Genom Looking Glass: Time-lapse Mikroskopi och Längs spårning av enskilda celler för att studera anti-cancer Therapeutics

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Svaret hos enstaka celler till anti-cancerdroger väsentligt bidrar i fastställandet av befolkningen respons, och därför är en stor bidragande faktor i den övergripande resultatet. Immunoblotting, flödescytometri och fasta experiment cell används ofta för att studera hur celler svarar på anti-cancerdroger. Dessa metoder är viktiga, men de har flera brister. Variationen i svaren läkemedels mellan cancer och normala celler, och mellan celler av olika cancer ursprung och övergående och sällsynta reaktioner är svåra att förstå med hjälp av befolkningsmedelvärdesanalyser och utan att kunna direkt spåra och analysera dem i längdriktningen. Mikroskopet är särskilt väl lämpad för bild levande celler. Framsteg inom teknik ger oss möjlighet att rutinmässigt bildceller med en upplösning som möjliggör inte bara cell spårning, men också observation av en mängd olika cellulära svar. Vi beskriver en metod i detalj som gör det möjligt att kontinuerligt time-lapse avbildning avceller under läkemedelssvar för i huvudsak så länge som önskas, typiskt upp till 96 tim. Använda varianter av tillvägagångssättet, kan celler övervakas i veckor. Med anställning av genetiskt kodade fluorescerande biosensorer många processer, vägar och svar kan följas. Vi visar exempel som inkluderar spårning och kvantifiering av celltillväxt och cellcykelprogression, kromosomdynamik, DNA-skada, och celldöd. Vi diskuterar också variationer av tekniken och dess flexibilitet, och lyfta fram några vanliga fallgropar.

Introduction

Live-cell mikroskopi och längsgående spårning av enskilda celler är inte en ny teknik. Från de tidigaste mikroskop, har entusiaster och forskare observerat och studerat enskilda celler och organismer, deras beteenden och utveckling 1-3. Ett berömt exempel från slutet av David Rogers vid Vanderbilt University i 1950-talet visar en humant neutrofilt i en blodutstryk jagar en Staphylococcus aureus bakterie och slutligen processen för fagocytos 4. Denna levande celler film är ett utmärkt exempel på hur flera processer kan observeras och korreleras i ett enda experiment: avkänning av en kemisk gradient, mekanik och hastighet av cellrörlighet, formar cell dynamik, vidhäftning och fagocytos av en patogen.

Tillkomsten av helautomatiska mikroskop och mycket känsliga digitalkameror har resulterat i ett ökande antal forskare som använder mikroskopi för att ställa grundläggande frågor i cellbiologi sträcker from hur celler rör sig 5,6 och dela 7,8 till organell dynamik och membranhandel 9-11. Icke-fluorescerande, bright mikroskopi, inklusive faskontrast (PC), som samlade Nobelpriset för Frits Zernike i 1953, och differential interferens kontrast (DIC) möjliggöra observation av celler och kärnor utan även subcellulära strukturer inklusive mikrotubuli buntar , kromosomer, nukleolerna, organell dynamik, och tjocka aktinfibrer 12. Genetiskt kodade fluorescerande proteiner och utveckling av fluorescerande färger mot organ har dramatiskt påverkat time-lapse mikroskopi 13-15. Även om inte i fokus för denna artikel, avbildning i cell sfäroiderna och in situ (intravital mikroskopi) med hjälp av konfokal och multifoton mikroskopi representerar en annan expansion av tillvägagångssättet, och det finns utestående artiklar som använder och diskutera dessa metoder 16-19.

Svaren av celler till anti-cancER läkemedel eller naturprodukter fastställs på molekylär och cellulär nivå. Förstå cellsvar och öden efter behandling innebär ofta befolkningsmedelvärdesanalyser (t ex., Immunoblotting, hela och åtgärder), eller fasta tidpunkter med immunofluorescens detektion och flödescytometri, som mäter enskilda celler. Heterogenitet i enkelcellsvar på läkemedel inom en population, i synnerhet i tumörer, kan förklara en del av variationen i svaret som ses tvärs cellinjer och tumörer som behandlas med samma läkemedel vid mättnad. Långsiktig longitudinella metoder för att följa en given enda cell eller en population av celler är en mindre vanlig men mycket kraftfull metod som gör det möjligt att direkt studera molekylära svarsvägar, olika fenotyper (eg., Celldöd eller celldelning), observation av cell till cell variation inom en population, och hur dessa faktorer bidrar till befolkningssvarsdynamik 20-22. Optimistiskt, att kunnaatt observera och kvantifiera enskilda cellsvar kommer att förbättra vår förståelse för hur läkemedel fungerar, varför de ibland misslyckas, och hur man bäst använder dem.

Tekniken långsiktiga time-lapse mikroskopi, längsgående spårning och analys av svaren drog är tillgänglig för många forskare och kan vara enkel, med enbart transmitterat ljus för att observera fenotyp svar 20,21. De viktigaste komponenterna i metoden omfattar: lämplig beredning av cellerna av intresse, ett automatiserat mikroskop med miljökammare, en kamera integrerat med en dator för att förvärva och lagra bilder, och programvara för att granska tidsförlopp och mäta och analysera cellerna och eventuella fluorescerande biosensorer. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll med många tips för att utföra tidsförlopp mikroskopi av odlade celler så länge som flera dagar att använda bright och / eller widefield epifluorescent mikroskopi. Detta protokoll kan användas för någon cellinje som kan odlas i kulturatt studera deras svar på anti-cancerterapier. Vi ger exempel på data som samlats in och analyserades med hjälp av flera olika genetiskt kodade fluorescerande biosensorer och ett exempel på faskontrastmikroskopi, kort diskutera olika typer av sönder, fördelar och nackdelar med långsiktig time-lapse och längsgående spårning, vad kan vara omar för detta synsätt som är svårt att förstå från icke-direkta metoder, och vissa variationer som vi hoppas kommer att vara av intresse och värde för oerfarna forskare som inte har övervägt att använda tillvägagångssättet, och erfarna forskare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Följande protokoll använder parametrar som definieras av experimenten i figurerna 4 och 6 om förvärv inställningar och experimentella förhållanden. Många av dessa parametrar kan modifieras för att passa andra experiment (dvs exponeringstider, binning, fluorescerande kanaler, osv.). Alla förfaranden måste följa institutionens riktlinjer och föreskrifter och godkännas av den institutionella biosäkerhet kommittén. Mikroskop tillverkare webbplatser innehåller bra information för levande cell imaging.

1. Mikroskop och Imaging Software

  1. Uppträda live cell imaging på en mängd olika inverterade mikroskop. De vanligaste mikroskop är widefield epifluorescence och spinning-skiva konfokala. Här använder en automatiserad och motoriserad widefield epifluorescensmikroskop med 200 watts metallhalogen ljuskälla.
  2. Skaffa en scen-top eller mikroskop klimatkammare. Här använder en scen-top miljökammare.
  3. Använd kommersiell programvara för att driva mikroskop med verktyg för att utföra tidsförlopp mikroskopi.
  4. Använda kommersiellt tillgänglig programvara eller ImageJ för bildanalys. Många andra analysverktyg är kommersiellt tillgängliga, och det finns skräddarsydda program av vilka många har publicerats 8,18.

2. Visualisera Cellular processer och Fenotypiska Responses

  1. Visualisera celler med brightfield mikroskopi. Differential interferens kontrast och faskontrast ensam kan vara mycket informativt att studera svar på anti-cancerläkemedlet svar. Dessa processer kan inkludera mitos, cellrörlighet och apoptos.
  2. Visualisera cellstrukturer, organeller och processer med fluorescerande biosensorer. Fluorescerande prober är informativa i spåra specifika subcellulära processer. Dessa kan bestå av mikrotubuli dynamik, mitokondrie och endoplasmatiska retiklet dynamik, protein ackumulering och lokalisering, ochmolekylär signalering (t ex., fosforylering, kalcium).

3. Framställning av prover

  1. Odla celler i cellodlings certifierade rätter i en standard, befuktad cellodlingsinkubator (t.ex., 37 ° C, 5% CO2, 80% relativ fuktighet).
    1. Växa HT1080-celler i MEM med EBSS. Komplettera mediet med 10% vol / vol FBS, 1% volym / volym Pen / Strep, 1% volym / volym natriumpyruvat och 1% volym / volym icke-essentiella aminosyror.
  2. Två dagar före avbildning, platta 50.000 HT1080 Fucci celler i 3 brunnar i en 12 brunnar # 1,5 glas nedre skålen i en certifierad steril laminärt flöde huva. Justera antalet celler utstrukna för att uppnå ~ 60% konfluens för starten av experimentet. Beroende på cellinjen och arten av experiment celltätheten kan vara mindre.
    Obs: Celldensitet kan ha stort inflytande på tillväxten av cellinjen och på de experimentella resultaten. Räkna celler för att minimera experiment till experiment variability på grund av densitet.
    1. Beroende på miljökammaren och de nödvändiga villkoren för experimentet, plåtceller i enskilda brunnar (typiskt 35- eller 60-mm), 4 och 35 mm skålar, 6-, 12- eller 24-brunnscellodlingsplattor, eller täckglas objektglasen i olika format. Använd glasbottnade plattor med # 1,5 glas som de flesta objektiv är optimerade för denna tjocklek av glas, och avbildning genom cellodling plast är mycket dålig.
      Obs! Vissa cellinjer inte växa och överleva på glas. I dessa fall, kan glaset vara belagd för att förbättra cellvidhäftning (t.ex.., Polylysin eller kollagen). Vissa företag tillverkar optiska cellodlings plast, måste det fastställas empiriskt om detta är en möjlig lösning.

4. Miljö Chamber Set-up

  1. Före varje experiment, ställa upp miljökammaren så att den fungerar på ~ 80% luftfuktighet och så att temperaturen på provposition är 37 ° C. Mest odlade celler växa i 5% CO2 / balans luft atmosfär på grund av natriumbikarbonatbuffert i mediet. Beroende på set-up, antingen ställa in miljöcontroller till 5% CO2 och det kommer att blanda 100% CO2 med luft, eller använd färdigblandad, certifierade 5% CO2 / balans luft gas. Följ tillverkarens anvisningar för gas- flödeshastigheter.
    Obs! Vissa cellinjer växer i CO 2-oberoende medium i vilket fall de kan upprätthållas utan CO2. Särskilt utformade avbildning medier är också tillgängliga som begränsar tillsättningen av autofluorescerande föreningar. Tillväxt i avhandlingar medier för den önskade celltypen måste bestämmas empiriskt i förväg.
  2. Före avbildning, se till att vattenbehållaren fylls (enligt tillverkarens anvisningar) med sterilt destillerat vatten. Slå på klimatkammare med inställningen önskad temperatur och placera den i mikroskop scenen infällda. För att spara gas, inte starta flödet vid denna punkt.
    Obs: Om det finns något fritt utrymme mellan scen övre kammaren och scen infälld och / eller någon spänning på anslutningskablar till kammaren kan införa rörelseartefakter i experimentet.
    1. Lägg bitar av paraffin film över kanterna på scenen infällda öppningen före införandet i kammaren i det att koppla kammaren till scenen, och se till att inga anslutningar drar på kammaren.
  3. Medge att kammaren till jämvikt till 37 ° C Upprätthålla en stabil temperatur för att förhindra temperaturvariationer under avbildning som kan påverka cellfysiologi och införa drift. Gående temperaturutjämning kräver typiskt 30 min till 1 h, beroende på miljön.
    1. Sätt i ett "dummy" skålen med vatten i brunnarna i kammaren under värmning. En bildskål fylld med vatten härmar provet, portion ser kammaren är tillräckligt uppvärmd och stabiliserats. Fyllning av kammaren med förvärmda sterilt vattenminskar tiden som krävs för att temperaturstabilisering och minimerar temperaturminskningen vid tillsats av det experimentella provet.

5. Mikroskop Set-up

  1. Slå på mikroskopet, tillhörande dator, och alla nödvändiga kringutrustning.
    1. Beroende på ljuskällan, vänta med att slå på den tills det behövs (t.ex.., LED).
  2. I syfte torn i en låg position, välj 20X 0,7 NA mål som skall användas.
  3. Placera provet över målet - detta kommer att göra det lättare att hitta cellerna när provet är i kammaren.
  4. Definiera avbildningsparametrar vid denna tid om de är kända från tidigare experiment.

6. Transport Celler till mikroskop och in i kammaren

  1. Transporterar cellerna som skall avbildas från inkubatorn till miljökammaren. Se till att detta sker snabbt för att begränsa effekterna av en jämförelsevis låg CO2
  2. Placera cellerna i en förseglad Styrofoam behållare eller isolerade påsen för att undvika stora miljöförändringar.
  • Sätt provet avbildnings skålen i kammaren enligt tillverkarens anvisningar.
  • Efter det att cellerna har fäst inuti miljökammaren, täta kammaren för att upprätthålla en stabil miljö och omedelbart slå på källan (s) av atmosfärisk gas.
    1. Som vissa miljökammare inte utnyttjar en tät, förseglad lock, för att fördröja avdunstning, skikt sterilt, embryo-certifierad mineralolja på toppen av tillväxtmediet. Wrap gas-genomträngande paraffin film runt perimetern kanterna av provet skålen försiktigt så att inte hindra glasavbildningsområdet. Lokaliserade, sekundära befuktningsmetoder kan användas. Kondensation på locket till prov skålen kan minska utför litengörandet av bright mikroskopi.
  • För att minimera effekterna av termisk drift tidigt under försöket, vänta 30 minuter innan time-lapse. Den tid som krävs varierar beroende på avbildning skålen storlek och andra faktorer. Bestämma empiriskt.
  • 7. Ställa in Imaging

    1. Välj avbildningsbetingelser som bäst representerar data. Vidta försiktighetsåtgärder för att undvika fototoxicitet genom att begränsa exponeringstider, med hjälp av lägre intensitet ljus och välja prober som exciteras av längre våglängder av ljus.
    2. Definiera x, y och z-planet och önskad våglängd (er) för varje position som skall avbildas. Tidsupplösningen är begränsad av antalet positioner och våglängder. För långsiktig time-lapse för de flesta cellulära processer, förvärva en bild var 10 - 20 min; högre tidsupplösning (korta intervall, t ex., 1 min) ger fler datapunkter och därför mer robust spårning cell, utan leder också till mer integreradeljusexponering och större datamängder.
      1. Som HT1080 Fucci har dynamiska grönt och rött fluorescerande proteiner (se Representativa resultat), använd följande exponeringstider: FITC / GFP - 50 ms, Texas Red / TRITC - 40 ms, bright - 20 ms. Använd en 2 x 2 bin.
    3. Aktivera mjukvarustyrd autofokusering med standardparametrar under avancerade inställningar. Definiera en autofokusområdet av 10 um med den rekommenderade stegstorleken. Var noga med att göra detta innan time-lapse. Autofokus med bright bilder och aldrig med fluorescens för att minska fototoxicitet och fotoblekning.
      1. Använd mjukvarustyrda autofokussystem på alla mikroskop med en motoriserad skede och direkt fokusera på provet. Men de kan begränsa förvärv hastighet av experimentet. Hårdvara kontrollerad kontinuerlig fokuseringssystem fungerar bra för time-lapse mikroskopi och förbättra hastigheten, vilket möjliggör flera positioner som ska avbildas eller en högre förvärvstakt. Men deförlitar sig på detektering av luft-glasgränsytan och kan förlora fokus av provet med variationer i glastjocklek utmed brunnen.
    4. Ersätt hälften av media med media som innehåller den önskade läkemedelskoncentrationen som värmts till 37 ° C Partiell media ersättning bidrar till att minska termisk drift. Förhållandena i detta experiment är Vehicle (DMSO), en iM selinexor och 10 iM PD0332991.
      Obs: Detta steg kan också göras efter start förvärv genom att pausa och starta försöket. Detta gör det möjligt för längsgående spårning av pre- och post-drog svaren hos enskilda celler. Om läkemedelsstabilitet eller ämnesomsättning är ett bekymmer, pausa och ersätta media kan göras med samma metod. För att testa för drog nedbrytning eller metabolism, kan media från behandlade celler också placeras på naiva celler för att testa läkemedelsverkan.
    5. Starta time-lapse.
    6. Som tidsförlopp körs se till att de avbildade fälten förblir i fokus och chamber upprätthåller en fuktig 37 ° C
      1. Justera fokus efter behov genom att pausa förvärvet under tidsintervallet mellan tidpunkterna.
    7. Om det behövs, tillsätt vatten till kammaren under längre experiment. Undvika kylning av kammaren genom att tillsätta förvärmt sterilt destillerat vatten vid 37 ° C

    8. Avsluta Time-lapse

    1. När experimentet har gått till fullbordan, stoppa förvärvet om det inte var inställd för att stoppa automatiskt.
    2. Se till att tidsförlopp har sparats på rätt sätt på hårddisken, även om de flesta programvarupaket sparar automatiskt under förvärvet om inte färdig korrekt data kan gå förlorad.
    3. Ta kammaren från mikroskopet och avyttra cellerna i biologiskt avfall efter godkända institutionella biosäkerhet rutiner.

    9. Längs spårning och analys av Time-lapse Data

    1. Välj den metod för analys som ärlämpliga för de biologiska processerna av intresse. Många plugins för ImageJ, program med hjälp av Matlab och anpassade plattformar har tagits fram för specifika applikationer. Följande metod omfattar spårning av kärnor och analys av nukleära fluorescerande prober såsom visas i figurerna 4 och 5.
    2. Öppna .tif bildstaplar för de utnyttjade kanaler i ImageJ. Alternativt, öppna infödda filer från förvärvet programmet direkt i ImageJ använder Bioformats plugin.
    3. Rita ett område av intresse (ROI) inom kärnan i en cell med hjälp av ljusfält bilden eller kärn etiketten kanal (om den används) och lägga till ROI manager. Obs: Om avbildade cellerna har en nukleär märkning (t.ex. histon H2B-EGFP.), Sedan automatisk spårning cell kan användas för att skapa regioner av intresse (ROI) som representerar enskilda kärnor genom tiden.
    4. Fortsätt till nästa tidpunkt och placera ROI inom samma nucleus. Lägg ROI till ROI manager.
    5. Fortsätt att spåra och göra ROI för den enskilda cellen tills det finns en cellulär händelse (mitos, apoptos, osv.) Eller cellen inte längre kan spåras (dvs.., Rör sig ut ur ramen eller experimentet slutar).
    6. När ROI har fastställts för celler genom den tid de är i området, läggs ovanpå varandra på de fluorescerande kanalerna av intresse. Mäta den genomsnittliga intensiteten av fluorescensen i varje kanal för varje tidpunkt. Spara ROI listan för senare användning.
      1. Olika mätningar kan göras inom ROI för tillämpningar inom olika experiment. Klicka Analys → Set Mätningar ... för att få upp en meny att välja analysmetoden (eg., Medelintensiteten inom ROI, integrerade intensiteten, osv.).
    7. Obs cell öden för enskilda celler (t ex., Apoptos, division, överlevnad) medan spåra. Detta gör det möjligt att skapa överlevnadskurvorna och further populationsanalys.
    8. Med den genomsnittliga intensiteten för båda kanalerna, skapa ett punktdiagram för att visa cellcykelns dynamik som svar på läkemedel (figur 5B, C).
      Obs: Tomter kan skapas för enskilda celler över tiden eller i genomsnitt över en population av spårade celler. Kvantitativ avbildning kan vara avgörande för att fastställa komplexa svar och cellförhållanden som svar på cancerterapi. Långsiktig time-lapse mikroskopi, längsgående spårning och analys av data är en flerstegsprocess, med många alternativ för den typ av mikroskopi och analysverktyg, och följer de allmänna riktlinjerna anges i figur 1.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Långsiktig time-lapse mikroskopi och direkt längsgående spårning möjliggör studier av många anti-cancer effekter under läkemedelssvar. Efter den allmänna kontur i figur 1, är flera exempel på celler visas uttrycker validerade fluorescerande reportrar som behandlats med anti-cancerläkemedel, spårade, och analyseras med hjälp av olika metoder.

    Ensam faskontrastmikroskopi är mycket informativ och kraftigt rapporter om interfaskärnorna kontra mitos, mitotiska varaktighet och gripande, onormal celldelning och celldöd 21,23,24. Läkemedel som riktar celldelning, ofta benämnda antimitotiska läkemedel, fortsätter att utvecklas. Figur 2 och Filmer 1 och 2 visar exempel på ett par av matchade bröstcancer-härledd MCF7-cellinjer som skiljer sig endast i deras p53 status, behandlades med 500 nM för en typ av läkemedel mot cancer som måloch hämmar mitotiska motorprotein, Kinesin-5 (KSP1, Kif11, Eg5), vilket resulterar i utdragna mitos 20. Vildtyp MCF7-celler (Figur 2A) är ett paradigm för att studera p53-beroende cellcykelstopp 25-27. Vildtypsceller anger mitos, återstår under flera timmar, så småningom lämna och i hög grad gripa med induktion av p53 25. När p53 avlägsnas genom stabil p53 knockdown (MCF7 sh p53), i stället för att gripa efter att de lämnat mitos, cellerna gå igenom upprepade cykler (figur 2b). Cellerna spåras manuellt och mitotiska indexet och procentandelen celler som anger en andra mitos poängsattes (Figur 2C, D). Vi observerar att sh p53 cellen spårade klyftor när det går in i en andra omgång av mitos snarare än att gripa och lämna mitos utan uppdelning. Även om det inte visas här varaktigheten av mitotiska händelser, kan tiden mellan successiva mitoses, procent av celldelningar, och tillhörande celldöd händelser också vara skärnhus 20,21.

    Taxaner, till exempel paklitaxel och docetaxel, är vanliga kemoterapi för många cancerformer, inklusive de som är svåra att behandla som bukspottskörteln och avancerad bröstcancer. Paklitaxel binder till den dynamiska plus slutet av mikrotubuli och stabiliserar dem, förhindrar deras normala funktion. Paclitaxel har noterat dosberoende effekter, och även vid låga koncentrationer kan störa normal mitotisk progression och kromosomsegregation 16. Trogen segregation av kromosomer är avgörande för normal celltillväxt och när onormalt kan resultera i aneuploidi som kan utlösa cellcykelstopp, men också fungera som en drivkraft för cancer progression. Figur 3 och Movie 3 visar cervikalkarcinomceller härrörande HeLa-celler som stabilt uttrycker kromatin markör histon-2b smält till mCherry och beta-tubulin smält till EGFP (ej visad) i normalt tillväxtmedium behandlades med 1 nM paklitaxel. I dennaExempelvis kan inträde i och progression genom mitos följas. Tidpunkten för mitos verkar normalt i denna cell, men kromosom inriktning och segregation är inte, vilket resulterar i kärn utbuktningar och mikrokärnor som är strukturer som indikerar dålig kromosomsegregation. Mikrokärnor är benägna att DNA-skada och chromothripsis, vilket är den storskaliga fragmentering av kromosomer eller kromatin - detta har viktiga konsekvenser i tumörutveckling 28,29. Även om det inte visas här, kan ursprunget till mikrokärnor i förhållande till andra mitotiska strukturer och öde dessa celler vara direkt spåras med hjälp långsiktig time-lapse. Vidare uttryckte en kromatin markör med en DNA-skada reporter kunde användas för att fastställa förhållandet mellan kromosomsegregation, mikrokärnor och DNA-skada.

    Fluorescerande reportrar möjliggör uppräkningscellprocesser som ska spåras och nya reportrar utvecklas ständigt. för exriklig, cellcykeln består av faser som är av särskilt intresse av att utveckla riktade anti-cancerterapi. Figur 4 och Movie 4 visar en fibrosarkom-härledd cellinje (HT1080) som stabilt samarbete uttrycker två reportrar kallas, fluorescerande ubiquitin cellcykelindikatorer (Fucci) 30. I systemet här, är en del av den Cdt1 polypeptid fuserad till mKO2 (monomert Kusabira apelsin 2) och ökar i G1-fasen och bryts ned i början av S-fasen, och en del av geminin är smält till mag (monomert Azami grön) och ökningar i mitten av S-fas och bryts ned vid anafas. Denna cell är i normalt tillväxtmedium och fortskrider genom cellcykeln i 15 h. Figur 5A, B och Movie 5 visar samma celler i normalt medium som behandlats med 10 | iM PD0332991, en ​​Cdk4 / 6-hämmare. Cellerna framsteg genom G2-fas och dela normalt och starkt gripande i den efterföljande G1-fas, vilket indikerar potentialen för effektIve cytostatisk effekt på växande tumörer. Figur 5C, D och film 6 visar samma celler i normalt medium behandlas med en liten molekyl som kallas selinexor (KPT-330), en potent hämmare kärnexportproteinet, exportin-1 (XPO1, aka CRM1 ). Dessa föreningar kallas selektiva hämmare av kärn export (SINE) och deras anti-cancereffekter är för närvarande under utredning 31,32. SINE behandlingsresultat i starka cellcykel fenotyper och celldöd 33,34. Detta exempel visar en cell som fortskrider genom G1-fas med normala kinetik (ungefär 6 h), men upplever fördröjning i S-fas progression såsom indikeras av perioden med både röd och grön signal (ca 3 h i kontroll, men 10 i SINE behandlad ). Denna cell dör i slutet av S- eller G2-fas efter 21 tim 30 min; en normal cellcykel är cirka 15 timmar. Effekterna av selinexor studeras för olika blod och solida tumörer 35.

    Figur 6 och film 7 visar HT1080 celler som stabilt uttrycker en dubbelsträngade DNA-skada reporter, mCherry-BP1-2 36 i normal tillväxt mediet behandlades med 10 | iM etoposid (VP-16), en topoisomeras Il-gift. Denna reporter består av en del av DNA dubbelsträngbrott site protein, 53BP1 som är smält till mCherry. Kärnan i denna cell spårades USIng analysera partiklar plugin i ImageJ och den integrerade mCherry-BP1-2 signal mättes i varje ram efter tröskel ut värden som eliminerade lösligt kärn sond. DNA-skada är minimal för den första 10 h och därefter stadigt ökar. Topoisomeras II-inhibitorer är kända för att ha större verkan för S- och G2-fas, när enzymet är mest aktiv 37,38. Kinetiken som observerats i detta exempel kan tyda på cellcykeln associerad skada; kombinera mCherry-BP1-2 med Fucci reportrar kunde visa tidpunkten för den skada som sedan kan kopplas till cell öde.

    Figur 1
    Figur 1. Översikt av att använda Långsiktig Time-lapse Mikroskopi och Längs Tracking att studera läkemedel mot cancer Response. Celler i lämpliga levande cell imaging rätter märkta som önskas avbildas, celler eller områden av intresse spåras, och data analyseras. Många metoder finns för att spåra och kvantifiera celler, vissa anges här. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2. faskontrast Time-lapse Mikroskopi visar p53-beroende efter antimitotiska drogbehandling. Vildtyps (A) och p53-knockdown (B) MCF7-celler behandlades med 500 nM Kinesin-5-hämmare och avbildas varje 10 min för 96 h med hjälp av faskontrastmikroskopi med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Individuella celler spåras manuellt och procent mitos och om cellen framskrider till en annan mitos igen under time-lapse räknades. Pilar indikerar cell som spåras. Sh p53 cell (B) delar på in i en andra mitos. (C) Båda cellinjerna show långvarig mitotiska rest såsom indikeras av procent mitos hög topp (första blå och röda pilar). (C, D) Nästan 90% av celler utan p53 (sh p53, n = 87) visar på fortsatt progression (röda pilar) jämfört med 20% av vildtyp (n = 130). Felstaplar indikerar standardavvikelsen. Bar = 20 nm. Filmer 1 och 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3. kromatinet Marker Histon 2b avslöjar bevis vid kromosomsegregation missbildningar efter Låg dos Paclitaxel behandling. Paclitaxel är en mikrotubuli riktade läkemedel som resulterar i komplexa, koncentrationsberoende defekter i celltillväxt och celldelning. Organisationen av kromatin informerar på olika celltillstånd, inklusive scenenav mitos och celldöd. HeLa-celler som stabilt uttrycker både H2b-mCherry och β-tubulin-EGFP behandlades med 1 nM paklitaxel. Denna cell initialt är i interfas, fortskrider genom de olika stadierna av mitos och klyftor. Medan tiden i mitos verkar normalt, det finns tecken på kromosomfäst och segregation fel som löses (pilar). Ödet för dessa celler kan bestämmas direkt genom längsgående spårning. Faskontrast (ej visad) och fluorescerande bilder förvärvades en ram per 10 min med en 20X Ph2 0,70 NA objektiv. Bar = 10 pm. Movie 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4. Fluorescerande cellcykeln Markörer Tillåt för direkt övervakning av cellcykelprogression.(A) Ett fält av levande HT1080 fibrosarkom-celler som uttrycker Fucci systemet avbildas av faskontrast och fluorescens. (B, C) ​​Det mitotiska cellen i den streckade rutan i panelen A följs. framsteg normalt genom cellcykeln hos ca 15 timmar. Efter mitos, celler är kort svagt, och sedan blir rött och framåt in i och genom G1-fas. När celler anger S-fas, är den röda Cdt1 sonden nedbrytes och de gröna geminin sond ökar. Den korta ca 3 h period där båda sonderna är närvarande, indikerar tidig S-fas. Som celler utvecklas genom S- och G2-fasen och in i nästa mitos de förblir grön. Den gröna sond bryts ned vid anafas av celldelning. Faskontrast och fluorescerande bilder förvärvades en ram per 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Bar = 10 pm. Movie 4. Klicka här för att VIew en större version av denna siffra.

    figur 5
    Figur 5. Cellcykel särskilda effekter och Associated celldöd. Samma cellinje som i figur 4, men behandlas med två olika molekyler som representerar olika anticancer mål. Gånger efter behandling anges. (A, B) Efter behandling av en sen S / G2-fas-cell med 10 pM PD0332991 Cdk4 / 6-inhibitor, cell fortskrider den normalt till mitos (M) och klyftor. Ett dottercellen spåras genom mätning röda och gröna fluorescerande intensiteter i regionen av intresse i kärnan. Cellen förblir greps i G1-fas för cirka 40 timmar. (C, D) Efter behandling av en sen G2-fas cell med en iM selinexor, cell fortskrider normalt mitos (M) och klyftor. En dotter cell spåras och det går G1-fas, fortskrider genomen utdragen tidig S-fas (röd och grön signal), övergår till enbart grönt och dör efter 21 tim 30 min. Data tyder på S-fas progression påverkas av selinexor behandling. Faskontrast och fluorescerande bilder förvärvades en ram per 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Bar = 10 nm. Filmer 5 och 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 6
    Figur 6. DNA-skada Dynamics efter läkemedelsbehandling. Många anti-cancerterapier resulterar i DNA-skador som djupt kan påverka cellsvar och behandling framgång. HT1080-celler som stabilt uttrycker både den dubbelsträngade DNA-skada markör mCherry-BP1-2 och H2b-EGFP (ej visad) behandlades med 10 ^ M av topoisomeras Il-läkemedlet etoposid och DNA dAmage spårades. (A) Antalet och intensiteten i fokus ökningen efter etoposid. Det är initialt en fördröjning, vilket indikerar möjliga cellcykeleffekter som överensstämmer med den kända mekanismen av etoposid. Med 22 tim 50 min denna cell har samlat höga nivåer av skador. Även om det inte visas här, kan ödet för denna cell bestämmas genom direkt spårning. (B) En ROI motsvarar kärnan erhålls genom H2b-EGFP-signalen spåras med hjälp av spårnings partikel i ImageJ och det integrerade BP1-2 mCherry signalen kvantifierades och plottades med tiden. Fördröjningen i signalen fram till ungefär 10 tim noteras, följt av en bestående ökning. Fluorescerande bilder förvärvades till en ram per 10 min med en 40X PH2 0,75 NA objektiv. Bar = 10 pm. Movie 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


    Film 1. faskontrast Time-lapse Mikroskopi hos vildtyp MCF7-celler efter anti-mitotiska läkemedelsbehandling. Vildtyps MCF7-celler behandlades med 500 nM Kinesin-5-hämmare och avbildas varje 10 min under 96 timmar med hjälp av faskontrastmikroskopi med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Kan observeras Förlängd mitotiska arrestering och utträde från mitos, som beskrivs i figur 2. Klicka här för att ladda ner filen.

    moive 2
    Film 2. faskontrast Time-lapse mikroskopi av p53-knockdown MCF7 celler efter anti-mitotiska drogbehandling. MCF7-celler som stabilt uttrycker en shrna inriktning p53 för nedbrytning behandlades med 500 nM Kinesin-5-hämmare och avbildas varje 10 min under 96 timmar med hjälp av faskontrastmikroskopi med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Kan observeras Förlängd mitotiska arrestering och flera omgångar av mitos, som beskrivs i figur 2. Klicka här för att ladda ner filen.

    moive 3
    Film 3. Fluorescerande Time-lapse mikroskopi av HeLa-celler efter låg dos Paclitaxel behandling. HeLa-celler som stabilt uttrycker H2B-mCherry och β-tubulin-EGFP behandlades med 1 nM paklitaxel. Kan observeras kromosom infästning och segregering frågor, som beskrivs i figur 3. Bilder förvärvades var 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Klicka här för att ladda ner filen.

    ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> moive 4
    Film 4. Fluorescerande cellcykeln Markörer Tillåt för direkt övervakning av cellcykelprogression. HT1080 celler som uttrycker Fucci systemet var i längdled spåras under time-lapse mikroskopi. Cellen går svag efter att ha lämnat mitos, och sedan blir rött som cellen framskrider genom G1-fas. När cellen går in i S-fas, blir det gula som de gröna geminin sond ökar och den röda Cdt1 sonden försämras. Cellen förblir grön medan den pågår genom S- och G2-fas. Den gröna försämras när cellerna går anafas. Kvantifiering av denna cell visas i figur 4. Bilder förvärvades var 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Klicka här för att ladda ner filen.

    Moive 5 "src =" / filer / ftp_upload / 53.994 / 53994movie5.jpg "/>
    Film 5. HT1080 cell som uttrycker Fluorescerande cellcykeln Markörer efter behandling med ett G1-fas Inhibitor. HT1080-celler som uttrycker Fucci systemet behandlades med 10 | iM PD0332991, en ​​Cdk4 / 6-hämmare. Det spårade cellen framskrider normalt mitos och klyftor. En dotter är spåras, och förblir röd i G1 under hela filmen. Kvantifiering visas i figur 5. Bilder förvärvades var 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Klicka här för att ladda ner filen.

    moive 6
    Film 6. HT1080 cell som uttrycker fluorescerande cellcykeln Markörer efter behandling med exportin-1 Inhibitor, Selinexor. HT1080 celler som uttrycker Fucci systemet var behandlaed med ett iM selinexor. Denna sena G2-fas cell spårades genom mitos. En dottercellen fortskrider sedan genom G1-fas (röd) och går in i S-fas (gul). Cellen framskrider långsamt genom S-faser tills det går sen-S / G2-fas och dör efter 21 tim 30 min behandling. Kvantifiering visas i figur 5. Bilder förvärvades var 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Klicka här för att ladda ner filen.

    moive 7
    Film 7. DNA-skada Dynamics efter behandling med ett topoisomeras Il-hämmare. HT1080-celler som stabilt uttrycker den dubbelsträngade DNA-skada markör mCherry-BP1-2 och H2B-EGFP behandlades med 10 | iM etoposid, en inhibitor till topoisomeras II. Den mCherry-BP1-2 visas i filmen. Som behandling fortsätters, signalen för mCherry-BP1-2 ökar, vilket indikerar ökad dubbelsträng DNA-skada. Kvantifiering visas i figur 6. Bilder förvärvades var 10 min med en 40X PH2 0,75 NA objektiv. Klicka här för att ladda ner filen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Fördelar med Time-lapse Mikroskopi och Längs Tracking

    Mikroskopet är ett idealiskt instrument för longitudinella studier av läkemedelssvar eftersom det tillåter utredarna att spåra enskilda celler och deras öden, liksom hela befolkningen. Variabilitet i läkemedelssvar inom en population av celler är en viktig fråga för anti-cancer terapeutisk design. Längsgående spårning av enskilda celler kan utredarna att observera denna variation och börjar förstå de bakomliggande mekanismerna och konsekvenser som det hänför sig till cellpopulationen. Med hjälp av en mängd olika fluorescerande prober ger en mängd olika sätt att observera och förstå både vanliga och ovanliga svars fenotyper. Tidpunkten och bidrag olika cell öden till befolkningen respons, relationer mellan specifika fenotyper och öden, och skillnader i svar mellan cellinjer eller staten efter behandling är exempel på vad som kan läras. Många cancerrelaterade processer kan studeras. Några som inte är markerade i denna artikel inkluderar celldöd med apoptos, autophagy och nekros reportrar 39-42, cellinvasion 43,44, och p53 dynamik som bestämmer cell öde beslut 27. Dessutom är detta tillvägagångssätt inte begränsat till studier i anti-cancerterapi studier. Samma principer kan användas för att studera många andra biologiska processer inklusive mitos 45 cytoskelettsystemen dynamik 46,47 och intracellulära signal 48.

    Time-lapse fluorescensmikroskopi kan också ge lokaliserings- och intensitetsdata av proteiner och molekyler av intresse. Inte bara är förändringar i proteinnivå viktigt för läkemedelssvar, men den riktiga (eller felaktiga) lokalisering av proteiner inom cellen är kritisk för att förstå svar. Time-lapse mikroskopi ger uppgifter om där proteiner är lokaliserade (eg., Kärnan, cytosolen, specifika organeller,osv.) efter läkemedelsbehandling och hur lokalisering och totala halterna förändras över tiden på en enda cell och populationsnivå.

    Utmaningar och begränsningar

    Trots styrkan i tidsförlopp mikroskopi och längsgående analys av enskilda celler, det finns begränsningar. Fluorescens reportrar begränsas av deras stabilitet och specificitet. Vid utformningen av fluorescerande fusionsproteiner, är det viktigt att välja en sond som är foto stabil och ljus, men det är också nödvändigt att beakta effekterna av den fluorescerande taggen är fäst till proteinet av intresse när det gäller sin normala funktion och förmåga att korrekt lokalisera . Dessa frågor har diskuterats i detalj på annat håll och det finns många tillgängliga fluorescerande taggade proteiner som har publicerats 15,49,50. Andra fluorescerande etiketter eller taggar kan tillsättas till cellerna, och omsorg måste vidtas för att säkerställa att de inte är giftiga. I vår erfarenhet, dessa pkläder, till exempel mitokondriella etiketter (membranpotential) eller cellgenomsläppliga DNA-färgämnen tenderar att bleka lättare och kommer att spädas ut på grund av celltillväxt.

    Dessutom finns det många tekniska utmaningar med växande och observera celler på ett mikroskop. Instabilitet med avseende på temperatur, luftfuktighet, atmosfär och ljus kommer att ha stora effekter på cellerna, vilket resulterar i förlust av data eller till och med hela experimentet. Stabilitetsproblem om bildfångst kan ses i filmer 1 och 2. Kan Denna effekt minimeras genom användning av paraffin film (se 4.2). Det finns också bildstabilisering algoritmer som efter förvärvet behandling, till exempel med hjälp av ImageJ (NIH). En aspekt av långsiktig time-lapse som ofta förbises är datahantering och filstorlek. Även när binning data, är en enda tidsförlopp experiment ofta över 30 gigabyte. Hög kapacitet, hög hastighet, pålitlig datalagring och överföring är starkaly uppmuntras. Beroende på den fluorescerande biosensorn (s) som avbildas, är det ofta inte nödvändigt att förvärva full upplösning bilder, till exempel kärnkraft eller cytoplasmiska sensorer. Vi rekommenderar när det är möjligt, att vidta åtgärder för att hålla filstorleken liten, vilket resulterar i lättare att arbeta med data, mindre krävande datorbehov, och förbättrad arbetsflödet.

    Fototoxicitet är ett stort problem när du utför långtids time-lapse mikroskopi. Högintensivt ljus och långa exponeringar kan leda till fotoblekning av fluorescerande prober, cellstress och celldöd. Dessa effekter kan få stora effekter på data och leda till förvrängning av experimentet. Kamera binning och förstärkning kan användas för att minska exponeringstider. Neutrala täthetsfilter i ljusbanan minska intensiteten av ljuset på provet. De ljusvåglängder som används för att bilden kommer också att påverka cellerna. Kortare våglängder (UV, nära UV) är mer skadlig för celler och resultera i fotoblekning vid snabbare hastigheter änlängre våglängder (eg., röd, långt rött). Val av mål kan också påverka avbildning villkor. Högre numerisk bländare (NA) linser ger bilder med högre upplösning, men högre förstoring ger mindre ljus som skall sändas från provet resulterar i högre gånger exponering eller mer intensivt ljus. Ett mål bör väljas med en lämplig NA och förstoring som kommer att lösa ditt objekt av intresse utan översampling. I många fall kan den högsta målet inte vara det lämpligaste valet. Med kärn sonder (figurerna 4, 5), tillåter en låg förstoring mål för en större fält som skall fångas, effektivt öka provstorleken, utan att kompromissa med upplösning av det önskade objektet. Långsiktig tidsförlopp i tre dimensioner bör utföras med försiktighet på grund av integrerad ljusexponering. Med hjälp av en snurrande skiva konfokalmikroskop, känslig kamera (t ex., EM-CCD), kamera vinst, och en snabb piezo motor för z-serien är suggested för att minska ljusexponering. Snabb z-serie förvärv är också viktigt att minimera rörelseartefakter på grund av cellrörelse och dynamik som uppstår under förvärvsperioden. Empirisk analys av obehandlade celler med användning av många olika inställningar kan vara användbar vid bestämning av effekterna av fluorescerande ljus på någon given cellinje eller reporter. Dessutom bör en obehandlad kontroll inkluderas i varje experiment för att bestämma de cytotoxiska effekterna av de experimentella inställningar.

    Variationer av tekniken

    Långsiktig time-lapse är robust och mycket flexibel. Användning av sam-odlingstekniker, olika cellinjer eller samma cellinjer som uttrycker olika reportrar kan användas. Ett enastående exempel på detta avbildning fagocytiska celler med målceller som dör till följd av en anti-cancer läkemedel. Ett annat exempel kan vara att undersöka effekterna av svarande celler på intilliggande läkemedels naiva celler. Tillsammans med foto activa(KillerRed eg.,) teable, foto cabriolet, och fotoomkopplings fluorescerande proteiner, och manipulerade proteiner som kan aktiveras av ljus för att utlösa specifika effekter, det finns många möjligheter. Mer komplicerade metoder kan användas som använder olika specialiserade typer av mikroskopi såsom fluorescerande omfördelning efter fotoblekning, Förster resonansenergiöverföring (FRET), och superupplösning (eg., Stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM), strukturell belysning mikroskopi (SIM), eller stimulerad utarmning emission (STED)), och många andra och det finns fördelar och begränsningar av varje metod.

    Långtidsbehandling (t.ex.., Veckor, månader) svar och återvinning av celler efter avlägsnande läkemedel är central för att förstå anticancerläkemedel åtgärder. Inrutade glasbottnade rätter är ett värdefullt verktyg för att övervaka specifika celler eller regioner inom en population / område flera gånger. Till exempel, med en rutindelad maträtt, den initiala drUG svar kan avbildas med en time-lapse, läkemedlet kan tas bort, och specifika områden i nätet kan avbildas med tiden eller underkastas ytterligare tidsförlopp vid önskad tidpunkt. Glas längst ned på disken kan avlägsnas antingen genom skärning med en skrivare verktyg eller genom att använda ett kommersiellt reagens och cellerna på glaset kan färgas för andra markörer av intresse, till exempel åldrande tillhörande β-galactocidase aktivitet och jämfördes med time-lapse för att förstå historien om hur celler nått detta tillstånd. Om cellpopulationen är tillräckligt stor kan det även utsättas för immunoblotting eller flödescytometri.

    Tjocka prover har traditionellt varit svårt att bild, till exempel spheroids i olika gelmaterial och matriser. Nyare metoder inklusive fluorescerande konfokala eller flera foton mikroskopi 16,18,19,51 kan användas för att förlänga inställning till en in situ förståelse för hur celler svarar på anti-cancerterapi. DeSE studier och ett växande antal av forskare med time-lapse för att studera anti-cancerläkemedlet svar 24,52-54 visar tydligt att vi är på väg mot att utveckla en förståelse för encelliga farmakodynamik som kommer att förbättra vår förmåga att använda anti-cancerläkemedel mer effektivt och kanske förutsäga anticancerläkemedel svar.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
    2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
    3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
    4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
    5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
    6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
    7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9, (e93718), (2014).
    8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
    9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
    10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
    11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
    12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. (2008).
    13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
    14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
    15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
    16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
    17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
    18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
    19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
    20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
    21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
    22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
    23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
    24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
    25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
    26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7, (488), (2011).
    27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
    28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
    29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
    30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
    31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
    32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7, (46), (2014).
    33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
    34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
    35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
    36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
    37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
    38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. (2015).
    39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
    40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
    41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
    42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
    43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
    44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7, (e30605), (2012).
    45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
    46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
    47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
    48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
    49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
    50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
    51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
    52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
    53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
    54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics