L'injection de cellules syngéniques murin de mélanome pour déterminer leur potentiel métastatique dans les Poumons

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Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

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Abstract

Introduction

Métastase est une cause majeure de décès chez les patients atteints de tumeurs malignes. Le processus de dissémination métastatique des cellules cancéreuses est mal compris, mais semble impliquer plusieurs étapes, y compris l'invasion des tissus adjacents, intravasculaire dans les vaisseaux lymphatiques et la vascularisation, la survie et la translocation dans le système circulatoire, l'extravasation de la vascularisation au niveau du site de la métastase, l'adaptation à la nouvelle micro - environnement du nouveau site, et la colonisation du nouveau site par la prolifération et la formation de tumeurs secondaires. 1 Chacun de ces événements biologiques impliquent la transformation, la diffusion et la survie des cellules tumorales métastatiques. Par exemple, la transformation du phénotype de l' épithélium de la cellule tumorale dans un phénotype mésenchymateuses, associée à l'interaction positive avec la matrice extracellulaire, de leur permettre d'envahir les tissus adjacents et se métastaser vers d' autres parties du corps 2,3 . En outre, ces métastases cellulesdoit survivre dans le sang circulant et d' échapper à la surveillance immunitaire de l'hôte. 4,5 Enfin, lorsqu'il est implanté à un site distant dans le corps, les cellules tumorales doivent adapter à leur microenvironnement afin de proliférer et de former des tumeurs secondaires. Par conséquent 6,7 , bien que des métastases est un phénomène courant chez les patients atteints du cancer, des cellules tumorales métastatiques ont de multiples zones de vulnérabilité qui se prêtent à une intervention thérapeutique.

Étant donné la nature immunogène du mélanome, et l'intérêt récent pour immunothérapies, des modèles de mélanome sont de plus en plus utile. 8 Aux États-Unis seulement, le mélanome est la cause d'environ 9.000 décès par an. 9 lieux communs de métastases du mélanome sont des os, du cerveau , le foie et les poumons. La majorité des métastases à des sites distants se produisent dans la circulation sanguine. Les cellules tumorales circulantes dans le sang doit échapper à la clairance immune, d'atteindre un lit capillaire d'un organe distal etenvahir par les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins afin de se mettre en place avec succès. 4-7,10, 11

Pour imiter les phénomènes communs et virulentes de la métastase, la lignée cellulaire B16-BL6 murin a été créé. Une personne décédée du C57BL / 6 lignée de cellules de mélanome parentale B16-F0, B16-BL6 est le produit de 10 sélections successives pour les métastases du poumon résultant de l'injection intraveineuse (entraînant B16-F10), suivis par 6 sélections successives de pénétration de membrane de la vessie extrémité. 12 en tant que tel, il est une lignée cellulaire de mélanome fiable pour la mise en place de foyers métastatiques chez la souris, en particulier lorsqu'il est injecté par voie intraveineuse. 13

Après injection d'une quantité suffisante de B16-BL6 cellules dans la veine caudale d'une B57BL / 6 souris, suivie de deux semaines ou plus pour permettre l'implantation et la croissance des cellules B16 / BL6, foyers métastatiques se forme dans les poumons. Lors de l'euthanasie et de l'inspection par microscopie de dissection, le nombre defoyers individuels présents peut être quantifiée. Ceci, à son tour, peut être utilisé pour créer un effet dose-métastases, comme le nombre de cellules B16-BL6 par injection est en corrélation avec le nombre de foyers formés sur la surface des poumons. Ce modèle est connu sous le nom de «métastase expérimentale», où les cellules connues métastatique sont introduits directement dans la circulation sanguine, ce qui facilite une diffusion et mise en place rapide et prévisible dans les poumons, le foie, ou un autre organe d'enquête. Ceci est en opposition à «métastase spontanée» , où les cellules tumorales sont implantées, souvent sous - cutanée, et les métastases proviennent de hangar biologique des cellules cancéreuses 14,15 .

Il est important d'injecter une quantité appropriée de cellules B16 / BL6 dans les veines de la queue des souris. Trop nombreux, et les poumons seront couverts avec des métastases et des foyers voisins seront indiscernables les uns des autres. Trop peu, et l'influence d'un agent thérapeutique sera indiscernable en raison de vari inhérenteations entre les injections. Afin d'obtenir un nombre optimal de foyers sur les poumons des souris C57BL / 6, il est nécessaire d'établir une corrélation entre le nombre de cellules injectées avec la quantité de foyers métastatiques établie sur la surface des poumons, tout en tenant compte de la distinction de la personne foyers. Ce protocole présentera un modèle de mélanome murin métastatique pour C57BL / 6.

Protocol

Déclaration d'éthique: L'utilisation de la souris dans la recherche est acceptable dans les cas où il pourrait faire avancer la compréhension humaine de la biologie fondamentale ou vers le traitement éventuel de la maladie.

1. Commande

  1. Achat femelle C57BL / 6 (âgés de 6 - 8 semaines), 5 souris par groupe. Autoriser plusieurs jours pour les souris pour ajuster.

2. Préparation des cellules B16-BL6

  1. Retirer les plaques de culture de cellules de l'incubateur 37 degrés et dans une hotte stérile. Les plaques doivent être d'environ 70% de confluence avec des cellules de mélanome murin B16-BL6. Une plus grande confluence peut modifier les cellules potentiel métastatique.
  2. Ajouter 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA par plaque, laisser reposer pendant 1 min, puis aspirer la solution trypsine-média.
  3. Ajouter 1 ml de trypsine par plaque et retourner des plaques dans l'incubateur pendant 10 min.
  4. Après avoir déplacé les plaques de l'incubateur à la hotte stérile, ajouter 4 ml de sans sérum Rosewell Memorial Park Institute Medium (RPMI) à chaque plaque.
  5. Recueillir les cellules avec une pipette motorisée stérile. Ejecter cellules contre le fond de la plaque, avec la pointe appuyée à un très léger angle, pour briser les cellules. Répéter plusieurs fois afin d'assurer une séparation adéquate des amas cellulaires, qui pourraient sinon boucher l'aiguille d'éjection. Rappeler et transférer dans un tube conique de 50 ml.
  6. Utiliser un hématimètre pour déterminer la densité cellulaire. Garder le nombre total de cellules B16-BL6 constante, déterminer le volume de RPMI sans sérum nécessaire pour atteindre des concentrations finales de 0, 0,065, 0,015, 0,25, et 0,5 millions de cellules / ml.
  7. aliquoter De même, les médias dans le tube de 50 ml à 15 ml tubes coniques. Centrifuger les tubes coniques à 2250 xg pendant 5 min. Décanter les médias. Ajouter un volume approprié de RPMI sans sérum et confirmer la densité cellulaire souhaitée via hématimètre. Ajuster densities- par adjonction supplémentaire RPMI ou le filage et la remise en suspension dans un volume- plus petit en conséquence.
  8. Aliquoter 500 pide chaque suspension cellulaire dans 1,8 ml marqués tubes sur la glace.

3. veine de la queue d'injection

  1. Prenez une souris, tenue par la queue, et la guider arrière d'abord dans le restrainer de la souris. Avec le torse dans la chambre principale de la restrainer, avec la queue à l'extérieur, tirez la souris vers la fin de la restrainer. Insérez le restrainer-plongeur, en continuant à pousser jusqu'à ce que la souris est sécurisé.
  2. Faire tourner la souris 90 degrés de telle sorte que l'une des nervures latérales de la queue est tournée vers le haut. L'utilisation d'un tampon imbibé d'alcool, nettoyer vigoureusement le côté de la queue de la souris, en particulier lorsque la veine de la queue est la plus visible.
    Remarque: Un bon éclairage est essentiel pour la queue efficace veine visualisation sur B57BL / 6J. Des lampes chauffantes ou des tampons de chirurgie chauffée, tandis que pas nécessaire, aideront aussi en augmentant le volume de la veine de la queue.
  3. Dans une hotte de culture stérile, la collecte 300 pi de milieu de culture cellulaire à partir de la 2 millions de cellules / ml tube. Inversez l'aiguille, effleurant les side et poussant le piston pour éjecter les bulles de la seringue. Éjecte culture RPMI pour donner un volume final de 250 ul.
  4. Etendre la souris-queue avec la main non dominante. Tenir la queue à l'extrémité proximale de la queue élevée avec l'index de la main non dominante, et la partie distale de la queue enfoncée avec le pouce.
    Remarque: De cette manière, la veine de la queue est maintenue dans une position latérale, parallèle à la surface du dispositif de retenue, avec une entrée congruentes possible dans la partie la plus distale de la queue.
  5. Insérez l'aiguille dans la veine de la queue, vers l'extrémité distale, à un angle vers le bas minute pour commencer, puis ajuster l'aiguille pour correspondre à l'angle de la veine de la queue à la poursuite de l'insertion (abaissement extrémité du piston de la seringue par rapport à l'aiguille) .
  6. Insérez l'aiguille d'environ 1 cm dans la veine de la queue. Après l'insertion, commencer à pousser le piston, tenant l'aiguille stable.
    Remarque: Si l'aiguille est dans la veine de la queue et l'extrémité de l'aiguille est un groupe not obstrué les médias devraient circuler librement dans la veine. injection efficace est caractérisée par la clairance de sang de la veine. En cas de résistance, ou une bulle commence à se former sur le site de l'injection, retirez l'aiguille et essayez à nouveau à un endroit plus proximal le long de la veine de la queue.
  7. Retirez l'aiguille de la veine et le jeter. Maintenez la gaze contre le site d'entrée pour arrêter le saignement.
  8. Retirer le piston de la restrainer et placez la souris dans la cage du destinataire.
  9. Répétez l'opération pour toutes les autres concentrations.
    Remarque:. Lung établissement foyers prend environ 2 - 3 semaines, avec une variabilité en fonction de la lignée cellulaire et la taille souhaitée des foyers 9 Dans l'intervalle, les souris doivent être surveillés pour des symptômes qui pourraient justifier l' euthanasie précoce, comme halètement excessif.

4. Compter le poumon Foci

  1. Euthanize la souris en plaçant dans une chambre de CO 2 et l' exposition à 100% de CO 2
  2. Splay la souris sur styromousse. Avec des ciseaux chirurgicaux, créer une incision chirurgicale le long du sternum.
  3. Faire deux incisions supplémentaires, à la fois par le haut de l'incision du sternum et la ramification vers les épaules de la souris, l'exposition de la cage thoracique.
  4. Faites deux coupes, chacun le long des côtés latéraux du sternum, pour enlever la cage thoracique du torse, ce qui expose les poumons et le cœur.
  5. En tenant le coeur avec des pincettes chirurgicales, couper l'œsophage et la trachée, ce qui libère le cœur et les poumons de la souris. Placer sous un microscope à dissection, au grossissement 10X, pour une meilleure visualisation.
  6. Disséquer le coeur des poumons et retirer le thymus, ne laissant que les deux poumons.
  7. Avec les poumons sous un champ de dissection, commencer à compter les foyers du poumon. Chaque foyers doit apparaître comme une circulaire, brun intrusion sur la surface des poumons.
    1. Pourla cohérence entre les souris, compter le nombre de foyers sur la surface d'un lobe, puis inverser ce lobe. Faire chacun des quatre lobes permet individuellement pour faciliter le comptage.
  8. Enregistrer et fixer les poumons si la procédure IHC, sinon, jetez les restes.

Representative Results

Lors de l'inspection visuelle, la variation des foyers de la surface est évidente. Compter le nombre de tumeurs sous un microscope à dissection devrait donner une relation linéaire entre le nombre de cellules tumorales injectées et le nombre de foyers résultant et dénombrables. L' utilisation d' un nombre optimal de cellules injectables, l'objectif est celui où les poumons ne sont pas complètement couverts, car ils sont à 500.000 cellules / ml dans la figure 1A, et pas trop peu couverts, car ils sont à 62.500 cellules / ml et 125.000 cellules / ml. Ceci est également mesurable par corrélation linéaire (figure 1B).

Figure 1
Figure 1. Lung Foci Résultant de queue Vein Injecté cellules B16 / BL6. (A) des foyers du poumon peut être visualisée sur la surface des poumons de souris C57BL / 6 comme masses brunes circulaires (foyers représentant sous flèches). Comme les tanièreslité de la culture cellulaire injectée (au-dessus de chaque image) augmente, plus le nombre correspondant de foyers résultant du poumon (en dessous de chaque image). Les poumons de la souris avec la plus forte densité de cellules injectées a la plus grande couverture visuelle des foyers du poumon. Les barres d'échelle représentent 20 mm. (B) Dénombrement des foyers du poumon par rapport à la densité de la culture cellulaire. Il existe une relation approximativement linéaire au- dessus de 125.000 cellules / ml, tel que déterminé par hématimètre. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Cellules tumorales circulantes à partir d' une injection dans la veine caudale représentent les métastases qui soustraient les sites de croissance primaire et migrer à travers des routes comme la circulation sanguine ou le système lymphatique, à l' occasion de s'établir dans les lits capillaires des endroits éloignés. 14 Le protocole décrit ci - dessus sert de modèle pour le secondaire métastases. Avec un nombre optimal de cellules B16-BL6 injecté, les expérimentateurs peuvent déterminer l'effet relatif d'un médicament administré ou d'une population de cellules immunitaires, post-neutralisation, sur les métastases de cellules cancéreuses.

Ce protocole a des limites. Les cellules tumorales circulantes ont été sélectionnés pour leur capacité à se métastaser et ne sont donc pas immunogène, ayant des niveaux inférieurs d'histocompatibilité majeur classe complexe 1 molécules. 12 En outre, l'introduction brutale et en grappe d' un grand nombre de métastases est la différence du scénario typique chez les patients où de petits nombres de cellules tumorales métastatiquesdissiper au cours d'une période de temps prolongée à partir de la localisation de la tumeur primaire. En outre, les cellules tumorales par voie intraveineuse sont introduites à partir de la culture de tissus et non d'une origine de la tumeur primaire. Par conséquent, ces cellules sont à la différence des métastases secondaires qui résultent de modifications dans l' adhésion cellulaire, la migration, la reconnaissance immunitaire et la création d'organes de destinataire. 15,16

Un protocole alternatif serait l'injection sous-cutanée de B16 / BL6 pour la génération des tumeurs primaires et l'analyse des métastases pulmonaires résultant "spontanées". Ces métastases «spontanées» ont été trouvés pour contenir plus d'hétérogénéité que leurs homologues «expérimentales», correspondant plus étroitement à celles des patients humains. Le protocole est limitante dans sa capacité à déterminer l'influence d'un composé expérimental sur les métastases. Avec une injection dans la veine caudale latérale, le nombre de cellules de mélanome injectées dans le courant sanguin peut être approximée par l'intermédiaire d'hemocytometer. Des métastases «spontanées», cependant, il existe une plus grande hétérogénéité entre les tumeurs, l' ajout d' une variable supplémentaire au nombre de foyers résultant du poumon. 16

En conclusion, le modèle de mélanome dans la veine caudale de souris B16-BL6 représente un modèle simple pour la détermination de l'influence d'un traitement ou d'une immunothérapie sur les métastases. En injectant par voie intraveineuse des cellules tumorales circulantes, les chercheurs peuvent reproduire, dans une certaine mesure, les patients post-métastase. Considérant les effets destructeurs des cellules tumorales métastatiques chez les patients atteints de cancer, ce modèle est un outil puissant pour comprendre le processus en plusieurs étapes de métastases.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Pris en charge en partie par une subvention du National Cancer Institute 1R03CA172923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

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