Injektion af Syngene Murine melanomaceller at bestemme deres metastatiske potentiale i lungerne

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Metastase er en væsentlig dødsårsag blandt patienter med maligne sygdomme. Processen med metastatisk spredning af cancerceller er dårligt forstået, men synes at involvere adskillige trin, herunder invasion af tilstødende væv, intravasation ind lymfekarrene og kar, overlevelse og translokation inden kredsløbssygdomme, ekstravasation fra vaskulaturen ved stedet for metastase, tilpasning til den nye mikromiljø af det nye site, og kolonisering på det nye site ved proliferation og dannelse af sekundære tumorer. 1. Hver af disse biologiske begivenheder indebærer transformation, udbredelse og overlevelse af metastatiske tumorceller. For eksempel omdannelsen af epitel fænotype af tumorcellen i en mesenchymal fænotype, kombineret med den succesfulde interaktion med den ekstracellulære matrix, således at de kan invadere tilstødende væv og metastasere til andre dele af kroppen. 2,3 Endvidere er disse metastatisk cellerskal overleve i den cirkulerende blodbanen og omgå immunovervågning fra værten. 4,5 Endelig, når implanteret på et fjernt sted inden i legemet, skal tumorcellerne tilpasse sig mikromiljø for at proliferere og danne sekundære tumorer. 6,7 Derfor , selv om metastaser er et almindeligt fænomen blandt kræftpatienter, metastatiske tumorceller har flere områder af sårbarhed, der er modtagelige for terapeutisk intervention.

I betragtning af den immunogene karakter melanom, og den nylige interesse inden for immunterapi, modeller for melanoma er i stigende grad nyttige. 8 I USA alene, melanom er årsag til en anslået 9.000 dødsfald om året. 9 Almindelige placeringer af melanom-metastase er knogler, hjerne , lever og lunger. Størstedelen af ​​metastaser til fjerne steder forekommer gennem blodbanen. Cirkulerende tumorceller i blodet skal undvige immune clearance, når en kapillær seng af en distal orgel oginvadere gennem endotelcellerne af blodkarret for at kunne etablere sig. 4-7,10, 11

For at efterligne de fælles og virulente fænomener metastase, blev det murine B16-BL6 cellelinje oprettet. En afdøde af den parentale C57BL / 6 melanomacellelinie B16-F0, B16-BL6 er slutproduktet af 10 på hinanden følgende udvælgelser til lunge metastase fra intravenøs injektion (hvilket resulterer i B16-F10), efterfulgt af 6 på hinanden følgende udvælgelser til penetration blære membran. 12 Som sådan er det en pålidelig melanom cellelinie til etablering af metastatiske foci i musen, især når det injiceres intravenøst. 13

Efter injektion af en tilstrækkelig mængde af B16-BL6-celler i halevenen af ​​en B57BL / 6 mus, efterfulgt af to eller flere uger for at tillade implantation og vækst af B16 / BL6-celler, vil metastatiske foci dannes i lungerne. Ved eutanasi og eftersyn dissekering mikroskopi, at antallet afindividuelle foci nuværende kan kvantificeres. Dette vil igen, kan anvendes til at etablere en dosis-metastase virkning, som antallet af injicerede B16-BL6-celler korrelerer med antallet af foci dannet på overfladen af ​​lungerne. Denne model er kendt som "eksperimentel metastase", hvor kendte-metastatisk celler indføres direkte i blodbanen, hvilket letter en hurtig og forudsigelig spredning og etablering i lunger, lever eller andre organer af undersøgelsen. Dette er i modsætning til "spontan metastase", hvor tumorceller implanteres, ofte subkutant, og metastaser stammer fra økologisk kaste kræftceller. 14,15

Det er vigtigt at injicere en passende mængde B16 / BL6-celler i halevener musene. For mange, og lungerne vil blive dækket med metastaser og tilstødende foci vil kunne skelnes fra hinanden. For få, og indflydelsen af ​​et terapeutisk middel vil være umærkelig på grund af iboende varitioner mellem injektioner. For at opnå et optimalt antal foci på lungerne af de C57BL / 6-mus, er det nødvendigt at korrelere antallet af injicerede celler med mængden af ​​etableret metastatiske foci på overfladen af ​​lungerne, mens der tages hensyn til distinguishability individuelle foci. Denne protokol vil demonstrere en metastatisk murin melanom model for C57BL / 6 mus.

Protocol

Etik Statement: Brugen af ​​mus i forskningen er kun acceptabel i tilfælde, hvor det kan fremme menneskelig forståelse af grundlæggende biologi eller mod den endelige behandling af sygdom.

1. Bestilling

  1. Køb kvindelige C57BL / 6 mus (alderen 6 - 8 uger), 5 mus per gruppe. Tillad flere dage for de mus, der skal justeres.

2. Udarbejdelse af B16-BL6 Cells

  1. Fjern celle kultur plader fra 37-graders inkubator og sted i en steril hætte. Plader bør være ca. 70% konfluente med B16-BL6 murine melanomceller. En større konfluens kan ændre cellerne metastatisk potentiale.
  2. Tilsæt 1 ml 0,05% trypsin-EDTA pr plade, lad sidde i 1 min, og derefter aspirere trypsin-media opløsning.
  3. Der tilsættes 1 ml trypsin pr plade og returnere pladerne til inkubatoren i 10 min.
  4. Efter flytning af pladerne fra inkubatoren til den sterile hætte, tilsættes 4 ml serumfrit Rosewell Park Memorial Institute Medium (RPMI) til hver plade.
  5. Saml cellerne med en steril, motoriseret pipette. Skubbe cellerne mod bunden af ​​pladen, med spidsen presset ved en meget lille vinkel, til at bryde op i cellerne. Gentag adskillige gange for at sikre passende adskillelse af celleklumper, som ellers kunne tilstoppe udslyngning nål. Huske og overførsel til en 50 ml konisk rør.
  6. Brug et hæmocytometer at bestemme celletætheden. Holde det samlede antal B16-BL6-celler konstant, bestemme mængden af ​​serum-frit RPMI nødvendige for at nå slutkoncentrationer på 0, 0,065, 0,015, 0,25, og 0,5 millioner celler / ml.
  7. Lige så udportionerer medierne i 50 ml rør til 15 ml koniske rør. Centrifuger koniske rør ved 2.250 xg i 5 min. Dekanteres medierne. Tilsæt en passende mængde serumfrit RPMI og bekræft den ønskede celledensitet via hæmacytometer. Juster densities- ved tilsætning af yderligere RPMI eller spinding og resuspendering i et mindre rumfang tilsvarende.
  8. Alikvote 500 piaf hver cellesuspension ind mærkede 1,8 ml rør på is.

3. haleveneinjektion

  1. Tag en mus, der blev afholdt i halen, og før den bageste først i musen harpiksstopperen. Med torso i hovedkammeret af harpiksstopperen, med halen uden for dette, trække musen mod slutningen af ​​harpiksstopperen. Sæt fastholdelsesanlæg-stemplet, fortsætter med at skubbe, indtil musen er sikker.
  2. Roter musen 90 grader, således at en af ​​de laterale halevener vender opad. Anvendelse af en alkohol pad, energisk rense den side af musens hale, navnlig når halevenen er mest synlige.
    Bemærk: God belysning er afgørende for en effektiv hale vene visualisering på B57BL / 6J mus. Varmelamper eller opvarmet kirurgi puder, mens ikke nødvendigt, vil også hjælpe ved at øge mængden af ​​halevenen.
  3. I en steril kultur hætte, indsamle 300 pi celledyrkningsmedier fra 2 millioner celler / ml rør. Vend nålen, svippede de side og skubbe stemplet, for at skubbe bobler fra sprøjten. Eject kultur-RPMI at resultere i en endelig volumen på 250 pi.
  4. Udvid musen-hale med ikke-dominerende hånd. Hold halen med den proximale ende af halen forhøjet med pegefingeren af ​​den ikke-dominerende hånd, og den distale del af halen deprimeret med tommelfingeren.
    Bemærk: På denne måde er halevenen holdes i en lateral position, parallelt med harpiksstopperen overflade, med en kongruent mulig post i mere distale del af halen.
  5. Stik nålen i halevenen, mod den distale ende, på et minut nedadgående vinkel til at begynde med, og derefter justere nålen til at matche vinkel halevenen efter yderligere indføring (sænke stempel ende af sprøjten i forhold til nålen) .
  6. Stik nålen ca. 1 cm i halevenen. Efter indsættelse, begynder at skubbe stemplet, holder nålen konstant.
    Bemærk: Hvis nålen er i halevenen og enden af ​​nålen er not hindret medierne skal flyde uhindret ind i venen. Effektiv injektion er karakteriseret ved blod-clearance fra venen. Hvis der er modstand, eller en boble begynder at danne på stedet i injektion, fjernes kanylen og prøv igen på et mere proksimal placering langs halen vene.
  7. Fjern nålen fra venen og kassér den. Hold gaze mod posten websted for at stoppe blødning.
  8. Fjern stemplet fra harpiksstopperen og placere musen i modtageren bur.
  9. Gentag for alle andre koncentrationer.
    Bemærk:. Lung foci etablering tager ca. 2 - 3 i uger med variation afhængig af cellelinje og den ønskede størrelse af foci 9 I mellemtiden bør overvåges mus for symptomer, der kunne berettige tidlig dødshjælp, ligesom overdreven gispende.

4. Counting Lung Foci

  1. Aflive musen ved anbringelse i en CO 2 kammer og udsætte til 100% CO2
  2. Defekter musen på Styrofoam. Ved hjælp af kirurgiske sakse, oprette et kirurgisk snit langs brystbenet.
  3. Gøre yderligere to indsnit, både fra toppen af ​​brystbenet incision og forgrening mod skuldrene af musen, udsætter brystkassen.
  4. Gøre to snit, hver langs de laterale sider af brystbenet, til fjernelse brystkassen fra torsoen, udsætter lungerne og hjertet.
  5. Hold hjerte med kirurgiske pincet, skære spiserøret og luftrøret, hvilket frigør hjerte og lunger fra musen. Placer under et dissektionsmikroskop, ved 10X forstørrelse, for bedre visualisering.
  6. Dissekere hjertet fra lungerne og fjern thymus, kun efterlader de to lunger.
  7. Med lungerne beneath en dissekere rækkevidde, begynder at tælle lunge brændpunkter. Hver foci skal vises som en cirkulær, brun obtrusion på overfladen af ​​lungerne.
    1. Tilsammenhæng mellem mus, tælle antallet af foci på overfladen af ​​en lap, og derefter invertere denne lap. Gør hver af de fire lapper individuelt muliggør lettere tælling.
  8. Gem og fastsætte lungerne, hvis udførelse IHC, ellers kasseres resterne.

Representative Results

Ved visuel inspektion, variationen i overfladen foci er indlysende. Tælle antallet af tumorer under et dissektionsmikroskop skulle give et lineært forhold mellem antallet af injicerede tumorceller og antallet af resulterende og tællelig foci. Brug af et optimalt antal injicerbare celler, målet er en, hvor lungerne ikke er helt dækket, da de er på 500.000 celler / ml i figur 1A, og ikke for tyndt dækkede, da de er på 62.500 celler / ml og 125.000 celler / ml. Dette er også kvantificerbar ved lineær korrelation (figur 1B).

figur 1
Figur 1. Lung Foci Som følge af Tail Vein indsprøjtet B16 / BL6 Cells. (A) Lung foci kan visualiseres på overfladen af lunger fra C57BL / 6-mus som brunt cirkulære masser (repræsentativ foci under pile). Som hulerity af den injicerede cellekultur (ovenfor hvert billede) stiger, så gør det tilsvarende antal resulterende lunge foci (under hvert billede). Lungerne fra mus med den højeste tæthed af injicerede celler har den største visuelle dækning af lunge foci. Scale søjler repræsenterer 20 mm. (B) Tælling af lungen foci i forhold til cellekulturen tæthed. Der er en tilnærmelsesvis lineær sammenhæng over 125.000 celler / ml, som bestemt ved hæmacytometer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Cirkulerende tumorceller fra en haleveneinjektion repræsentere metastaser, der unddrage steder af primær vækst og migrere gennem ruter som blodbanen eller lymfesystemet, lejlighedsvis at etablere sig i de kapillære senge af fjerntliggende steder. 14 ovenfor beskrevne protokol tjener som model for sekundær metastaser. Med et optimalt antal B16-BL6-celler injiceret, kan eksperimentatorer bestemme den relative virkning af et indgivet lægemiddel eller immun cellepopulation, post-neutralisering på cancercelle metastase.

Denne protokol har begrænsninger. De cirkulerende tumorceller er blevet udvalgt for deres evne til at metastasere og er derfor ikke-immunogen, har lavere niveauer af dominerende histokompatibilitetskompleks klasse 1-molekyler. 12. Endvidere pludselige og Clustered indførelse af store antal metastaser er ulig den typisk scenarie i patienter hvor et lille antal metastatiske tumorcellersprede over en længere tidsperiode fra den primære tumor placering. Derudover intravenøst ​​indførte tumorceller er fra vævskultur og ikke af en primær tumor oprindelse. Derfor er disse celler er i modsætning til de sekundære metastaser, der skyldes ændringer i celleadhæsion, migrering, immungenkendelse og modtager orgel etablering. 15,16

En alternativ protokol ville være subkutan injektion af B16 / BL6 til generering af primære tumorer og analyse af de resulterende "spontane" lungemetastaser. Disse "spontane" metastaser har vist sig at indeholde mere heterogenitet end deres "eksperimentelle" modstykker, nærmere svarer til dem af humane patienter. Protokollen er begrænsende på dens evne til at bestemme indflydelsen af ​​en eksperimentel forbindelse på metastase. Med en lateral halevene injektion, kan antallet af melanomceller injiceret i blodbanen tilnærmes via hemocytometer. Med "spontan" metastase, men der er større heterogenitet mellem tumorer, tilføje en ekstra variabel til antallet af resulterende lunge foci. 16

Afslutningsvis halevenen B16-BL6 murint melanom model repræsenterer en simpel model til bestemmelse af indflydelsen af ​​en behandling eller immunterapi på metastase. Ved intravenøst ​​injektion af cirkulerende tumorceller, kan forskerne replikere i nogen grad, patienter post-metastase. I betragtning af de ødelæggende virkninger af metastatiske tumorceller i cancerpatienter, denne model er et stærkt værktøj til forståelse af den flertrinsproces af metastase.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Delvist understøttet af en National Cancer Institute tilskud 1R03CA172923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
  2. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, (6), 1420-1428 (2009).
  3. Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
  4. Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
  5. Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
  6. Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
  7. Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
  8. Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363, (13), 711-723 (2002).
  9. Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 5 Supple 1 133-143 (2011).
  10. Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
  11. Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1, (3), 263-264 (2007).
  12. Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56, (4), 875-879 (1996).
  13. Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
  14. Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5, (2), 87-114 (1986).
  15. Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.2 (2001).
  16. Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18, (4), 669-681 (2001).
  17. Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97, (3), 587-600 (1979).
  18. Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20, (1), (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics