Gennem Looking Glass: Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking af enkelte celler til at studere antikræftmidler

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Responset af enkeltceller til anticancerlægemidler bidrager væsentligt til at bestemme befolkningen reaktion, og derfor er en væsentlig medvirkende faktor i det samlede resultat. Immunoblotting, flowcytometri og faste celle eksperimenter er ofte anvendt til at undersøge, hvordan celler reagerer på anticancerlægemidler. Disse fremgangsmåder er vigtige, men de har flere ulemper. Variation i narkotika reaktioner mellem kræft og normale celler, og mellem celler af forskellig kræft oprindelse og forbigående og sjældne reaktioner er vanskelige at forstå at bruge befolkning gennemsnitsperioder analyser og uden at kunne direkte spore og analysere dem på langs. Mikroskopet er særlig velegnet til at afbilde levende celler. Fremskridt inden for teknologi gør det muligt at rutinemæssigt billeddata celler ved en beslutning, som muliggør ikke kun cellesporing, men også den observation af en række cellulære responser. Vi beskriver en fremgangsmåde i detaljer, der giver mulighed for kontinuerlig time-lapse billeddannelse afceller under lægemiddelrespons til væsentlige så længe som ønsket, typisk op til 96 timer. Brug af variationer af fremgangsmåde kan celler overvåges for uger. Med ansættelsen af ​​genetisk kodet fluorescerende biosensorer mange processer, veje og reaktioner kan følges. Vi viser eksempler, der omfatter sporing og kvantificering af cellevækst og cellecyklusprogression, kromosom dynamik, DNA-skader, og celledød. Vi diskuterer også variationer af teknikken og dens fleksibilitet, og fremhæve nogle almindelige faldgruber.

Introduction

Live-cell mikroskopi og langsgående sporing af enkeltceller er ikke en ny teknik. Fra de tidligste mikroskoper, har entusiaster og forskere observeret og studeret enkelte celler og organismer, deres adfærd og udvikling 1-3. Et berømt eksempel fra slutningen David Rogers på Vanderbilt University i 1950'erne viser en menneskelig neutrofil i en blod udstrygning jagter en Staphylococcus aureus bakterie og til sidst processen med fagocytose 4. Denne live-cell film er en glimrende illustration af, hvordan flere processer kan observeres og korreleres i et enkelt forsøg: sansning af en kemisk gradient, mekanikere og hastigheden af ​​cellemotilitet, celleformer dynamik, adhæsion og fagocytose af et patogen.

Fremkomsten af ​​fuldautomatiske mikroskoper og meget følsomme digitale kameraer har resulteret i et stigende antal efterforskere bruger mikroskopi til at stille grundlæggende spørgsmål i cellebiologi spænder from hvordan celler bevæger 5,6 og dividere 7,8 til organel dynamik og membran menneskehandel 9-11. Ikke-fluorescerende, lysfelt mikroskopi, herunder fase-kontrast (PC), der høstede Nobelprisen for Frits Zernike i 1953, og differential interferens kontrast (DIC) giver mulighed for observation af celler og kerner, men også sub-cellulære strukturer, herunder bundter mikrotubuli , kromosomer, nucleoli, organel dynamik, og tykke actin fibre 12. Genetisk indkodede fluorescerende proteiner og udvikling af fluorescerende farvestoffer mod organeller har dramatisk påvirket tidsforskudt mikroskopi 13-15. Selvom det ikke er i fokus i denne artikel, billedbehandling i celle sfæroider og in situ (intravital mikroskopi) ved hjælp af konfokal og multifoton mikroskopi repræsenterer en anden udvidelse af tilgang, og der er udestående artikler, der bruger og diskutere disse tilgange 16-19.

Svarene fra celler til anti-CancER narkotika eller naturlige produkter bestemmes på det molekylære og cellulære skala. Forståelse celle responser og skæbner efter behandling indebærer ofte befolkningens gennemsnitsperioder assays (f.eks., Immunoblotting, hele såvel foranstaltninger), eller faste tidspunkter med immunfluorescent afsløring og flowcytometri, der måler enkeltceller. Heterogenitet encellede reaktioner på lægemidler inden for en population, især i tumorer, kan forklare nogle af variabiliteten i respons set på tværs af cellelinjer og tumorer, der behandles med det samme lægemiddel ved mætning. Langsigtet langsgående tilgange til at følge en given enkelt celle eller en population af celler er et mindre almindelig men meget kraftfuld tilgang, der giver mulighed for direkte undersøgelse af molekylære respons pathways, forskellige fænotyper (f.eks., Celledød eller celledeling), observation af celle-til-celle variation i en population, og hvordan disse faktorer bidrager til befolkningens respons dynamik 20-22. Optimistisk, at kunneat observere og kvantificere encellede svar vil hjælpe med at forbedre vores forståelse af, hvordan lægemidler virker, hvorfor de undertiden mislykkes, og hvordan man bedst bruger dem.

Teknikken med langsigtet time-lapse mikroskopi, langsgående sporing og analyse af lægemiddelkandidater responser er tilgængelig for mange forskere, og kan være enkel, der kun bruger transmitteret lys at observere fænotype responser 20,21. De vigtigste komponenter i tilgangen omfatter: passende forberedelse af cellerne af interesse, et automatiseret mikroskop med klimakammer, et kamera integreret med en computer til at erhverve og gemme billederne, og software til at gennemgå time-lapse og måle og analysere cellerne og eventuelle fluorescerende biosensorer. Vi giver en detaljeret protokol med mange tips til udførelse time-lapse mikroskopi af dyrkede celler, så længe flere dage ved hjælp lysfelt og / eller vidvinklede epifluorescens mikroskopi. Denne protokol kan anvendes til enhver cellelinie, der kan dyrkes i kulturat studere deres reaktioner på anti-behandlinger mod kræft. Vi giver eksempler på data indhentet og analyseret ved hjælp af flere forskellige genetisk kodet fluorescerende biosensorer og et eksempel på fase-kontrast mikroskopi, kort diskutere forskellige typer af sonder, fordele og ulemper ved længerevarende time-lapse og langsgående sporing, hvad der kan være lært til denne tilgang, der er svært at forstå fra ikke-direkte tilgange, og nogle variationer, som vi håber vil være af interesse og værdi for uerfarne forskere, der ikke har overvejet at bruge tilgang, og til erfarne forskere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende protokol anvender parametre defineret af eksperimenterne i figur 4 og 6 om indstillinger erhvervelse og forsøgsbetingelserne. Mange af disse parametre kan ændres til at passe andre eksperimenter (dvs. eksponeringstider, binning, fluorescerende kanaler, osv.). Alle procedurer skal overholde institutionelle retningslinier og regler, og skal godkendes af den institutionelle biosikkerhed udvalget. Mikroskop producenten hjemmesider indeholder gode oplysninger for levende celler.

1. Mikroskoper og Imaging Software

  1. Udføre levende celler på en lang række forskellige inverterede mikroskoper. De mest almindelige mikroskoper er vidvinklede epifluorescens og spinding-disc konfokal. Her skal du bruge en automatiseret og motoriseret Vidvinklet epifluorescensmikroskop med 200 watt metalhalogen lyskilde.
  2. Anskaf en scene-top eller mikroskop miljømæssig kammer. Her skal du bruge en scene-top klimakammer.
  3. Brug kommerciel software til at drive mikroskoper med hjælpeprogrammer til at udføre time-lapse mikroskopi.
  4. Brug kommercielt tilgængelige software eller ImageJ til billedanalyse. Mange andre analyseværktøjer er kommercielt tilgængelige, og der er skræddersyede programmer, hvoraf mange er blevet offentliggjort 8,18.

2. Visualisering cellulære processer og fænotypiske Responses

  1. Visualisere celler med lysfeltmikroskopi. Differential interferens kontrast og fasekontrast alene kan være meget informativ at studere reaktioner på anti-cancer narkotika reaktioner. Disse processer kan indbefatte mitose, cellemotilitet og apoptose.
  2. Visualiser cellestrukturer, organeller og processer med fluorescerende biosensorer. Fluorescerende prober er informative i at spore specifikke subcellulære processer. Disse kan omfatte mikrotubulusdynamik, mitokondrie og endoplasmatisk reticulum dynamik, protein ophobning og lokalisering, ogmolekylær signalering (f.eks., phosphorylering, calcium).

3. Forberedelse af prøver

  1. Grow celler i cellekultur-certificerede retter i en standard, befugtet cellekultur inkubator (f.eks 37 ° C, 5% CO2, 80% relativ fugtighed).
    1. Grow HT1080-celler i MEM med EBSS. Supplere mediet med 10% v / v FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / v natriumpyruvat og 1% volumen / volumen ikke-essentielle aminosyrer.
  2. To dage før billedbehandling, plade 50.000 HT1080 Fucci celler i 3 brønde i en 12-brønd # 1.5 glasbund fad i en godkendt steril laminar flow hætte. Justere antallet af udpladede celler til opnåelse ~ 60% konfluens for starten af ​​forsøget. Afhængigt af cellelinjen og arten af ​​forsøget celletætheden kan være mindre.
    Bemærk: Celletæthed kan have stor indflydelse på væksten af ​​cellelinjen og de eksperimentelle resultater. Tæl celler for at minimere eksperiment-til-eksperiment variability grund densitet.
    1. Afhængig af den miljømæssige kammer og de nødvendige betingelser for eksperimentet, plade celler i enkelte såvel retter (typisk 35- eller 60-mm), 4 godt 35-mm skåle, 6-, 12- eller 24-well cellekulturplader, eller dækglasset dias i forskellige formater. Brug glas-bund plader med # 1.5 glas som de fleste objektive linser er optimeret til denne tykkelse af glas, og billeddannelse gennem cellekultur plast er meget dårlig.
      Bemærk: Nogle cellelinier ikke vokse og overleve på glas. I disse tilfælde kan glasset være overtrukket for at øge celleadhærence (f.eks., Poly-lysin eller collagen). Nogle virksomheder fremstiller optisk cellekultur plast, skal det bestemmes empirisk, hvis dette er en farbar vej.

4. Miljømæssige Chamber Set-up

  1. Forud for enhver eksperimenter, opsætning den miljømæssige kammer, så den fungerer ved ~ 80% fugtighed og så temperaturen ved prøven position er 37 ° C. Mest dyrkede celler vokse i 5% CO2 / balance luftatmosfære grund natriumbicarbonatpuffer i mediet. Afhængig af opsætning, enten indstille den miljømæssige controller til 5% CO2, og det vil blande 100% CO2 med luft, eller brug forblandet, certificeret 5% CO2 / balance luft gas. Følg producentens anvisninger for gas flowhastigheder.
    Bemærk: Nogle cellelinjer vokser i CO 2 -uafhængig medium i hvilket tilfælde de kan vedligeholdes uden CO 2. Specielt designet billeddannelse medier er også tilgængelig som begrænser tilsætningen af ​​autofluorescerende forbindelser. Vækst i afhandlinger medier for den ønskede celletype skal bestemmes empirisk forhånd.
  2. Forud for billedbehandling, sikre vandreservoiret er fyldt (efter producentens anvisninger) med sterilt destilleret vand. Tænd for miljømæssige kammer til indstillingen ønskede temperatur og læg det i mikroskop scenen indsatte. For at spare gas, ikke starte strømmen på dette tidspunkt.
    Bemærk: Hvis der er nogen fri plads mellem scenen-top kammer og scene indsat og / eller nogen spænding på tilslutning ledninger til kammeret den kan indføre bevægelsesartefakter i eksperimentet.
    1. Læg stykker af paraffin film over kanterne af scenen inset åbning ved indsætning i kammeret ind i det at par kammeret på scenen, og sørg for, at ingen forbindelser trækker på kammeret.
  3. Lad kammeret afbalancere til 37 ° C. Oprethold en stabil temperatur for at undgå temperatursvingninger under billedbehandling, som kan påvirke celle fysiologi og indføre afdrift. Nå temperatur ligevægt kræver typisk 30 min til 1 time, afhængigt af miljøet.
    1. Indsætte en "dummy" skål med vand i brøndene i kammeret under opvarmning. En imaging fad fyldt med vand efterligner prøven, hjælpe sikre kammeret er tilstrækkeligt varmet og stabiliseret. Fyldning af kammeret med foropvarmet sterilt vandreducerer den nødvendige tid til stabilisering temperatur og minimerer temperaturfaldet ved tilsætning af den eksperimentelle prøve.

5. Mikroskop Opsætning

  1. Tænd mikroskopet, tilhørende computer, og eventuelle nødvendige periferiudstyr.
    1. Afhængig af lyskilden, vente med at tænde den, indtil behov (f.eks., LED).
  2. Med det formål tårn i en lav position, skal du vælge 20X 0,7 NA mål, der skal anvendes.
  3. Anbring prøven for målet - dette vil gøre det lettere at finde de celler, når prøven er i kammeret.
  4. Definer imaging parametre på nuværende tidspunkt, hvis de er kendt fra tidligere eksperimenter.

6. Transport Celler til mikroskop og ind i salen

  1. Transporterer cellerne, der skal afbildes fra inkubatoren til miljøkammeret. Sørg for, at dette sker hurtigt for at begrænse virkningerne af en forholdsvis lav CO 2
  2. Placer cellerne i en forseglet Styrofoam beholder eller isolerede pose for at undgå store miljømæssige ændringer.
  • Sæt prøven imaging skålen ind i kammeret efter producentens anvisninger.
  • Efter cellerne er blevet fastgjort i den miljømæssige kammer, forsegle kammeret at opretholde et stabilt miljø og straks tænder for kilden (r) af atmosfærisk gas.
    1. Da nogle miljøkamre ikke udnytter en stram, forseglet låg, for at forsinke fordampningen, lag sterilt, embryo-certificeret mineralolie oven på vækstmediet. Wrap gas-gennemtrængelige paraffin film omkring omkredsen-kanterne af prøven parabol være omhyggelig med ikke at lægge hindringer i vejen glasset imaging-området. Lokaliserede, sekundære befugtning fremgangsmåder kan anvendes. Kondens på låget af prøven parabol kan mindske perfortater af brightfield mikroskopi.
  • For at minimere virkningerne af termisk drift tidligt under forsøget, vente 30 min før du starter time-lapse. Den nødvendige tid varierer baseret på billedbehandling fad størrelse og andre faktorer. Bestem empirisk.
  • 7. Opsætning af Imaging

    1. Vælg imaging betingelser, der vil bedst repræsenterer de data. Tag forholdsregler for at undgå fototoksicitet ved at begrænse eksponering gange med lavere intensitet lys og vælge sonder, der er ophidset af længere bølgelængder af lys.
    2. Definer x, y og z-planet og ønskede bølgelængde (r) for hver position, der skal afbildes. Den tidsopløsning er begrænset af antallet af positioner og bølgelængder. For langsigtede time-lapse af de fleste cellulære processer, erhverve et billede hver 10 - 20 minutter; højere tidsopløsning (korte intervaller, f.eks., 1 min) giver flere datapunkter, og derfor mere robust celle sporing, men også resulterer i mere integreredelyseksponering og større datasæt.
      1. Som HT1080 Fucci har dynamiske grønne og røde fluorescerende proteiner (se Repræsentative resultater), bruge følgende eksponeringstider: FITC / GFP - 50 msek, Texas Rød / TRITC - 40 msek, lysfelt - 20 msek. Anvend en 2 x 2 bin.
    3. Aktiver software kontrolleret autofokus ved brug af standardparametre under avancerede indstillinger. Definer en autofokus mellem 10 um med den anbefalede trin størrelse. Sørg for at gøre dette, før du starter time-lapse. Autofokus med lysfelt billeder og aldrig med fluorescens at reducere fototoksicitet og fotoblegning.
      1. Brug software kontrolleret autofokus-systemer på alle mikroskop med en motoriseret scene, og direkte fokus på prøven. De kan imidlertid begrænse erhvervelsen hastighed af eksperimentet. Hardware kontrolleret kontinuerlig fokus systemer fungerer godt for time-lapse mikroskopi og forbedre hastigheden, der giver mulighed for flere positioner, der skal afbildes eller en højere sats for erhvervelsen. Men deafhængige detektion af luft-glas-grænsefladen og kan miste fokus af prøven med variationer i glastykkelse på tværs brønden.
    4. Erstat halvdelen af mediet med medium indeholdende den ønskede lægemiddelkoncentration, der er blevet opvarmet til 37 ° C. Delvis medier udskiftning hjælper med at reducere termisk drift. Betingelserne i dette forsøg er Vehicle (DMSO), 1 pM selinexor og 10 pM PD0332991.
      Bemærk: Dette trin kan også gøres efter start overtagelse ved pause og genstarte eksperimentet. Dette giver mulighed for langsgående sporing af præ- og post-lægemiddel reaktioner af enkeltceller. Hvis lægemiddel stabilitet eller metabolisme er en bekymring, pauser og erstatning af medier kan gøres med den samme metode. For at teste for nedbrydning eller metabolisme narkotika, kan medier fra behandlede celler også placeres på naive celler til at teste narkotika handling.
    5. Start time-lapse.
    6. Da den time-lapse kører, sikre, at de afbildede felter forbliver i fokus og chamber opretholder et fugtigt 37 ° C.
      1. Juster fokus efter behov ved at pause købet i den tid kløft mellem tidspunkter.
    7. Hvis det er nødvendigt, tilsæt vand til kammeret i længere eksperimenter. Undgå afkøling af kammeret ved tilsætning forvarmet, sterilt destilleret vand ved 37 ° C.

    8. Afslutning af Time-lapse

    1. Når eksperimentet er løbet til ende, stoppe købet, hvis det ikke var indstillet til at stoppe automatisk.
    2. Sørg for, at time-lapse er blevet gemt korrekt på harddisken, selv om de fleste softwarepakker automatisk gemme under købet, hvis ikke færdig korrekt data kan gå tabt.
    3. Fjern kammeret fra mikroskop og disponere over de celler i biologisk affald efter godkendte institutionel biosikkerhed procedurer.

    9. Langsgående sporing og analyse af Time-lapse data

    1. Vælg den metode til analyse, der erpassende for den biologiske processer af interesse. Mange plugins til ImageJ, programmer ved hjælp af Matlab og brugerdefinerede platforme er blevet produceret til specifikke applikationer. Følgende metode omfatter sporing af kerner og analyse af nukleare fluorescerende prober som vist i figur 4 og 5.
    2. Åbn .tif billedstakke for de udnyttede kanaler i ImageJ. Alternativt åbne indfødte filer fra købet program direkte i ImageJ bruge Bioformats plugin.
    3. Tegn et område af interesse (ROI) i kernen af ​​en celle ved hjælp af lysfelt billede eller den nukleare label kanal (hvis anvendt), og føje den til ROI manager. Bemærk: Hvis de afbildede celler har en nuklear etiket (f.eks histon H2B-EGFP.), Derefter automatisk cellesporing kan anvendes til at skabe områder af interesse (ROI'er), der repræsenterer individuelle kerner gennem tiden.
    4. Fortsæt til næste tidspunkt og placere ROI inden for samme nucleus. Tilsæt ROI til ROI manager.
    5. Fortsæt med at spore og gøre ROI'er for den enkelte celle, indtil der er en cellulær begivenhed (mitose, apoptose, osv.) Eller cellen ikke længere kan spores (dvs.., Bevæger sig ud af rammen eller eksperiment slutter).
    6. Når der er etableret ROI'er for celler gennem tid, de er i marken, overlejre dem på de fluorescerende kanaler af interesse. Mål den gennemsnitlige intensitet af fluorescensen i hver kanal for hver tidspunkt. Gem listen ROI til senere brug.
      1. Forskellige målinger kan foretages inden for ROI for ansøgninger i forskellige eksperimenter. Klik Analyse → Set Målinger ... for at få en menu til at vælge den analytiske metode (f.eks., Mener intensitet i ROI, integrerede intensitet osv.).
    7. Bemærk celle skæbner for individuelle celler (f.eks., Apoptose, division, overlevelse), mens sporing. Dette giver mulighed for etablering af overlevelseskurver og further population analyse.
    8. Med den gennemsnitlige intensitet for begge kanaler, skabe et scatter plot for at vise cellecyklus dynamik som respons på terapi (figur 5B, C).
      Bemærk: Plots kan oprettes for individuelle celler over tid eller i gennemsnit over en population af sporede celler. Kvantitativ billedbehandling kan være afgørende for oprettelse af komplekse reaktioner og celle relationer som reaktion på kræftmedicin. Langsigtet time-lapse mikroskopi, langsgående sporing og analyse af data er en multi-trins proces, med mange muligheder for den type mikroskopi og analyseværktøjer, og følger den generelle skitse tilvejebragt i figur 1.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Langsigtet time-lapse mikroskopi og direkte langsgående sporing muliggør studiet af mange anti-cancer virkninger under lægemiddelrespons. Efter den generelle omrids i figur 1, er flere eksempler på celler vist udtrykker validerede fluorescerende journalister, at behandling med anti-cancer medicin, spores, og analyseret ved hjælp af forskellige metoder.

    Fase kontrast mikroskopi alene er meget informativ og håndfast rapporter om interfasen versus mitose, mitotisk varighed og anholdelse, unormal celledeling, og celledød 21,23,24. Lægemidler, der er målrettet celledeling, ofte betegnet antimitotiske lægemidler fortsat blive udviklet. Figur 2 og Film 1 og 2 viser eksempler på et par af matchede brystkræft-afledte MCF7 cellelinjer, som kun afviger i deres p53 status, som blev behandlet med 500 nM af en type anticancerlægemiddel at målog hæmmer mitotiske motor protein, kinesin-5 (KSP1, Kif11, EG5), hvilket resulterer i langvarige mitose 20. Vildtype MCF7-celler (figur 2A) er et paradigme for at studere p53-afhængig cellecyklusstandsning 25-27. Vildtypeceller indtaste mitose, forbliver i adskillige timer, til sidst forlade og stort set standse med induktion af p53 25. Når p53 fjernes ved stabil p53 knockdown (MCF7 sh p53), i stedet for at standse, når de forlader mitose, cellerne gennemgå gentagne cyklusser (figur 2B). Celler blev sporet manuelt, og mitotisk indeks og procentdelen af celler, der indtaster et andet mitose blev bedømt (figur 2C, D). Vi observerer, at sh p53 celle spores skel, når det kommer ind i et anden runde af mitose stedet anholde og forlader mitose uden deling. Selvom det ikke er vist her, varigheden af ​​mitotiske begivenheder, kan tiden mellem successive mitose, procent af celledelinger, og tilhørende celledød begivenheder også være skernehus 20,21.

    De taxaner, fx paclitaxel og docetaxel, er almindelige kemoterapi for mange cancertyper, herunder dem, der er vanskelige at behandle som pancreas og avanceret bryst. Paclitaxel binder til den dynamiske plus-enden af ​​mikrotubuli og stabiliserer dem, forhindrer deres normale funktion. Paclitaxel har noteret dosisafhængige virkninger, og selv ved lave koncentrationer kan forstyrre normal mitotisk progression og kromosom segregation 16. Trofast adskillelse af kromosomer er afgørende for normal celledeling og når unormale kan resultere i aneuploidi, der kan udløse cellecyklus arrest, men også fungere som en drivkraft for kræft progression. Figur 3 og Movie 3 viser cervikale carcinoma-afledte HeLa-celler stabilt udtrykker kromatin markør histon-2b fusioneret til mCherry og beta-tubulin fusioneret til EGFP (ikke vist) i normalt vækstmedium behandlet med 1 nM paclitaxel. Herieksempel kan indrejse i og progression gennem mitose følges. Timingen af ​​mitose forekommer normalt i denne celle, men kromosom tilpasning og adskillelse er ikke, hvilket resulterer i nukleare buler og mikrokerner, som er strukturer indikerer dårlig kromosom adskillelse. Mikrokerner er tilbøjelige til at DNA-skader og chromothripsis, som er den store fragmentering af kromosomer eller kromatin - dette har vigtige implikationer i tumor evolution 28,29. Selvom det ikke er vist her, kan oprindelsen af ​​mikrokerner med relation til andre mitotiske strukturer og skæbnen for disse celler være direkte spores ved hjælp langsigtet time-lapse. Endvidere kan en kromatin markør udtrykt med en DNA-skader reporter kunne anvendes til at fastslå forholdet mellem kromosom adskillelse, mikrokerner og DNA-beskadigelse.

    Fluorescerende journalister mulighed for enumerable celle processer, der skal spores og nye reportere løbende blive udviklet. til exrigelig, celle cyklus består af faser, der er af særlig interesse i at udvikle målrettede kræftlægemidler. figur 4 og Movie 4 viser en fibrosarcoma-afledt cellelinje (HT1080), der stabilt co-udtrykker to journalister betegnes, fluorescerende ubiquitin cellecyklus indikatorer (Fucci) 30. I systemet her, er en del af Cdt1 polypeptid fusioneret til mKO2 (monomert Kusabira appelsin 2) og stigninger i G1-fasen og nedbrydes i begyndelsen S-fase, og en del af geminin er fusioneret til MAG (monomere Azami grøn) og stigninger i midten af ​​S-fasen og nedbrydes ved anafase. Denne celle er i normalt vækstmedium, og skrider frem gennem cellecyklussen i 15 timer. Figur 5A, B og Movie 5 viser de samme celler i normalt medium behandlet med 10 pM PD0332991, en ​​Cdk4 / 6 inhibitor. Cellerne fremskridt gennem G2-fase og deler normalt, og kraftigt standse i den efterfølgende G1-fasen, hvilket indikerer potentialet for virkningive cytostatiske virkninger i voksende tumorer. figur 5C, D og Movie 6 viser de samme celler i normalt medium behandlet med en lille molekyle kaldet selinexor (KPT-330), en potent inhibitor den nukleare eksport protein, exportin-1 (XPO1, alias CRM1 ). Disse forbindelser betegnes selektive inhibitorer af nuklear eksport (SINE) og deres anti-cancer effekter i øjeblikket under efterforskning 31,32. SINE behandling resulterer i stærke cellecyklus fænotyper og celledød 33,34. Dette eksempel viser en celle, der skrider frem gennem G1-fase med normale kinetik (ca. 6 timer), men oplever forsinkelser i S-fase progression som angivet ved perioden med både røde og grønne signal (ca. 3 timer i kontrol, men 10 i SINE behandlet ). Denne celle dør i slutningen S- eller G2-fase efter 21 timer 30 min; en normal cellecyklus er ca. 15 timer. Virkningerne af selinexor bliver undersøgt for forskellige blod og solide tumorer 35.

    Figur 6 og Movie 7 viser HT1080 celler, der stabilt udtrykker en dobbelt-strenget DNA-skader reporter, mCherry-BP1-2 36 i normal vækst medium behandlet med 10 pM etoposid (VP-16), en topoisomerase II gift. Denne reporter består af en del af DNA dobbelt-strenget pause websted protein, 53BP1 der er fusioneret til mCherry. Kernen i denne celle blev sporet USIng Analyser Partikler plugin i ImageJ og den integrerede mCherry-BP1-2 signal blev målt i hver ramme efter tærsklingsrutine ud værdier, der eliminerede opløselig nukleare sonde. DNA-skader er minimal for den første 10 timer og derefter stiger støt. Topoisomerase II-inhibitorer er kendt for at især ramme S- og G2-fase, når enzymet er mest aktive 37,38. De observerede i dette eksempel kunne tyde cellecyklus associeret skade kinetik; kombinere mCherry-BP1-2 med Fucci journalister kunne påvise timingen af ​​de skader, som derefter kan knyttes til celle skæbne.

    figur 1
    Figur 1. Oversigt over hjælp Langsigtet Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking at studere Anti-cancer Drug svar. Celler i passende levende celle billedbehandling retter mærket som ønsket er afbildet, celler eller områder af interesse spores, og dataene er analyseret. Der findes mange metoder til at spore og kvantificere celler, nogle er angivet her. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2. Fase-kontrast Time-lapse mikroskopi Viser p53-afhængighed efter Anti-mitotisk Drug Treatment. Vildtype (A) og p53-knockdown (B) MCF7 celler blev behandlet med 500 nM kinesin-5 hæmmer og filmede hver 10 min til 96 hr hjælp fase-kontrast mikroskopi med en 20X PH2 0,70 NA-objektiv. Individuelle celler blev sporet manuelt, og procent mitose og hvis cellen udvikler sig til en anden mitose igen under time-lapse blev bedømt. Pile angiver celle, som spores. Sh p53 celle (B) opdeler ved ankomsten en anden mitose. (C) Begge cellelinier show langvarig mitosestandsning som angivet af den høje peak procent mitose (første blå og røde pile). (C, D) næsten 90% af cellerne uden p53 (sh p53, n = 87) viser fortsat progression (røde pile) sammenlignet med 20% af vild-type (n = 130). Fejlsøjler indikerer standardafvigelse. Bar = 20 um. Film 1 og 2. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3. kromatin Marker histon 2b afslører Bevis for kromosomsegregering Abnormiteter efter Lavdosis Paclitaxel Treatment. Paclitaxel er et mikrotubulus-målrettet lægemiddel, der resulterer i komplekse, koncentrationsafhængige defekter i cellevækst og deling. Organiseringen af ​​kromatin informerer om forskellige celle stater, herunder stadiumaf mitose og celledød. HeLa-celler der stabilt udtrykker både H2b-mCherry og β-tubulin-EGFP blev behandlet med 1 nM paclitaxel. Denne celle er i første omgang i interfase, skrider gennem stadier af mitose og skel. Mens tiden i mitose forekommer normalt, der er tegn på kromosom vedhæftede og segregation fejl, der er løst (pile). Skæbne af disse celler kan bestemmes direkte ved langsgående sporing. Phase-kontrast (ikke vist) og fluorescerende billeder blev erhvervet til en ramme pr 10 min med en 20X Ph2 0,70 NA-objektiv. Bar = 10 um. Movie 3. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4. Fluorescerende Cell Cycle Markers Tillad for direkte overvågning af cellecyklusprogression.(A) Et felt af levende HT1080 fibrosarcomceller celler, der udtrykker Fucci systemet afbildet af fase-kontrast og fluorescens. (B, C) ​​Den mitotiske celle i den punkterede kasse i panel A følges. Normalt fremskridt gennem cellecyklus i ca. 15 timer. Efter mitose, celler kortvarigt dæmpet, og derefter bliver rød som de fremskridt i og gennem G1-fasen. Når celler ind S-fase, den røde Cdt1 proben er nedbrudt og de grønne geminin probe stiger. Den korte ca. 3 timer periode, hvor begge prober er til stede, indikerer tidlige S-fase. Som celler fremskridt gennem S- og G2-fase og ind i den næste mitose de forbliver grøn. Den grønne probe nedbrydes ved anafase af celledeling. Fase-kontrast og fluorescerende billeder blev erhvervet til en ramme pr 10 min med en 20X PH2 0,70 NA-objektiv. Bar = 10 um. Movie 4. Klik her for til view en større version af dette tal.

    Figur 5
    Figur 5. Cell Cycle Specifikke Effekter og Associeret celledød. Den samme cellelinje som i figur 4, men behandlet med to forskellige molekyler, der repræsenterer forskellige anti-cancer-targets. Tidspunkter efter behandling er vist. (A, B) Efter behandling af sen S / G2-fase celle med 10 pM PD0332991 Cdk4 / 6 inhibitor, det celle skrider normalt til mitose (M) og skel. En datter celle spores ved måling røde og grønne fluorescerende intensiteter i området af interesse i kernen. Cellen forbliver anholdt i G1-fasen i ca. 40 timer. (C, D) Efter behandling af en sen G2-fase celle med 1 uM selinexor, det celle skrider normalt til mitose (M) og skel. En datter celle er sporet og den træder G1-fasen, skrider frem gennemen langvarig tidlige S-fase (rød og grøn signal), går over i udelukkende grønt og dør efter 21 timer 30 min. Dataene antyder S-fase progression er påvirket af selinexor behandling. Fase-kontrast og fluorescerende billeder blev erhvervet til en ramme pr 10 min med en 20X PH2 0,70 NA-objektiv. Bar = 10 um. Film 5 og 6. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 6
    Figur 6. DNA-skader Dynamics efter medicinsk behandling. Mange anti-cancer behandlinger resulterer i DNA-skader, der dybt kan påvirke celle respons og behandling succes. HT1080 celler, der stabilt udtrykker både den dobbelt-strenget DNA beskadigelse markør mCherry-BP1-2 og H2b-EGFP (ikke vist) blev behandlet med 10 pM af topoisomerase II drug etoposid og DNA dAmage blev sporet. (A) Antallet og intensiteten af brændpunkterne stigning efter etoposid. Der er i første omgang en vis forsinkelse, hvilket indikerer mulige cellecyklus virkninger i overensstemmelse med den kendte mekanisme etoposid. Ved 22 t 50 min denne celle har akkumuleret høje niveauer af skader. Mens ikke vist her, kan skæbne denne celle bestemmes ved direkte sporing. (B) En ROI svarende til kernen opnås ved H2b-EGFP signal blev sporet ved hjælp partikel tracking i ImageJ og det integrerede BP1-2 mCherry signal blev kvantificeret og plottet med tiden. Den slæbende signal indtil ca. 10 timer bemærkes, efterfulgt af en vedvarende stigning. Fluorescerende billeder blev erhvervet til en ramme pr 10 min med en 40X PH2 0,75 NA-objektiv. Bar = 10 um. Movie 7. Klik her for at se en større version af dette tal.


    Movie 1. Fase kontrast Time-lapse mikroskopi af Vildtype MCF7 celler efter anti-mitotisk medicinsk behandling. Vildtype MCF7 celler blev behandlet med 500 nM kinesin-5 hæmmer og filmede hver 10 min i 96 timer ved hjælp af fase-kontrast mikroskopi med en 20X PH2 0,70 NA-objektiv. Langvarig mitosestandsning og udgang fra mitose kan observeres som beskrevet i figur 2. Klik her for at downloade denne fil.

    moive 2
    Movie 2. Fase-kontrast Time-lapse mikroskopi af p53-knockdown MCF7 celler efter anti-mitotisk Drug Treatment. MCF7-celler stabilt udtrykker en lille hårnål RNA rettet mod p53 til nedbrydning blev behandlet med 500 nM kinesin-5 hæmmer og afbildet hver 10 min i 96 timer ved hjælp af fase-kontrast mikroskopi med en 20X PH2 0,70 NA-objektiv. Langvarig mitosestandsning og flere runder af mitose kan observeres som beskrevet i figur 2. Klik her for at downloade denne fil.

    moive 3
    Movie 3. Fluorescerende Time-lapse mikroskopi af HeLa-celler efter Low-dosis Paclitaxel behandling. HeLa celler stabilt udtrykker H2B-mCherry og β-tubulin-EGFP blev behandlet med 1 nM paclitaxel. Kan observeres Kromosom udlæg og segregation spørgsmål, som beskrevet i figur 3. Billeder blev erhvervet hver 10 min med en 20X PH2 0,70 NA-objektiv. Klik her for at downloade denne fil.

    ove_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> moive 4
    Movie 4. Fluorescerende Cell Cycle Markers Tillad for direkte overvågning af cellecyklusprogression. HT1080 celler, der udtrykker Fucci systemet blev på langs sporet under tidsforskudt mikroskopi. Cellen går dim efter afslutning mitose, og derefter bliver rød som cellen skrider frem gennem G1-fasen. Som cellen træder S-fase, bliver det gul som de grønne geminin probe stiger og den røde Cdt1 proben nedbrudt. Cellen er stadig grøn som den skrider frem gennem S- og G2-fase. Den grønne nedbrydes efterhånden som cellerne går ind anafase. Kvantificering af denne celle er vist i figur 4. Billeder blev erhvervet hver 10 min med en 20X PH2 0,70 NA-objektiv. Klik her for at downloade denne fil.

    Moive 5 "src =" / files / ftp_upload / 53.994 / 53994movie5.jpg "/>
    Movie 5. HT1080 celle, der udtrykker Fluorescerende cellecyklus Markers efter behandling med en G1-fasen Inhibitor. HT1080 celler, der udtrykker Fucci systemet blev behandlet med 10 pM PD0332991, en ​​Cdk4 / 6 inhibitor. Den sporede celle skrider normalt mitose og skel. En datter er spores, og forbliver rødt i G1 for varigheden af ​​filmen. Kvantificering er vist i figur 5. Billeder blev erhvervet hver 10 min med en 20X PH2 0,70 NA-objektiv. Klik her for at downloade denne fil.

    moive 6
    Movie 6. HT1080 Cell udtrykker Fluorescerende Cell Cycle Markers efter behandling med exportin-1 Inhibitor, Selinexor. HT1080 celler, der udtrykker Fucci systemet var treated med en uM selinexor. Denne sene G2-fase celler blev sporet via mitose. En dattercelle skrider derefter gennem G1-fasen (rød) og går ind i S-fasen (gul). Cellen skrider langsomt gennem S-faser, indtil den træder sent-S / G2-fase og dør efter 21 timer 30 min behandling. Kvantificering er vist i figur 5. Billeder blev erhvervet hver 10 min med en 20X PH2 0,70 NA-objektiv. Klik her for at downloade denne fil.

    moive 7
    Film 7. DNA-skader Dynamics efter behandling med en topoisomerase II-hæmmer. HT1080 celler stabilt udtrykker dobbelt-strenget DNA skader markør mCherry-BP1-2 og H2B-EGFP blev behandlet med 10 pM etoposid, en topoisomerase II-hæmmer. Den mCherry-BP1-2 vises i filmen. Som behandling fortsætters, signalet for mCherry-BP1-2 stiger, hvilket indikerer øget dobbelt-strenget DNA-skader. Kvantificering er vist i figur 6. Billeder blev erhvervet hver 10 min med en 40X PH2 0,75 NA-objektiv. Klik her for at downloade denne fil.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Fordele ved Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking

    Mikroskopet er et ideelt instrument for longitudinelle studier af narkotika respons, da det giver efterforskere til at spore de enkelte celler og deres skæbner samt hele befolkningen. Variabilitet i lægemiddelrespons i en population af celler er et stort problem for anti-cancer terapeutisk design. Longitudinal sporing af enkelte celler giver efterforskerne at overholde denne variation og begynde at forstå de underliggende mekanismer og konsekvenser som den vedrører cellepopulationen. Ved hjælp af en bred vifte af fluorescerende prober giver masser af måder at observere og forstå både almindelige og sjældne respons fænotyper. Timingen og bidrag forskellige celle skæbner til befolkningen respons, relationer mellem bestemte fænotyper og skæbner, og forskelle i respons mellem cellelinjer eller staten efter behandling er eksempler på, hvad der kan læres. Mange kræftrelaterede processer kan studeres. Nogle, der ikke er fremhævet i denne artikel, omfatter celledød med apoptose, autophagy, og nekrose reportere 39-42, celleinvasion 43,44, og p53 dynamik, der bestemmer celle skæbne beslutninger 27. Desuden er denne metode ikke begrænset til studier anticancer-midler studier. De samme principper kan anvendes til at studere mange andre biologiske processer, herunder mitose 45 cytoskeleton dynamik 46,47 og intracellulær signalering 48.

    Time-lapse fluorescerende mikroskopi kan også give lokalisering og intensitet data for proteiner og molekyler af interesse. Ikke alene er ændringer i proteinniveauet vigtigt at lægemiddelrespons, men den korrekte (eller ukorrekt) lokalisering af proteiner i cellen er kritisk for forståelsen respons. Time-lapse mikroskopi giver data om, hvor proteiner er lokaliseret (f.eks., Kerne, cytosol, specifikke organeller,osv.) efter behandling og hvordan lokalisering og totale niveauer ændre sig over tid på en enkelt celle og befolkningsniveau.

    Udfordringer og begrænsninger

    På trods af de stærke sider af time-lapse mikroskopi og langsgående analyse af enkelte celler, der er begrænsninger. Fluorescens reportere er begrænset af deres stabilitet og specificitet. Ved konstruktionen fluorescerende fusionsproteiner, er det vigtigt at vælge en probe, er foto-stabil og lyse, men det er også nødvendigt at undersøge virkningerne af det fluorescerende mærke er fastgjort til proteinet af interesse med hensyn til dens normale funktion og evne til korrekt at lokalisere . Disse spørgsmål er blevet drøftet i detaljer andetsteds, og der er mange tilgængelige fluorescerende mærkede proteiner, der er blevet offentliggjort 15,49,50. Andre fluorescerende mærker eller tags kan tilsættes til cellerne, og skal der drages omsorg for at sikre, at de ikke er giftige. Det er vores erfaring, disse pklæder, for eksempel mitokondrielle etiketter (membranpotentiale) eller cellepermeable DNA-farvestoffer, tendens til at blege lettere og vil være fortyndet-ud på grund af celleproliferation.

    Derudover er der mange tekniske udfordringer med voksende og observere cellerne på et mikroskop. Ustabilitet med hensyn til temperatur, fugtighed, atmosfære, og lys vil have store effekter på cellerne, hvilket resulterer i tab af data eller endda hele eksperimentet. Stabilitetsproblemer vedrørende billedoptagelse kan ses på film 1 og 2. Denne effekt kan minimeres ved anvendelse af paraffin film (se 4.2). Der er også stabilisering billede algoritmer til rådighed for post-erhvervelse behandling, for eksempel ved hjælp af ImageJ (NIH). Et aspekt af langsigtet time-lapse, der ofte overses, er data management og filstørrelse. Selv når binning data, en enkelt time-lapse eksperiment er ofte overstiger 30 gigabytes. Høj kapacitet, høj hastighed, pålidelig datalagring og overførsel er stærkely fremmes. Afhængig af den fluorescerende biosensor (e), der afbildes, er det ofte ikke nødvendigt at hente billeder i fuld opløsning, f.eks nukleare eller cytoplasmatiske sensorer. Vi anbefaler, når det er muligt, at træffe foranstaltninger til at holde filstørrelser lille, hvilket resulterer i nemmere at arbejde med data, mindre krævende computing behov, og forbedret arbejdsgang.

    Fototoksicitet er et stort problem, når der udføres langsigtet time-lapse mikroskopi. Høj intensitet lys og lange eksponeringer kan føre til fotoblegning af fluorescerende prober, celle stress og celledød. Disse virkninger kan have store indvirkninger på dataene og føre til forvanskning af eksperimentet. Kamera Binning og forstærkning kan anvendes til at reducere eksponeringstider. Neutralfiltre i strålegangen reducere intensiteten af ​​lyset på prøven. De lysbølgelængder, der anvendes til billede vil også påvirke cellerne. Kortere bølgelængder (UV, nær UV) er mere skadelige for cellerne og resultere i foto-blegning på hurtigere satser endlængere bølgelængder (f.eks., rød, langt rød). Valg af mål kan også påvirke billeddannelse betingelser. Højere blændetal (NA) linser vil producere billeder i højere opløsning, men højere forstørrelse giver mindre lys, der skal overføres fra prøven resulterer i gange højere eksponering eller mere intenst lys. En objektiv skal vælges med en passende NA og forstørrelse, der vil løse dit objekt af interesse uden oversampling. I mange tilfælde kan den højeste målsætning ikke være det mest hensigtsmæssige valg. Med nukleare sonder (figur 4, 5), en lav forstørrelse mål giver mulighed for en større banen for at blive taget til fange, effektivt at øge stikprøvestørrelsen, uden at gå på kompromis løsning på det ønskede objekt. Langsigtet time-lapse i tre dimensioner bør udføres med forsigtighed på grund af integreret lys eksponering. Ved hjælp af en roterende skive konfokalt mikroskop, følsom kamera (f.eks., EM-CCD), kamera gevinst, og en hurtig piezo motor for z-serien er suggested at reducere lyseksponering. Hurtig erhvervelse z-serien er også vigtigt at minimere bevægelsesartefakter grund cellebevægelse og dynamik, der opstår under erhvervelsen periode. Empirisk analyse af ubehandlede celler under anvendelse mange forskellige indstillinger kan være nyttige ved bestemmelse af virkningerne af fluorescerende lys på en given cellelinie eller reporter. Desuden bør en ubehandlet kontrol inkluderes i hvert forsøg for at bestemme de cytotoksiske virkninger af forsøgsopstillingen.

    Variationer af teknikken

    Langsigtet time-lapse er robust og meget fleksibelt. Brug af co-dyrkningsteknikker, forskellige cellelinier eller de samme cellelinier, der udtrykker forskellige reportere kan anvendes. Et fremragende eksempel på dette er at afbilde fagocytiske celler med målceller, der dør i respons på et anticancerlægemiddel. Et andet eksempel kunne være at undersøge virkningen af ​​at reagere celler på nærliggende narkotika naive celler. Kombineret med foto-activateable, foto-konvertible og foto-omskiftelig fluorescerende proteiner, og manipulerede proteiner, der kan aktiveres af lys til at udløse specifikke virkninger (f.eks., KillerRed), er der mange muligheder. Mere komplekse metoder kan anvendes, at anvende forskellige specialiserede typer af mikroskopi, såsom fluorescerende omfordeling efter fotoblegning, Forster resonans (FRET), og super opløsning (f.eks., Stokastisk optisk genopbygning mikroskopi (STORM), strukturel belysning mikroskopi (SIM), eller stimuleret emission depletion (STED)), og mange andre, og der er fordele og begrænsninger ved hver strategi.

    Langsigtet (f.eks., Uger, måneder) svarene og inddrivelse af celler efter fjernelse stof er central for forståelsen anti-cancer stof handling. Inddelte glas-bottom retter er et værdifuldt værktøj til at overvåge specifikke celler eller regioner inden en population / område gentagne gange. For eksempel med en gitret skålen, den oprindelige drug svar kan afbildes ved hjælp af en time-lapse, stoffet kan fjernes, og specifikke områder i nettet kan afbildes over tid eller udsat for ekstra tid-lapse på det ønskede tidspunkt. Glas bunden på skålene kan fjernes ved enten skæring med en skriver værktøj eller ved anvendelse af et kommercielt reagens, og cellerne på glasset kan farves for andre markører af interesse, for eksempel senescens associeret β-galactocidase aktivitet og sammenlignet med den time-lapse at forstå historien om, hvordan celler nået denne tilstand. Hvis cellepopulationen er stor nok, kan også underkastes immunblotting eller flowcytometri.

    Tykke prøver har traditionelt været vanskeligt at billedet, f.eks spheroids i forskellige gel materialer og matricer. Nyere tilgange herunder fluorescerende konfokal eller multi-foton mikroskopi 16,18,19,51 kan bruges til at udvide tilgangen til en in situ forståelse af, hvordan cellerne reagerer på anticancer-midler. DetSE undersøgelser og et stigende antal fra forskere ved hjælp af time-lapse at studere anti-cancer drug svar 24,52-54 viser tydeligt, at vi er på vej mod at udvikle en forståelse af encellede farmakodynamik, der vil hjælpe med at forbedre vores evne til at bruge kræftmedicin mere effektivt og måske forudsige anticancerlægemiddel respons.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
    2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
    3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
    4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
    5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
    6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
    7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9, (e93718), (2014).
    8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
    9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
    10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
    11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
    12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. (2008).
    13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
    14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
    15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
    16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
    17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
    18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
    19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
    20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
    21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
    22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
    23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
    24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
    25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
    26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7, (488), (2011).
    27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
    28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
    29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
    30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
    31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
    32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7, (46), (2014).
    33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
    34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
    35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
    36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
    37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
    38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. (2015).
    39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
    40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
    41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
    42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
    43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
    44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7, (e30605), (2012).
    45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
    46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
    47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
    48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
    49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
    50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
    51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
    52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
    53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
    54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics