الضوء فقط تنتقل إلى مراقبة ردود النمط الظاهري 20،21. المكونات الرئيسية لهذا النهج ما يلي: إعداد مناسب من الخلايا من الفائدة، المجهر الآلي مع الغرفة البيئية، متكاملة الكاميرا مع جهاز الكمبيوتر للحصول على وتخزين الصور، وبرامج لإعادة النظر في الوقت الفاصل بين وقياس وتحليل الخلايا وأية أجهزة الاستشعار الفلورسنت. ونحن نقدم بروتوكول مفصلة مع العديد من النصائح لإجراء الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الخلايا المستزرعة لطالما عدة أيام باستخدام brightfield و / أو widefield المجهر epifluorescent. ويمكن استخدامها في أي خط الخلية التي يمكن زراعتها في ثقافة هذا البروتوكوللدراسة ردودهم على العلاجات المضادة للسرطان. نحن نقدم أمثلة على البيانات التي حصل عليها وتحليلها باستخدام متعددة مختلفة أجهزة الاستشعار الفلورسنت المشفرة وراثيا ومثال على المرحلة المجهري على النقيض، ومناقشة لفترة وجيزة أنواع مختلفة من تحقيقات، ومزايا وعيوب على المدى الطويل الوقت الفاصل بين وتتبع الطولي، ما يمكن أن يكون علمت لهذا النهج الذي يصعب فهمه من النهج غير المباشرة، وبعض الاختلافات التي نأمل أن تكون ذات فائدة وقيمة للباحثين عديمي الخبرة الذين لا يعتبر استخدام هذا النهج، والباحثين من ذوي الخبرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يستخدم بروتوكول التالية المعلمات التي تحددها التجارب في أرقام 4 و 6 بشأن إعدادات اقتناء والظروف التجريبية. العديد من هذه المعايير يمكن تعديلها لتناسب تجارب أخرى (أي التعرض مرات، binning، قنوات الفلورسنت، الخ.). ويجب على جميع إجراءات الانضمام إلى المبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية وأن تتم الموافقة عليها من قبل لجنة السلامة الأحيائية المؤسسية. تحتوي مواقع تصنيع المجهر معلومات ممتازة لتصوير الخلايا الحية.

1. المجاهر والتصوير البرمجيات

  1. أداء تصوير الخلايا الحية على مجموعة واسعة من المجاهر المقلوب. وwidefield المجاهر الأكثر شيوعا epifluorescence ومتحد البؤر القرص الغزل. هنا، استخدام المجهر widefield epifluorescence الآلي ويجهز مع 200 واط مصدر الضوء معدن هاليد.
  2. الحصول على مرحلة أعلى أو المجهر غرفة البيئية. هنا، استخدم مرحلة تيغرفة البيئية المرجع.
  3. استخدام البرمجيات التجارية لتشغيل المجهر مع المرافق لتنفيذ الوقت الفاصل بين المجهري.
  4. استخدام البرمجيات المتاحة تجاريا أو يماغيج لتحليل الصور. العديد من الأدوات التحليل الأخرى المتاحة تجاريا، وهناك برامج حسب الطلب وكثير منها قد تم نشرها 8،18.

2. تصور العمليات الخلوية والردود المظهري

  1. تصور الخلايا مع المجهري brightfield. التفاضلية النقيض من التدخل والطوري وحدها يمكن أن يكون مفيدة للغاية لدراسة الردود على الردود دواء مضاد للسرطان. ويمكن أن تشمل هذه العمليات الانقسام، حركية الخلية وموت الخلايا المبرمج.
  2. تصور هياكل الخلية، عضيات والعمليات مع أجهزة الاستشعار الفلورسنت. تحقيقات الفلورسنت هي برامج إعلامية في تتبع عمليات التحت خلوية محددة. ويمكن أن تشمل هذه الديناميات أنيبيب، الميتوكوندريا وديناميكية الشبكة الإندوبلازمية، تراكم البروتين والتعريب، والإشارات الجزيئية (على سبيل المثال، الفسفرة، الكالسيوم).

3. إعداد العينات

  1. زراعة خلايا في أطباق شهادة زراعة الخلايا في مستوى والثقافة خلية ترطيب حاضنة (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 80٪ الرطوبة النسبية).
    1. زراعة خلايا HT1080 في MEM مع EBSS. استكمال وسائل الإعلام مع 10٪ FBS ت / ت، 1٪ ت / ت القلم / بكتيريا، 1٪ ت / ت البيروفات الصوديوم و 1٪ ت / ت الأحماض الأمينية غير الأساسية.
  2. يومين قبل التصوير، وخلايا لوحة 50،000 HT1080 FUCCI إلى 3 آبار من صحن القاع 12-جيدا # 1.5 الزجاج في العقيمة هود الصفحي التدفق شهادة. ضبط عدد من الخلايا مطلي إلى تحقيق ~ 60٪ التقاء لبدء التجربة. اعتمادا على خط الخلية وطبيعة التجربة كثافة الخلية قد يكون أقل.
    ملاحظة: قد يكون كثافة الخلية تأثير عميق على نمو خط الخلية وعلى النتائج التجريبية. عد الخلايا للحد من تجربة إلى تجربة variabilitذ بسبب كثافة.
    1. اعتمادا على غرفة البيئة والظروف اللازمة للتجربة، وخلايا لوحة في الصحون جيدا واحدة (عادة 35- أو 60 ملم)، 4 جيد أطباق 35 ملم، 6-، 12- أو 24-جيدا لوحات زراعة الخلايا، أو ساترة الشرائح في أشكال مختلفة. استخدام لوحات من الزجاج السفلي مع # 1.5 الزجاج كما هي الأمثل معظم العدسات موضوعية لهذا سمك الزجاج، والتصوير من خلال البلاستيك خلية ثقافة رديئة للغاية.
      ملاحظة: بعض خطوط الخلايا لا تنمو والبقاء على قيد الحياة على الزجاج. في هذه الحالات، والزجاج يمكن أن تطلى من أجل تعزيز الالتزام خلية (على سبيل المثال، بولي يسين أو الكولاجين). بعض الشركات تصنع الضوئية البلاستيكية زراعة الخلايا، يجب أن تقرر تجريبيا إذا كان هذا هو خيارا قابلا للتطبيق.

4. غرفة البيئة مجموعة المتابعة

  1. قبل أي التجريب، انشاء غرفة البيئية بحيث تعمل في ~ 80٪ الرطوبة وبالتالي فإن درجة الحرارة في موقف العينة 37 درجة مئوية. تنمو الخلايا الأكثر مثقف في 5٪ جو الهواء CO 2 / الرصيد المستحق إلى عازلة بيكربونات الصوديوم في المتوسط. اعتمادا على مجموعة المتابعة، إما تعيين وحدة تحكم البيئي إلى 5٪ CO وسوف مزيج 100٪ CO 2 مع الهواء، أو استخدام ما قبل مختلطة، شهادة غاز الهواء 5٪ CO 2 / توازن. اتبع توجيهات المصنع للغاز تدفق أسعار الفائدة.
    ملاحظة: بعض خطوط الخلايا تنمو في CO 2 متوسطة مستقلة من في هذه الحالة لا يمكن الحفاظ عليه دون CO 2. وسائل الإعلام تصوير مصممة خصيصا متاح أيضا أن يحد من إضافة مركبات autofluorescent. يجب أن يتوقف النمو في أطروحات وسائل لنوع من الخلايا المطلوبة تجريبيا مسبقا.
  2. قبل التصوير، تأكد من ملأ خزان المياه (بعد توجيهات المصنع) مع الماء المقطر المعقم. بدوره على غرفة البيئية لتحديد درجة الحرارة المطلوبة ووضعه في درج المسرح المجهر. لانقاذ الغاز، لا تبدأ في التدفق في هذه المرحلة.
    ملاحظة: إذا كان هناك أي مساحة حرة بين الغرفة مرحلة أعلى ومرحلة أقحم و / أو أي توتر على الحبال اتصال إلى غرفة ذلك قد يعرض الحركة الفنية في التجربة.
    1. وضع قطعة من فيلم البارافين على حواف أقحم مرحلة الافتتاح قبل إدخال الغرفة إلى أن الزوجين إلى غرفة المرحلة، والتأكد من عدم وجود صلات وسحب على الغرفة.
  3. السماح للغرفة لكي تتوازن إلى 37 درجة مئوية. الحفاظ على درجة حرارة ثابتة لمنع التقلبات في درجات الحرارة خلال التصوير التي يمكن أن تؤثر فسيولوجيا الخلية وإدخال الانجراف. الوصول إلى موازنة درجة الحرارة وعادة ما يتطلب 30 دقيقة إلى 1 ساعة، اعتمادا على البيئة.
    1. إدراج "دمية" الطبق مع الماء في الآبار في غرفة بينما ارتفاع درجات الحرارة. طبق التصوير مليئة يقلد المياه العينة، مما يساعد على ضمان غرفة وتحسنت بما فيه الكفاية واستقرت. ملء الغرفة مع الماء المعقم قبل تحسنتيقلل من الوقت اللازم لاستقرار درجة الحرارة ويقلل من انخفاض درجات الحرارة على إضافة العينة التجريبية.

5. مجهر مجموعة المتابعة

  1. بدوره على المجهر، الكمبيوتر المرتبطة بها، وأية ملحقات المطلوبة.
    1. اعتمادا على مصدر الضوء، وانتظر لتشغيله لحين الحاجة إليها (على سبيل المثال، LED).
  2. مع برج موضوعي في وضع منخفض، وحدد الهدف NA 20X 0.7 لاستخدامها.
  3. ضع العينة على الهدف - وهذا سيجعل من الأسهل العثور على الخلايا عندما تكون العينة في الغرفة.
  4. تعريف المعلمات التصوير في هذا الوقت إذا كانت معروفة من التجارب السابقة.

6. نقل الخلايا إلى مجهر وفي الغرفة

  1. نقل الخلايا للتصوير من الحاضنة إلى غرفة البيئية. تأكد من أن يتم ذلك بسرعة للحد من آثار CO منخفضة نسبيا 2
  2. وضع الخلايا في وعاء الستايروفوم مختومة أو كيس معزول لتجنب التغيرات البيئية الكبيرة.
  • إدراج الطبق التصوير العينة إلى الغرفة التالية توجيهات المصنع.
  • بعد أن تم تأمين الخلايا داخل غرفة البيئية، وختم الغرفة للحفاظ على بيئة مستقرة وتتحول فورا على المصدر (ق) من الغاز في الغلاف الجوي.
    1. حيث أن بعض الدوائر البيئية لا تستخدم ضيق، غطاء مختومة، لتؤخر التبخر، طبقة العقيمة، الزيوت المعدنية على شهادة الجنين على أعلى متوسط ​​النمو. التفاف فيلم البارافين نفيذ الغاز حول محيط حواف الطبق عينة والحرص على عدم عرقلة منطقة التصوير الزجاج. ويمكن استخدام محلية، طرق الترطيب الثانوية. التكثيف على غطاء الطبق عينة يمكن أن تقلل ادائهامانس المجهر brightfield.
  • من أجل تقليل آثار الانجراف الحراري في وقت مبكر خلال التجربة، وانتظر 30 دقيقة قبل البدء في الوقت الفاصل. الوقت المطلوب باختلاف حجم الطبق التصوير وعوامل أخرى. تحديد تجريبيا.
  • 7. إعداد التصوير

    1. حدد شروط التصوير التي سوف تمثل أفضل البيانات. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الضيائية عن طريق الحد من التعرض مرات، وذلك باستخدام أقل شدة الضوء واختيار تحقيقات التي ولع الأطوال الموجية للضوء.
    2. تحديد X و Y و Z-الطائرة والمطلوب الطول الموجي (الصورة) لكل موقف للتصوير. هو قرار الوقت محدودة بسبب عدد من المواقف وموجات. على المدى الطويل الوقت الفاصل بين معظم العمليات الخلوية، والحصول على صورة واحدة كل 10-20 دقيقة. دقة أعلى الوقت (فترات قصيرة، على سبيل المثال، 1 دقيقة) توفر المزيد من نقاط البيانات وتتبع الخلية وبالتالي أكثر قوة، ولكن النتائج أيضا في أكثر اندماجاالتعرض للضوء ومجموعات البيانات الكبيرة.
      1. كما HT1080 FUCCI ديك البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء الحيوية (انظر ممثل النتائج)، استخدم مرات التعرض التالية: FITC / GFP - 50 ميللي ثانية، تكساس الأحمر / TRITC - 40 ميللي ثانية، Brightfield - 20 ميللي ثانية. استخدام الحاوية 2 × 2.
    3. تمكين برنامج autofocusing التحكم باستخدام المعلمات الافتراضية ضمن إعدادات متقدمة. تحديد مجموعة وضبط تلقائي للصورة من 10 ميكرون مع حجم خطوة الموصى بها. تأكد من القيام بذلك قبل البدء في الوقت الفاصل. ضبط تلقائي للصورة مع الصور brightfield وأبدا مع مضان للحد من الضيائية وphotobleaching من.
      1. استخدام أنظمة autofocusing البرمجيات التي تسيطر على أي المجهر مع مرحلة الآلية، والتركيز مباشرة على العينة. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تحد من سرعة اكتساب التجربة. الأجهزة أنظمة التحكم التركيز المستمر تعمل بشكل جيد للفحص المجهري مرور الزمن وتحسين سرعة، مما يسمح للمزيد من المناصب إلى أن تصوير أو ارتفاع معدل الاستحواذ. ومع ذلك، فإنهاالاعتماد على الكشف عن واجهة من الزجاج الهواء، وقد يفقد التركيز من العينة مع وجود اختلافات في سماكة الزجاج عبر البئر.
    4. استبدال نصف وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام التي تحتوي على تركيز الدواء المطلوب الذي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية. استبدال وسائل الإعلام الجزئي يساعد على الحد من الانجراف الحراري. الظروف في هذه التجربة هي المركبات ([دمس])، 1 ميكرومتر selinexor و 10 ميكرومتر PD0332991.
      ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم هذه الخطوة بعد بدء اكتساب التوقف وإعادة تشغيل التجربة. وهذا يسمح لتتبع الطولي للردود السابقة واللاحقة للأدوية الخلايا وحيدة. إذا ثباتية الدواء أو الأيض هو مصدر قلق، والتوقف واستبدال وسائل الإعلام يمكن أن يتم بنفس الطريقة. لاختبار تدهور المخدرات أو التمثيل الغذائي، وسائل الإعلام من الخلايا المعالجة ويمكن أيضا أن توضع على خلايا ساذجة لاختبار عمل الدواء.
    5. بدء مرور الزمن.
    6. كما يعمل على مرور الزمن، وضمان أن تظل الحقول تصوير في التركيز وchambeيحافظ ص ورطب 37 درجة مئوية.
      1. ضبط التركيز حسب الحاجة التوقف الاستحواذ خلال الفجوة الزمنية بين نقاط الوقت.
    7. إذا لزم الأمر، إضافة الماء إلى الغرفة خلال التجارب أطول. تجنب تبريد الغرفة بإضافة قبل تحسنت والماء المقطر المعقم في 37 درجة مئوية.

    8. إنهاء الوقت الفاصل

    1. عند تشغيل التجربة على الانتهاء، والتوقف عن اكتساب إذا لم يتم تعيين لتتوقف تلقائيا.
    2. تأكد من أن الفاصل بين الوقت قد تم حفظها بشكل صحيح على القرص الصلب، وعلى الرغم من أن معظم حزم البرمجيات حفظ تلقائيا خلال اقتناء إذا لم تنته بشكل صحيح يمكن أن يتم فقدان البيانات.
    3. إزالة غرفة من المجهر والتخلص من الخلايا في النفايات biohazardous التالية إجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية المعتمدة.

    9. تتبع طولية وتحليل البيانات في الوقت الفاصل بين

    1. اختيار منهجية لتحليل ما هوالمناسبة للعمليات البيولوجية من الفائدة. وقد تم إنتاج العديد من الإضافات ليماغيج، البرامج باستخدام ماتلاب، ومنصات مخصصة لتطبيقات محددة. وتغطي المنهجية التالية تتبع نوى وتحليل تحقيقات الفلورسنت النووية كما هو موضح في الشكلين 4 و 5.
    2. فتح مداخن صورة. TIF عن القنوات المستخدمة في ImageJ. بدلا من ذلك، فتح الملفات الأصلية من برنامج شراء مباشرة في ImageJ باستخدام البرنامج المساعد Bioformats.
    3. رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) داخل النواة من خلية واحدة باستخدام صورة brightfield أو قناة التسمية النووية (في حال استخدامها) وإضافته إلى مدير العائد على الاستثمار. ملاحظة: إذا كانت الخلايا المصورة لديها التسمية النووية (على سبيل المثال، هيستون H2B-EGFP.)، ثم يمكن الاستفادة تتبع الخلية التلقائي لخلق مناطق الفائدة (رويس) التي تمثل نواة الفردية عبر الزمن.
    4. انتقل إلى نقطة زمنية المقبلة ووضع العائد على الاستثمار داخل نفس nucleuالصورة. إضافة العائد على الاستثمار إلى مدير العائد على الاستثمار.
    5. مواصلة تتبع وجعل رويس للخلية فردية حتى يكون هناك حدث الخلوي (الانقسام، موت الخلايا المبرمج، الخ.) أو لم يعد من الممكن تعقب خلية (أي، يتحرك خارج الإطار أو التجربة ينتهي).
    6. عندما أنشئت رويس للخلايا من خلال ذلك الوقت هم في الميدان، ركب لهم على القنوات الفلورسنت من الفائدة. قياس كثافة يعني من مضان في كل قناة عن كل نقطة زمنية. حفظ قائمة العائد على الاستثمار لاستخدامها لاحقا.
      1. قياسات مختلفة يستطيع كنت جعلت ضمن العائد على الاستثمار لتقديم الطلبات في تجارب مختلفة. انقر فوق تحليل → مجموعة القياسات ... لإحضار قائمة لاختيار الطريقة التحليلية (على سبيل المثال، يعني كثافة في العائد على الاستثمار، وكثافة متكاملة، الخ.).
    7. ملاحظة مصير الخلية لخلايا فردية (على سبيل المثال، موت الخلايا المبرمج، وتقسيم، البقاء على قيد الحياة)، في حين تتبع. وهذا يسمح لإنشاء منحنيات البقاء على قيد الحياة وابعد من ذلكالتحليل السكاني ص.
    8. مع كثافة يعني لكلا قنوات، وخلق مؤامرة مبعثر لعرضه ديناميات دورة الخلية ردا على العلاجات (الشكل 5B، C).
      ملاحظة: يمكن إنشاء قطع اراضي للخلايا فردية مع مرور الوقت أو متوسط ​​على مجموعة من الخلايا تتبعها. التصوير الكمي يمكن أن تكون حاسمة لتحديد استجابات معقدة والعلاقات الخلايا في الاستجابة لعلاجات السرطان. على المدى الطويل الوقت الفاصل بين المجهري، وتتبع الطولي وتحليل البيانات هو عملية متعددة الخطوات، مع العديد من الخيارات لنوع من الفحص المجهري والتحليل والأدوات، ويتبع المخطط العام المنصوص عليه في الشكل 1.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    على المدى الطويل الوقت الفاصل بين المجهر وتتبع الطولي المباشر يسمح لدراسة العديد من الآثار المضادة للسرطان خلال الاستجابة للدواء. بعد المخطط العام في الشكل 1، وترد أمثلة متعددة من الخلايا معربا عن صحفيين الفلورسنت التحقق من صحة أن تعامل مع الأدوية المضادة للسرطان، تعقب، وتحليلها باستخدام أساليب مختلفة.

    المرحلة المجهر النقيض من ذلك وحده هو مفيدة للغاية وتقارير عن البيني مقابل الانقسام، ومدة الإنقسامية والاعتقال، انقسام الخلايا غير الطبيعي، وموت الخلايا 21،23،24 بقوة. عقاقير تستهدف انقسام الخلايا، وغالبا ما تسمى العقاقير المضادة للالإنقسامية، والاستمرار في تطويرها. الشكل 2 و أفلام 1 و 2 أمثلة تبين من زوج من الخطوط المستمدة من سرطان الثدي مطابقة خلية MCF7 التي تختلف فقط في حالة البروتين p53 بهم، وتعامل مع 500 نانومتر من نوع من العقار المضاد للسرطان أن الأهدافويمنع البروتين السيارات الإنقسامية، كينيسين 5 (KSP1، Kif11، Eg5)، مما أدى إلى الانقسام الذي طال أمده 20. البرية خلايا MCF7 نوع (الشكل 2A) هي نموذج لدراسة تعتمد على البروتين p53 دورة الخلية القبض 25-27. خلايا نوع البرية تدخل الانقسام، تبقى لعدة ساعات، وترك في نهاية المطاف واعتقال إلى حد كبير مع تحريض البروتين p53 25. عند إزالة البروتين p53 التي كتبها مستقرة ضربة قاضية البروتين p53 (MCF7 ش البروتين p53)، بدلا من إلقاء القبض عليهم بعد مغادرتهم الانقسام، وخلايا تذهب من خلال دورات متكررة (الشكل 2B). وتتبع خلايا يدويا ومؤشر الإنقسامية والنسبة المئوية للخلايا التي تدخل في الانقسام الثاني وسجل (الشكل 2C، D). ونلاحظ أن الخلية البروتين p53 ش تتبعت الانقسامات عندما يدخل الجولة الثانية من الانقسام بدلا من اعتقال وترك الانقسام دون تقسيم. في حين لم تظهر هنا مدة أحداث الإنقسامية، والوقت بين mitoses المتعاقبة، في المئة من انقسامات الخلية، وما يرتبط بها من أحداث موت الخلايا يمكن أيضا أن تكون الصورةمحفور 20،21.

    وtaxanes، على سبيل المثال باكليتاكسيل وDOCETAXEL، والعلاج الكيميائي الشائع للعديد من أنواع السرطان، بما في ذلك تلك التي يصعب علاجها مثل الثدي البنكرياس والمتقدمة. باكليتاكسيل بربط ديناميكية زائد نهاية الأنابيب الدقيقة ويستقر لهم، ومنع وظيفتها الطبيعية. وقد لاحظ باكليتاكسيل الآثار تعتمد على الجرعة، وحتى بتركيزات منخفضة يمكن التشويش على طبيعتها الإنقسامية التقدم وكروموسوم الفصل 16. الفصل المؤمنين من الكروموسومات ضروري لتكاثر الخلايا العادية وعندما غير طبيعي يمكن أن يؤدي إلى عدم توازن الصبغيات التي قد تؤدي إلى اعتقال دورة الخلية، ولكن أيضا بمثابة سائق تطور السرطان. الشكل (3) وفيلم 3 عرض عنق الرحم خلايا هيلا المستمدة من سرطان التعبير عن مستقر لونين علامة تنصهر mCherry وبيتا تويولين تنصهر EGFP (لا يظهر) في متوسطة النمو الطبيعي تعامل مع 1 نانومتر باكليتاكسيل هيستون-2B. في هذاسبيل المثال، دخول والتقدم من خلال الانقسام يمكن اتباعها. توقيت الانقسام يبدو طبيعيا في هذه الخلية، ولكن الانحياز كروموسوم والعزل ليست كذلك، مما أدى إلى الانتفاخات النووية والنويات التي هي هياكل مشيرا إلى الفقراء العزل الصبغي. النويات عرضة للتلف الحمض النووي وchromothripsis، وهو تجزئة على نطاق واسع من الكروموسومات أو لونين - وهذا له آثار هامة في تطور الورم 28،29. في حين لم تظهر هنا، أصل النويات وعلاقتها الهياكل الإنقسامية أخرى ومصير هذه الخلايا يمكن أن تكون مباشرة تتبع استخدام على المدى الطويل الوقت الفاصل. وعلاوة على ذلك، أعربت علامة لونين مع مراسل الحمض النووي من التلف يمكن أن يستخدم لتحديد العلاقة بين العزل الصبغي، النويات والحمض النووي من التلف.

    السماح للصحفيين الفلورسنت لعمليات الخلية enumerable لتعقبها ويجري باستمرار تطوير صحفيين الجديد. لالسابقينوافرة، دورة الخلية تتكون من المراحل التي هي ذات أهمية خاصة في وضع الأهداف العلاجات المضادة للسرطان. الشكل (4) والفيلم 4 يظهر خط الخلية المستمدة يفية (HT1080) أن ثابت المشارك عن اثنين من الصحفيين يطلق، اليوبيكويتين الفلورسنت مؤشرات دورة الخلية (FUCCI) 30. في النظام هنا، وتنصهر جزء من ببتيد Cdt1 إلى mKO2 (أحادى Kusabira البرتقال 2) وزيادة في G1-مرحلة وتدهور في وقت مبكر S-المرحلة، وتنصهر جزء من geminin إلى المجموعة الاستشارية للألغام (أحادى AZAMI الأخضر) والزيادات في منتصف S-مرحلة وتتحلل على طور الصعود. هذه الخلية في متوسط ​​النمو الطبيعي وتقدم من خلال دورة الخلية في 15 ساعة. الشكل 5A وباء والفيلم 5 تظهر نفس الخلايا في المتوسط ​​العادي تعامل مع 10 PD0332991 ميكرومتر، وهو CDK4 / 6 المانع. الخلايا التقدم من خلال G2 المرحلة، وتقسم عادة، وتعتقل بقوة في G1-مرحلة لاحقة، مما يدل على احتمالية تأثير إيف آثار تثبيط الخلايا في الأورام المتنامية. الشكل 5C، D والفيلم 6 تظهر نفس الخلايا في المتوسط ​​العادي تعامل مع جزيء صغير يسمى selinexor (KPT-330)، وهو قوي مثبط بروتين الصادرات النووية، exportin-1 (XPO1، ويعرف أيضا باسم CRM1 ). ويطلق على هذه المركبات مثبطات انتقائية من الصادرات النووية (جيبية) والآثار المضادة للسرطان التي هي حاليا قيد التحقيق 31،32. نتائج العلاج شرط في قوية الظواهر دورة الخلية وموت الخلايا 33،34. يوضح هذا المثال خلية التي تقدم من خلال G1-المرحلة مع حركية عادية (ما يقرب من 6 ساعات)، ولكن واجه تأخير في S-مرحلة تطور كما هو مبين من قبل فترة مع كل من إشارة حمراء وخضراء (حوالي 3 ساعات في السيطرة ولكن 10 في جيبية المعالجة ). تموت هذه الخلايا في وقت متأخر S- أو G2 المرحلة بعد 21 ساعة و 30 دقيقة. دورة الخلية العادية حوالي 15 ساعة. ويجري حاليا دراسة آثار selinexor للدماء مختلفة والأورام الصلبة 35.

    FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الدعامة الأساسية لعلاج مضاد للسرطان هي السمية الخلوية من خلال الحمض النووي من التلف كارثية. الحمض النووي من التلف يمكن أن يتسبب من خلال العديد من العلاجات بما في ذلك الإشعاع، adducts البلاتيني، والمخدرات جزيء صغير - على سبيل المثال، تلك التي تستهدف topoisomerase أنا و / أو الثاني. أيضا مهاجمة العديد من العلاجات المركبة محور الحمض النووي من التلف إما عن طريق إحداث الضرر من خلال مسارات منفصلة أو عرقلة قدرة الخلايا على إصلاح الأضرار. حركية ومستوى الضرر، وإذا وكيف يسبب هذا موت الخلايا هو من أهمية على نطاق واسع في العلاجات التنموية الشكل خلايا HT1080 6 و 7 فيلم المعرض التي تعبر عن ثابت مزدوج حبلا الحمض النووي الضرر المراسل، mCherry-BP1-2 36 في النمو الطبيعي متوسطة تعامل مع 10 ميكرومتر إيتوبوسيد (VP-16)، والسم topoisomerase الثاني. ويتكون هذا المراسل لجزء من الحمض النووي المزدوج حبلا البروتين موقع الاستراحة، 53BP1 التي تنصهر mCherry. وقد تعقب نواة هذه الخلية باليودنانوغرام المساعد تحليل الجزيئات في ImageJ وإشارة mCherry-BP1-2 متكاملة تم قياس في كل إطار بعد العتبة من القيم التي ألغت التحقيق النووي القابلة للذوبان. الحمض النووي من التلف هو الحد الأدنى للساعة 10 الأولى ثم يزيد بشكل مطرد. ومن المعروف Topoisomerase الثاني مثبطات لتؤثر بشكل خاص S- وG2 المرحلة، عندما الانزيم الأكثر نشاطا 37،38. حركية لاحظ في هذا المثال يمكن أن تشير إلى دورة تلف الخلايا المرتبطة بها؛ يمكن الجمع بين mCherry-BP1-2 مع الصحفيين FUCCI إظهار توقيت الضرر الذي يمكن بعد ذلك أن يرتبط إلى الخلية مصير.

    الشكل 1
    يتم تصوير الشكل 1. نظرة عامة على طريق طويل الأجل المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية لدراسة مكافحة السرطان الاستجابة للدواء. خلايا في أطباق التصوير الخلية الحية المناسبة المسمى كما هو مطلوب، يتم تعقب الخلايا أو المناطق ذات الاهتمام، والبيانات حلل. وتوجد العديد من الطرق لتتبع وتحديد الخلايا، وأشار البعض هنا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2. المرحلة على النقيض الوقت الفاصل بين المجهري يظهر البروتين p53 الاعتماد بعد مكافحة المخدرات الإنقسامية العلاج. Wildtype (أ) والبروتين p53-ضربة قاضية (ب) تم علاج خلايا MCF7 مع 500 نيوتن متر كينيسين 5 المانع وتصوير كل 10 دقيقة لمدة 96 ساعة باستخدام المجهر المرحلة على النقيض مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. وتتبع الخلايا الفردية يدويا والانقسام في المئة، وإذا تقدم الخلية إلى الانقسام آخر مرة أخرى خلال الوقت الفاصل بين وسجل. تشير الأسهم الخلايا التي يتم تتبعها. الخلية ش البروتين p53 (ب) يقسم على الدخول في الانقسام الثاني. (ج) كل من خطوط الخلايا SHOث اعتقال الإنقسامية لفترة طويلة كما هو مشار إليه من قبل في المئة الانقسام ذروة عالية (أولا الأزرق والسهام الحمراء). (C، D) ما يقرب من 90٪ من الخلايا دون البروتين p53 (البروتين p53 ش، ن = 87) عرض اصلت التقدم (الأسهم الحمراء) مقارنة مع 20٪ من wildtype (ن = 130). أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. بار = 20 ميكرون. أفلام 1 و 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الشكل 3. لونين ماركر هيستون 2B يكشف أدلة على كروموسوم الفصل شذوذ بعد جرعة منخفضة من العلاج باكليتاكسيل. باكليتاكسيل دواء المستهدفة أنيبيب أن يؤدي إلى عيوب معقدة، تعتمد على التركيز في نمو الخلايا والانقسام. تنظيم لونين تطلع على دول مختلفة من الخلايا، بما في ذلك مرحلةمن الانقسام وموت الخلايا. خلايا هيلا يعبرون عن ثابت على حد سواء H2B-mCherry وβ تويولين-EGFP عولجوا 1 نانومتر باكليتاكسيل. هذه الخلية في البداية في الطور البيني، تقدم من خلال مراحل الانقسام والانقسامات. في حين أن الوقت في الانقسام بشكل عادي، وهناك أدلة من مرفق كروموسوم والفصل الأخطاء التي تم حلها (السهام). مصير هذه الخلايا يمكن تحديد مباشرة من تتبع الطولي. تم الحصول على النقيض من المرحلة (لا يظهر) والصور الفلورسنت في 1 إطار في 10 دقيقة مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. بار = 10 ميكرون. الفيلم 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (4)
    الشكل 4. فلوري علامات دورة الخلية تسمح لرصد المباشر للتقدم دورة الخلية.(A) حقل من خلايا ليفية HT1080 الحية معربا عن نظام FUCCI تصويرها من قبل على النقيض من المرحلة ومضان. (B، C) ويتبع الخلية الإنقسامية في مربع متقطع في لوحة A. تقدم عادة من خلال دورة الخلية في ما يقرب من 15 ساعة. بعد الانقسام، الخلايا لفترة وجيزة قاتمة، ومن ثم تصبح حمراء وأنها تقدم في ومن خلال G1-المرحلة. عندما تدخل الخلايا S-المرحلة، وCdt1 التحقيق الأحمر المتدهورة والأخضر الزيادات geminin التحقيق. موجز ما يقرب من 3 مدة ساعة حيث توجد كل من تحقيقات، ويشير في وقت مبكر S-المرحلة. كخلايا التقدم من خلال S- وG2-مرحلة وفي الانقسام القادمة التي تبقى خضراء. تتحلل التحقيق الأخضر على طور الصعود من انقسام الخلايا. تم الحصول على النقيض من المرحلة والصور الفلورسنت في 1 إطار في 10 دقيقة مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. بار = 10 ميكرون. الفيلم 4. يرجى النقر هنا لالسادسEW نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 5
    الشكل دورة 5. خلية تأثيرات محددة وما يرتبط بذلك من موت الخلية. نفس خط الخلية كما في الشكل (4) ولكن تعامل مع اثنين من الجزيئات المختلفة التي تمثل أهدافا مختلفة مضادة للسرطان. يشار مرات بعد العلاج. (A، B) بعد العلاج من خلية / G2-مرحلة متأخرة S مع 10 ميكرومتر PD0332991 CDK4 / 6 المانع، فإنه خلية تقدم عادة إلى الانقسام (M) والانقسامات. وتعقب خلية ابنة واحدة عن طريق قياس كثافة فلوري الحمراء والخضراء في المنطقة من اهتمام في النواة. يبقى الخلية اعتقلوا في G1-مرحلة ما يقرب من 40 ساعة. (C، D) بعد العلاج من خلية أواخر G2 المرحلة مع 1 ميكرومتر selinexor، فإنه خلية يتطور عادة إلى الانقسام (M) والانقسامات. وتعقب خلية ابنة واحدة ويدخل G1-المرحلة، تقدم من خلالالمطول في وقت مبكر S-المرحلة (إشارة حمراء وخضراء)، التحولات إلى اللون الأخضر فقط ويموت بعد 21 ساعة و 30 دقيقة. وتشير البيانات يتأثر S-مرحلة التقدم عن طريق العلاج selinexor. تم الحصول على النقيض من المرحلة والصور الفلورسنت في 1 إطار في 10 دقيقة مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. بار = 10 ميكرون. أفلام 5 و 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (6)
    الشكل 6. ديناميات الحمض النووي الأضرار بعد العلاج من تعاطي المخدرات. العديد من العلاجات المضادة للسرطان تؤدي إلى تلف الحمض النووي التي يمكن أن تؤثر تأثيرا عميقا استجابة الخلية ونجاح العلاج. خلايا HT1080 يعبرون عن ثابت على حد سواء انقر نقرا مزدوجا حبلا الحمض النووي من التلف علامة mCherry-BP1-2 وH2B-EGFP (لا يظهر) عولجوا 10 ميكرومتر من إيتوبوسيد المخدرات topoisomerase الثاني والحمض النووي د وقد تعقب amage. (أ) عدد وشدة زيادة بؤر بعد إيتوبوسيد. هناك في البداية ذلك تأخر كثيرا، مشيرا إلى الآثار دورة الخلية الممكنة بما يتفق مع الآلية المعروفة من إيتوبوسيد. قبل 22 ساعة 50 دقيقة تراكمت هذه الخلية مستويات عالية من الضرر. في حين لم تظهر هنا، فإن مصير هذه الخلية يمكن تحديده من خلال تتبع مباشرة. وتعقب (ب) والعائد على الاستثمار الموافق نواة الحصول عليها من خلال إشارة H2B-EGFP باستخدام تتبع الجسيمات في ImageJ وكان كميا إشارة BP1-2 mCherry المتكاملة وتآمر مع مرور الوقت. ويلاحظ الفارق في إشارة إلى أن ما يقرب من 10 ساعة، تليها زيادة مستمرة. تم الحصول على صور الفلورسنت في 1 إطار في 10 دقيقة مع 40X PH2 0.75 عدسة NA. بار = 10 ميكرون. الفيلم 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    . في غضون الصفحات = "1"> Moive 1
    وعولج الفيلم 1. المرحلة على النقيض المجهري الوقت الفاصل بين الخلايا Wildtype MCF7 بعد مكافحة المخدرات الإنقسامية علاج الخلايا Wildtype MCF7 مع 500 نيوتن متر كينيسين 5 المانع وتصوير كل 10 دقيقة لمدة 96 ساعة باستخدام المجهر المرحلة على النقيض مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. اعتقال الإنقسامية لفترات طويلة والخروج من الانقسام ويمكن ملاحظة، كما هو موضح في الشكل (2). يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

    Moive 2
    وعولج الفيلم 2. المرحلة على النقيض المجهري الوقت الفاصل بين الخلايا MCF7-ضربة قاضية البروتين p53 بعد خلايا مكافحة المخدرات الإنقسامية العلاج. MCF7 التعبير عن مستقر القاسي RNA الصغيرة التي تستهدف البروتين p53 للتدهور مع 500 نيوتن متر كينيسين 5 المانع و تصوير كل 10 دقيقة لمدة 96 ساعة باستخدام المجهر المرحلة على النقيض مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. اعتقال الإنقسامية لفترات طويلة وجولات متعددة من الانقسام ويمكن ملاحظة، كما هو موضح في الشكل (2). يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

    Moive 3
    وعولج فيلم 3. الفلورسنت الوقت الفاصل بين المجهري للخلايا هيلا بعد جرعة منخفضة من خلايا باكليتاكسيل علاج. هيلا التعبير عن مستقر H2B-mCherry وβ تويولين-EGFP مع 1 نانومتر باكليتاكسيل. ويمكن ملاحظة مرفق كروموسوم وقضايا الفصل، كما هو موضح في الشكل (3). تم الحصول على الصور كل 10 دقيقة مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

    ove_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> Moive 4
    فيلم 4. فلوري علامات دورة الخلية تسمح لرصد المباشر للتقدم دورة الخلية. وتعقب خلايا HT1080 معربا عن نظام FUCCI طوليا خلال الوقت الفاصل بين المجهري. الخلية يذهب قاتمة بعد الخروج من الانقسام، ومن ثم تصبح حمراء كما تقدم الخلية من خلال G1-المرحلة. كما يدخل الخلية S-المرحلة، يصبح أصفر كما تتحلل الزيادات geminin التحقيق الخضراء والتحقيق Cdt1 الأحمر. تبقى الخلية الخضراء كما أنها تقدم من خلال S- وG2-المرحلة. يحط الخضراء مثل خلايا يدخل طور الصعود. ويرد الكمي لهذه الخلية في الشكل (4). تم الحصول على الصور كل 10 دقيقة مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

    Moive 5 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53994 / 53994movie5.jpg "/>
    وعولج فيلم 5. HT1080 خلية التعبير عن فلوري علامات دورة الخلية بعد العلاج مع المانع G1-المرحلة. HT1080 الخلايا معربا عن نظام FUCCI مع 10 ميكرومتر PD0332991، وCDK4 / 6 المانع. خلية تتبع تقدم عادة إلى الانقسام والانقسامات. ابنة واحدة هي تتبعت، وتبقى حمراء في G1 لمدة الفيلم. يظهر الكمي في الشكل (5). تم الحصول على الصور كل 10 دقيقة مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

    Moive 6
    وكان فيلم 6. HT1080 خلية التعبير عن نيون علامات دورة الخلية بعد العلاج مع Exportin-1 المانع، Selinexor. HT1080 الخلايا معربا عن نظام FUCCI معاملتهمإد مع selinexor 1 ميكرومتر. وتتبع هذه الخلية أواخر G2 المرحلة من خلال الانقسام. ثم تقدم خلية ابنة من خلال G1-المرحلة (الحمراء)، ويدخل S-المرحلة (الصفراء). الخلية تقدم ببطء من خلال S-مراحل حتى يدخل وقت متأخر من S / G2-مرحلة ويموت بعد 21 ساعة و 30 دقيقة من العلاج. يظهر الكمي في الشكل (5). تم الحصول على الصور كل 10 دقيقة مع 20X PH2 0.70 عدسة NA. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

    Moive 7
    وعولج فيلم 7. الحمض النووي ديناميات الأضرار بعد العلاج مع Topoisomerase الثاني HT1080 الخلايا المانع. معربا عن ستابلي انقر نقرا مزدوجا حبلا الحمض النووي من التلف علامة mCherry-BP1-2 وH2B-EGFP مع 10 ميكرومتر إيتوبوسيد، مثبط topoisomerase الثاني. يتم عرض mCherry-BP1-2 في الفيلم. كعلاج مواصلةالصورة، إشارة من زيادات mCherry-BP1-2، مما يشير إلى زيادة المزدوج حبلا الحمض النووي من التلف. يظهر الكمي في الشكل (6). تم الحصول على الصور كل 10 دقيقة مع 40X PH2 0.75 عدسة NA. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    مزايا المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية

    المجهر هو أداة مثالية للدراسات طولية من الاستجابة للدواء كما أنه يسمح للمحققين لتعقب الخلايا الفردية ومصائرهم وكذلك السكان. التغير في الاستجابة للدواء ضمن مجموعة من الخلايا هي قضية رئيسية للتصميم العلاجية المضادة للسرطان. تتبع طولية من الخلايا واحد يسمح للمحققين لمراقبة هذا التغير والبدء في فهم الآليات والنتائج الأساسية لأنها تتعلق السكان الخلية. استخدام مجموعة متنوعة من تحقيقات الفلورسنت يوفر العديد من الطرق لمراقبة وفهم كل الظواهر استجابة مشتركة ونادرة. توقيت ومساهمة مصائر مختلفة من الخلايا في الاستجابة السكان، والعلاقات بين الظواهر ومصائر محددة، والاختلاف في الاستجابة بين خطوط الخلايا أو الدولة على العلاج هي أمثلة على ما يمكن أن نتعلمه. يمكن دراسة العديد من العمليات المرتبطة بالسرطان. بعض التي لا يتم تسليط الضوء في هذه المقالة تشمل موت الخلايا مع موت الخلايا المبرمج، الالتهام الذاتي، وصحفيين نخر 39-42، غزو الخلايا 43،44، وديناميات البروتين p53 التي تحدد القرارات مصير الخلية 27. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النهج لا تقتصر على دراسات في علم التداوي الدراسات المضادة للسرطان. المبادئ نفسها يمكن استخدامها لدراسة العديد من العمليات البيولوجية الأخرى بما في ذلك الانقسام 45 ديناميات الهيكل الخلوي 46،47 وبين الخلايا مما يشير إلى 48.

    إلا أن الوقت الفاصل بين فلوري المجهر كما توفر التعريب وكثافة البيانات من البروتينات والجزيئات المثيرة للاهتمام. لم يقتصر الأمر على التغييرات في مستوى البروتين المهم أن الاستجابة للدواء، ولكن التعريب الصحيح (أو غير لائق) والبروتينات داخل الخلية أمر بالغ الأهمية للاستجابة التفاهم. يوفر الوقت الفاصل بين المجهري البيانات على حيث يتم ترجمة البروتينات (على سبيل المثال، نواة، العصارة الخلوية، العضيات محددة،الخ.) بعد العلاج من تعاطي المخدرات وكيفية توطين والمستويات الإجمالية تتغير بمرور الزمن على مستوى الخلية والسكان واحد.

    التحديات والقيود

    وعلى الرغم من نقاط القوة في الوقت الفاصل بين المجهري والتحليل الطولي للخلايا واحدة، وهناك قيود. تقتصر صحفيين مضان من قبل استقرارها وخصوصية. عند تصميم البروتينات الانصهار فلوري، فمن الأهمية بمكان أن يختار التحقيق التي هي الصور مستقرة ومشرق، ولكن من الضروري أيضا النظر في آثار العلامة الفلورسنت التي تعلق على البروتين من الفائدة فيما يتعلق ظيفته الطبيعية والقدرة على توطين بشكل صحيح . وقد نوقشت هذه القضايا بالتفصيل في مكان آخر، وهناك العديد من الفلورسنت الموسومة البروتينات المتاحة التي تم نشرها 15،49،50. التسميات أو العلامات الفلورية أخرى يمكن أن تضاف إلى الخلايا، ويجب توخي الحذر لضمان أنها ليست سامة. في تجربتنا، هذه صالجلباب، على سبيل المثال تسميات الميتوكوندريا (غشاء المحتملة) أو خلية قابلة للاختراق الأصباغ الحمض النووي، وتميل لتبييض أسهل وستكون مخففة التدريجي بسبب تكاثر الخلايا.

    وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من التحديات التقنية مع تزايد ومراقبة الخلايا على المجهر. وعدم الاستقرار فيما يتعلق درجة الحرارة، والرطوبة، والغلاف الجوي، والضوء يكون لها آثار كبيرة على الخلايا، مما يؤدي إلى فقدان البيانات أو حتى التجربة بأكملها. ويمكن رؤية قضايا الاستقرار فيما يتعلق التقاط الصور في أفلام 1 و 2. يمكن التقليل من هذا التأثير من خلال استخدام فيلم البارافين (انظر 4.2). هناك أيضا خوارزميات تثبيت الصورة المتاحة لمعالجة ما بعد الشراء، على سبيل المثال باستخدام يماغيج (NIH). جانب من جوانب طويلة الأجل الوقت الفاصل التي غالبا ما يتم تجاهله هو إدارة البيانات وحجم الملف. حتى عندما binning البيانات، واحدة التجربة مرور الزمن في كثير من الأحيان في اكثر من 30 غيغا بايت. قدرة عالية وسرعة عالية، تخزين بيانات موثوقة ونقل قويةشجع لاي. اعتمادا على جهاز الاستشعار البيولوجي فلوري (الصورة) التي يجري تصويرها، بل هو في كثير من الأحيان ليس من الضروري الحصول على صور بدقة كاملة، على سبيل المثال أجهزة الاستشعار هيولي النووية أو. ونحن نوصي عندما يكون ذلك ممكنا، واتخاذ تدابير للحفاظ على ملف الأحجام الصغيرة، مما أدى إلى أسهل للعمل مع البيانات، واحتياجات الحوسبة أقل تطلبا، وتحسين تدفق العمل.

    الضيائية هو مصدر قلق كبير عند تنفيذ على المدى الطويل الوقت الفاصل بين المجهري. ارتفاع شدة الضوء والتعرض لفترة طويلة يمكن أن يؤدي إلى photobleaching من تحقيقات الفلورسنت، والإجهاد الخلية وموت الخلايا. هذه الآثار يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على البيانات ويؤدي إلى تشويه التجربة. binning الكاميرا ومكاسب يمكن استخدامها للحد من التعرض مرات. مرشحات الكثافة محايدة في مسار الضوء تقلل من شدة الضوء على عينة. فإن الأطوال الموجية للضوء تستخدم لصورة تؤثر أيضا على الخلايا. الأطوال الموجية الأقصر (الأشعة فوق البنفسجية، الأشعة فوق البنفسجية القريب) هي أكثر ضررا على الخلايا وتؤدي إلى الصور وتبييض بمعدلات أسرع منالموجات الأطول (على سبيل المثال، أحمر، أحمر بعيد). اختيار هدف يمكن أن تؤثر أيضا التصوير الظروف. وارتفاع الفتحة العددية (NA) العدسات تنتج صورا عالية الدقة، ولكن أعلى التكبير يسمح أقل ضوء أن تنتقل من العينة مما أدى إلى التعرض مرات أعلى أو ضوء أكثر كثافة. يجب أن يتم تحديد هدف مع NA والتكبير المناسبة التي من شأنها حل وجوه الخاص بك من الفائدة دون الإفراط. في كثير من الحالات، قد لا تكون على أعلى الهدف الخيار الأنسب. مع تحقيقات النووية (أرقام 4، 5)، يسمح هدف تضخم منخفض لحقل أكبر ليتم القبض، وزيادة فعالية حجم العينة، دون المساس بقرار من الكائن المطلوب. يجب أن يتم تنفيذ على المدى الطويل الوقت الفاصل في ثلاثة أبعاد بحذر بسبب التعرض للضوء متكامل. باستخدام قرص الغزل المجهر متحد البؤر، وكاميرا حساسة (مثل، EM-CCD)، وزيادة الكاميرا، وبيزو محرك سريع لض السلسلة suggesteد للحد من التعرض للضوء. سريع اكتساب ض سلسلة مهم أيضا لتقليل الحركة الفنية بسبب حركة الخلية والديناميات التي تحدث أثناء فترة التملك. التحليل التجريبي من الخلايا غير المعالجة باستخدام العديد من بيئات مختلفة يمكن أن تكون مفيدة في تحديد الآثار المترتبة على ضوء الفلورسنت على أي خط خلية معينة أو مراسل. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إدراج عنصر تحكم غير المعالجة في كل تجربة لتحديد الآثار السامة للخلايا من الإعدادات التجريبية.

    الاختلافات في تقنية

    على المدى الطويل الوقت الفاصل بين قوي ومرن جدا. باستخدام تقنيات ثقافة مشتركة، وخطوط مختلفة من الخلايا أو نفس خطوط الخلايا معربا عن صحفيين مختلفة يمكن استخدامها. أحد الأمثلة البارزة على ذلك هو التصوير الخلايا البلعمية مع الخلايا الهدف الذي يموتون في استجابة لدواء مضاد للسرطان. مثال آخر يمكن أن يكون لدراسة تأثير الاستجابة الخلايا على خلايا ساذجة المخدرات المجاورة. إلى جانب الصور ACTIVAteable، صور للتحويل، والبروتينات الفلورية-صور للتحويل، والبروتينات المهندسة والتي يمكن تفعيلها من خلال الضوء لتؤدي إلى آثار محددة (على سبيل المثال، KillerRed)، وهناك العديد من الاحتمالات. أكثر يمكن استخدام النهج المعقدة التي تستخدم مختلف أنواع متخصصة من المجهري مثل إعادة توزيع الفلورسنت بعد photobleaching من، فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق)، وقرار السوبر (على سبيل المثال، ستوكاستيك البصرية إعادة الإعمار المجهري (STORM) الإنشائي إضاءة المجهر (SIM)، أو استنزاف الانبعاث المستحث (STED))، وغيرها الكثير، وهناك مزايا وقيود كل النهج.

    على المدى الطويل (على سبيل المثال، أسابيع، أشهر) الردود واستعادة الخلايا بعد إزالة المخدرات أمر أساسي لفهم عمل للأدوية المضادة للسرطان. أطباق الزجاج السفلي الشبكية هي أداة قيمة لمراقبة خلايا أو مناطق معينة ضمن مجموعة من السكان / منطقة مرارا وتكرارا. على سبيل المثال، مع طبق الشبكية، والدكتور الأولياستجابة ميكروغرام يمكن تصوير باستخدام الوقت الفاصل، ويمكن إزالتها في المخدرات، ومجالات محددة في الشبكة يمكن تصوير مع مرور الوقت أو تعرضوا لالإضافي مرور الزمن في الوقت المطلوب. أسفل الزجاج على أطباق يمكن إزالتها عن طريق إما قطع مع أداة الكاتب أو باستخدام كاشف التجاري، والخلايا على الزجاج يمكن أن تكون ملطخة عن علامات أخرى من الفائدة، وعلى سبيل المثال الشيخوخة المرتبطة النشاط β-galactocidase، ومقارنة الوقت الفاصل بين لفهم التاريخ من كيفية وصول خلايا هذه الدولة. إذا كان السكان خلية كبيرة بما فيه الكفاية كما يجوز أن تخضع لimmunoblotting أو التدفق الخلوي.

    وكانت عينات كثيفة تقليديا الصعب صورة، على سبيل المثال الكروية في مختلف المواد جل والمصفوفات. نهج أحدث بما في ذلك متحد البؤر الفلورسنت أو متعدد الفوتون المجهري 16،18،19،51 يمكن استخدامها لتوسيع النهج لفي فهم الموقع من كيفية استجابة الخلايا لالعلاجات المضادة للسرطان. الدراسات حد ذاتها، وعدد متزايد من العلماء باستخدام الوقت الفاصل بين لدراسة الاستجابة للدواء مضاد للسرطان 24،52-54 تبين بوضوح أننا نسير في اتجاه تطوير فهم الدوائية خلية واحدة من شأنها أن تساعد على تحسين قدرتنا على استخدام الأدوية المضادة للسرطان أكثر فعالية وربما التنبؤ استجابة للأدوية المضادة للسرطان.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
    2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
    3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
    4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
    5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
    6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
    7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9, (e93718), (2014).
    8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
    9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
    10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
    11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
    12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. (2008).
    13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
    14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
    15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
    16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
    17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
    18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
    19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
    20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
    21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
    22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
    23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
    24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
    25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
    26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7, (488), (2011).
    27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
    28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
    29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
    30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
    31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
    32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7, (46), (2014).
    33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
    34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
    35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
    36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
    37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
    38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. (2015).
    39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
    40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
    41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
    42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
    43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
    44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7, (e30605), (2012).
    45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
    46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
    47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
    48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
    49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
    50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
    51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
    52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
    53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
    54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics