एक सेल मुक्त परख का उपयोग

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

कोशिका जीव विज्ञान में एक मौलिक सवाल यह है कि सेल और organelle आकार विनियमित रहे है। यह लंबे समय से मान्यता दी गई है कि नाभिक के आकार आम तौर पर विशेष रूप से embryogenesis दौरान, सेल के आकार के साथ तराजू जब दोनों सेल में नाटकीय कमी और परमाणु आकार घटित हो गया है। परमाणु आकार विनियमन के तंत्र काफी हद तक अनजान रहे हैं और कैंसर के लिए प्रासंगिक हो सकता है, जहां बदल परमाणु आकार एक प्रमुख नैदानिक ​​और शकुन पैरामीटर है। विवो में परमाणु आकार नियामकों की पहचान करने के लिए दृष्टिकोण परमाणु समारोह के आवश्यक और जटिल प्रकृति से जटिल कर रहे हैं। इन विट्रो दृष्टिकोण यहाँ वर्णित परमाणु आकार नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए परमाणु के आकार में सामान्य कटौती है कि Xenopus laevis विकास के दौरान होने का फायदा उठाते हैं। सबसे पहले, नाभिक एक्स में इकट्ठा कर रहे हैं अंडा निकालने laevis। फिर, इन नाभिक अलग-थलग और देर चरण भ्रूण से कोशिका द्रव्य में resuspended हैं। 90 मिनट ऊष्मायन अवधि, परमाणु सतह क्षेत्र - एक 30 के बाद60% देर चरण भ्रूण कि विकासात्मक परमाणु आकार स्केलिंग के लिए योगदान में मौजूद cytoplasmic घटकों की पहचान करने के लिए एक उपयोगी परख प्रदान - 20 से कम हो जाती है। इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख लाभ रिश्तेदार की सुविधा के साथ जो अंडे और भ्रूण के अर्क biochemically चालाकी से किया जा सकता है, उपन्यास प्रोटीन और गतिविधियों है कि परमाणु के आकार को विनियमित की पहचान के लिए अनुमति है। इन विट्रो दृष्टिकोण में किसी के साथ के रूप में, एक विवो प्रणाली में परिणाम के सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण है, और एक्स के microinjection laevis भ्रूण इन अध्ययनों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।

Introduction

सेलुलर अंगों का आकार आमतौर पर सेल के आकार के साथ पैमाने पर, और यह शायद सबसे अच्छा सेल आकार 1-10 के साथ परमाणु आकार की स्केलिंग के लिए दर्ज किया गया है। इस embryogenesis और सेल भेदभाव, जब दोनों सेल और परमाणु के आकार में नाटकीय कमी अक्सर 11,12 मनाया जाता है के दौरान विशेष रूप से सच है। इसके अलावा, बदल परमाणु आकार कैंसर निदान और रोग का निदान 13-17 में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। तंत्र है कि परमाणु आकार नियमन में योगदान जटिलता और परमाणु संरचना और समारोह के आवश्यक प्रकृति के कारण काफी हद तक अनजान, हिस्से में हैं। विधि यहाँ वर्णित परमाणु आकार स्केलिंग के लिए इन विट्रो परख है कि जैव रासायनिक हेरफेर और परमाणु आकार विनियमन के तंत्र की व्याख्या करने के लिए उत्तरदायी है के रूप में विकसित किया गया था।

Xenopus laevis अंडे निकालने के एक अच्छी तरह से स्थापित पुनरावृत्ति और इन विट्रो में जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रणाली है 18-22 सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में नई मौलिक जानकारी से पता चला है। निकालने व्यवस्था करने के लिए एक प्रमुख लाभ यह है कि एक्स है laevis अंडे अर्क एक लगभग undiluted कोशिका द्रव्य रचना जिसका आसानी से पुनः संयोजक प्रोटीन या immunodepletion के अलावा के माध्यम से उदाहरण के लिए, बदला जा सकता है प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, एक उपचार है कि अन्यथा एक विवो संदर्भ में घातक हो सकता है रोजगार से आवश्यक प्रक्रियाओं में हेरफेर करने में सक्षम है। अंडा निकालने प्रक्रिया का संशोधन एक्स से अर्क के अलगाव के लिए अनुमति देते हैं laevis भ्रूण के बजाय अंडे, और इन भ्रूण अर्क समान रूप से जैव रासायनिक हेरफेर 23 के लिए उत्तरदायी हैं। एक्स के दौरान विकास laevis, एकल कोशिका निषेचित भ्रूण (~ 1 मिमी व्यास) बारह तेजी से कोशिका विभाजन की एक श्रृंखला आए (चरणों 1 - 8) उत्पन्न करने के लिए कई हजार 50 μमीटर व्यास और छोटे कोशिकाओं, एक विकास मंच तक पहुँचने midblastula संक्रमण (एमबीटी) या 8 स्टेज 24-26 करार दिया। एमबीटी युग्मज ट्रांसक्रिप्शन, सेल प्रवास, अतुल्यकालिक कोशिका विभाजन, अंतर चरणों के अधिग्रहण, और पूर्व एमबीटी भ्रूण के रूप में नित्य परमाणु विस्तार परमाणु स्थिर राज्य आकारों के बजाय की स्थापना की शुरुआत की विशेषता है। Gastrulation करने के लिए मंच 4 से (10.5 चरणों - 12), व्यक्तिगत नाभिक की मात्रा अधिक से अधिक 10 गुना 11 से कम हो जाती है।

इधर, लक्ष्य विकास प्रगति के दौरान परमाणु आकार में इन कटौती के लिए जिम्मेदार तंत्र की पहचान है। दृष्टिकोण पहले एक्स में नाभिक को इकट्ठा करने के लिए है अंडा निकालने laevis और अंडे कोशिका द्रव्य / निकालने से उन लोगों के नाभिक को अलग-थलग करने के लिए। इन नाभिक फिर देर गेसट्रुला चरण भ्रूण से कोशिका द्रव्य में resuspended हैं। एक ऊष्मायन अवधि के बाद, अंडा निकालने से नाभिक देर चरण भ्रूण निकालने में छोटे हो जाते हैं। हम तर्क यह है कि woulदेर चरण भ्रूण कि विकासात्मक परमाणु आकार स्केलिंग के लिए योगदान में मौजूद cytoplasmic घटकों की पहचान करने के लिए एक उपयोगी परख होगी। इस परख, विवो सत्यापन के साथ मिलकर प्रयोग, हम दिखा दिया है कि प्रोटीन काइनेज सी (पीकेसी) एक्स में परमाणु के आकार में कटौती विकास के लिए योगदान 23 laevis।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी Xenopus प्रक्रियाओं और अध्ययन की देखभाल और प्रयोगशाला पशु 8 वीं संस्करण के उपयोग के लिए एनआरसी गाइड के अनुपालन में आयोजित की गई। प्रोटोकॉल व्योमिंग संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (आश्वासन # ए-3216-01) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. एक्स की तैयारी laevis अंडे निकालें (27,28 से अनुकूलित)

  1. प्रधानमंत्री महिला एक्स laevis तीन दिनों की एक न्यूनतम और गर्भवती घोड़ी सीरम gonadotropin (PMSG) की एक एकल 100 आइयू इंजेक्शन के साथ अंडा संग्रह से पहले दो सप्ताह की एक अधिकतम मेंढक।
  2. प्रयोग से पहले एक दिन, 1 / 3x मार्क संशोधित ringers (एमएमआर) के मेंढक प्रति 1 एल में 16 डिग्री सेल्सियस पर मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) और जगह के 800 आइयू के साथ primed मेंढ़कों इंजेक्षन। सभी बफर रचनाओं के लिए 1 टेबल देखें।
    नोट: कुछ मेंढ़कों अंडे देना नहीं होगा या गरीब गुणवत्ता अंडे देना होगा। आमतौर पर 2 - 3 मेंढ़कों कम से कम एक मेंढक sufficien रखना होगा सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन हैंअच्छी गुणवत्ता के अंडे की टी संख्या। औसत मेंढक रखना पर्याप्त अंडे अंडे निकालने के कम से कम 1 मिलीलीटर उत्पादन होगा।
  3. 1 ठंड आसुत विआयनीकृत पानी के साथ तैयार एल 1 / 3x एमएमआर (DDH 2 हे), 500 मिलीलीटर बफर बी, एल 1 बफर सी, 500 मिलीलीटर बफर डी, और 100 मिलीलीटर बफर ई
  4. स्थानांतरण एक गिलास crystallizing पकवान (150 x 75 मिमी) के लिए अंडे रखी। टिप के साथ एक प्लास्टिक पाश्चर pipet कट-ऑफ का उपयोग करना, सफेद झोंके सक्रिय अंडे या अंडे lysed बाहर खेत। केवल अलग और बराबर अंधेरे पशु डंडे और सफेद वनस्पति डंडे के साथ अंडे बरकरार रहती है।
  5. बफर ई के 1 मिलीलीटर डी cytochalasin 355 माइक्रोन के साथ पूरक के साथ 13 x 51 मिमी सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों तैयार सिर्फ 1.7 कदम में उपयोग करने से पहले जोड़ा।
  6. Dejelly और अंडे धो लें।
    1. 4 बार - अंडे संक्षेप में बफर बदलते 3, एक उचित आकार बीकर में ठंड 1 / 3x एमएमआर के साथ धोएं।
    2. बफर बी यह साथ ऊष्मायन द्वारा अंडे से जेली कोट हटाये 3 से कहीं भी ले जाएगा - 10 मिनट। बादल जेली कोट अंडे से जारी कर रहे हैं के रूप मेंएस, बफर बदल जाते हैं।
      नोट: Dejellying पूरा हो गया है जब अंडे कसकर पकवान के कोने में पैक दिखाई देते हैं जब झुका हुआ है और वनस्पति के खंभे नीचे की ओर उन्मुख होते हैं। अंडे बहुत अधिक नाजुक dejellying बाद कर रहे हैं, तो आवश्यक और बाद washes से अधिक समय के लिए बफर बी के साथ अंडे सेते नहीं है बहुत सावधानी से प्रदर्शन करने की आवश्यकता।
    3. बफर सी के 4 परिवर्तन - 3 के साथ धो अंडे संक्षेप में
    4. बफर डी के 2 में परिवर्तन के साथ धो अंडे संक्षेप में
    5. बफर ई के 2 में परिवर्तन के साथ धो अंडे संक्षेप में
  7. एक विस्तृत बोर कांच या प्लास्टिक पिपेट dropper का उपयोग अंडे के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब भरें। अतिरिक्त बफर बंद महाप्राण। अंडे पैक और जितना संभव बफर, सेंट्रीफ्यूज के रूप में झूल बाल्टी रोटर में 212 XG पर 60 सेकंड के लिए 478 XG पर 30 सेकंड के लिए हटाने और फिर करने के लिए। अतिरिक्त बफर बंद महाप्राण।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए अंडे निकालने न्यूनतम पतला है इस कदम पर जितना संभव हो उतना अतिरिक्त बफर दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  8. एक झूल में बाल्टी रोटर, 12,000 XG पर 15 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए वैक्यूम के अंतर्गत ultracentrifuge अंडे खुला कुचलने और कोशिका द्रव्य बीच में एम्बर रंग की परत होने के साथ अलग अलग परतों में अलग करने के लिए। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और जगह बर्फ पर तुरंत हटा दें।
  9. निकालने लीजिए।
    1. एक 18 गेज सुई और सिरिंज का प्रयोग, बस ट्यूब के नीचे अंधेरे pigmented परत के ऊपर अपकेंद्रित्र ट्यूब पंचर और मध्य एम्बर रंग cytoplasmic परत को हटा दें। शीर्ष लिपिड परत के किसी भी एकत्र नहीं है। एक उचित आकार ट्यूब में कोशिका द्रव्य लीजिए।
      नोट: आम तौर पर, 1 मेंढक निकालने के कम से कम 1 मिलीलीटर पैदा करता है।
    2. 1/1000 डी cytochalasin 19.7 मिमी की मात्रा, 1 / 1,000 LPC शेयर की मात्रा, और 1/50 50x ऊर्जा मिश्रण की मात्रा के साथ पूरक कोशिका द्रव्य। धीरे ट्यूब मिश्रण करने के लिए पलटना। जरूरत से ज्यादा निकालने pipet मत करो।
    3. बर्फ पर निकालने रखें और अच्छे परिणाम के लिए तैयार करने के 3 घंटा के भीतर उपयोग करें।
_title "> 2। Demembranated एक्स laevis शुक्राणु (29 से अनुकूलित) की तैयारी

नोट: प्रक्रिया यहाँ प्रस्तुत की मात्रा अप करने के लिए 8 वृषण के लिए कर रहे हैं।

  1. 0.05% benzocaine (10% benzocaine शेयर इथेनॉल में तैयार किया है और मेंढक की टंकी के पानी में 0.05% करने के लिए पतला) 4 डिग्री सेल्सियस से और कमरे के तापमान को गर्म निकालें। Anesthetize और पुरुष एक्स बलिदान 30 मिनट - 20 के लिए कमरे के तापमान पर benzocaine समाधान में मेंढकों laevis। जांच और छाती क्षेत्र लग रहा है, यांत्रिक उत्तेजना के जवाब की कमी से, और / या कत्ल द्वारा द्वारा दिल की धड़कन की अनुपस्थिति से मौत सुनिश्चित करें।
  2. पेट के साथ एक यू के आकार का चीरा। पीले रंग की वसा शरीर के tubulated बड़े पैमाने पर निकालें। गुर्दे के शीर्ष पर, वृषण, जो अंडाकार आकार लंबाई 29 में 1 सेमी के बारे में गुलाबी रंग पीला जनता कर रहे हैं का पता लगाने। वृषण आबकारी एवं सोख्ता कागज रक्त और अन्य ऊतकों को दूर करने पर उन्हें रोल।
  3. बफर टी उपयोग में वृषण धो बफर के 1 मिलीलीटर के साथ वृषण भरती करने के लिए एक तंग फिट मूसलएक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में टी समरूप तक (10 स्ट्रोक या अधिक)। अपकेंद्रित्र 5 - एक मिनी अपकेंद्रित्र में 10 सेकंड और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा, ऊतक के बड़े टुकड़े को हटाने। एक बार फिर centrifugation दोहराएँ और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  4. एक 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब के लिए शुक्राणु युक्त समाधान स्थानांतरण। बफर टी अपकेंद्रित्र के साथ 2 मिलीलीटर की कुल मात्रा को शुक्राणु गोली के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1411 XG पर बढ़ाएँ।
  5. तैरनेवाला निकालें और 16 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1411 XG पर बफर टी अपकेंद्रित्र के 500 μl में गोली resuspend। एक या दो बार के रूप में दैहिक और लाल रक्त कोशिकाओं की गोली साफ करने की जरूरत है इस चरण को दोहराएँ।
  6. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 100 μl बफर टी और 300 μl बफर एस सेते में गोली Resuspend।
    नोट: बफर एस lysolecithin, जो demembranation के लिए जिम्मेदार होता है।
  7. बफर आर के तीन खंडों में जोड़ें (तैयार उपयोग करने से पहले ताजा)। ठीक एक बार ट्यूब पलटना। 16 और 15 मिनट के लिए 1411 XG पर अपकेंद्रित्र# 176; सी।
  8. में 400 μl बफर आर गोली Resuspend और फिर 16 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 1411 XG पर बफर आर सेंट्रीफ्यूज की एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  9. 50 μl बफर टी में गोली Resuspend
  10. पतला 9 μl बफर T के साथ 1 μl demembranated शुक्राणु नाभिक एक hemocytometer को यह कमजोर पड़ने लागू करें। एक बड़े 4 x 4 ग्रिड में पतली एस के आकार का शुक्राणु नाभिक की संख्या की गणना, और μl प्रति शुक्राणु नाभिक में शेयर की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 100 से उस नंबर गुणा।
  11. बफर टी के साथ μl प्रति 100,000 शुक्राणु नाभिक, एक 200x स्टॉक में जिसके परिणामस्वरूप के लिए शेयर पतला। 5 μl aliquots - 3 तैयार करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज।

3. परमाणु विधानसभा

  1. 1.5 μl 35.5 मिमी cycloheximide (अंतिम एकाग्रता ~ 0.5 मिमी) के साथ अंडा निकालने के 100 μl पूरक, 6 μl 20x कैल्शियम शेयर समाधान (अंतिम एकाग्रता ~ 0.6 मिमी), और 0.7 μl 200x शुक्राणु (अंतिम एकाग्रता ~ 700शुक्राणु नाभिक / μl)। प्रतिक्रिया मात्रा ऊपर या नीचे के रूप में आवश्यक पैमाने। पलटना या धीरे मिश्रण करने के लिए नल।
    नोट: अंतरावस्था में metaphase से साइकिल निकालें परमाणु विधानसभा के लिए एक और अधिक मजबूत और विश्वसनीय मंच प्रदान करता है।
  2. 90 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस - 16 पर एक पानी के स्नान में सेते हैं। धीरे हर 15 मिनट के दोहन सुनिश्चित करने के नाभिक निकालने में निलंबित कर रह द्वारा मिक्स।
  3. एक स्क्वैश तैयारी के रूप में निम्नानुसार से 45 मिनट में परमाणु विधानसभा की प्रगति की निगरानी।
    1. Pipet एक गिलास स्लाइड पर निकालने के 2 μl और 2 μl नाभिक तय जोड़ें।
    2. एक 22 मिमी 2 coverslip के साथ ओवरले। 100X उद्देश्यों और एक DAPI फिल्टर - पानी, तेल, या हवा 20 का उपयोग कर एक epifluorescence माइक्रोस्कोप पर छवि।
      नोट: नाभिक उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग द्वारा देखे जा सकते हैं, लेकिन ज्यादा प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना करने के लिए आसान कर रहे हैं।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में तुरंत नाभिक या फ्लैश फ्रीज aliquots का प्रयोग करें।
      नोट: नाभिक जनसंपर्क करने के लिए 4% ग्लिसरॉल जोड़नाठंड के लिए आईओआर उनकी ईमानदारी बनाए रखने में मदद कर सकते हैं। जमे हुए नाभिक आम तौर पर अभी भी व्यवहार्य और परमाणु आयात करने में सक्षम हैं, लेकिन ठंड प्रक्रिया बाधित या अधिक संरचनात्मक रूप से नाजुक नाभिक के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। नाभिक ठंड के बाद एक साल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

4. एक्स की तैयारी laevis भ्रूण निकालें

  1. महिला एक्स प्रेरित मेंढ़कों laevis 1.1 और 1.2 में वर्णित के रूप में अंडे देना।
  2. पुरुष एक्स से वृषण अलग 2.2 में वर्णित के रूप में मेंढकों laevis। एक गिलास 35 x 10 मिमी पेट्री डिश में 50 आइयू / पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन की मिलीलीटर के साथ पूरक L15 मीडिया में वृषण डूब। अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. लीजिए और अंडे की खाद डालना।
    1. एक गिलास पुन: प्रयोज्य पेट्री डिश पर मेंढकों धारण करके हौसले रखी अंडे ले लीजिए और करने के लिए पीठ के निचले हिस्से गंदा नाला के पास कोमल दबाव लागू करने से अंडे बिछाने को बढ़ावा देने के। मेंढक भी मुश्किल फैलाएंगे चोट में परिणाम कर सकते हैं, एक फूला हुआ पेट और अनुरोध करने के लिए अग्रणीइच्छामृत्यु 29 uiring।
    2. एक अनुमानित 45 डिग्री के कोण पर पकवान सहारा, अंडे पकवान के किनारे में जमा है, सभी अतिरिक्त बफर हटाने, और पर्याप्त 1 / 3x एमएमआर मुश्किल से अंडे को कवर में जोड़ने के लिए अनुमति देते हैं। संग्रह के 15 मिनट के भीतर अंडे की खाद।
    3. पानी में डालकर रखना और संशोधित बार्थ का खारा (उच्च नमक एमबीएस) उच्च नमक के 500 μl के साथ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक वृषण के 1/4 homogenize करने के लिए एक कसकर फिट मूसल का प्रयोग करें। अंडे को macerated वृषण जोड़ें और 15 के लिए कमरे के तापमान पर घटित करने के निषेचन के लिए अनुमति देते हैं - 20 मिनट, तो 1 / 3x एमएमआर के साथ अंडे बाढ़।
      नोट: वृषण की प्रभावशीलता, भंडारण समय के साथ कम हो जाती है इसलिए अधिक वृषण ऊतक जब कि अधिक से अधिक एक सप्ताह के लिए संग्रहित किया गया है वृषण का प्रयोग सफल निषेचन के लिए आवश्यक हो सकता है।
    4. कुचल Teste के अलावा के बाद 30 मिनट - आमतौर पर के बारे में 20 सामना करना पड़ रहा है, अंधेरे pigmented पशु पोल के संकुचन के लिए जाँच करके और उनके पशु डंडे के साथ भ्रूण के रोटेशन से निषेचन की पुष्टिएस। 90 मिनट के भीतर होने की पहली सेल दरार की अपेक्षा करें।
    5. एक विस्तृत बोर कांच विंदुक का प्रयोग लगन से मृत (सफेद और झोंके या जर्दी और वर्णक के असमान वितरण) को हटाने, lysed, या unfertilized अंडे (यानी, cleaved नहीं), के रूप में वे तेजी से पड़ोसी भ्रूण में मौत के लिए प्रेरित करेगा।
    6. कहीं भी 1 से - 2.5 घंटे बाद निषेचन, dejelly 2 में भ्रूण - 3% सिस्टीन 1/3 x एमएमआर में भंग कर दिया और 10 एन KOH के साथ पीएच 7.9 करने के लिए समायोजित। 4 मिनट - दो बफर परिवर्तन है कि प्रत्येक 3 प्रदर्शन कर रहे हैं। अच्छी तरह से 6 के साथ भ्रूण धो - 10 1 / 3x एमएमआर का संक्षिप्त परिवर्तन सिस्टीन के सभी निशान हटाने के लिए।
      नोट: Dejellied भ्रूण एक पीतक झिल्ली है और dejellied अंडे के रूप में के रूप में कमजोर नहीं हैं।
  4. एक विस्तृत बोर गिलास पिपेट का प्रयोग, 16 डिग्री सेल्सियस ताजा 1 / 3x एमएमआर युक्त एक पेट्री डिश के लिए स्वस्थ निषेचित (यानी, cleaved) भ्रूण हस्तांतरण और उन्हें आरटी पर वांछित चरण के लिए विकसित या, के लिए अगर धीमी विकास पसंद किया जाता है की अनुमति देते हैं। मृत या Ly दूर करने के लिए जारीएसईडी भ्रूण प्रथम श्रेणी या सफेद झोंके उपस्थिति की कमी से संकेत दिया।
  5. Blastopore का लगभग पूरा बंद करने के लिए जाँच करके और संदर्भ सामग्री 24 में मंचन उपलब्ध भ्रूण के चित्र के तुलना द्वारा भ्रूण के मंच की जाँच करें।
    नोट: भ्रूण 16 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत चरण 11.5 तक पहुंच जाएगा - लगभग 12 घंटा में 12।
  6. ताजा 1 / 3x एमएमआर आरटी पर 1 घंटे के लिए 0.5 मिमी cycloheximide के साथ पूरक में 12 भ्रूण, देर अंतरावस्था में भ्रूण की गिरफ्तारी के लिए - स्टेज सेते 11.5।
  7. विस्तृत बोर कांच या प्लास्टिक पिपेट 15 (अधिमानतः 30 या अधिक) की एक न्यूनतम एक microcentrifuge ट्यूब अंतरावस्था गिरफ्तार भ्रूण के साथ स्थानांतरण।
    नोट: 15 भ्रूण निकालने के लगभग 20 μl उत्पादन करने के लिए पर्याप्त हैं। अप पैमाने के रूप में की जरूरत है।
  8. 1 मिलीलीटर अंडा सेल बफर (ईएलबी) LPC शेयर की 1 μl के साथ पूरक जोड़ें। धीरे, भ्रूण धोने भ्रूण ट्यूब के नीचे गिर करने के लिए अनुमति देते हैं, और बफर दूर करने के लिए पलटना। इस धोने कदम दो बार दोहराएँ। </ Li>
  9. ईएलबी के 500 μl प्लस LPC शेयर के 0.5 μl, 19.7 मिमी cycloheximide के 5 μl, और 35.5 मिमी डी cytochalasin के 5 μl में Resuspend भ्रूण (actin polymerization को बाधित करने के लिए)। एक tabletop microcentrifuge में 1 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र।
  10. अतिरिक्त बफर निकालें और एक पैर का उपयोग अच्छी तरह से भ्रूण को कुचलने के लिए। 10,000 XG पर 10 मिनट और 16 डिग्री सेल्सियस के लिए एक झूलते बाल्टी रोटर में अपकेंद्रित्र।
  11. एक 200 μl pipet टिप के साथ शीर्ष से लिपिड परत पंचर। एक स्वच्छ 200 μl pipet टिप के साथ, एक उचित आकार ट्यूब के बीच cytoplasmic एम्बर रंग की परत को हटा दें।
  12. 1/50 के साथ पूरक भ्रूण निकालने 50x ऊर्जा मिश्रण की मात्रा (एक एटीपी उत्थान प्रणाली प्रदान करने के लिए), 1/100 35.5 मिमी cyclohexamide, 1/500 19.7 मिमी डी cytochalasin की मात्रा, और 1/1000 की मात्रा की मात्रा LPC शेयर।
  13. 3.3 में वर्णित के रूप में निकालने में अंतर्जात भ्रूण नाभिक कल्पना करने के लिए एक स्क्वैश तैयार करें।
    नोट: भ्रूण निकालने के साथ जमे हुए किया जा सकता है इस बिंदु पर अंतर्जात नाभिक। अशेष -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज / पिघलना चक्र और दुकान को कम।
  14. भ्रूण निकालने से नाभिक को दूर करने के लिए, ईएलबी के एक बराबर मात्रा 1/50 50x ऊर्जा मिश्रण की मात्रा, 1/100 युक्त निकालने पतला 35.5 मिमी cyclohexamide की मात्रा, 1/500 डी cytochalasin 19.7 मिमी की मात्रा, और 1 / 1,000 LPC शेयर की मात्रा। 16 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 17,000 XG पर एक झूलते बाल्टी रोटर में अपकेंद्रित्र।
  15. शीर्ष पर किसी भी शेष लिपिड से बचने के लिए सावधान किया जा रहा सतह पर तैरनेवाला लीजिए। ट्यूब के नीचे pelleted नाभिक को परेशान मत करो। 3.3 में वर्णित के रूप में सुनिश्चित करने के लिए है कि ज्यादातर नाभिक हटा दिया गया है एक स्क्वैश तैयार करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर निकालने ताजा या विभाज्य और दुकान का प्रयोग करें।
  16. एक थर्मल cycler का उपयोग कर 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस से कम 100 निकालने की μl aliquots - नियंत्रण प्रयोगों, गर्मी 30 के लिए भ्रूण निकालने निष्क्रिय गर्मी। गर्मी निष्क्रिय निकालने कमरे के तापमान का उपयोग करने से पहले करने के लिए वापसी करने की अनुमति दें।
_title "> 5। परमाणु परख और इम्यूनोफ्लोरेसेंस सिकुड़

  1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 1 मिलीलीटर ईएलबी में पूर्व इकट्ठे नाभिक के 150 μl - 25 गिराए द्वारा अंडे निकालने में इकट्ठे नाभिक अलग। एक tabletop microcentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1600 XG पर अपकेंद्रित्र। बफर निकालें, ट्यूब के नीचे नाभिक की नाजुक गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा।
  2. भ्रूण निकालने 5.1 में इस्तेमाल अंडा निकालने की मूल मात्रा के बराबर की मात्रा में नाभिक Resuspend। उपयोग ईएलबी या नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए गर्मी निष्क्रिय निकालने, के रूप में उपयुक्त।
  3. धीरे गोली को तोड़ने और नाभिक resuspend करने के लिए ट्यूब नल। 90 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, धीरे ट्यूब हर 15 मिश्रण करने के लिए दोहन - 30 मिनट। नोट: परमाणु सिकुड़ने से अधिकांश पहले 30 मिनट के भीतर होता है।
  4. एक स्क्वैश तैयार करके परमाणु सिकुड़ने की प्रगति की निगरानी।
    1. Pipet एक गिलास स्लाइड पर निकालने के 2 μl और 2 μl नाभिक तय जोड़ें।
    2. एक 22 मिमी 2 के साथ ओवरले
  5. ट्यूब सिर्फ 15% ग्लिसरॉल 2.6% paraformaldehyde ईएलबी से मिलकर लगानेवाला के 500 μl, और जोड़ने से पहले नाभिक resuspend लिए टैप करें। तुरंत पलटना, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक रोटेटर पर ट्यूब जगह।
  6. दौर नीचे प्लास्टिक सम्मिलित करता है (डिजाइन और अनुरोध पर उपलब्ध schematics) के साथ 15 मिलीलीटर दौर नीचे ग्लास ट्यूब outfitting द्वारा ट्यूबों नीचे स्पिन तैयार करें। परमाणु तकिया बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें। ट्यूब में एक 12 मिमी परिपत्र coverslip गिरा, यकीन है कि यह प्लास्टिक डालने के शीर्ष पर फ्लैट देता जा रहा है।
  7. धीरे समाधान परमाणु तकिया एक विस्तृत बोर pipet टिप का उपयोग कर के शीर्ष पर तय नाभिक युक्त परत। 1,000 XG पर 15 मिनट और 16 डिग्री सेल्सियस के लिए एक झूलते बाल्टी रोटर में अपकेंद्रित्र।
  8. बफर के सभी हटाने और ट्यूब के शीर्ष करने के लिए प्लास्टिक डालने खींचने के लिए एक Aspirator का प्रयोग करें। ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ coverslip निकालें, कवर की तरफ ध्यान दें करने के लिए सावधान किया जा रहापर्ची पर जो नाभिक काता थे। ठंड मेथनॉल में पोस्ट तय आरटी पर 5 मिनट के लिए (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत)।
  9. एक बड़े प्लास्टिक पेट्री डिश अस्तर प्लास्टिक आयल फिल्म के एक पत्रक पर ऊपर coverslip नाभिक पक्ष स्थानांतरण। गीला डिस्पोजेबल पोंछे निर्जलीकरण को रोकने के लिए पकवान के पक्ष के साथ रखें।
  10. 10 सेकंड - के बाद 5 पीबीएस NP40 के 500 μl (1x पीबीएस प्लस 0.1% NP40) और महाप्राण के साथ coverslip पर नाभिक rehydrate।
  11. ध्यान से coverslip पर पीबीएस 3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के 75 μl परत। कमरे के तापमान पर 1 घंटे या रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस ब्लॉक करने के लिए अनुमति दें।
  12. अवरुद्ध समाधान निकालें, और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं (जैसे, परमाणु ताकना परिसर, 1 खिलाफ mAb414: 1,000) कमरे के तापमान पर या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पीबीएस 3% BSA में पतला। पीबीएस NP40 के पांच तत्काल परिवर्तन के साथ धोएं।
  13. आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस 3% BSA में पतला एंटीबॉडी के साथ सेते हैं। पीबीएस NP40 के पांच तत्काल परिवर्तन के साथ धोएं।
  14. सेते10 माइक्रोग्राम के साथ / एमएल Hoechst आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस 3% BSA में पतला। पीबीएस NP40 के साथ पांच बार धोएं। सभी अतिरिक्त बफर निकालें।
  15. 5 μl antifade बढ़ते मध्यम के साथ एक स्लाइड पर coverslip माउंट। स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील। बाद में इमेजिंग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100x उद्देश्यों या दुकान - छवि तुरंत 20 के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग।
    नोट: के रूप में पहले 23 में वर्णित मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करना।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

अंडे निकालने में नाभिक के विधानसभा

इस प्रोटोकॉल का पहला कदम एक्स तैयार कर रहे हैं laevis अंडे निकालने (1 प्रोटोकॉल) और demembranated शुक्राणु नाभिक (प्रोटोकॉल 2)। इन अभिकर्मकों तो नाभिक नए सिरे से (प्रोटोकॉल 3) इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। चित्रा 1 कुछ प्रतिनिधि आंकड़ों से पता चलता। कैल्शियम के अलावा अंतरावस्था में meiotically को गिरफ्तार कर लिया अंडे निकालने ड्राइव, और cycloheximide निकालने अंतरावस्था में गिरफ्तार रहता है। 30 से - प्रतिक्रिया की दीक्षा के बाद 45 मिनट, शुरू में पतली एस के आकार का शुक्राणु नाभिक काउंटर के आकार का क्रोमेटिन जनता में और अधिक मोटा होना करने के लिए शुरू करना चाहिए। एक अक्षुण्ण परमाणु लिफाफा के सफल गठन इस तरह के जीएसटी GFP-एनएलएस (डेटा नहीं दिखाया गया है), या कि पहचानता FG-दोहराने mAb414 का उपयोग कर परमाणु ताकना परिसर के लिए रिम धुंधला द्वारा के रूप में आयात और, एक fluorescently लेबल आयात माल की अवधारण के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है contaiनिंग nucleoporins (चित्रा 1 ए)। बाद परमाणु विधानसभा होता है, परमाणु आकार और गोल हो जाना चाहिए और परमाणु लिफाफा फैलता है और परमाणु प्रोटीन आयात कर रहे हैं (चित्रा 1 बी-सी) परमाणु मात्रा में वृद्धि करनी चाहिए। एक अक्षुण्ण परमाणु लिफाफा या परमाणु विकास के गठन का पालन करने में विफलता एक गरीब गुणवत्ता अंडे निकालने इंगित करता है। इस मामले में, यह अंडे का एक नया बैच के साथ फिर से शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है।

भ्रूण निकालने से अंतर्जात नाभिक का हटाया
अगले कदम के लिए एक देर चरण भ्रूण निकालने (प्रोटोकॉल 4) तैयार करने के लिए है। निकालने और नाभिक के हटाने से पहले की प्रारंभिक तैयारी के बाद, इसे निकालने के एक छोटे से विभाज्य की एक Hoechst से सना हुआ स्क्वैश तैयार करने के लिए सबसे अच्छा है। कई छोटे भ्रूण नाभिक के दृश्य निकालने (2A चित्रा) तैयार करने में सफलता का एक अच्छा संकेत है। अंतर्जात भ्रूण नाभिक नीचे की ओर विश्लेषण करने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैंएस, यह भी कमजोर पड़ने और centrifugation द्वारा नाभिक को हटाने के बाद निकालने के एक विभाज्य जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है। पहले स्क्वैश की तुलना में, बहुत कुछ नाभिक निकालने (चित्रा 2 बी) में छोड़ दिया जाना चाहिए। वहाँ अभी भी कई नाभिक हैं तो मौजूद है, centrifugation के दूसरे दौर के लिए आवश्यक है।

परमाणु सिकुड़ परख
चित्रा 3 परमाणु सिकुड़ परख के लिए प्रतिनिधि परिणाम (प्रोटोकॉल 5) से पता चलता है। अंडे निकालने नाभिक देर चरण भ्रूण निकालने में resuspended समय (चित्रा 3 बी) पर छोटे हो जाते हैं। परख के लिए एक अच्छा नकारात्मक नियंत्रण भ्रूण निकालने कि गर्मी निष्क्रिय (चित्रा 3) के लिए किया गया है साथ नाभिक सेते है। नाभिक गर्मी निष्क्रिय निकालने में असफल हटना करने के लिए के रूप में, यह कुछ विश्वास है कि इलाज भ्रूण निकालने के साथ सिकुड़ परमाणु मनाया आसमाटिक प्रभाव का एक परिणाम नहीं है प्रदान करता है। परमाणु आकार की हदमनाया कटौती अंडे निकालने नाभिक के विशेष बैच के साथ ही भ्रूण निकालने की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। हमारे अनुभव में, परमाणु सिकुड़ने हमेशा मनाया जाता है (उदाहरण के लिए, 40 से अधिक विभिन्न भ्रूण अर्क में) हालांकि यह अलग नाभिक के साथ इन प्रयोगों को कई बार दोहराने के लिए महत्वपूर्ण है और परख के निहित परिवर्तनशीलता को संबोधित करने निकालता है। चित्रा 4 एक योजनाबद्ध दिखाता है पूरे प्रोटोकॉल का।

आकृति 1
चित्रा 1 एक्स में परमाणु विधानसभा टाइम कोर्स laevis अंडे निकालें। नाभिक नए सिरे से एक्स में इकट्ठे हुए थे अंडा निकालने laevis परमाणु ताकना परिसर (एनपीसी) (mAb414) के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में immunofluorescence द्वारा 3. एक ही प्रतिक्रिया से Aliquots तय की और कल्पना थे: > ए) 30 मिनट, बी) 60 मिनट, और सी) परमाणु विधानसभा की दीक्षा के बाद 90 मिनट। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल 5 में वर्णित है पैमाने बार 25 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 एक्स से नाभिक का हटाया भ्रूण निकालने laevis। एक्स ए)) नाभिक को हटाने, और centrifugation द्वारा नाभिक को हटाने के बाद बी से पहले: प्रोटोकॉल 4 में वर्णित के रूप में 12 भ्रूण निकालने के एक छोटे से विभाज्य तय की गई थी और Hoechst के साथ दाग - laevis भ्रूण निकालने मंच से तैयार किया गया था 11.5। पैमाने बार 25 माइक्रोन है।ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि डेटा परमाणु सिकुड़ परख से। नाभिक नए सिरे से एक्स में इकट्ठे हुए थे laevis अंडे निकालने पुनः संयोजक GFP-LB3 के साथ पूरक (परमाणु पटल कल्पना करने के लिए)। प्रोटोकॉल 5 में वर्णित है, अंडा निकालने नाभिक अलग-थलग और मंच में resuspended 11.5 थे - 12 भ्रूण निकालने से अंतर्जात भ्रूण नाभिक हटा दिया गया था। लाइव समय चूक इमेजिंग 90 मिनट के लिए 30 सेकंड के अंतराल पर प्रदर्शन किया गया था। ए) देर चरण भ्रूण निकालने (ली), और बी) गर्मी निष्क्रिय (एचआई) भ्रूण निकालने: चित्रा पैनलों में incubated नाभिक के लिए 6 मिनट के अंतराल पर हासिल कर लिया छवियों को दिखाने के। समय पाठ्यक्रम से छवियाँ आगे बढ़नाबाएं से दाएं। पैमाने पर पट्टी माइक्रोन। 25 सी) के 46 विभिन्न अंडे और भ्रूण के अर्क से परमाणु सिकुड़ डेटा है। बार्स> 240 नाभिक के लिए साधन दिखा। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. परमाणु परख सिकुड़ के योजनाबद्ध। प्रत्येक रंग बॉक्स में प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है। लाल X की तैयारी को इंगित करता है laevis अंडे निकालने (1 प्रोटोकॉल)। ब्लू demembranated एक्स की तैयारी को इंगित करता है laevis शुक्राणु (प्रोटोकॉल 2)। गुलाबी (प्रोटोकॉल 3) अंडा निकालने में नए सिरे से परमाणु विधानसभा इंगित करता है। ग्रीन एक्स की तैयारी को इंगित करता है laevis भ्रूण निकालने (प्रोटोकॉल) 4। बैंगनी इंगित करता है परमाणु रोंhrinking परख प्रोटोकॉल और immunofluorescence (प्रोटोकॉल 5)। यह आंकड़ा 23 के भाग से पुन: उपयोग किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बफर नाम बफर संरचना
मार्क संशोधित Ringers (एमएमआर), 1 / 3x 33 मिमी NaCl, 0.7 मिमी KCl, 0.3 मिमी MgSO 4, 0.7 मिमी 2 CaCl, 1.7 मिमी HEPES, 7.4 पीएच
निकालें बफर (XB), 10x 1 एम KCl, 1 मिमी CaCl 2, 10 मिमी 2 MgCl, 500 मिमी सुक्रोज, 100 मिमी HEPES, पीएच 7.8 (पीएच 10 एन KOH के साथ समायोजित, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत)
बफर बी 4% सिस्टीन 0.8x XB में भंग (ठंड DDH 2 हे, पीएच एक साथ तैयार10 एन NaOH के साथ 7.8 djusted)
बफर सी 100 मीटर 10x XB के मिश्रण ठंडा DDH 2 हे के 900 मिलीलीटर के साथ
बफर डी बफर सी प्लस 5 मिमी EGTA और 800 माइक्रोन के 2 MgCl
LPC शेयर, 1,000x 10 मिलीग्राम / एमएल leupeptin, pepstatin, और chymostatin DMSO में भंग के प्रत्येक (-20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहित)
बफर ई 100 मिलीलीटर बफर डी प्लस 100 μl LPC शेयर
ऊर्जा मिश्रण, 50x 190 मिमी creatine फॉस्फेट Disodium, 25 मिमी एटीपी Disodium नमक, 25 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड
बफर टी 15 मिमी पाइप, 15 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, 7 मिमी 2 MgCl, 80 मिमी KCl, 0.2 एम सुक्रोज, 7.4 पीएच (फिल्टर बाँझ और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत)
बफर एस 20 मिमी माल्टोज और बफर टी में तैयार lysolecithin 0.05%
बफर आर बफर टी प्लस 3% गोजातीयसीरम एल्ब्युमिन
कैल्शियम शेयर समाधान, 20x 10 मिमी 2 CaCl, 0.1 एम KCl, 1 मिमी 2 MgCl (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत)
न्यूक्लियस तय 125 μl 2 एम सुक्रोज, 12.5 μl 1 एम HEPES पीएच 7.9, 250 μl 37% formaldehyde, 112 μl DDH 2 हे, 0.5 μl 10 मिलीग्राम / एमएल Hoechst (अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित)
संशोधित बार्थ खारा (एमबीएस), 10x 880 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl, 50 मिमी HEPES, 25 मिमी 3 NaHCO, पीएच 7.8
उच्च नमक एमबीएस 1x एमबीएस प्लस 0.7 मिमी 2 CaCl और 20 मिमी NaCl
अंडा सेल बफर, ईएलबी 250 मिमी सुक्रोज, 50 मिमी KCl, 2.5 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी HEPES, पीएच 7.8
परमाणु तकिया बफर 1x XB, 0.2 एम सुक्रोज, 25% ग्लिसरॉल (फिल्टर निष्फल और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत)

तालिका 1. बफ़र। इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी buffers की रचनाएं इस तालिका में वर्णित हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. The Macmillan Company. 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143, (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6, (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113, (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122, (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23, (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25, (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24, (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4, (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12, (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18, (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38, (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2, (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124, (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, (1), a019166 (2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206, (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30, (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1, (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98, (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14, (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121, (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189, (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18, (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147, (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10, (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169, (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13, (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22, (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (10), 633 (2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126, (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11, (12), 937-957 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics