लुकिंग ग्लास के माध्यम से: समय चूक माइक्रोस्कोपी और एकल कक्षों के अनुदैर्ध्य अध्ययन करने के लिए ट्रैकिंग विरोधी कैंसर चिकित्सा

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Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

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Abstract

कैंसर रोधी दवाओं के लिए एकल कक्षों की प्रतिक्रिया आबादी प्रतिक्रिया का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण योगदान देता है, और इसलिए कुल परिणाम में एक प्रमुख योगदान कारक है। Immunoblotting, प्रवाह cytometry और तय सेल प्रयोगों अक्सर अध्ययन करने के लिए कैसे कोशिकाओं को कैंसर रोधी दवाओं का जवाब उपयोग किया जाता है। इन तरीकों में महत्वपूर्ण हैं, लेकिन वे कई कमियों है। दवा प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता कैंसर और सामान्य कोशिकाओं के बीच, और विभिन्न कैंसर कोशिकाओं की उत्पत्ति, और क्षणिक और दुर्लभ प्रतिक्रियाओं के बीच आबादी औसतन assays का उपयोग और सीधे ट्रैक और उन्हें longitudinally विश्लेषण करने के लिए सक्षम होने के बिना समझना मुश्किल है। माइक्रोस्कोप विशेष रूप से अच्छी छवि की जीवित कोशिकाओं के लिए अनुकूल है। प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के एक संकल्प है कि न केवल सेल ट्रैकिंग, लेकिन यह भी सेलुलर प्रतिक्रियाओं की एक किस्म के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है पर नियमित रूप से छवि कोशिकाओं कर सकें। हम विस्तार में एक दृष्टिकोण है कि के निरंतर समय चूक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है का वर्णनअनिवार्य रूप में लंबे समय, वांछित आम तौर पर 96 घंटा के लिए ऊपर के रूप में दवा के लिए प्रतिक्रिया के दौरान कोशिकाओं। दृष्टिकोण के रूपांतरों का प्रयोग, कोशिकाओं सप्ताह के लिए नजर रखी जा सकती है। आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट biosensors कई प्रक्रियाओं, रास्ते और प्रतिक्रियाओं के रोजगार के साथ पीछा किया जा सकता। हम उस पर नज़र रखने और सेल के विकास और कोशिका चक्र प्रगति, गुणसूत्र गतिशीलता, डीएनए की क्षति की मात्रा का ठहराव, और कोशिका मृत्यु में शामिल उदाहरण दिखाते हैं। हम यह भी तकनीक और इसके लचीलेपन के रूपांतरों पर चर्चा, और कुछ आम नुकसान पर प्रकाश डाला।

Introduction

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी और एकल कक्षों के अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग एक नई तकनीक नहीं है। जल्द से जल्द माइक्रोस्कोप से, उत्साही और वैज्ञानिकों मनाया और एकल कक्षों और जीवों, उनके व्यवहार, और विकास 1-3 अध्ययन किया है। 1950 के दशक में वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय में देर डेविड रोजर्स से एक प्रसिद्ध उदाहरण एक स्ताफ्य्लोकोच्चुस जीवाणु और अंततः phagocytosis 4 की प्रक्रिया का पीछा करते हुए एक रक्त धब्बा में एक मानव न्युट्रोफिल पता चलता है। इस लाइव सेल फिल्म कैसे कई प्रक्रियाओं मनाया जा सकता है और सहसंबद्ध एक ही प्रयोग में का एक उत्कृष्ट उदाहरण है: एक रासायनिक ढाल, यांत्रिकी और सेल गतिशीलता की गति की संवेदन, सेल गतिशीलता, आसंजन, और एक रोगज़नक़ के phagocytosis आकार।

पूरी तरह से स्वचालित माइक्रोस्कोप और अति संवेदनशील डिजिटल कैमरों के आगमन माइक्रोस्कोपी का उपयोग जांचकर्ताओं की एक बढ़ती हुई संख्या में हुई है कोशिका जीव विज्ञान से लेकर एफ में मौलिक सवाल पूछने के लिएROM कैसे कोशिकाओं 5,6 के लिए कदम और 7.8 विभाजित गतिशीलता और झिल्ली की तस्करी 9-11 organelle करने के लिए। गैर फ्लोरोसेंट, चरण विपरीत (पीसी) है, जो 1953 में Frits Zernike के लिए नोबेल पुरस्कार हुई हैं, और अंतर हस्तक्षेप विपरीत सहित brightfield माइक्रोस्कोपी, (डीआईसी) कोशिकाओं और नाभिक लेकिन यह भी microtubule बंडलों सहित उप सेलुलर संरचनाओं के अवलोकन के लिए अनुमति गुणसूत्रों, nucleoli, organelle गतिशीलता, और मोटी actin फाइबर 12। आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन इनकोडिंग और अंगों के खिलाफ फ्लोरोसेंट रंगों के विकास नाटकीय रूप से समय चूक माइक्रोस्कोपी 13-15 असर पड़ा है। हालांकि इस लेख का ध्यान केंद्रित नहीं, सेल spheroids में और सीटू (intravital माइक्रोस्कोपी) confocal और multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने में इमेजिंग दृष्टिकोण का एक और विस्तार का प्रतिनिधित्व करते हैं, और वहाँ बकाया लेख है कि का उपयोग करें और इन तरीकों 16-19 पर चर्चा कर रहे हैं।

विरोधी CANC के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएंएर दवाओं या प्राकृतिक उत्पादों आणविक और सेलुलर पैमाने पर निर्धारित होते हैं। समझना सेल प्रतिक्रिया और भाग्य इलाज के बाद अक्सर आबादी औसतन assays (जैसे।, Immunoblotting, पूरे अच्छी तरह के उपाय), या immunofluorescent का पता लगाने के साथ तय समय अंक और प्रवाह cytometry, जो एकल कक्षों को मापने शामिल है। आबादी के भीतर दवाओं के लिए एक सेल प्रतिक्रिया में विविधता, ट्यूमर में विशेष रूप से, सेल लाइनों और ट्यूमर है कि संतृप्ति में एक ही दवा के साथ व्यवहार कर रहे हैं भर में देखा प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता के कुछ समझा जा सकता है। लंबे समय तक अनुदैर्ध्य दृष्टिकोण एक दिया एकल कक्ष या कक्षों की आबादी का पालन करने के लिए एक कम आम है लेकिन बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण है कि आणविक प्रतिक्रिया रास्ते में से प्रत्यक्ष अध्ययन के लिए अनुमति देता है, अलग अलग phenotypes (जैसे।, कोशिका मृत्यु या कोशिका विभाजन), के अवलोकन आबादी के भीतर सेल करने वाली सेल परिवर्तनशीलता, और कैसे इन कारकों जनसंख्या प्रतिक्रिया गतिशीलता 20-22 के लिए योगदान करते हैं। आशावादी, सक्षम होने के नातेनिरीक्षण और एकल कोशिका प्रतिक्रियाओं का अंदाजा कैसे दवाओं काम करते हैं, यही कारण है कि वे कभी कभी असफल हो, और करने के लिए सबसे अच्छा कैसे उन का उपयोग करने के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने में मदद करने के लिए होगा।

लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी, अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग, और दवा प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने की तकनीक कई जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध है और phenotype प्रतिक्रियाओं 20,21 निरीक्षण करने के लिए केवल प्रेषित प्रकाश का उपयोग कर, आसान हो सकता है। दृष्टिकोण के मुख्य घटक शामिल हैं: ब्याज की कोशिकाओं की उचित तैयारी, पर्यावरण कक्ष के साथ एक स्वचालित माइक्रोस्कोप, एक कैमरा एक कंप्यूटर के साथ प्राप्त करने के लिए और समय चूक की समीक्षा करने के लिए छवियों को स्टोर, और सॉफ्टवेयर और मापने के लिए और कोशिकाओं का विश्लेषण एकीकृत और किसी भी फ्लोरोसेंट biosensors। हम brightfield और / या widefield epifluorescent माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के रूप में लंबे समय के रूप में कई दिनों के लिए संवर्धित कोशिकाओं के समय चूक माइक्रोस्कोपी के संचालन के लिए कई सुझावों के साथ एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल किसी भी कोशिका लाइन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि संस्कृति में उगाया जा सकता हैविरोधी कैंसर उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए। हम अधिग्रहीत डेटा का उदाहरण देते हैं और कई अलग अलग आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट biosensors और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का एक उदाहरण का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया है, संक्षेप में जांच के विभिन्न प्रकार के फायदे और लंबी अवधि के समय चूक और अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग के नुकसान पर चर्चा, क्या हो सकता है इस दृष्टिकोण है कि गैर प्रत्यक्ष दृष्टिकोण, और कुछ बदलाव है कि हमें आशा है कि ब्याज और अनुभवहीन शोधकर्ताओं जो दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए विचार नहीं किया है मूल्य का हो जाएगा से समझने के लिए मुश्किल है, और अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए है के लिए सीखा है।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल आंकड़े 4 और 6 के बारे में अधिग्रहण सेटिंग्स और प्रयोगात्मक शर्तों में प्रयोगों द्वारा निर्धारित मापदंडों का उपयोग करता है। इन मानकों में से कई अन्य प्रयोगों फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है (यानी, जोखिम बार, binning, फ्लोरोसेंट चैनलों, आदि।)। सभी प्रक्रियाओं संस्थागत दिशा निर्देशों और नियमों का पालन करना होगा और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना। माइक्रोस्कोप निर्माता वेबसाइटों को लाइव सेल इमेजिंग के लिए उत्कृष्ट जानकारी होती है।

1. सूक्ष्मदर्शी और इमेजिंग सॉफ्टवेयर

  1. उल्टे माइक्रोस्कोप की एक विस्तृत विविधता पर लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन। सबसे आम सूक्ष्मदर्शी epifluorescence और कताई डिस्क confocal widefield रहे हैं। इधर, 200 वाट धातु halide प्रकाश स्रोत के साथ एक स्वचालित और मोटर चालित widefield epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  2. एक चरण शीर्ष प्राप्त या पर्यावरण कक्ष माइक्रोस्कोप। इधर, एक चरण-टी का उपयोगसेशन पर्यावरण कक्ष।
  3. समय चूक माइक्रोस्कोपी निष्पादित करने के लिए उपयोगिताओं के साथ सूक्ष्मदर्शी संचालित करने के लिए वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
  4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर या छवि विश्लेषण के लिए ImageJ का प्रयोग करें। कई अन्य विश्लेषण उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और वहाँ की जो प्रकाशित किया गया है 8,18 कई कस्टम बनाया कार्यक्रम कर रहे हैं।

2. सेलुलर प्रक्रियाओं और प्ररूपी जवाब Visualizing

  1. brightfield माइक्रोस्कोपी के साथ कोशिकाओं कल्पना। अंतर हस्तक्षेप विपरीत और चरण अकेले विपरीत बहुत कैंसर रोधी दवा प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए जानकारीपूर्ण किया जा सकता। इन प्रक्रियाओं बँटवारा, सेल गतिशीलता और apoptosis शामिल कर सकते हैं।
  2. फ्लोरोसेंट biosensors के साथ सेल संरचनाओं, अंगों और प्रक्रियाओं कल्पना। फ्लोरोसेंट जांच विशिष्ट subcellular प्रक्रियाओं पर नज़र रखने में जानकारीपूर्ण हैं। ये microtubule गतिशीलता, mitochondrial और जालिका गतिशीलता, प्रोटीन संचय और स्थानीयकरण, और शामिल कर सकते हैंआणविक संकेतन (जैसे।, फोस्फोराइलेशन, कैल्शियम)।

3. नमूनों की तैयारी

  1. एक मानक में सेल संस्कृति प्रमाणित बर्तन में कोशिकाओं को विकसित, humidified सेल कल्चर इनक्यूबेटर (जैसे, 37 सी, 5% सीओ 2, 80% सापेक्ष आर्द्रता)।
    1. EBSS के साथ सदस्य में HT1080 कोशिकाओं को विकसित। के साथ 10% वी / वी FBS, 1% वी / वी पेन / Strep, 1% v / v सोडियम पाइरूवेट और 1% वी / वी गैर आवश्यक अमीनो एसिड मीडिया अनुपूरक।
  2. दो दिन इमेजिंग के लिए पहले, एक प्रमाणित बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में एक 12 अच्छी तरह से # 1.5 गिलास नीचे पकवान के 3 कुओं में प्लेट 50,000 HT1080 FUCCI कोशिकाओं। प्रयोग की शुरुआत के लिए प्राप्त करने के लिए ~ 60% संगम चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या को समायोजित करें। सेल लाइन और प्रयोग सेल घनत्व की प्रकृति पर निर्भर करता है कम हो सकता है।
    नोट: सेल घनत्व सेल लाइन के विकास पर और प्रयोगात्मक परिणामों पर गहरा प्रभाव हो सकता है। कोशिकाओं की गणना करने के लिए कम से कम प्रयोग करने वाली प्रयोग variabilitघनत्व के कारण y।
    1. पर्यावरण कक्ष और प्रयोग के लिए आवश्यक शर्तों, एकल अच्छी तरह से बर्तन में थाली कोशिकाओं (आमतौर पर 35 या 60 मिमी), 4 अच्छी तरह से 35 मिमी बर्तन, 6, ​​12 या 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटें, या पर निर्भर करता है विभिन्न स्वरूपों में स्लाइड coverslip। सेल संस्कृति के माध्यम से प्लास्टिक # 1.5 कांच के रूप में सबसे उद्देश्य लेंस कांच के इस मोटाई के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, और इमेजिंग के साथ गिलास नीचे प्लेटों का प्रयोग बहुत खराब है।
      नोट: कुछ सेल लाइनों बढ़ने और कांच पर जीवित नहीं है। इन मामलों में, कांच आदेश सेल पालन बढ़ाने के लिए लेपित किया जा सकता है (उदाहरण के।, पाली lysine या कोलेजन)। कुछ कंपनियों ऑप्टिकल सेल संस्कृति प्लास्टिक, यह अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए का निर्माण करता है, तो यह एक व्यवहार्य विकल्प है।

4. पर्यावरण कक्ष सेट-अप

  1. किसी भी प्रयोग करने से पहले, सेट-अप पर्यावरण कक्ष इतना है कि यह ~ 80% आर्द्रता चल रही है और इसलिए नमूना स्थिति में तापमान 37 सी। अधिकांश संवर्धित कोशिकाओं के माध्यम में सोडियम बाइकार्बोनेट बफर के कारण 5% सीओ 2 / संतुलन हवा वातावरण में हो जाना। सेट-अप पर निर्भर करता है, तो 5% सीओ 2 के लिए पर्यावरण नियंत्रक सेट और यह 100% सीओ 2 के मिश्रण होगा हवा के साथ, या पूर्व मिश्रित, प्रमाणित 5% सीओ 2 / संतुलन हवा गैस का उपयोग करें। गैस प्रवाह दरों के लिए निर्माता निर्देशों का पालन करें।
    नोट: कुछ सेल लाइनों सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम है जो मामले में वे सीओ 2 के बिना बनाए रखा जा सकता है में हो जाना। विशेष रूप से डिजाइन इमेजिंग मीडिया है कि autofluorescent यौगिकों के अलावा सीमा में भी उपलब्ध है। वांछित सेल प्रकार के लिए शोध करे माध्यमों में वृद्धि अनुभव से पहले से निर्धारित किया जाना चाहिए।
  2. इमेजिंग के लिए पहले, यह सुनिश्चित पानी जलाशय भर जाता है (निर्माता के निर्देशों का पालन) बाँझ आसुत जल के साथ। वांछित तापमान की स्थापना करने के लिए पर्यावरण कक्ष पर मुड़ें और खुर्दबीन मंच इनसेट में जगह। गैस बचाने के लिए, इस बिंदु पर प्रवाह शुरू नहीं करते।
    नोट: वहाँ है, तो चरण शीर्ष चैम्बर और मंच इनसेट और / या चैम्बर यह प्रयोग में गति कलाकृतियों को पेश हो सकता करने के लिए कनेक्शन डोरियों पर किसी भी तनाव के बीच किसी भी मुक्त अंतरिक्ष।
    1. मंच इनसेट उद्घाटन चैम्बर इसे में कुछ करने के लिए मंच पर चैम्बर डालने से पहले के किनारों पर आयल फिल्म के टुकड़े करना, और सुनिश्चित करें कि कोई कनेक्शन कक्ष पर खींच रहे हैं।
  3. चैम्बर 37 सी को संतुलित करने की अनुमति दें इमेजिंग जो सेल शरीर विज्ञान को प्रभावित और बहाव शुरू कर सकते हैं दौरान तापमान के उतार चढ़ाव को रोकने के लिए एक स्थिर तापमान बनाए रखें। पहुँचना तापमान संतुलन आम तौर पर 1 घंटा 30 मिनट, पर्यावरण पर निर्भर करता है की आवश्यकता है।
    1. जबकि वार्मिंग के चेंबर में एक 'डमी' कुओं में पानी के साथ पकवान डालें। एक इमेजिंग पकवान पानी mimics के साथ नमूना भरा, की मदद से चैम्बर सुनिश्चित पर्याप्त गरम और स्थिर है। पूर्व गर्म बाँझ पानी के साथ चैम्बर भरनेसमय तापमान स्थिरीकरण के लिए आवश्यक कम कर देता है और प्रयोगात्मक नमूना के अलावा पर तापमान में कमी को कम करता है।

5. माइक्रोस्कोप सेट-अप

  1. माइक्रोस्कोप, जुड़े कंप्यूटर, और किसी भी आवश्यक peripherals चालू करें।
    1. प्रकाश स्रोत पर निर्भर करता है, जब तक की जरूरत इसे चालू करने के इंतजार (जैसे।, एलईडी)।
  2. एक कम स्थिति में उद्देश्य बुर्ज के साथ, 20X 0.7 NA उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए चयन करें।
  3. उद्देश्य के ऊपर नमूना स्थिति - यह आसान कोशिकाओं को खोजने के लिए जब नमूना कक्ष में है कर देगा।
  4. इस समय इमेजिंग मानकों को परिभाषित करता है, तो वे पिछले प्रयोगों से जाना जाता है।

6. माइक्रोस्कोप के लिए और चैंबर में कोशिकाओं परिवहन

  1. परिवहन कोशिकाओं पर्यावरण कक्ष को इनक्यूबेटर से imaged किया जा सके। सुनिश्चित करें कि यह जल्दी से किया जाता है कि एक अपेक्षाकृत कम सीओ 2 के प्रभाव को सीमित करने के लिए
  2. एक मोहरबंद कंटेनर स्टायरोफोम या अछूता बैग में कोशिकाओं बड़े पर्यावरण परिवर्तन से बचने के लिए रखें।
  • निर्माता के निर्देशों का पालन कक्ष में नमूना इमेजिंग पकवान डालें।
  • बाद कोशिकाओं पर्यावरण कक्ष के भीतर सुरक्षित किया गया है, एक स्थिर वातावरण बनाए रखने के लिए और तुरंत वायुमंडलीय गैस के स्रोत (ओं) पर बारी चैम्बर सील।
    1. जैसा कि कुछ पर्यावरण कक्षों एक तंग सील ढक्कन का उपयोग नहीं करते, मध्यम विकास के शीर्ष पर वाष्पीकरण, परत बाँझ, भ्रूण प्रमाणित खनिज तेल मंदबुद्धि। चारों ओर कांच इमेजिंग क्षेत्र में बाधा डालती के लिए नहीं सावधान किया जा रहा नमूना पकवान की परिधि के किनारों गैस permeant आयल फिल्म लपेटें। स्थानीय, माध्यमिक आर्द्रीकरण तरीकों नियोजित किया जा सकता है। नमूना पकवान कामकाज कम कर सकते हैं के ढक्कन पर संक्षेपणbrightfield माइक्रोस्कोपी के Mance।
  • आदेश थर्मल बहाव प्रयोग के दौरान जल्दी के प्रभाव को कम करने के लिए, समय चूक शुरू करने से पहले 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें। आवश्यक समय इमेजिंग पकवान आकार और अन्य कारकों के आधार पर भिन्न होता है। अनुभव से निर्धारित करते हैं।
  • 7. इमेजिंग की स्थापना

    1. इमेजिंग शर्तों का चयन सबसे अच्छा है कि डेटा का प्रतिनिधित्व करेंगे। , जोखिम बार सीमित कम तीव्रता प्रकाश के उपयोग और जांच जो प्रकाश की तरंग दैर्ध्य अब से उत्साहित हैं का चयन करके phototoxicity से बचने के लिए सावधानियों ले लो।
    2. प्रत्येक स्थिति के लिए परिभाषित एक्स, वाई और जेड विमान और वांछित तरंगदैर्ध्य (ओं) imaged किया जाना है। समय संकल्प की दशा और तरंग दैर्ध्य की संख्या से सीमित है। सबसे सेलुलर प्रक्रियाओं की लंबी अवधि के समय चूक के लिए, एक छवि हर 10 का अधिग्रहण - 20 मिनट; उच्च समय संकल्प (कम अंतराल, उदा।, 1 मिनट) और अधिक डेटा अंक और इसलिए अधिक मजबूत सेल ट्रैकिंग प्रदान करता है, लेकिन यह भी अधिक एकीकृत में यह परिणामप्रकाश जोखिम और बड़े डेटा सेट।
      1. - 50 मिसे, टेक्सास लाल / TRITC - 40 मिसे, brightfield - 20 मिसे FITC / GFP: HT1080 FUCCI गतिशील हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है (प्रतिनिधि परिणाम देखें), निम्न जोखिम बार का उपयोग करें। एक 2 x 2 बिन का प्रयोग करें।
    3. उन्नत सेटिंग के तहत डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग सॉफ्टवेयर नियंत्रित autofocusing सक्षम करें। सिफारिश कदम आकार के साथ 10 माइक्रोन की एक ऑटोफोकस सीमा को परिभाषित करें। समय चूक शुरू करने से पहले यह करने के लिए सुनिश्चित करें। brightfield छवियों के साथ ऑटो फोकस और प्रतिदीप्ति के साथ कभी नहीं phototoxicity और photobleaching कम करने के लिए।
      1. एक मोटर चालित मंच के साथ किसी भी माइक्रोस्कोप पर सॉफ्टवेयर नियंत्रित autofocusing सिस्टम का उपयोग करें, और सीधे नमूना पर ध्यान केंद्रित। हालांकि, वे प्रयोग के अधिग्रहण की गति को सीमित कर सकते हैं। हार्डवेयर नियंत्रित निरंतर ध्यान केंद्रित सिस्टम समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं और गति में सुधार, अधिक पदों के लिए अनुमति देता है imaged या अधिग्रहण की एक उच्च दर के लिए किया। हालांकि, वेएयर कांच इंटरफेस का पता लगाने पर भरोसा करते हैं और अच्छी तरह से भर कांच मोटाई में बदलाव के साथ नमूना का ध्यान केंद्रित खो सकते हैं।
    4. मीडिया वांछित दवा एकाग्रता है कि 37 सी को गरम कर दिया गया है युक्त मीडिया के आधे बदलें आंशिक मीडिया प्रतिस्थापन थर्मल बहाव को कम करने में मदद करता है। इस प्रयोग की स्थिति में वाहन (DMSO), 1 माइक्रोन selinexor और 10 माइक्रोन के PD0332991 हैं।
      नोट: यह कदम भी रोक और प्रयोग शुरु द्वारा अधिग्रहण शुरू करने के बाद किया जा सकता है। यह एकल कक्षों के पूर्व और बाद दवा प्रतिक्रियाओं के अनुदैर्ध्य नज़र रखने के लिए अनुमति देता है। अगर दवा स्थिरता या चयापचय एक चिंता का विषय है, रोक और जगह की मीडिया में एक ही विधि के साथ किया जा सकता है। दवा गिरावट या चयापचय के लिए परीक्षण करने के लिए, इलाज कोशिकाओं से मीडिया भी दवा का परीक्षण कार्रवाई के लिए भोले कोशिकाओं पर रखा जा सकता है।
    5. समय चूक की शुरुआत करें।
    6. समय चूक चलाता है के रूप में, यह सुनिश्चित करें कि imaged क्षेत्रों फोकस और chambe में रहनाआर एक उमस भरे 37 सी का कहना है
      1. के रूप में समय बिंदुओं के बीच समय अंतराल के दौरान अधिग्रहण रोक द्वारा की जरूरत फोकस समायोजित करें।
    7. यदि आवश्यक हो, अब प्रयोगों के दौरान चैम्बर के लिए पानी जोड़ें। 37 सी पर पूर्व गर्म, बाँझ आसुत जल जोड़कर चैम्बर ठंडा करने से बचें

    8. समय चूक समाप्त

    1. प्रयोग पूरा करने के लिए चला गया है, जब अधिग्रहण को रोकने के लिए अगर यह स्वचालित रूप से बंद करने के लिए सेट नहीं किया गया था।
    2. सुनिश्चित करें कि समय चूक हार्ड ड्राइव पर ठीक से बचा लिया गया है, हालांकि ज्यादातर सॉफ्टवेयर संकुल स्वचालित रूप से अधिग्रहण के दौरान बचाने के लिए यदि ठीक से नहीं समाप्त डेटा खो दिया जा सकता है।
    3. माइक्रोस्कोप से चैम्बर निकालें और अनुमोदित संस्थागत जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन biohazardous कचरे में कोशिकाओं के निपटान के।

    9. अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग और समय चूक डेटा का विश्लेषण

    1. विश्लेषण है कि के लिए कार्यप्रणाली चुनेंब्याज की जैविक प्रक्रियाओं के लिए उपयुक्त है। ImageJ के लिए कई plugins, MATLAB का उपयोग कर कार्यक्रम, और कस्टम प्लेटफार्मों विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उत्पादन किया गया है। के रूप में आंकड़े 4 और 5 में प्रदर्शन के बाद कार्यप्रणाली नाभिक और परमाणु फ्लोरोसेंट जांच के विश्लेषण की ट्रैकिंग शामिल किया गया है।
    2. ImageJ में उपयोग किया चैनलों के लिए .tif छवि के ढेर खोलें। वैकल्पिक रूप से, ImageJ में सीधे अधिग्रहण कार्यक्रम Bioformats प्लगइन का उपयोग करने से खुले देशी फ़ाइलों।
    3. brightfield छवि या परमाणु लेबल चैनल (अगर इस्तेमाल) का उपयोग कर एक कोशिका के नाभिक के भीतर ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र ड्रा और आरओआई प्रबंधक में जोड़ें। नोट: imaged कोशिकाओं को एक परमाणु लेबल है (जैसे, हिस्टोन H2B-EGFP।), तो स्वत: सेल ट्रैकिंग समय के माध्यम से ब्याज (ROIs) व्यक्तिगत नाभिक का प्रतिनिधित्व करने के क्षेत्रों बनाने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
    4. अगली बार बात करने के लिए आगे बढ़ना है और एक ही nucleu भीतर रॉय की स्थितिएस। रॉय प्रबंधक को रॉय जोड़ें।
    5. ट्रैक और जब तक वहाँ एक सेलुलर घटना (बँटवारा, apoptosis, आदि।) या सेल अब नहीं लगाया जा सकता है अलग-अलग सेल के लिए ROIs बनाने के लिए जारी (यानी।, फ्रेम से बाहर ले जाता है या प्रयोग समाप्त होता है)।
    6. ROIs समय वे क्षेत्र में हैं के माध्यम से कोशिकाओं के लिए स्थापित किया गया है, उन्हें ब्याज के फ्लोरोसेंट चैनलों पर मिलाना। हर समय बिंदु के लिए हर चैनल में प्रतिदीप्ति का मतलब तीव्रता को मापने। बाद में उपयोग के लिए रॉय सूची सहेजें।
      1. विभिन्न माप विभिन्न प्रयोगों में अनुप्रयोगों के लिए रॉय के भीतर किया जा सकता है। क्लिक विश्लेषण → सेट माप ... विश्लेषणात्मक विधि का चयन करने के लिए एक मेनू ऊपर लाने के लिए (जैसे।, रॉय, एकीकृत तीव्रता, आदि के भीतर तीव्रता मतलब है।)।
    7. नोट व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए सेल भाग्य (जैसे।, Apoptosis, विभाजन, अस्तित्व) ट्रैकिंग करते हुए। यह अस्तित्व घटता है और furthe के निर्माण के लिए अनुमति देता हैआर आबादी विश्लेषण।
    8. दोनों चैनलों के लिए मतलब तीव्रता के साथ, चिकित्सा विज्ञान (चित्रा 5 ब, सी) के जवाब में कोशिका चक्र की गतिशीलता प्रदर्शित करने के लिए एक तितर बितर साजिश बनाने के लिए।
      नोट: भूखंड समय के साथ अलग-अलग कक्षों के लिए बनाया जा सकता है या ट्रैक कोशिकाओं की आबादी पर औसतन। मात्रात्मक इमेजिंग कैंसर चिकित्सा के जवाब में जटिल प्रतिक्रियाओं और सेल संबंधों को स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी, अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग और डेटा विश्लेषण माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण उपकरण के प्रकार के लिए कई विकल्पों के साथ एक बहु कदम प्रक्रिया है, और चित्रा 1 में प्रदान की सामान्य रूपरेखा इस प्रकार है।

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    Representative Results

    लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी और प्रत्यक्ष अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग दवा प्रतिक्रिया के दौरान कई विरोधी कैंसर प्रभाव के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। चित्रा 1 में सामान्य रूपरेखा के बाद, कोशिकाओं के कई उदाहरण मान्य फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त कि कैंसर रोधी दवाओं, ट्रैक के साथ इलाज दिखाया गया है, और अलग अलग तरीकों का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं।

    चरण विपरीत अकेले माइक्रोस्कोपी बहुत जानकारीपूर्ण है और मजबूती के साथ बनाम बँटवारा, mitotic अवधि और गिरफ्तारी, असामान्य कोशिकाओं के विभाजन, और कोशिका मृत्यु 21,23,24 Interphase पर रिपोर्ट। दवाओं है कि कोशिका विभाजन लक्षित करते हैं, अक्सर कहा जाता विरोधी mitotic दवाओं, विकसित हो रहे हैं। चित्रा 2 और फिल्म 1 और मिलान स्तन कैंसर व्युत्पन्न MCF7 सेल लाइनों है कि उनके P53 स्थिति में ही अलग से एक जोड़ी के 2 शो उदाहरण, 500 के साथ इलाज कैंसर रोधी दवा है कि लक्ष्यों की एक प्रकार की एनएमऔर mitotic मोटर प्रोटीन, kinesin-5 (KSP1, Kif11, Eg5), दीर्घ बँटवारा 20 में जिसके परिणामस्वरूप को रोकता है। जंगली प्रकार MCF7 कोशिकाओं (2A चित्रा) P53 निर्भर सेल चक्र गिरफ्तारी 25-27 अध्ययन करने के लिए एक प्रतिमान हैं। जंगली प्रकार की कोशिकाओं बँटवारा दर्ज करते हैं, कई घंटे के लिए बने हुए हैं, अंत में छोड़ने के लिए और काफी हद तक P53 25 की प्रेरण के साथ गिरफ्तार किया। जब P53 P53 स्थिर पछाड़ना (MCF7 श P53) से निकाल दिया जाता है, बजाय गिरफ्तार वे बँटवारा छोड़ने के बाद से, कोशिकाओं को दोहराया चक्र (चित्रा 2 बी) के माध्यम से जाना। प्रकोष्ठों मैन्युअल ट्रैक किए गए थे और mitotic सूचकांक और कोशिकाओं का प्रतिशत है कि एक दूसरे बँटवारा दर्ज रन बनाए थे (चित्रा -2 सी, डी)। हम पालन कि श P53 सेल विभाजित नज़र रखी जब यह बँटवारा की बजाय गिरफ्तार करने और विभाजन के बिना बँटवारा छोड़ने से एक दूसरे दौर में प्रवेश करती है। जबकि यहाँ नहीं mitotic घटनाओं की अवधि दिखाया गया है, लगातार mitoses, कोशिका विभाजन का प्रतिशत, और संबंधित कोशिका मृत्यु की घटनाओं के बीच समय भी रों हो सकता है20,21 cored।

    taxanes, उदाहरण के पैक्लिटैक्सेल और docetaxel के लिए, उन है कि अग्नाशय और उन्नत स्तन की तरह व्यवहार करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं सहित कई तरह के कैंसर, के लिए आम कीमोथेरेपी हैं। पैक्लिटैक्सेल सूक्ष्मनलिकाएं के गतिशील प्लस के अंत तक बांधे रखता है और उन्हें स्थिर, अपने सामान्य कार्य को रोकने। पैक्लिटैक्सेल खुराक पर निर्भर प्रभाव का उल्लेख किया गया है, और यहां तक कि कम मात्रा में सामान्य mitotic प्रगति और गुणसूत्र अलगाव 16 उपद्रव कर सकते हैं। गुणसूत्रों के वफादारों अलगाव सामान्य सेल प्रसार और जब असामान्य aneuploidy है कि सेल चक्र गिरफ्तारी को गति प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह भी कैंसर की प्रगति के एक ड्राइवर के रूप में कार्य कर सकते हैं परिणाम के लिए आवश्यक है। स्थिरतापूर्वक क्रोमेटिन व्यक्त 3 और मूवी 3 शो ग्रीवा कार्सिनोमा व्युत्पन्न हेला कोशिकाओं चित्रा मार्कर हिस्टोन -2 बी mCherry के लिए जुड़े हुए हैं और बीटा ट्यूबिलिन सामान्य मध्यम विकास में EGFP (नहीं दिखाया गया है) के लिए जुड़े हुए 1 एनएम पैक्लिटैक्सेल साथ इलाज किया। इसमेंउदाहरण के लिए, बँटवारा माध्यम में प्रवेश और प्रगति का पालन किया जा सकता है। बँटवारा के समय इस सेल में सामान्य दिखाई देता है, तथापि गुणसूत्र संरेखण और अलगाव परमाणु bulges और micronuclei कि गरीब गुणसूत्र अलगाव का संकेत संरचनाओं हैं, जिसके परिणामस्वरूप में नहीं है। Micronuclei डीएनए की क्षति और chromothripsis, जो क्रोमोसोम या क्रोमेटिन की बड़े पैमाने पर विखंडन है से ग्रस्त हैं - इस ट्यूमर के विकास 28,29 में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। जबकि यहाँ नहीं दिखाया गया है, अन्य mitotic संरचनाओं के संबंध और इन कोशिकाओं के भाग्य के साथ micronuclei की उत्पत्ति सीधे हो सकता है लंबी अवधि के समय चूक का उपयोग कर लगाया। इसके अलावा, एक क्रोमेटिन मार्कर व्यक्त एक डीएनए की क्षति पत्रकार के साथ गुणसूत्र अलगाव, micronuclei और डीएनए की क्षति के बीच संबंध स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

    फ्लोरोसेंट संवाददाताओं गणनीय सेल प्रक्रियाओं के लिए लगाया जा करने के लिए और नए संवाददाताओं से लगातार विकसित किया जा रहा है की अनुमति देते हैं। पूर्व सैनिकों के लिएपर्याप्त, सेल चक्र के चरणों कि लक्षित विरोधी कैंसर चिकित्सा विज्ञान के विकास में विशेष रुचि के हैं के होते हैं। चित्रा 4 और मूवी 4 एक fibrosarcoma व्युत्पन्न सेल लाइन (HT1080) कि स्थिरतापूर्वक सह व्यक्त दो पत्रकारों करार दिया, फ्लोरोसेंट यूबीक्यूटिन कोशिका चक्र चलता संकेतक (FUCCI) 30। प्रणाली यहाँ में, Cdt1 पॉलीपेप्टाइड के एक हिस्से G1-चरण में mKO2 (मोनोमेरिक Kusabira नारंगी 2) और बढ़ जाती है से जुड़े हुए है और जल्दी एस चरण में अपमानित किया जाता है, और geminin के एक हिस्से को पत्रिका से जुड़े हुए है (मोनोमेरिक Azami हरा) और मिड-एस चरण में बढ़ जाती है और anaphase पर अपमानित किया जाता है। यह सेल सामान्य मध्यम विकास में है और में 15 घंटा। चित्रा 5 ए, बी और मूवी 5 से 10 माइक्रोन के PD0332991, एक Cdk4 / 6 अवरोध के साथ इलाज सामान्य मध्यम में एक ही कोशिकाओं दिखाने सेल चक्र के माध्यम से प्रगति। कोशिकाओं G2 चरण के माध्यम से प्रगति और सामान्य रूप से विभाजित है, और दृढ़ता से बाद में G1 चरण में गिरफ्तारी, प्रभाव के लिए क्षमता का संकेतबढ़ रही ट्यूमर में cytostatic प्रभाव ive। चित्रा 5C, डी और मूवी 6 एक छोटा सा अणु बुलाया selinexor (केपीटी-330), परमाणु निर्यात प्रोटीन अवरोध एक शक्तिशाली के साथ इलाज सामान्य मध्यम में एक ही कोशिकाओं दिखाने के लिए, exportin-1 (XPO1, उर्फ CRM1 )। इन यौगिकों चयनात्मक inhibitors परमाणु निर्यात (साइन) और उनके विरोधी कैंसर प्रभाव की जांच 31,32 अंतर्गत वर्तमान में कहा जाता है। मजबूत कोशिका चक्र phenotypes और कोशिका मृत्यु 33,34 में साइन उपचार का परिणाम है। यह उदाहरण एक सेल है कि सामान्य कैनेटीक्स (लगभग 6 घंटा) के साथ G1 चरण के माध्यम से प्रगति से पता चलता है, लेकिन दोनों के रूप में लाल और हरी झंडी (लगभग 3 इलाज नियंत्रण में मानव संसाधन लेकिन ज्या में 10 के साथ अवधि ने संकेत एस चरण प्रगति में देरी का अनुभव )। यह सेल 21 घंटा 30 मिनट के बाद देर एस या G2 चरण में मर जाता है; एक सामान्य कोशिका चक्र लगभग 15 घंटा है। Selinexor के प्रभाव को अलग रक्त और ठोस ट्यूमर 35 के लिए अध्ययन किया जा रहा है।

    6 और मूवी 7 शो HT1080 कोशिकाओं है कि स्थिरतापूर्वक सामान्य विकास में एक डबल कतरा डीएनए की क्षति संवाददाता, mCherry-BP1-2 36 को व्यक्त चित्रा मध्यम 10 माइक्रोन के etoposide (उपाध्यक्ष -16), एक topoisomerase द्वितीय जहर के साथ इलाज किया। इस संवाददाता डीएनए डबल कतरा तोड़ साइट प्रोटीन का एक भाग है, 53BP1 कि mCherry से जुड़े हुए है के शामिल है। इस सेल के नाभिक यूएसआई लगाया गया थाएनजी ImageJ और एकीकृत mCherry-BP1-2 संकेत में विश्लेषण कण प्लगइन मूल्यों है कि घुलनशील परमाणु जांच का सफाया बाहर thresholding के बाद प्रत्येक फ्रेम में मापा गया था। डीएनए की क्षति पहले 10 घंटे के लिए कम है और फिर तेजी से बढ़ जाती है। Topoisomerase द्वितीय अवरोधकों विशेष रूप से, एस और G2 चरण को प्रभावित करने के लिए जब एंजाइम सबसे सक्रिय 37,38 है जाना जाता है। कैनेटीक्स इस उदाहरण कोशिका चक्र जुड़े नुकसान का संकेत मिलता है में मनाया; FUCCI पत्रकारों के साथ mCherry-BP1-2 संयोजन क्षति है कि उसके भाग्य सेल से जोड़ा जा सकता के समय प्रदर्शन कर सकता है।

    आकृति 1
    चित्रा 1. एंटी कैंसर ड्रग प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी और अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग का उपयोग का अवलोकन। उचित लाइव सेल इमेजिंग व्यंजन के रूप में वांछित लेबल में कोशिकाओं imaged हैं, कोशिकाओं या हित के क्षेत्रों ट्रैक किए गए हैं, और डेटा है विश्लेषण किया। कई तरीकों, ट्रैक और कोशिकाओं यों के लिए मौजूद कुछ यहाँ संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2 चरण विपरीत समय चूक माइक्रोस्कोपी शो विरोधी mitotic औषध उपचार। Wildtype (ए) और P53-पछाड़ना (बी) MCF7 कोशिकाओं के साथ 500 एनएम kinesin-5 अवरोध इलाज किया गया और 96 के लिए हर 10 मिनट के बाद imaged थे P53-निर्भरता मानव संसाधन एक 20X PH2 0.70 एनए लेंस के साथ चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग। व्यक्तिगत कोशिकाओं मैन्युअल ट्रैक किए गए थे और प्रतिशत बँटवारा और अगर सेल समय चूक के दौरान फिर से एक और बँटवारा करने के लिए प्रगति रन बनाए थे। तीर सेल जाता है कि पता लगाया जा रहा संकेत मिलता है। श P53 सेल (बी) के एक दूसरे बँटवारा में प्रवेश करने पर बिताते हैं। (सी) दोनों सेल लाइनों थानेदारडब्ल्यू लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी के रूप में उच्च शिखर प्रतिशत बँटवारा (प्रथम नीले और लाल तीर) ने संकेत दिया। (सी, डी) P53 बिना कोशिकाओं के लगभग 90% (एसएच P53, एन = 87) शो जारी रखा प्रगति (लाल तीर) 20 (एन = 130) wildtype का% की तुलना में। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत मिलता है। बार = 20 माइक्रोन। फिल्म 1 और 2। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3. Chromatin मार्कर Histone 2 बी के बाद कम खुराक पैक्लिटैक्सेल उपचार। पैक्लिटैक्सेल एक microtubule-लक्षित दवा है कि सेल के विकास और विभाजन में जटिल, एकाग्रता पर निर्भर दोष में परिणाम है क्रोमोजोम पृथक्करण असामान्यताएं के साक्ष्य का पता चलता है। क्रोमेटिन के संगठन अलग सेल राज्यों पर बताते हैं, मंच सहितबँटवारा और कोशिका मृत्यु की। हेला कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक दोनों H2B-mCherry और β ट्यूबिलिन EGFP व्यक्त 1 एनएम पैक्लिटैक्सेल के साथ इलाज किया गया। यह सेल अंतरावस्था में शुरू में है, बँटवारा और विभाजित के चरणों के माध्यम से प्रगति। बँटवारा में समय सामान्य दिखाई देता है, वहाँ गुणसूत्र लगाव और अलगाव त्रुटियों कि (तीर) हल कर रहे हैं का सबूत है। इन कोशिकाओं के भाग्य अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग द्वारा सीधे निर्धारित किया जा सकता है। चरण विपरीत (नहीं दिखाया गया है) और फ्लोरोसेंट छवियों को एक 20X PH2 0.70 एनए लेंस के साथ 10 मिनट प्रति 1 फ्रेम में हासिल किया गया। बार = 10 माइक्रोन। मूवी 3। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4. फ्लोरोसेंट सेल चक्र मार्करों कोशिका चक्र प्रगति की प्रत्यक्ष निगरानी के लिए अनुमति दें।(ए) लाइव HT1080 fibrosarcoma कोशिकाओं चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति द्वारा imaged FUCCI प्रणाली को व्यक्त करने का एक क्षेत्र है। (बी, सी) पैनल में धराशायी बॉक्स में mitotic सेल पीछा किया जाता है। आम तौर पर लगभग 15 घंटे में सेल चक्र के माध्यम से प्रगति। बँटवारा के बाद, कोशिकाओं संक्षेप में मंद कर रहे हैं, और फिर लाल हो जाते हैं, क्योंकि वे में और G1 चरण के माध्यम से प्रगति। जब कोशिकाओं एस चरण में प्रवेश, लाल Cdt1 जांच अपमानित और हरे रंग geminin जांच बढ़ जाती है। संक्षिप्त लगभग 3 घंटा अवधि जहां दोनों जांच मौजूद हैं, जल्दी एस चरण इंगित करता है। कोशिकाओं एस और G2 चरण के माध्यम से और अगले बँटवारा में प्रगति के रूप में वे हरे रहते हैं। हरे रंग की जांच कोशिका विभाजन के anaphase पर अपमानित किया जाता है। चरण विपरीत और फ्लोरोसेंट छवियों को एक 20X PH2 0.70 एनए लेंस के साथ 10 मिनट प्रति 1 फ्रेम में हासिल किया गया। बार = 10 माइक्रोन। मूवी 4। यहाँ छठी क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण ईडब्ल्यू।

    चित्रा 5
    चित्रा 5. कोशिका चक्र विशेष प्रभाव और संबद्ध सेल मौत। चित्रा 4 के रूप में ही सेल लाइन लेकिन दो अलग अणुओं है कि विभिन्न कैंसर विरोधी लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व साथ इलाज किया। उपचार के बाद टाइम्स संकेत कर रहे हैं। (ए, बी) के साथ 10 माइक्रोन के PD0332991 Cdk4 / 6 अवरोध एक देर एस / G2 चरण सेल के उपचार के बाद, यह सेल बँटवारा (एम) और विभाजित करने के लिए सामान्य रूप से प्रगति। एक बेटी सेल नाभिक में ब्याज के क्षेत्र में लाल और हरे रंग का फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के द्वारा पता लगाया है। सेल लगभग 40 घंटे के लिए G1 चरण में गिरफ्तार रहता है। (सी, डी) 1 माइक्रोन selinexor के साथ एक देर G2 चरण सेल के उपचार के बाद, यह सेल बँटवारा (एम) और विभाजित करने के लिए सामान्य रूप से प्रगति। एक बेटी सेल लगाया है और यह G1 चरण में प्रवेश करती है, के माध्यम से प्रगतिएक लंबी जल्दी एस चरण (लाल और हरी झंडी), पूरी तरह से हरे रंग के संक्रमण और 21 घंटा 30 मिनट के बाद मर जाता है। आंकड़े बताते हैं एस चरण प्रगति selinexor उपचार से प्रभावित है। चरण विपरीत और फ्लोरोसेंट छवियों को एक 20X PH2 0.70 एनए लेंस के साथ 10 मिनट प्रति 1 फ्रेम में हासिल किया गया। बार = 10 माइक्रोन। फिल्म 5 और 6। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    चित्रा 6. औषध उपचार। कई विरोधी कैंसर उपचार के बाद डीएनए की क्षति गतिशीलता डीएनए की क्षति कि गहराई से सेल प्रतिक्रिया और उपचार सफलता को प्रभावित कर सकते हैं में परिणाम। HT1080 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त दोनों डबल कतरा डीएनए की क्षति मार्कर mCherry-BP1-2 और H2B-EGFP () नहीं दिखाया topoisomerase द्वितीय दवा etoposide और डीएनए डी के 10 माइक्रोन के साथ इलाज किया गयाamage लगाया गया था। (ए) संख्या और etoposide के बाद foci वृद्धि की तीव्रता। वहाँ शुरू में एक अंतराल, संभव सेल चक्र etoposide के ज्ञात तंत्र के साथ लगातार प्रभाव का संकेत है। द्वारा 22 घंटा के 50 मिनट के इस कोशिका क्षति के उच्च स्तर पर जमा हो गया है। जबकि यहाँ नहीं दिखाया गया है, इस सेल के भाग्य का सीधा ट्रैकिंग द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। (बी) के नाभिक H2B-EGFP संकेत के माध्यम से प्राप्त करने के लिए इसी एक रॉय ImageJ में कण ट्रैकिंग का उपयोग कर लगाया गया था और एकीकृत BP1-2 mCherry संकेत मात्रा निर्धारित है और समय के साथ साजिश रची गई थी। लगभग 10 घंटा तक संकेत में अंतराल का उल्लेख किया, एक लगातार वृद्धि के बाद है। फ्लोरोसेंट छवियों को एक 40X PH2 0.75 एनए लेंस के साथ 10 मिनट प्रति 1 फ्रेम में हासिल किया गया। बार = 10 माइक्रोन। मूवी 7। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


    विरोधी mitotic औषध उपचार। Wildtype MCF7 कोशिकाओं के बाद wildtype MCF7 कोशिकाओं की मूवी 1. चरण विपरीत समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ 500 एनएम kinesin-5 अवरोध इलाज किया गया और एक 20X PH2 के साथ चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर 96 घंटे के लिए हर 10 मिनट imaged 0.70 एनए लेंस। लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी और बँटवारा से बाहर निकलें, देखा जा सकता है चित्रा 2 में वर्णित है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

    moive 2
    विरोधी mitotic औषध उपचार। MCF7 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक एक छोटे बाल के लिये कांटा आरएनए को निशाना गिरावट के लिए P53 व्यक्त करने के बाद P53-पछाड़ना MCF7 कोशिकाओं की मूवी 2. चरण विपरीत समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ 500 एनएम kinesin-5 अवरोध इलाज किया गया और एक 20X PH2 0.70 एनए लेंस के साथ चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर 96 घंटे के लिए हर 10 मिनट imaged। लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी और बँटवारा के कई दौर, देखा जा सकता है चित्रा 2 में वर्णित है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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    कम खुराक पैक्लिटैक्सेल उपचार। हेला कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त H2B-mCherry और β ट्यूबिलिन-EGFP के बाद हेला प्रकोष्ठों के मूवी 3. फ्लोरोसेंट समय चूक माइक्रोस्कोपी 1 एनएम पैक्लिटैक्सेल के साथ इलाज किया गया। क्रोमोजोम लगाव और अलगाव के मुद्दों, देखा जा सकता है चित्रा 3 में वर्णित है। छवियाँ एक 20X PH2 0.70 एनए लेंस के साथ हर 10 मिनट हासिल किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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    मूवी 4. फ्लोरोसेंट सेल चक्र मार्करों कोशिका चक्र प्रगति की प्रत्यक्ष निगरानी के लिए अनुमति दें। FUCCI प्रणाली व्यक्त HT1080 कोशिकाओं longitudinally समय चूक माइक्रोस्कोपी के दौरान ट्रैक किए गए थे। सेल बँटवारा बाहर निकलने के बाद मंद हो जाता है, और फिर लाल हो जाता है के रूप में सेल G1 चरण के माध्यम से प्रगति। सेल में प्रवेश करती एस चरण के रूप में, यह पीला हो जाता है के रूप में हरी geminin जांच बढ़ जाती है और लाल Cdt1 जांच अपमानित किया जाता है। सेल हरी बनी हुई है के रूप में यह एस और G2 चरण के माध्यम से प्रगति। हरी degrades के रूप में कोशिकाओं anaphase प्रवेश करती है। इस सेल की मात्रा 4 चित्र में दिखाया गया है। छवियाँ एक 20X PH2 0.70 एनए लेंस के साथ हर 10 मिनट हासिल किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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    मूवी 5. HT1080 सेल एक G1 चरण अवरोध करनेवाला के साथ उपचार के बाद फ्लोरोसेंट सेल चक्र मार्करों व्यक्त। HT1080 कोशिकाओं FUCCI प्रणाली व्यक्त 10 माइक्रोन PD0332991, एक Cdk4 / 6 अवरोध करनेवाला के साथ इलाज किया गया। पर नज़र रखी सेल बँटवारा और विभाजित करने के लिए सामान्य रूप से प्रगति। एक बेटी पता लगाया है, और फिल्म की अवधि के लिए G1 में लाल रहता है। मात्रा का ठहराव चित्रा 5 में दिखाया गया है। छवियाँ एक 20X PH2 0.70 एनए लेंस के साथ हर 10 मिनट हासिल किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

    moive 6
    मूवी 6. HT1080 सेल Selinexor। Exportin -1 एफडीए, HT1080 कोशिकाओं FUCCI प्रणाली को व्यक्त करने के साथ उपचार के बाद फ्लोरोसेंट सेल चक्र मार्करों व्यक्त इलाज थे1 माइक्रोन selinexor साथ एड। यह देर से G2 चरण सेल बँटवारा माध्यम से पता लगाया गया था। एक बेटी सेल के माध्यम से तो G1 चरण (लाल) की प्रगति और प्रवेश करती एस चरण (पीला)। सेल एस चरणों के माध्यम से धीरे-धीरे प्रगति जब तक यह देर-एस / G2 चरण में प्रवेश करती है और 21 घंटा के उपचार के 30 मिनट के बाद मर जाता है। मात्रा का ठहराव चित्रा 5 में दिखाया गया है। छवियाँ एक 20X PH2 0.70 एनए लेंस के साथ हर 10 मिनट हासिल किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

    moive 7
    एक topoisomerase द्वितीय अवरोध करनेवाला। HT1080 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक डबल कतरा डीएनए की क्षति मार्कर mCherry-BP1-2 और H2B-EGFP व्यक्त के साथ उपचार के बाद मूवी 7. डीएनए में नुकसान गतिशीलता 10 माइक्रोन etoposide, एक topoisomerase द्वितीय अवरोध करनेवाला के साथ इलाज किया गया। mCherry-BP1-2 फिल्म में दिखाया गया है। उपचार के रूप में जारी रखने के लिएएस, mCherry-BP1-2 बढ़ जाती है की सिग्नल, डबल कतरा डीएनए की क्षति वृद्धि हुई संकेत मिलते हैं। मात्रा का ठहराव 6 चित्र में दिखाया गया है। छवियाँ एक 40X PH2 0.75 एनए लेंस के साथ हर 10 मिनट हासिल किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    समय चूक माइक्रोस्कोपी और अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग के लाभ

    माइक्रोस्कोप दवा प्रतिक्रिया के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए एक आदर्श साधन के रूप में यह जांचकर्ताओं व्यक्ति की कोशिकाओं और उनके भाग्य के साथ-साथ पूरी आबादी को ट्रैक करने की अनुमति देता है। कोशिकाओं की आबादी के भीतर दवा जवाब में परिवर्तनशीलता विरोधी कैंसर चिकित्सकीय डिजाइन के लिए एक प्रमुख मुद्दा है। एकल कक्षों के अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग जांचकर्ताओं इस परिवर्तनशीलता का पालन और अंतर्निहित तंत्र और परिणामों को समझने के रूप में यह सेल की आबादी से संबंधित है शुरू करने के लिए अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट जांच की एक किस्म का उपयोग तरीकों का पालन और दोनों आम और दुर्लभ प्रतिक्रिया phenotypes समझने के लिए मुहैया कराती है। समय और अलग सेल भाग्य का योगदान जनसंख्या प्रतिक्रिया करने के लिए, उपचार पर सेल लाइनों या राज्य के बीच जवाब में विशिष्ट phenotypes और भाग्य, और मतभेदों के बीच रिश्तों को क्या सीखा जा सकता है के उदाहरण हैं। कई कैंसर से संबंधित प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है। कुछ है कि इस लेख में प्रकाश डाला नहीं कर रहे हैं apoptosis, भोजी साथ कोशिका मृत्यु, और नेक्रोसिस संवाददाताओं से 39-42, सेल आक्रमण 43,44, और p53 गतिशीलता है कि सेल भाग्य का निर्णय 27 का निर्धारण शामिल हैं। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण विरोधी कैंसर चिकित्सा विज्ञान के अध्ययन में अध्ययन करने के लिए सीमित नहीं है। एक ही सिद्धांतों बँटवारा 45 cytoskeleton गतिशीलता 46,47 और intracellular 48 सिगनल सहित कई अन्य जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

    समय चूक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी भी प्रोटीन और ब्याज के अणुओं के स्थानीयकरण और तीव्रता डेटा प्रदान कर सकते हैं। न केवल प्रोटीन के स्तर का दवा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण में परिवर्तन कर रहे हैं, लेकिन सेल के भीतर प्रोटीन की उचित (या अनुचित) स्थानीयकरण समझ प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। समय चूक माइक्रोस्कोपी (जहां प्रोटीन स्थानीय कर रहे हैं पर डेटा प्रदान करता है जैसे।, नाभिक, cytosol, विशिष्ट अंगों,नशीली दवाओं के उपचार और कैसे स्थानीयकरण और कुल का स्तर एक एकल कोशिका और जनसंख्या के स्तर पर समय के साथ बदलने के बाद आदि।)।

    चुनौतियां और सीमाएं

    समय चूक माइक्रोस्कोपी और एकल कक्षों के अनुदैर्ध्य विश्लेषण की ताकत के बावजूद, वहाँ सीमाएं हैं। प्रतिदीप्ति संवाददाताओं से अपनी स्थिरता और विशिष्टता द्वारा सीमित हैं। जब फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन डिजाइनिंग, यह एक जांच तस्वीर-स्थिर और उज्ज्वल है कि चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह अपने सामान्य कार्य है और ठीक से स्थानीय बनाना करने की क्षमता के बारे में ब्याज की प्रोटीन से जुड़ी होने के फ्लोरोसेंट टैग के प्रभाव पर विचार करने के लिए आवश्यक भी है । इन मुद्दों को अन्यत्र विस्तार से चर्चा की गई है और वहाँ कई उपलब्ध फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन कि 15,49,50 प्रकाशित किया गया है। अन्य फ्लोरोसेंट लेबल या टैग कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है, और देखभाल सुनिश्चित करने के लिए वे जहरीले नहीं हैं लिया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, इन पीवस्त्र, उदाहरण के mitochondrial लेबल (झिल्ली क्षमता) या सेल पारगम्य डीएनए रंगों के लिए, आसान ब्लीच करने के लिए जाते हैं और सेल प्रसार के कारण पतला-बाहर हो जाएगा।

    इसके अलावा, वहाँ बढ़ रही है और एक माइक्रोस्कोप पर कक्षों का अवलोकन करने के साथ कई तकनीकी चुनौतियां हैं। तापमान, आर्द्रता, वातावरण, और प्रकाश के संबंध के साथ अस्थिरता कोशिकाओं पर बड़ा प्रभाव हो, डेटा की हानि या यहां तक ​​कि पूरे प्रयोग में जिसके परिणामस्वरूप। छवि पर कब्जा के बारे में स्थिरता के मुद्दे सिनेमा 1 और 2 में देखा जा सकता है। इस आशय (4.2 देखें) आयल फिल्म के उपयोग के माध्यम से कम किया जा सकता है। वहाँ भी ImageJ (एनआईएच) का उपयोग अधिग्रहण के बाद के प्रसंस्करण के लिए उपलब्ध छवि स्थिरीकरण एल्गोरिदम, उदाहरण के लिए कर रहे हैं। लंबी अवधि के समय चूक का एक पहलू है कि अक्सर अनदेखी डेटा प्रबंधन और फ़ाइल आकार है। यहां तक ​​कि जब डेटा binning, एक ही समय चूक प्रयोग 30 गीगाबाइट से अधिक में अक्सर होता है। उच्च क्षमता, उच्च गति, विश्वसनीय डेटा भंडारण और हस्तांतरण मजबूत हैंLy प्रोत्साहित किया। फ्लोरोसेंट biosensor (s) imaged किया जा रहा है पर निर्भर करता है, यह अक्सर पूर्ण संकल्प छवियों, उदाहरण के परमाणु या cytoplasmic सेंसरों के लिए प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है। हम छोटे, आसान है, जिसके परिणामस्वरूप डेटा, कम मांग कंप्यूटिंग की जरूरत है, और काम के प्रवाह में सुधार के साथ काम करने के लिए आकार फ़ाइल रखने के लिए कदम उठाने की सलाह देते हैं, जब भी संभव हो,।

    Phototoxicity जब लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन एक प्रमुख चिंता का विषय है। उच्च तीव्रता प्रकाश और लंबे निवेश फ्लोरोसेंट जांच, सेल तनाव और कोशिका मृत्यु का photobleaching के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इन प्रभावों डेटा पर बड़ा प्रभाव हो और प्रयोग की गलत बयानी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। कैमरा binning और लाभ के लिए जोखिम के समय को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रकाश पथ में तटस्थ घनत्व फिल्टर नमूना पर प्रकाश की तीव्रता को कम। प्रकाश की तरंग दैर्ध्य छवि के लिए इस्तेमाल भी कोशिकाओं को प्रभावित करेगा। तरंग दैर्ध्य (यूवी, पास यूवी) कोशिकाओं के लिए अधिक हानिकारक होते हैं और की तुलना में जल्दी दरों पर तस्वीर विरंजन में परिणामअब तरंग दैर्ध्य (जैसे।, लाल, लाल अब तक)। उद्देश्य का चुनाव भी इमेजिंग शर्तों को प्रभावित कर सकते हैं। उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) लेंस उच्च संकल्प छवियों का उत्पादन होगा, लेकिन उच्च बढ़ाई कम प्रकाश नमूना उच्च जोखिम बार या उससे अधिक तीव्र प्रकाश में जिसके परिणामस्वरूप से प्रेषित किया जा सकता है। एक उद्देश्य के लिए एक उपयुक्त एनए और बढ़ाई कि oversampling बिना ब्याज के अपने उद्देश्य को हल करेंगे के साथ चुना जाना चाहिए। कई मामलों में, उच्चतम उद्देश्य के लिए सबसे उपयुक्त विकल्प नहीं हो सकता। परमाणु जांच (आंकड़े 4, 5) के साथ, के लिए एक बड़ा क्षेत्र है, पर कब्जा कर लिया जा करने के लिए प्रभावी ढंग से नमूने का आकार बढ़ रही है, इच्छित वस्तु का संकल्प समझौता किए बिना एक कम बढ़ाई उद्देश्य की अनुमति देता है। तीन आयामों में लंबी अवधि के समय व्यतीत हो जाने के एकीकृत प्रकाश जोखिम के कारण सावधानी से किया जाना चाहिए। एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन, संवेदनशील कैमरे का उपयोग (जैसे।, ईएम सीसीडी), कैमरा लाभ, और जेड श्रृंखला के लिए एक तेजी से पीजो मोटर suggeste हैडी प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए। तेजी से जेड श्रृंखला अधिग्रहण भी है कि अधिग्रहण की अवधि के दौरान हो सेल आंदोलन और गतिशीलता के कारण गति कलाकृतियों को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। कई अलग अलग सेटिंग्स का उपयोग कर इलाज कोशिकाओं के अनुभवजन्य विश्लेषण किसी भी कोशिका लाइन या पत्रकार पर फ्लोरोसेंट प्रकाश के प्रभाव का निर्धारण करने में उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, एक अनुपचारित नियंत्रण प्रयोगात्मक सेटिंग की साइटोटोक्सिक प्रभाव का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए।

    तकनीक के बदलाव

    लंबी अवधि के समय व्यतीत हो जाने के मजबूत और बहुत लचीला है। सह संस्कृति तकनीक, अलग सेल लाइनों या एक ही सेल लाइनों अलग संवाददाताओं से व्यक्त करने का प्रयोग किया जा सकता है। इस का एक उत्कृष्ट उदाहरण लक्ष्य कोशिकाओं है कि एक एंटी-कैंसर की दवा के जवाब में मर रहे हैं साथ phagocytic कोशिकाओं इमेजिंग है। एक अन्य उदाहरण पड़ोसी दवा भोली कोशिकाओं पर कोशिकाओं जवाब के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए हो सकता है। फोटो-एक्टिवा के साथ युग्मितteable, फोटो परिवर्तनीय, और फोटो switchable फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और इंजीनियर प्रोटीन है कि प्रकाश से सक्रिय किया जा सकता है विशेष प्रभाव ट्रिगर करने के लिए (जैसे।, KillerRed), वहाँ कई संभावनाएं हैं। अधिक जटिल दृष्टिकोण, इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तरह photobleaching, Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) के बाद फ्लोरोसेंट पुनर्वितरण, और सुपर संकल्प (उदा।, स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान), स्ट्रक्चरल रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) के रूप में माइक्रोस्कोपी के विभिन्न विशेष प्रकार के काम या प्रेरित उत्सर्जन कमी (STED)), और कई अन्य लोगों और वहाँ फायदे और प्रत्येक दृष्टिकोण की सीमाएं हैं।

    लंबी अवधि (जैसे।, सप्ताह, महीने) प्रतिक्रियाओं और नशीली दवाओं के हटाने के बाद कोशिकाओं की वसूली विरोधी कैंसर दवा कार्रवाई को समझने के लिए केंद्रीय है। Gridded गिलास नीचे व्यंजन बार बार एक जनसंख्या / क्षेत्र के भीतर विशिष्ट कोशिकाओं या क्षेत्रों पर नजर रखने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं। उदाहरण के लिए, एक gridded पकवान के साथ, प्रारंभिक डॉयूजी प्रतिक्रिया एक समय चूक का उपयोग imaged किया जा सकता है, दवा से हटाया जा सकता है, और ग्रिड में विशिष्ट क्षेत्रों इच्छित समय पर समय के साथ imaged या अतिरिक्त समय चूक के लिए किए जा सकते हैं। बर्तन पर गिलास नीचे एक मुंशी उपकरण के साथ या तो काटने से या एक वाणिज्यिक अभिकर्मक का उपयोग करके हटाया जा सकता है, और कांच पर कोशिकाओं हित के अन्य मार्कर, उदाहरण के वार्धक्य जुड़े β-galactocidase गतिविधि के लिए के लिए कलंकित किया जा सकता है, और की तुलना समय चूक कैसे कोशिकाओं को इस स्थिति तक पहुँच के इतिहास को समझने की। अगर सेल की आबादी काफी बड़ी है यह भी immunoblotting के अधीन या प्रवाह cytometry जा सकता है।

    मोटी नमूने पारंपरिक रूप से छवि के लिए मुश्किल हो गया है, विभिन्न जेल सामग्री और matrices में उदाहरण के लिए spheroids। नई फ्लोरोसेंट confocal या बहु photon माइक्रोस्कोपी 16,18,19,51 सहित कैसे कोशिकाओं विरोधी कैंसर चिकित्सा विज्ञान के लिए प्रतिक्रिया के सीटू समझ में करने के लिए दृष्टिकोण का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दृष्टिकोण।एसई के अध्ययन और कैंसर रोधी दवा प्रतिक्रिया 24,52-54 स्पष्ट रूप से प्रदर्शित है कि हम एकल कोशिका फार्माकोडायनामिक्स की समझ के कैंसर रोधी दवाओं का उपयोग करने की हमारी क्षमता में सुधार में मदद मिलेगी कि विकास की ओर बढ़ रहे हैं अध्ययन करने के लिए समय चूक का उपयोग करते हुए वैज्ञानिकों से बढ़ती संख्या अधिक प्रभावी ढंग से और शायद कैंसर रोधी दवा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

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