A Cell-Free Assay hjelp

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Et grunnleggende spørsmål i cellebiologi er hvordan celler og organelle størrelser er regulert. Det har lenge vært kjent at størrelsen av kjernen som regel øker med størrelsen av cellen, særlig i løpet av embryogenesen når dramatiske reduksjoner i både cellen og atomstørrelser forekommer. Mekanismer av kjernefysisk størrelse regulering er i stor grad ukjent og kan være relevant for kreft der endrede kjernefysisk størrelse er en viktig diagnostisk og prognostisk parameter. In vivo tilnærminger til å identifisere kjernefysiske størrelse regulatorer kompliseres av den essensielle og komplekse natur av kjernefysisk funksjon. Den in vitro-metode som er beskrevet her for å studere kjernefysisk størrelse kontroll dro fordel av de normale reduksjon av kjernestørrelse som forekommer i løpet av Xenopus laevis utvikling. For det første er kjerner montert i X. laevis egg ekstrakt. Deretter blir disse kjerner isoleres og resuspendert i cytoplasma fra sent stadium embryoer. Etter en 30-90 minutters inkubasjonsperiode, kjerneoverflatearealreduseres med 20 - 60%, noe som gir en nyttig analyse for å identifisere cytoplasmiske komponenter som er tilstede i sent stadium embryoer som bidrar til utviklingskjernefysisk størrelse skalering. En stor fordel med denne løsning er den relative innretningen med hvilken egg og embryoekstrakter kan biokjemisk manipuleres, slik at for identifisering av nye proteiner og aktiviteter som regulerer kjernefysisk størrelse. Som med en hvilken som helst in vitro-metode, er validering av resultatet i et in vivo system viktig, og mikroinjeksjon av X. laevis embryoer er spesielt egnet for disse studiene.

Introduction

Størrelsene på cellulære organ typisk skaleres med størrelsen av cellen, og dette har blitt kanskje best dokumentert for skalering av kjernefysisk størrelse med cellestørrelse 1-10. Dette er spesielt sant i løpet av embryogenesen og celledifferensiering, når dramatiske reduksjoner i både celle- og kjernefysisk størrelse er ofte observert 11,12. Videre er endret atom størrelse en viktig parameter i kreft diagnose og prognose 13-17. Mekanismer som bidrar til kjernefysisk størrelse regulering er i stor grad ukjent, delvis på grunn av kompleksiteten og essensielle natur av kjernefysisk struktur og funksjon. Metoden som beskrives her ble utviklet som en in vitro-analyse for kjernefysisk størrelse skalering som er mottagelig for biokjemisk manipulering og belysning av mekanismer for kjernefysisk størrelse regulering.

Xenopus laevis egg ekstrakt er et veletablert system for å rekapitulere og studere komplekse cellulære prosesser i en in vitro 18-22. En viktig fordel for å ekstraktet systemet er at X. laevis egg ekstrakter representerer en nesten ufortynnet cytoplasma hvis sammensetning kan enkelt endres, for eksempel ved tilsetning av rekombinante proteiner eller immunodepletion. Videre er man i stand til å manipulere avgjørende prosesser ved anvendelse av behandlinger som ellers ville være dødelig i en in vivo sammenheng. Modifikasjoner av egg ekstrakt prosedyren tillater isolering av utdrag fra X. laevis embryoer i stedet for egg og disse embryo ekstrakter er like mottagelig for biokjemisk manipulering 23. Under X. laevis utvikling, encellede befruktet embryo (~ 1 mm diameter) gjennomgår en serie på tolv raske celledelinger (trinn 1-8) for å generere flere tusen 50 μm diameter og mindre celler, og nådde et utviklingsstadium kalt midblastula overgang (MBT) eller scene 24 til 26 august. MBT er preget av utbruddet av zygotiske transkripsjon, cellemigrasjon, asynkrone celledelinger, oppkjøp av gap faser, og etablering av kjernefysiske steady-state størrelser i stedet for kontinuerlig kjernefysiske ekspansjon som i pre-MBT embryo. Fra trinn 4 for å gastrulation (stadier 10,5 til 12), volumet av de enkelte kjerner reduseres med mer enn 10 ganger 11.

Her er målet å identifisere mekanismene som er ansvarlig for disse reduksjonene i kjernefysisk størrelse i løpet av utviklings progresjon. Tilnærmingen er å først montere kjerner i X. laevis egg ekstrakt og å isolere disse kjerner fra egg cytoplasma / avtrekk. Disse kjerner blir deretter resuspendert i cytoplasma fra sent gastrulastadiet embryoer. Etter en inkubasjonsperiode, kjernene fra egg ekstrakt blir mindre i sent stadium embryo ekstrakt. Vi tenkte at dette noen kilo for tungd være en nyttig analyse for identifisering av cytoplasmatiske komponenter som er tilstede i sent stadium embryoer som bidrar til utviklingskjernefysisk størrelse skalering. Ved hjelp av denne analysen, sammen med in vivo validering, demonstrerte vi at protein kinase C (PKC) bidrar til utviklingsmessige reduksjon av kjernestørrelse i X. laevis 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Xenopus prosedyrer og undersøkelser ble gjennomført i samsvar med NRC Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr åttende utgaven. Protokoller ble godkjent av University of Wyoming Institutional Animal Care og bruk Committee (Assurance # A-3216-01).

1. Fremstilling av X. laevis Egg Extract (tilpasset fra 27,28)

  1. Prime kvinnelige X. laevis frosker minimum tre dager, og maksimalt to uker før egg samling med en enkel 100 IU injeksjon av gravide mare serum gonadotropin (PMSG).
  2. En dag før eksperimentet, injisere grunnede frosker med 800 IE humant choriongonadotropin (HCG) og sted ved 16 ° C i 1 L per frosk på 1 / 3x Marcs modifiserte ringers (MMR). Se tabell 1 for alle bufferblandinger.
    Merk: Noen frosker vil ikke legge egg eller vil legge dårlig kvalitet egg. Vanligvis 2 - 3 frosker injiseres for å sikre minst en frosk vil legge sufficient antall god kvalitet egg. Den gjennomsnittlige frosk legger nok egg til å produsere minst 1 ml av egg ekstrakt.
  3. Fremstille en L 1 / 3x MMR med kaldt destillert deionisert vann (DDH 2 O), 500 ml buffer B, en L buffer C, 500 ml buffer D, og 100 ml buffer E.
  4. Overføring lagt egg i et glass krystalliseringsskål (150 x 75 mm). Ved hjelp av en plast Pasteur pipette med spissen avskåret, gården ut hvite puffy aktivert egg eller lysert egg. beholde bare egg med forskjellige og like mørkt dyr stolper og hvite vegetal stolper.
  5. Fremstille 13 x 51 mm sentrifugerør med 1 ml Buffer E supplert med 355 pM cytokalasin D tilsatt like før bruk i trinn 1,7.
  6. Dejelly og vaske egg.
    1. Vask egg kort med kaldt 1 / 3x MMR i en passe stor beger, endre buffer 3 - 4 ganger.
    2. Fjern gelé strøk fra eggene ved inkubasjon med buffer B. Dette vil ta alt fra 3 - 10 min. Som skyet gelé strøk er gitt ut fra eggs, endrer buffer.
      Merk: Dejellying er ferdig når eggene vises tett pakket i hjørnet av fatet når vippes og vegetal stolper er orientert nedover. Egg er mye mer sårbar etter dejellying, så ikke ruge egg med Buffer B lenger enn nødvendig og etterfølgende vasker må utføres svært nøye.
    3. Vask egg kort med 3 - 4 endringer av buffer C.
    4. Vask egg kort med 2 endringer av buffer D.
    5. Vask egg kort med 2 endringer av buffer E.
  7. Fyll sentrifugerør med egg med et bredt boring glass pipette eller plast dropper. Sug av overflødig buffer. Å pakke eggene og fjerne så mye buffer som mulig, sentrifuger i svingende bucket rotor ved 212 xg i 60 sekunder og deretter ved 478 xg i 30 sek. Sug av overflødig buffer.
    Merk: Det er viktig å fjerne så mye overflødig buffer som mulig på dette trinnet for å sikre egget ekstrakt er minimalt utvannet.
  8. I en svingende bucket rotor, ultrasentrifuge under vakuum i 15 minutter ved 12000 xg og 4 ° C for å knuse egg åpen og separere i forskjellige lag, med cytoplasma blir rav-farget lag i midten. Fjern sentrifugerør og sted umiddelbart på is.
  9. Samle ekstrakten.
    1. Ved anvendelse av en 18 gauge nål og sprøyte, punktering sentrifugerøret like over det mørke pigmentlakksjikt på bunnen av røret og fjern den midterste rav-farget cytoplasmisk lag. Ikke samle noen av de beste lipid laget. Samle cytoplasma i en riktig størrelse tube.
      Merk: Vanligvis produserer en frosk minst 1 ml ekstrakt.
    2. Supplement cytoplasma med 1/1000 volumet av 19,7 mM cytokalasin D, 1/1000 volumet av LPC lager, og 1/50 volum av 50x energiblanding. Snu forsiktig røret for å blande. Ikke overdrevent pipettér ekstraktet.
    3. Hold ekstrakt på is og bruke den innen tre timer med forberedelse for best resultat.
_title "> 2. Utarbeidelse av Demembranated X. laevis Sperm (tilpasset fra 29)

Merk: Fremgangsmåten volumene som presenteres her er for opptil 8 testiklene.

  1. Fjern 0,05% benzokain (10% benzokain lager fremstilt i etanol og fortynnet til 0,05% i frosk tank vann) fra 4 ° C og oppvarm til romtemperatur. Anesthetize og ofre mannlig X. laevis frosker i benzokain oppløsningen ved værelsestemperatur i 20 - 30 For min. Sikre død ved fravær av hjerteslag ved å undersøke og føler brystkassen, ved manglende respons på mekanisk stimulering, og / eller ved halshogging.
  2. Foreta en U-formet snitt langs buken. Fjern tubulated massen av gule fett organer. På toppen av nyrene, finn testiklene, som er oval blek rosa massene om 1 cm i lengde 29. Skjære testiklene og rull dem på trekkpapir for å fjerne blod og annet vev.
  3. Vask testiklene i buffer T. Bruk et stramt montert støter for å hakke testiklene med 1 ml bufferT i et 1,5 ml rør inntil den var homogen (10 drag eller mer). Sentrifuger 5 - 10 sekunder i en mini-sentrifuge og samle supernatanten, fjerning av store stykker av vev. Gjenta sentrifugeringen en gang til og samle supernatanten.
  4. Overfør sperm-inneholdende oppløsning i et 15 ml plastrør. Øke volumet til et total på 2 ml med buffer T. Sentrifuger ved 1411 xg i 10 min ved 16 ° C for å pelletere sperm.
  5. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 500 pl buffer T. Sentrifuger ved 1411 xg i 10 min ved 16 ° C. Gjenta dette trinnet en eller to ganger som nødvendig for å rense pellet av somatiske og røde blodceller.
  6. Resuspender pelleten i 100 pl buffer T og 300 ul buffer S. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
    Merk: Buffer S inneholder lysolecitin, som er ansvarlig for demembranation.
  7. Legg tre bind av buffer R (forberedt frisk før bruk). Vend røret nøyaktig en gang. Sentrifuger ved 1411 xg i 15 min ved 16 &# 176; C.
  8. Resuspender pelleten i 400 pl buffer R og deretter legge til en ekstra 2 ml Buffer R. Sentrifuger ved 1411 xg i 15 min ved 16 ° C.
  9. Resuspender pelleten i 50 ul buffer T.
  10. Fortynn 1 mL demembranated sperm atomkjerner med 9 mL buffer T. Bruk denne fortynning til en hemocytometer. Tell antall tynne S-formet sperm kjerner i en stor 4 x 4 rutenett, og multiplisere dette tallet med 100 for å få konsentrasjonen av bestanden i sperm kjerner per mL.
  11. Fortynn aksjen til 100.000 sperm kjerner per ml med buffer T, noe som resulterer i en 200x lager. Forbered 3 - 5 pl prøver. Flash fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C.

3. Nuclear Assembly

  1. Supplement 100 ul egg ekstrakt med 1,5 ul 35,5 mM cykloheksimid (sluttkonsentrasjon 0,5 mM ~), 6 pl 20x kalsium-stamoppløsning (sluttkonsentrasjon ~ 0,6 mM), og 0,7 ul 200x sædceller (endelig konsentrasjon ~ 700sperm kjerner / mikroliter). Scale reaksjonen volumet opp eller ned etter behov. Snu eller banke forsiktig å blande.
    Merk: Utdrag syklet fra meta til inter gir en mer robust og pålitelig plattform for atom montering.
  2. Inkuber i et vannbad ved 16-20 ° C i 90 min. Bland ved å banke hver 15 minutter for å sikre kjerner forbli suspendert i ekstraktet.
  3. Følge utviklingen av atomenheten i 45 min ved å forberede en squash som følger.
    1. Pipet 2 mL av ekstrakt mot en glassplate og tilsett 2 mL kjernen fix.
    2. Overlegg med en 22 mm 2 dekkglass. Bilde på en epifluorescens mikroskop under anvendelse av vann, olje eller luft 20 - 100X mål og en DAPI filter.
      Merk: Kjerner kan visualiseres ved lyse-feltet avbildning, men er mye lettere å visualisere ved fluorescens.
    3. Bruk atomkjerner umiddelbart eller flash fryse porsjoner i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C.
      Note: Legge til 4% glycerol til kjerner prior til frysing kan bidra til å opprettholde sin integritet. Frosne kjerner er generelt fortsatt levedyktig og i stand til kjernekraft import, men frysing prosessen kan føre til forstyrret eller mer strukturelt skjøre kjerner. Kjerner opp til et år etter frysing kan anvendes.

4. Fremstilling av X. laevis Embryo Extract

  1. Fremkall kvinnelige X. laevis frosker å legge egg som beskrevet i 1.1 og 1.2.
  2. Isoler testiklene fra hann X. laevis frosker som beskrevet i 2.2. Senk testikler i L15 media supplert med 50 IE / ml penicillin og streptomycin i et glass 35 x 10 mm petriskål. Oppbevar ved 4 ° C i opptil to uker.
  3. Samle og befrukte egg.
    1. Samle ferske lagt egg ved å holde frosker over et glass gjenbrukpetriskål og fremme egglegging ved å trykke lett på korsryggen nær Cloaca. Klemme frosken for hardt kan føre til skader, noe som fører til en oppblåst mage og requiring dødshjelp 29.
    2. Prop fatet på en omtrentlig 45 ° vinkel, la egg for å samle seg i kanten av fatet, fjerne all overflødig buffer, og legger nok en / 3x MMR til knapt dekke eggene. Gjødsle egg i løpet av 15 minutter etter prøvetaking.
    3. Bruk en tett montert støter for å macerate og homogen 1/4 av en testikkel i en 1,5 ml tube med 500 mL av høy salt Modified Barths Saline (høyt salt MBS). Legg macerated testiklene til eggene og gi rom for befruktning å skje ved romtemperatur i 15 - 20 min, deretter oversvømme egg med 1 / 3x MMR.
      Merk: Effektiviteten av testiklene avtar med lagringstiden, derfor mer testiklene vev kan være nødvendig for en vellykket befruktning ved bruk av testikler som har vært lagret i mer enn én uke.
    4. Bekrefte befruktning ved å se etter sammentrekning av det mørke pigmenterte animalske pol og ved rotasjon av embryoene med sine dyr poler vendt opp, vanligvis i 20 - 30 minutter etter tilsetning av knust testes. Forvent den første cellen cleavage å skje i løpet av 90 min.
    5. Ved hjelp av en bred boring glass pipette flittig fjerne død (hvit og puffy eller ujevn fordeling av eggeplomme og pigment), lysert, eller ubefruktede egg (dvs. ikke kløyvet), så vil de raskt indusere død i nabo embryoer.
    6. Hvor som helst 1 til 2,5 timer etter befruktning, dejelly embryoene i 2 - 3% cystein ble oppløst i 1/3 x MMR og justert til pH 7,9 med 10 N KOH. Utfør to buffer endringer som er hver 3-4 min. vask grundig embryoene med 6 - 10 kortvarige forandringer av 1 / 3x MMR for å fjerne alle spor av cystein.
      Merk: Dejellied embryo har en vitelline membran og er ikke så skjør som dejellied egg.
  4. Ved hjelp av en bred utboring glass pipette, overføres friske befruktede (dvs. spaltes) embryo til en petriskål inneholdende fersk 1 / 3x MMR og tillate dem å utvikle seg til det ønskede stadium ved romtemperatur eller, hvis langsommere utvikling er foretrukket, 16 ° C. Fortsett å fjerne døde eller lysed embryoer indikert av mangel på første divisjon eller hvit puffy utseende.
  5. Kontroller scenen av embryoene ved å se etter nesten fullstendig lukking av blastopore og ved å sammenligne med tegninger av iscenesatt embryoer som er tilgjengelige i referansemateriale 24.
    Merk: Embryoet dyrket ved 16 ° C vil nå scenen 11,5 til 12 i ca 12 timer.
  6. Inkuber stadium 11.5 - 12 embryoene i frisk 1 / 3x MMR supplert med 0,5 mM cykloheksimid i 1 time ved romtemperatur, for å arrestere embryoer i slutten av interfase.
  7. Overfør med vid boring glass eller plast pipette minst 15 (fortrinnsvis 30 eller mer) interfase-arrestert embryoer til et mikrosentrifugerør.
    Merk: 15 embryoer er tilstrekkelig til å gi omtrent 20 pl ekstrakt. Skalere opp etter behov.
  8. Tilsett 1 ml egg lyseringsbuffer (ELB) supplert med 1 mL av LPC lager. Snu forsiktig for å vaske embryoer, tillate embryoer for å falle til bunnen av røret, og fjerne bufferen. Gjenta dette vasketrinn to ganger til. </ Li>
  9. Resuspender embryoer i 500 mL av ELB pluss 0,5 mL av LPC lager, 5 mL av 19,7 mM cycloheximide, og 5 pl 35,5 mM cytokalasin D (for å hemme aktin polymerisasjon). Sentrifuger ved 200 xg i 1 min i en bordmikrosentrifuge.
  10. Fjern overflødig buffer og bruke en stampe til grundig knuse embryoer. Sentrifuge i en svingende spannrotor i 10 minutter ved 10000 xg og 16 ° C.
  11. Punkter lipid lag fra toppen med en 200 mL pipette tips. Med en ren 200 mL pipette tips, fjern den midterste cytoplasma rav-farget lag til en passende størrelse tube.
  12. Supplement embryo ekstrakt med 1/50 volum av 50x energiblanding (for å tilveiebringe et ATP-regenerering system), 1/100 volum av 35,5 mM cykloheksamid, 1/500 volum av 19,7 mM cytokalasin D, og ​​1/1000 volumet LPC lager.
  13. Forbered en squash som beskrevet i 3.3 til å visualisere endogene embryonale kjerner i ekstraktet.
    Merk: Embryo ekstrakt kan fryses med endogene kjerner på dette punktet. Delmengde å redusere fryse / tine sykluser og oppbevares ved -80 ° C.
  14. For å fjerne kjerner fra embryo ekstrakt, fortynne ekstrakten med et like stort volum ELB inneholdende 1/50 volum av 50x energiblanding, 1/100 volum av 35,5 mM cykloheksamid, 1/500 volum av 19,7 mM cytokalasin D, og 1/1000 volumet av LPC lager. Sentrifuge i en svingende spannrotor ved 17.000 xg i 15 min ved 16 ° C.
  15. Samle supernatanten er forsiktig med å unngå eventuelle gjenværende lipid på toppen. Ikke forstyrre de pelleterte kjerner i bunnen av røret. Forbered en squash som beskrevet i 3.3 for å sikre at de fleste atomkjerner har blitt fjernet. Bruk ekstrakt fersk eller delmengde og oppbevares ved -80 ° C.
  16. For å varme inaktivere embryoekstrakt for kontrollforsøk, varme 30 - 100 ul porsjoner av ekstrakt ved 56 ° C i 30 minutter ved hjelp av en termosykler. Tillate varme-inaktivert ekstrakt for å vende tilbake til romtemperatur før bruk.
_title "> 5. Nuclear Shrinking analysen og immunfluorescens

  1. Isoler kjerner samlet i egg ekstrakt ved å fortynne 25 - 150 mL av ferdigmontert kjerner i en ml ELB i en 1,5 ml tube. Sentrifuger ved 1600 x g i 3 min ved 4 ° C i en bordmikrosentrifuge. Fjern-buffer, være forsiktig for ikke å forstyrre den skjøre pellet av kjerner i bunnen av røret.
  2. Resuspender atomkjerner i et volum på embryoekstrakt lik det opprinnelige volum av egg ekstrakt brukes i 5.1. Bruk ELB eller varme inaktivert ekstrakt for kontroll reaksjoner, som passer.
  3. Forsiktig på røret for å bryte opp pellet og resuspender kjerner. Inkuber ved romtemperatur i 90 min, å banke lett på røret for å blande hver 15-30 min. Merk: De fleste av atom krympende skjer innen de første 30 min.
  4. Følge utviklingen av atom krymper ved å forberede en squash.
    1. Pipet 2 mL av ekstrakt mot en glassplate og tilsett 2 mL kjernen fix.
    2. Overlegg med en 22 mm 2
  5. Trykk på røret for å resuspendere kjerner like før legge 500 mL av fiksativ bestående av ELB, 15% glyserol og 2,6% paraformaldehyde. Invertere umiddelbart, og plassere røret på en rotator i 15 minutter ved romtemperatur.
  6. Forbered spinne ned rør ved utrustnings 15 ml rund bunn glassrør med runde bunnen plastinnsatser (utforming og skjemaer tilgjengelig på forespørsel). Tilsett 5 ml av atom pute buffer. Drop en 12 mm rund dekk inn i røret, som er sikker på at det ligger flatt på toppen av plastinnsats.
  7. Forsiktig lag løsningen inneholder faste kjerner på toppen av den kjernefysiske pute ved hjelp av en vid boring pipette tips. Sentrifuge i en svingende spannrotor i 15 minutter ved 1000 x g og 16 ° C.
  8. Bruk en vifte for å fjerne alt av buffer og dra i plastinnsats til toppen av røret. Fjern dekkglass med et par fine tang, er forsiktig med å merke på siden av dekseletgli på hvilken kjernen ble spunnet. Post-fix i kald metanol (lagret ved -20 ° C) i 5 min ved RT.
  9. Overfør dekk kjernen siden opp på et ark av plast parafin film fôr en stor plast petriskål. Plasser våte engangskluter langs siden av fatet for å unngå dehydrering.
  10. Rehydrere kjerner på dekkglass med 500 mL PBS-NP40 (1x PBS pluss 0,1% NP40) og aspirer etter 5-10 sek.
  11. Nøye lag 75 ul av PBS-3% bovint serumalbumin (BSA) på dekkglass. Tillat å blokkere 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
  12. Fjern blokkeringsløsning og inkuber med primært antistoff (f.eks mAb414 mot kjernefysiske pore-kompleks, 1: 1000) fortynnet i PBS-3% BSA i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C. Vask med fem umiddelbare endringer av PBS-NP40.
  13. Inkuber med sekundært antistoff fortynnet i PBS-3% BSA i 1 time ved RT. Vask med fem umiddelbare endringer av PBS-NP40.
  14. Inkubermed 10 ug / ml Hoechst fortynnet i PBS-3% BSA i 5 min ved RT. Vask fem ganger med PBS-NP40. Fjern alt overflødig buffer.
  15. Monter dekkglass på et lysbilde med 5 pl antifade monteringsmedium. Tett med klar neglelakk. Bilde umiddelbart med en epifluorescence mikroskop med 20 - 100x mål eller oppbevares ved 4 ° C for senere bildebehandling.
    Merk: Utfør kvantifisering som tidligere beskrevet 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Montering av Nuclei i Egg Extract

De første trinnene i denne protokollen er å forberede X. laevis egg ekstrakt (protokoll 1) og demembranated sperm kjerner (protokoll 2). Disse reagensene blir så brukt til å montere kjerner de novo (protokoll 3). Figur 1 viser noen representative data. Tilsetting av kalsium driver meiotically arrestert egg ekstrakt i inter, og cycloheximide holder ekstrakt arrestert i interfase. Ved 30 - 45 minutter etter initiering av reaksjonen, bør innledningsvis tynne S-formet spermie kjerner begynner å tykne inn i snegleformede kromatin massene. Vellykket dannelse av et intakt kjerne konvolutt kan vurderes ved innførsel og oppbevaring av et fluorescensmerket import last, slik som GST-GFP-NLS (data ikke vist), eller ved rim farging for den kjernefysiske pore-komplekset ved hjelp av mAb414 som gjenkjenner FG-repeat containing nucleoporins (figur 1A). Etter atom montering skjer, bør kjernefysisk form blir mer avrundet og atom volumet bør øke etter hvert som den kjernefysiske konvolutten utvides og nukleære proteiner importeres (Figur 1B-C). Unnlatelse av å observere dannelsen av en intakt kjernefysisk konvolutt eller kjernekraft vekst indikerer en dårlig kvalitet egg ekstrakt. I dette tilfellet er det best å starte på nytt med en ny gruppe med egg.

Fjerning av Endogen Nuclei fra Embryo Extract
Det neste trinnet er å forberede et sent stadium embryo ekstrakt (protokoll 4). Etter innledende fremstilling av ekstraktet og før fjerning av kjerner, er det best å fremstille en Hoechst-farget squash av en liten alikvot av ekstraktet. Visualisering av mange små embryonale kjerner er en god indikasjon på suksess ved fremstilling av ekstrakt (figur 2A). Som endogene embryonale kjerner kan forstyrre nedstrøms analyseverktøs, er det også viktig å kontrollere en alikvot av ekstraktet etter fjerning av kjerner ved fortynning og sentrifugering. Sammenlignet med den første squash, bør svært få kjerner bli stående i ekstraktet (figur 2B). Hvis det fremdeles er mange atomkjerner til stede, er en andre runde med sentrifugering er nødvendig.

Nuclear Shrinking analyse
Figur 3 viser representative resultater for atom krympende analysen (protokoll 5). Egg ekstrakt kjerner resuspendert i sent stadium embryo ekstrakt blir mindre over tid (figur 3B). En god negativ kontroll for analysen er å inkubere atomkjerner med embryoekstrakt som har blitt varmeinaktivert (figur 3A). Som kjerner klarer å krympe i varme inaktivert ekstrakt, gir dette noen tillit som ble observert atom krymper med ubehandlet embryo ekstrakt er ikke en konsekvens av osmotiske effekter. Omfanget av kjernefysisk størrelsereduksjonene ble observert varierer avhengig av den spesielle gruppe av egg ekstrakt kjerner, så vel som kvaliteten av embryoet ekstrakt. I vår erfaring, er kjernekraft krymper alltid observert (for eksempel i mer enn 40 forskjellige embryo utdrag), men det er viktig å gjenta disse forsøkene flere ganger med ulike kjerner og trekker ut for å ta den iboende variasjonen i analysen. Figur 4 viser en skjematisk av hele protokollen.

Figur 1
Figur 1. Nuclear Assembly Tid Kurs i X. laevis Egg Extract. Kjerner ble satt sammen de novo i X. laevis egg ekstrakt som beskrevet i protokoll 3. Aliquoter fra samme reaksjon ble fiksert og visualisert ved immunfluorescens ved å bruke et antistoff mot det nukleære porer kompleks (NPC) (mAb414) hos: > A) 30 min, B) 60 min, og C), 90 min etter igangsettingen av kjernesammenstillingen. Den immunfluorescens protokollen er beskrevet i protokoll 5. Målestokk er 25 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Fjerning av Nuclei fra X. laevis Embryo Extract. X. laevis embryoekstrakt ble fremstilt fra trinn 11.5 - 12 embryoer, som beskrevet i protokoll 4. En liten alikvot av ekstraktet ble fiksert og farget med Hoechst: A) forut for fjerning av kjerner, og b) etter fjerning av kjernene ved sentrifugering. Målestokken er 25 mikrometer.om / filer / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. representative data fra Nuclear Shrinking analysen. Kjerner ble satt sammen de novo i X. laevis egg ekstrakt supplert med rekombinant GFP-LB3 (for å visualisere atom lamina). Som beskrevet i protokoll 5, ble egg ekstrakt kjerner isoleres og resuspendert i trinn 11,5 til 12 embryo ekstrakt hvorfra endogene embryonale kjerner hadde blitt fjernet. Live-time-lapse bildebehandling ble utført ved 30 sek intervaller i 90 min. Figur panelene viser bilder ervervet ved 6 minutters intervaller for atomkjerner ruges i: A) sent stadium embryo ekstrakt (LEE), og B) varme inaktivert (HI) embryo ekstrakt. Bilder fra den gang kursene fortsettefra venstre mot høyre. Målestokken er 25 mikrometer. C) Kjernefysiske krympende data fra 46 forskjellige egg og embryo ekstrakter. Linjer viser innretningen for å> 240 kjerner. Feilfelt er standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Skjematisk av Nuclear Krympende analysen. Hver farget boks representerer en protokoll. Rødt indikerer utarbeidelse av X. laevis egg ekstrakt (protokoll 1). Blå indikerer utarbeidelse av demembranated X. laevis sperm (protokoll 2). Pink viser de novo atom montering i egg ekstrakt (protokoll 3). Grønn indikerer utarbeidelse av X. laevis embryo ekstrakt (protokoll 4). Lilla indikerer atom shrinking analyseprotokollen og immunfluorescens (protokoll 5). Deler av dette tallet har blitt gjenbrukt fra 23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

buffer navn buffer sammensetning
Marc modifiserte Ringers (MMR), 1 / 3x 33 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,3 mM MgSO4, 0,7 mM CaCl2, 1,7 mM HEPES, pH 7.4
Extract buffer (XB), 10x 1 M KCl, 1 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 500 mM sukrose, 100 mM HEPES, pH 7,8 (pH justert med 10 N KOH, lagret ved 4 ° C)
buffer B 4% Cysteine ​​oppløst i 0,8x XB (tilberedt med kaldt DDH 2 O, pH endjusted til 7,8 med 10 N NaOH)
buffer C Bland 100 m 10x XB med 900 ml kaldt DDH 2 O
buffer D Buffer C pluss 5 mM EGTA og 800 mikrometer MgCl2
LPC lager, 1,000x 10 mg / ml hver av leupeptin, pepstatin og chymostatin oppløst i DMSO (lagret i alikvoter ved -20 ° C)
buffer E 100 ml buffer D pluss 100 ul LPC lager
Energimiks, 50x 190 mM kreatinfosfat dinatrium, 25 mM ATP-dinatriumsalt, 25 mM magnesiumklorid
buffer T 15 mm rør, 15 mM NaCl, 5 mM EDTA, 7 mM MgCl2, 80 mM KCl, 0,2 M sukrose, pH 7,4 (filter sterilisere og lagret ved 4 ° C)
buffer S 20 mM maltose og 0,05% Lysolecithin utarbeidet i Buffer T
buffer R Buffer T pluss 3% storfeserumalbumin
Kalsium stamløsning, 20x 10 mM CaCl2, 0,1 M KCI, 1 mM MgCl2 (lagret ved -20 ° C)
Nucleus fix 125 ul 2 M sukrose, 12,5 pl 1 M HEPES pH 7,9, 250 ul 37% formaldehyd, 112 ul DDH 2 O, 0,5 ul 10 mg / ml Hoechst (lagret ved romtemperatur i opptil to uker)
Modifisert Barth Saline (MBS), 10x 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 50 mM HEPES, 25 mM NaHCO3, pH 7,8
Høye Salt MBS 1x MBS pluss 0,7 mM CaCl2 og 20 mM NaCl
Egg lysis buffer, ELB 250 mM sukrose, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,8
Nuclear pute buffer 1x XB, 0,2 M sukrose, 25% glycerol (filtersterilisert og lagret ved 4 ° C)

Tabell 1. buffere. Komposisjoner av alle buffere som er nevnt i denne protokollen er beskrevet i denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. The Macmillan Company. 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143, (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6, (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113, (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122, (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23, (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25, (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24, (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4, (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12, (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18, (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38, (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2, (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124, (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, (1), a019166 (2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206, (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30, (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1, (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98, (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14, (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121, (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189, (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18, (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147, (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10, (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169, (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13, (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22, (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (10), 633 (2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126, (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11, (12), 937-957 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics