Author Produced

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Developmental Biology
 

Summary

בזאת אנו מתארים שיטות לנתיחה של רקמות יולדות ועובר מן שלית מונח אנושית, ואחריו בידוד והרחבת גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) מרקמות אלה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue. J. Vis. Exp. (112), e54204, doi:10.3791/54204 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) הם מתעוררים כמועמד מבטיח לשימוש טיפולים מבוססי תאים 1. רוב היישומים נראה כי הן מיועדות לתקן רקמות MSC בתיווך או תקנה החיסונית 2. בשנת רבים של יישומים אלה, אלוגנאית MSC יכול להיות יעיל כמו עצמיים MSC 3. השימוש MSC אלוגנאית יש את היתרון הכלכלי של להיות תואם עם ייצור בקנה מידה גדול של מנות תאים מרובים ממקור יחיד רקמות 4 לטפל בחולים רבים.

מבחינה הסטורית, פרה-קליניים ומחקרים קליניים מנוצלים MSC-נגזר מח העצם 4. מוח העצם נאסף בדרך כלל מפסגת הכסל של תורם מתנדב. תהליך זה הוא פולשני, ורק נפח קטן של מח (~ 20 מ"ל) נאסף באמצעות ניקור יחיד. יצירת מספרים בעלי משמעות קלינית של MSC דורש נרחב הרחבה חוץ גופית. עצמה ניידת יורדת עם מספר מעבר '4), אשר ניתן לקצור בסביבה נקיה מחיידקים במהלך ניתוח קיסרי ללא סיכון לתורם. יש MSC נגזר שליה לטווח ארוך התפשטות 5 ו אימונו-קיבולת 6, תנעל MSC מח נגזרות עצם. במחקר קודם, הראינו כי שליה מונחת בודדת כלולה MSC מספיק לייצור של עד 7,000 מנות קליניות 4. תכונות אלו הופכות את שלית רקמת מקור אידיאלית לייצור MSC אלוגנאית.

השליה היא איבר fetomaternal מורכב משני הרקמות יולדות ועובר 7, ובכך MSC ממוצא עוברי או אימהי יכול להיות, באופן תיאורטי, מבודד. האזכורים הבאים מספקים דהמידע זנב על התפתחות ופתולוגיה, כמו גם בדיקה מיקרוסקופית ואת מקרוסקופית של השליה האנושית adnexa 8,9. השליה נכונה מורכבת בעיקר של כלי הדם של העובר ואת הפרשה ותאים תומכים בשם trophoblasts, מה שהופך את villi כוריוני מכוסה סיסית frondosum (צלחת) 8. Villi השליה מסועף שטופים בדם האם נמסר מן העורקים ספירלה הרחם, מה שמאפשר מזין, הורמון חילוף הגזים בין העובר לאם. השליה מעוגנת האנדומטריום באמצעות תאי סטרומה decidual אימהיים trophoblasts extravillious העוברי משובצים ב מטריקס 8. Villi להתכנס לצלחת כוריוני העובר שם הם יוצרים את חבל הטבור 8.

פועל יוצא של הסדנה הבינלאומית הראשונה על תאי גזע שמקורם השליה (2008) נרשם ייסוף של צורך לתקנן את הבידוד characterization של התאים מפני השליה מונח אנושי 10. בגלל האנטומיה של השליה, דיסקציה של הרקמות השונות, בידוד של MSC ותוצאות התרבות הצפויה יכולים להיות מכריעים עבור עולים חדשים בתחום. בפרוטוקול זה, הקציר של רקמות שליה שליה, ואחריו בידוד MSC והרחבת הוא מפורט היטב. אפיון MSC באמצעות זרימת cytometry וב בידול במבחנה נחשב שגרת 5,11-13, ובכך רק בקצרה מפורט כאן.

מודגש כמו סקירת ספרות שיטתית אחרונה 14, MSC המתקבל villi כוריוני השליה הם הניחו בדרך כלל להיות עובריים. אמנם, רק 18% מהמחקרים בחנו את מקורו של MSC שהושג, ושל אלה, רק חצי מהמחקרים דיווחו MSC העובר ואת החצי השני דיווח אוכלוסיות MSC אימהיות או מעורבות. כל אחד שלושת המרכיבים רקמות כפי שיתואר בהמשך (villi כוריוני, basalis צלחת decidua כוריוני) הם composed בעיקר של קרום / villi העובר, וחלק קטן של תאים אימהיים הנגזרות הרחם, אשר נשארים מחוברים השליה נמסר. אנו מספקים נתונים הוכחת כי לבודד MSC מהצד האימהי של השליה, ולא בצד העוברי של השליה, כפי שכבר דווחו בעבר 5,11, הוא חומר מוצא מתאים יותר אם MSC האימהי הם רצויים. פרוטוקול זה גם מתאר את השימוש FISH XY כדי לאמת תרומה עוברית או אימהית בתרביות תאים. אמנם זה פרוטוקול סטנדרטי מהיצרן, ניתוח זה הוא מוזנח לעתים קרובות וחשיבותו לזלזל 14.

Protocol

ועדות אתיקה מחקר האדם בשירותי בריאות מאטר, רויאל בריסביין החולים לנשים, קווינסלנד University of Technology ואוניברסיטת קווינסלנד אישרה את המחקר ואיסוף דגימות השליה האנושית השתמשו במחקר. כל הפרוטוקולים מצייתים להנחיות מחקר לאומיות. חולים בתנאי הסכמה מדעת נכתבה עבור השימוש ברקמה למטרות מחקר.

שליות שליש שלישיות התקבלו מאמהות בריאות הבאים קיסרי שיגרתית (CS) לידה במועד מבתי החולים הנ"ל בבריסביין, אוסטרליה. הריונות צורמים זכר עבור דגימות טווח נוצלו במחקר זה להבחין עוברי מתאי אימהי. מין העובר נקבע על-פי אולטרסאונד לפני הלידה ו / או בדיקה ויזואלית של הילוד בלידה ידי הצוות הקליני. קרינת כרומוזום X ו- Y כלאה באתרו (FISH) נוצלה כדי להמשיך ולאמת מגדר ומוצא עוברי או אימהי של רקמה נשמר מןשליות מקוריות.

1. לפני הקציר, הכן את בעקבות

הערה: כאשר ממציא פתרונות האנזים, את הדרישות הספציפיות וריכוזי שסיפק היצרן עבור כל מוצר צריך להיות אחריו. אנזימים ניתנים לעתים קרובות כמו שילוב גולמי של חלבונים, ולכן אנזימים דומים מחברות שונות צפויים להיות פעילויות / ריכוזים שונים. מסיבה זו העצה של היצרן צריכה להיות מוסכמת והכנת פתרון עשויה להיות שונה בהתאם.

  1. כן או לרכוש 1.5 עד 2 L הכולל סטרילית תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) עבור פרוטוקול זה.
  2. הכן פתרון המניות שאני collagenase בשקילה החוצה אני סוג collagenase לפזר 1 מ"ג / מ"ל ​​ב HBSS מערבולת בעדינות כדי להבטיח פירוק מוחלט. לקבוע את עוצמת הקול של HBSS (המכיל סידן ומגנזיום) נדרש להביא פתרון collagenase 100 יחידות (U) / μl (פתרון 1,000x לני"ע) ולאחר מכן לסנן באמצעות 0.2 &# 181; מסנן מזרק מ. כרכים Aliquot 1 מ"ל לתוך צינורות 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C עד הצורך.
  3. הכן פתרון המניות dispase ידי המסת dispase שאינו סטרילי ב 10 מ"ג / מ"ל ​​סליין שנאגרו פוספט של Dulbecco (DPBS) ללא סידן או מגנזיום. בהמשך לדלל עם DPBS ללא סידן או מגנזיום לריכוז סופי של 2.4 U / ml. סנן לעקר דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר. כרכים Aliquot 1 מ"ל ב 1.5 מ"ל צינורות ולאחסן ב -20 ° C עד הצורך.
  4. הכן deoxyribonuclease (DNase) פתרון המניות -אני ידי המסת DNase-I ב 10 מ"ג / מ"ל ​​ב 0.15 M NaCl. סנן thorugh מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. כרכים Aliquot 1 מ"ל ב 1.5 מ"ל צינורות ולאחסן ב -20 ° C עד הצורך.
  5. הכן את הפתרון העיכול עובד על ידי שילוב של 100 U / סוג collagenase מ"ל לי, I.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNase אני ו -2.4 U / ml dispase ב סרום ללא DMEM. טרי להפשיר לדלל מניות אנזים מיד לפני השימוש. כ, יחס של 1: 1 של פתרון העיכולנפח נפח הרקמה נדרש (למשל 10 מ"ל של רקמות, נמדד בתוך שפופרת 50 מ"ל, דורש 10 מ"ל של פתרון העיכול).
  6. כן פתרון של 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS ולהתאים pH 7.4 15. חנות 25 aliquots מ"ל ב -20 ° C לטווח ארוך או על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע 1.
  7. כן בינוני תרבות MSC מן הגלוקוז DMEM-הנמוך (DMEM-LG) השלים עם פתרון אנטיביוטי 1x ו antimycotic ו -10% בסרום שור מומת שאינו חום עובר. FBS MSC כיתה ניתן לרכוש מהספקים FBS רבים.
  8. חיטוי לעקר ציוד לנתיחה מראש בהתאם להנחיות מוסדיות. אלה כוללים מספריים, מלקחיים, אזמלים, ומגש לנתיחת מתכת גדול. אסוף plasticware רקמה סטרילית תרבות נוספים וחומרים מתכלים (להבי אזמל למשל, 50 מ"ל ו -15 מ"ל צינורות, 25 מ"ל, 10 מ"ל ו -5 טפטפות מ"ל, ו -75 או 175 צלוחיות תרבית תאים 2 ס"מ).
  9. השתמש בציוד מעבדת תרבית תאי סטנדרט ראשוני: א ב class IIiosafety ארון המתאים בידוד תא ראשוני, תרבית תאי חממה נקבעה על 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס, כיסא נדנדה בתוך 37 ° C חממה, וכן צנטריפוגה עם קיבולת של 50 מ"ל צינורות.
  10. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים: מעיל מעבדה, 2 זוגות של כפפות (בכל הזמנים), משקפי מגן, ונעליים צבאיות קרוב לפי הנחיות מוסדיים.
  11. הכן פתרונות טיהור מתאימים דגימות דם אדם על פי הנחיות מוסדיות מכולות פסולות ביולוגיות נוזל מראש.

בידוד 2. MSC שליה

  1. הכנה של השליה
    1. שמלה בתוך הציוד האישי המגן נדרש. הגדר את ארון הבטיחות הביולוגי עם חומרים דרושים, פתרונות מכולות פסולות לבצע את ההליך עד עיכול אנזימטי (סעיף 2.5.6).
    2. השג שליה עם הסכמה מדעת ואישור אתי. אסוף את השליה באמצעות שניות ניתוח קיסריtion בתנאים כירורגית ספטית, וחבילה בשקית או בדלי סטרילי לתחבורה למעבדה.
    3. במהלך הובלה לפני לנתיחה, לאחסן השליה בטמפרטורת החדר או 4 ° C.
      הערה: רקמה ניתן לאחסן עד 6 שעות מבלי להשפיע על ביצועי תרבית תאים.
      1. הגבל את הזמן בין איסוף השליה עיבוד רקמות במידת האפשר. המלצה זו מבוססת על סוגיות מעשיות. בחלק מהמקרים, עיכבנו תהליך בידוד תא עד 6 שעות לאחר הלידה. במקרים אלה השליות נשמרו בטמפרטורת החדר או 4 ° C (במעבדה או במרכז האיסוף). לא נמצא הבדל לזיהוי נצפה, מעל וריאציה תורמת ובכלל, MSC המתקבל שליות כשהם אוחסנו ב 4 ° C או בטמפרטורת חדר.
    4. מניח את המכל עם שליה בקבינט הבטיחות הביולוגית. פתח את המיכל ולהעביר את השליה לתוך מגש סטרילי.
    5. פתח את ממברנות העובר (שק השפיר או laeve כוריוני-amnion) 8. הפוך חוקי עם החלקים של השליה. הצד העובר יש החדרה חבל הטבור, שהוא בכלל, מוכנס מרכזי בשליה. הצד האימהי (מרופד basalis decidua), שנמצא מול לצד העובר, יש cotyledons הברור (או אונות).
    6. כדי להתחיל את הנתיחה, להתמצא השליה עם חבל הטבור כלפי מעלה במגש סטרילי.
      הערה: פרוטוקול זה נועד להניב מספיק תאי זרע לתוך בקבוק T175 אחד מכל אחד משלושה סוגי הרקמות. כל Digest מתחילה עם כ 10 גרם של רקמת גוף. זהו מספר התחלה דומה של צלוחיות כמו תרבויות MSC שהופעלו מתוך לשאוב מח 20 מיליליטר עצם. אם יותר תאים רצויים, אז יותר רקמות ניתן לקצור והפרוטוקול וניתן לשנותם באופן ליניארי. הגדלים של רקמה להיות שנקטפו הם רק מעידים על מה הוא מעשי עם רקמת השליה. ישנם כמה defininתכונות גרם של villi השליה, אשר ניתן להשתמש בהם כנקודת התייחסות. הממדים הצביעו ומשמשים כאומדן וחבל הטבור משמש כציון דרך על פני השטח של העובר.
  2. דיסקציה של רקמות Decidual (D)
    1. תהפוך את השליה על כך את פני השטח האימהיים (basalis decidua) הוא פונה כלפי מעלה. ודא שהצד העוברי עם נקודת הכניסה חבל הטבור פונה כלפי מטה.
    2. חותכים חתיכות של עובי 0.5 ס"מ מהצד האימהי של השליה (המכיל רקמות decidua basalis).
    3. מניח פיסות רקמה לתוך צלחת פטרי המכילה HBSS במהלך הניתוח כדי לשמור על פיסות רקמת התייבשות.
    4. העברת רקמות מספיק כדי למלא צינור עומד על הגובה 10 מ"ל בתוך שפופרת 50 מ"ל (זה הוא כ -10 גרם של רקמות).
  3. Dissection של רפידת כוריוני (CP) רקמות
    1. מבחינה מכנית להסיר של קרום השפיר מפני השטח העוברי של השליה (לא שק מי השפיר), עוזב את chofrondosum rionic (צלחת כוריוני) ללא פגע.
    2. חותכים חתיכות ~ 1 ס"מ רחב ב -0.5 ס"מ עמוק מהצלחת שליה. קציר את צלחת כוריוני מהאזור קרוב את חבל הטבור, מהקצה של השליה.
    3. מניחים פיסות הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילה HBSS במהלך הניתוח כדי לשמור אותם hydrated.
    4. העברת רקמות מספיק כדי למלא צינורית 50 מ"ל עד 10 מ"ל סימן (~ 10 גרם של רקמות).
  4. דיסקציה של כוריוני villi (CV) רקמות
    1. לנתח CV רקמות ~ 1 ס"מ 2 x 0.5-1 ס"מ עמוק מרקמות השליה שבו CP כבר הוסר. שוב, קציר CV מהאזור הקרוב את חבל הטבור, מהקצה של השליה. נסו להישאר לפחות 1 ס"מ מן הצד האימהי של השליה (המכיל רקמות decidua basalis); המטרה היא לקצור רקמה מהחלק הפנימי של רקמת villi השליה.
    2. מניחים פיסות הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילות HBSS במהלך dissection לשמור אותם hydrated.
    3. העברת רקמות מספיק כדי למלא צינורית 50 מ"ל עד 10 מ"ל סימן (~ 10 גרם של רקמות).
  5. ממינסינג ו אנזימתי עיכול של D, CP, ורקמות שליה CV
    1. כמו ישנם ~ 10 גרם של D, רקמות CP או CV בשלושה צינורות שונים 50 מ"ל, למלא צינור אחד עם כ 40 מ"ל של HBSS שוב ושוב להפוך את הצינור כדי לשטוף את הרקמה (לחזור על ~ 10 שניות).
    2. למזוג supernatant וחזור על שלב זה לשטוף 2-3 פעמים עד הפתרון הוא בחינם בעיקר מדם. השתמש פיפטה 10 מ"ל או פינצטה ארוכה כדי להבטיח את פיסות הרקמה לא הולכים לאיבוד מתוך הצינור (ים) כאשר decanting supernatant.
    3. חזור פיסות הרקמה כדי בצלחת פטרי 10 ס"מ עם העברת נוזל מינימלי. קוצצים / לקצץ את הרקמה לחתיכות לקנס בגובה של כ 1-5 מ"מ 3 במספריים או סכין גילוח.
    4. מעביר את הרקמות הטחונות בחזרה לתוך שכותרתו כראוי (D, CP או CV) 50 מ"ל צינורות.
    5. וסוחטים לתוכו prepared לעכל תקשורת לפחות יחס של 1: 1 עם הרקמה (למשל 10 מיליליטר של רקמה בתוספת 10 מיליליטר של לעכל תקשורת). החלף את הכובע על צינור כל להפוך את הצינורות מספר פעמים כדי לערבב.
    6. דגירת רקמות הצינורות עם לעכל תקשורת במשך 1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס. אווירה humidified ו 5% CO 2 אינם נחוצים בשלב זה.
      הערה: טלטול מהיר נדרש על מנת לנתק תאים ביעילות מהרקמה ולמקסם תשואת MSC. תשואה מוגבלת תהיה ברורה על ידי תאים מעט מאוד מחוברים אל בקבוק התרבות ב 48 שעות וזמן מעבר ראשון יותר 1-2 שבועות. זמן הדגירה ושיטת רועד תלוי 37 ° C החממה זמינים במעבדה עשוי לדרוש אופטימיזציה.
      1. לקבלת באינקובטור עם מנגנון רועד מהיר לשליטה, רקמת מקום ולעכל בינוני בתוך שפופרת 50 מיליליטר או בקבוק חרוטי סטרילי, מקום בחממה ולהגדיר רועד מהירות 250 סל"ד. זה יגרום שלם תקציר שלרקמות 1 hr.
      2. לחלופין, עבור באינקובטור עם נדנדה עדינה או שום מנגנון נדנדה, ידני לנער את הצינור במהירות במרץ ביד במשך 10 שניות כל 30 דקות עבור 1.5 עד 2 שעות. תקופת דגירת האנזים היא זמן מתאים להשליך פסולת, לנקות את ארון הבטיחות הביולוגי של פריטים מיותרים, שינה את מעייל מעבדה אם מלוכלך להתכונן לחלק הבא של ההליך.
  6. אוסף של תאים mononuclear ציפוי לתוך צלוחיות
    הערה: מהשלב הקודם, ישנם שלושה צינורות 50 מ"ל (D, CP או CV) עם לעכל פיסות הרקמה. כאשר הפתרון לעכל רקמות מתפתח עכירות וכלי דם לבנים ברורים בתוך הרקמה, לעיכול הושלם.
    1. הוסף 30 מ"ל של התקשורת MSC המכיל FBS צינור אחד כדי להשבית את האנזימים הכלול פתרון העיכול.
    2. כדי להפריד את תאי mononuclear מן ההריסות מעוכלות הגדולות, דופק צנטריפוגות צינור 50 המ"ל. בקצרה, לאפשרבצנטריפוגה להגיע 340 x גרם במשך 5 שניות ולאחר מכן להפסיק. הפעולה זו תאלץ את הפסולת הגדולה גלולה בחלק התחתון של הצינור, תוך השארת תאי mononuclear בתרחיף נוזלי.
      הערה: תאי mononuclear יישארו בשלב הנוזלי אם הצינור הוא רק לזמן קצר (פעם) centrifuged. אם צנטריפוגה מוארך, תאי mononuclear גם גלולים בחלק התחתון של הצינור עם פיסות הרקמה, ותוצאה הוא אובדן תא רצוי.
    3. אסוף את supernatant, המכיל את התאים mononuclear, ולהעביר זה לתוך צינור חדש 50 מ"ל עם טפטפת.
    4. הוסף 30 מ"ל של התקשורת או HBSS אל פסולת רקמות שליה שנותרו לנער במרץ. זה יביא תאי mononuclear מנותקים הנותרים לתוך השעיה ולאפשר יבול שני של MSC המשוערת מן הרקמה.
    5. צנטריפוגה Pulse הצינור בשנית, ושוב להעביר את supernatant לצינור חדש 50 מ"ל. חזור על פעולה זו פעם שלישית על מנת למקסם את היעילות האוספתשל תאי mononuclear מכל מקור רקמה.
    6. פינה את supernatants מכל אחד מסוגי רקמות פרט לשתי צינורות 50 מיליליטר. זו תניב 6 צינורות כוללים (2 צינורות של כל D, CP ו CV). צנטריפוגה כל צינור במשך 5 דקות ב 340 x ז. שלב זה יהיה גלולת תאי mononuclear לתחתית של הצינורות.
    7. בזהירות למזוג או פיפטה את supernatant לתוך הפסולת. זה מיותר לנסות לחסל כל טיפת supernatant.
      הערה: התא הגלול יהיה שברירי בשל מספר רב של תאי דם אדומים. היזהר שלא וזורקים את הכדור בטעות אם אתה decanting ישירות מהצינור 50 מ"ל.
    8. לאחר ההסרה רוב supernatant, בעדינות קפיץ הצינור מספר פעמים עם אצבע כדי לסלק את התא גלול. מערבבים את הכדורים, כך שיש צינור אחד עבור כל רקמת D, CP או CV ו resuspend כל ב 35 מיליליטר של תקשורת MSC.
    9. אופציונלי: סנן השבר mononuclear דרך מסננת תא רשת 100 מיקרומטר להגדיר up בתוך שפופרת 50 מ"ל כדי להסיר גושים התא או חומר סיבי.
      הערה: טיפול נדרש כמו תוכנות סינון יכולות סותמים בקלות יתר המילוי. בנוסף, בועות אוויר יכולות לחסום מסננים מן הניקוז. במקרה כזה, לאט להרים את המסנן מתוך הצינור כדי לאפשר לאוויר לזרום תחת המסנן, לשטוף מסנן דרך עם תקשורת תרבית תאים או החלפת מסנן חדש. בנטרול צעד הסינון אינו מופיע לשנות תשואה או איכות של תרבויות MSC שלאחר מכן.
      1. לחלופין, תאי דם אדומים (RBC) צנטריפוגה שיפוע תמוגה או צפיפות יכולה להתבצע בשלב זה 15. עם זאת, הניסיון שלנו הוא RBC אינו מפריע MSC מצורף או התפשטות ולכן תמוגה RBC אינו הכרחי. תאי mononuclear אפשר לספור על שלב זה אם הסרת RBC בוצעה 15. אמנם, הרוב המכריע של תאים בשלב זה לא יהיה MSC, אבל להיות trophoblasts מקור עוברי, תאי אנדותל ותאים hematopoietic, כמו גם maתאי hematopoietic ממוצא ternal ותאי סטרומה decidual.
    10. מעבירים את ההשעיה תא עבור כל D, CP או רקמות CV לתוך בקבוק ותרבות T175 יחיד חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  7. הרחבת בידוד תאי הודעה
    1. בשעת 48 שעות לאחר הבידוד הראשוני, להסיר את המדיום מכל אחד הצלוחיות (D, CP ו CV) ולהחליפו 35 מיליליטר של תקשורת MSC הטריה. המדיום בילה ותאי מנותקים יכולים להיות מושלכים, כפי MSC המשוערת הן בחזקה שתצורף הבקבוק בתרבית הרקמה 16. חזור צלוחיות אל האינקובטור עבור hr 24 נוסף.
    2. בעקבות התרבות 24 שעות של נוספים, לשטוף את צלוחיות פעמיים עם DPBS (25 מ"ל) כדי להסיר פסולת RBCs. מערבולת הנוזל סביב החלק התחתון של הבקבוק כדי לסלק RBCs. השתמש פיפטה כדי להסיר את נוזל ופסולת. להוסיף 35 מ"ל של התקשורת MSC כדי צלוחיות ולהחזיר את צלוחיות אל האינקובטור.
    3. חלף תקשורת פעמים בשבוע, ובתרבויות cubate עד monolayers התא הם 80- 90% ומחוברות. התפשטות ראשונית זה לוקח 4-14 ימים, תלוי באיכות של הרקמה, כמות של חומר המוצא ויעילות וזמן דגירה עם הפתרון לעכל.

3. תת של pMSCs

  1. כאשר תרבויות הם 80-90% ומחוברות, לשטוף פעמיים עם 20 מ"ל 1x HBSS או DPBS וזורקים שוטף. להוסיף טריפסין-תחליף בקבוק אחד (כלומר, להשתמש 5 מ"ל בבקבוק T175).
  2. דגירה צלוחיות במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לשחרר MSC מפני השטח בתרבית רקמה. הקש על הצדדים של הבקבוק כל ~ 2 דקות כדי להקל ניתוק.
  3. כאשר תאים מנותקים מפני השטח והן השעית תא בודדת, לשטוף את התאים מהבקבוק עם תקשורת MSC ולאסוף תאי צינורות. תקשורת MSC שתדלל ולהפסיק את-תחליף טריפסין (שימוש ~ 15 מיליליטר של תקשורת MSC לכל בקבוק T175).
  4. מעבירים את תכולת בקבוק אחד בתרבית רקמה על 50צינור מ"ל.
  5. צינורות צנטריפוגה ב 340 XG במשך 5 דקות עד גלולת התאים.
  6. בטל supernatant ו resuspend את כדורי תא 1 מ"ל של התקשורת MSC.
  7. לדלל 10 μl של ההשעיה תא 10 μl trypan כחול. ספירת תאים באמצעות hemocytometer לחשב את המספר הכולל של תאי 15.
  8. עבר תאי צלוחיות חדשות 1,150 תאים / 2 סנטימטר במדיה MSC טריים דגירת חממה בתרבית רקמה. בשעה צפיפות זריעה זו, זרע 200,000 MSC לתוך בקבוק אחד T175 חדש 35 מ"ל של התקשורת MSC. Feed תאים פעמים בשבוע עד ומחוברות 80-90%. זרעי קטעים עוקבים 1,150 תאים / 2 סנטימטר או 200,000 MSC לתוך בקבוק אחד T175.
  9. כאשר מעבר 1 (P1) או תאי P2 הם ומחובר, cryopreserve רוב התאים לשימוש עתידי, ו reseed רק בקבוק T175 אחד לריבוי נוסף ואפיון. התאים המופצים ניתן להשתמש ב- P3 או P4 עבור מבחני בידול mesodermal ואפיון תא באמצעות flow cytometry.
    הערה: בקטעים מוקדם, ייתכנו מושבות מופרדות מעט מאוד בדלילות, אך צפיפות התא המקומית בתוך כל מושבה עלולה להיות גבוהה מאוד. זה לא אידיאלי, כמו האריזה הצפופה המקומית של התאים תגרום עיכוב קשר, עיכוב צמיחה וצמצום ביצועי תרבות. אנו ממליצים כאשר מושבות צפופות הם נצפו, התאים צריכים להיות שנקטפו reseeded לתוך בקבוק חדש. תהליך חלוקה מחדש זה מספק תאים עם מקום להתרבות, וביצועים תרבות הכולל יהיה שיפור.
  10. כדי cryopreserve MSC, לאסוף ~ 1 x 10 6 תאים 1 מ"ל של FCS 90% ו -10% dimethylsulphoxide (DMSO) ולהקפיא באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
    הערה: במקטע תוצאות הנציג, יש תיאורים של אפיון MSC באמצעות cytometry זרימה, בידול mesodermal וניתוח FISH XY לקבוע את המין של השלוש אוכלוסיות תאים מורחבות השונה (D, CP ו CV). במחקר שלנו, שליות היו מן תינוקות זכרים; ולכן כלתאי העובר יכול להבחין כזכר (כרומוזום Y) וכל התאים אימהי שאפשר לייחד כנקבות (כרומוזום X בלבד).

Representative Results

הליך בידוד MSC השליה מסוכם באיור 1. השלושה התחומים של האנטומיה השליה שממנו MSC בודד מודגש באיור 2. אלו decidua האימהי, כמו גם ברקמות העובר בעיקרם צלחת כוריוני ו villi שליה. ספרי לימוד רבים, מאמרים ופרטי משאבים מקוונים בפיתוח התפקיד פונקציונלי של רקמות השליה השונות (רואים התייחסות 8).

מורפולוגיה של תרבויות 48 שעות לאחר בידוד והסרה של פסולת רקמות.
בעקבות 48 שעות של תרבות, MSCs יהיה מצורף הפלסטיק בתרבית רקמה, בעוד RBCs ופסולת הסלולר האחרת ביותר לא מצורפות. בשלב זה, המדיום חייב להיות מוחלף עם 35 מ"ל של מדיום תרבות טריים. לפני חילופי בינוני זה, קשה לבצע תצפיות מדויקות בגללמספר גדול של RBCs, אשר יקשה על הערכה חזותית. הופעתו של supernatant התרבות יכולה להיות שונה מהותית בין תורמי שליה. וריאציה זו ניתן לראות ויזואלית בדוגמה 1 ו -2 (איור 3 א). אלה שני בידודי MSC, שהופיעו להיות שונה מאוד, בוצעו בו זמנית משתי השליות שונות. עם זאת, ברגע השטף, שתי התרבויות הופיעו דומות (ראה שטף למשל 3, איור 3 א).

תחת מיקרוסקופ, לאחר חילופי תקשורת 48 שעות, רק כמה תאים יצורפו הבקבוק (איור 3 ב), והתאים יופיעו שונים באופן מהותי מן MSCs המורחבת יותר בהרחבה. פסולת RBCs חלקם יהיו גלויים כמו גושים צפים או לעיקול ואלה לא יפריע לצמיחה של MSCs. ככל תאי fibroblastic דבקים התחתון של הבקבוק צפויים להיות תערובת של תאים כולל MSC, היווצרות דם,trophoblastic או תאי האנדותל. שוב, התאים הלא-MSC לא מתפשרים תרבויות MSC, כמו תאים אלה לא ישרדו בדרך כלל יותר מ 1-2 קטעים בתנאי תרבות MSC. למרות וריאציה מסוימת את ההופעה הראשונית של תרבויות, התוצאות הרחבות לאחר מכן הם בדרך כלל בקנה אחד.

מורפולוגיה של תרבויות MSC לאורך זמן.
בדוגמא נציג זה, לאחר שיחלוף שבעה ימים בבידוד, מושבות MSC fibroblastic קטנות נראו, למרות תאים שאינם MSC יכולים גם לראות עגול או תאים מחוברים באופן רופף (איור 4 א). התאים המחוברים מה שכונו במקור "יחידת המושבה להרכיב -fibroblast "(CFU-F) 17 ומאוחר יותר כינה 18 MSC. שלושה עשרה ימים לאחר בידוד, מושבות MSC fibroblastic היו גדולים (איור 4 ב). באופן כללי, בשכבה תהיה ומחוברות 80-90% בשלב זה התאים צריכים להיות פאסה GED. עולה מדבר 2 ואילך, בשכבת MSC השליה תפתח את מורפולוגיה מערבולת דמוית המאפיינת בנקודת המפגש (האיור 4C). אם התאים passaged בצפיפות נמוכה, היווצרות CFU-F כבר לא תהיה שנצפתה. בצפיפות נמוכה, MSC נגזרת שליה יש מראה קטנה, מרובעת יותר מ-מוח עצמות נגזרים מבוגר MSC 1. בעוד MSC נגזרת שלית MSC העצם שמקורם במח להפגין שיעורי התפשטות דומים, תאי נגזרות השליה נוטים פחות הזדקנות 5 מהירה.

אפיון של MSC השליה במבחנה.
כל אוכלוסיית תאים מורחבות חייבת להתאפיין כדי לוודא שהוא עומד בקריטריוני MSC תקן 16, כוללים (1) דבקות פלסטיק (2) הנוכחות של סמני משטח mesenchymal והיעדר סמני משטח hematopoietic, ו (3) את היכולת לעבור mesodermal בידול.

"FO: keep-together.within-page =" 1 "> MSCs השליה הוא חסיד פלסטיק.
כפי שניתן לראות בתרשים 4, MSCs בתרבות הם פלסטיק חסיד ויש מורפולוגיה fibroblastic דמוי; זה מאמת כי התאים עומדים בקריטריונים הראשונים שמגדירים MSC 16.

סמני MSC תצוגת השלית משטח mesenchymal.
המאפיין השני בהגדרת MSC הוא הנוכחות של סמני משטח mesenchymal והיעדר סמני משטח hematopoietic 16. מאחר ואין סמן יחיד מסוגל זיהוי MSC באופן מוחלט, לוחות של סמנים מנוצלים בדרך כלל בשילוב עם ניתוח תזרים cytometry לזהות תאים הנמצאים mesenchymal, אך לא hematopoietic. במערכת נתוני הנציג הניתנת כאן (איור 5 א), בדקנו ביטוי תא של סמני mesenchymal CD73, CD105, CD90, CD146, ו CD44, סמני hematopoietic CD45 ו CD34, ו- HLA-DR, כמו well כמו CD31 סמן אנדותל. כל הנוגדנים מנוצלים בתהליך אפיון שלית MSC זה מפורט בטבלה של חומרים / ציוד. מכתים בוצע על פי הוראות מייצרת, עם שיטות ניתוח המתואר כאן 19.

התאים היו חיוביים עבור סמני mesenchymal CD73, CD105, CD44, ושלילי עבור הסמנים פני תא CD45, CD34, HLA-DR ו CD31, כצפוי 5,20. כ, 37% ו -57% של תאי סט נתוני הנציג שלנו היו חיוביים עבור CD90 ו CD146 21, בהתאמה. שניהם CD90 ו CD146 הם בדרך כלל מנוצל MSC סמנים 21. פרופילים סמנו פני תא MSC עשויים להיות שונים בהתאם למקור רקמת MSC, רכב בינוני, או מספר מעבר 22. בשנים הרבות של ניסיון שלנו, אנחנו לא הבחנו זיהום לטווח ארוך של MSC נגזרת שליה עם תאים שאינם mesenchymal הבאים 1-2 עמ '5,11 assages.

MSC תצוגת פוטנציאל התמיינות mesenchymal שליה
על פי הגדרה, MSC צריך להחזיק קיבולת בידול mesodermal במבחנת 5,13. בידול פוטנציאל mesodermal נבחן בדרך כלל באמצעות מבחני בידול תלת או דו-שושלת או. מבחני Bi-השושלת בדרך כלל להעריך osteogenic וקיבולת בידול adipogenic, בעוד מבחני השושלת תלת בנוסף להעריך יכולת התמיינות chondrogenic. בתוצאות הנציגים המוצגות כאן, אנו מראים כי באוכלוסיות MSC המורחבות יוצרים הם משקעי סידן, מעידים על בידול osteogenic, ו vacuoles שומנים, מעיד על adipogenesis (איור 5).

כדי לאפיין את האוכלוסיות MSC דיווחו כאן, אנו זורעים תאים לתוך 24 בארות התרבות ב 6 x 10 4 תאים 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה. Compo הבינוניnents מפורטים בטבלה של חומרים / ציוד. בעוד ניסוחים בינוני אינדוקציה נפוצים בספרות, ישנה שונות רבה בניסוחים שפורסמו. מסיבה זו אנו בקצרה לפרט ניסוחי האינדוקציה בינונית והגישות מכתימות שלנו כאן. בינוני אינדוקציה osteogenic הכלול DMEM-HG, 10% FBS, פתרון antimycotic אנטיביוטי 1x, 10 מ"מ β-גליצרול phophate, 100 dexamethasone ננומטר, ו -50 מיקרומטר 2-פוספט L-חומצה אסקורבית. בינוני אינדוקציה Adipogenic הכלול DMEM-HG, 10% FBS, פתרון antimycotic אנטיביוטי 1x, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין, 100 dexamethasone ננומטר, 200 מיקרומטר indomethacin, ו 500 מיקרומטר xanthine 3-isobutyl-1-מתיל. הנה, תרבויות נשמרו בתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ותרבותי במשך 14 ימים. בינוני אינדוקציה הוחלף פעמים בשבוע במשך תקופת התרבות. בעקבות 14 ימי אינדוקציה, תרבויות התאפיינו לאף עצם דמוי מטריקס (osteogenesis) או vacuoles השומנים (adipogenesis) לפי קודם שלנופרסום 5 ious. ניתוח בתצהיר סידן מטריקס osteogenic הושגה על ידי aspirating דבר ראשון המדיום, לתקן את תרבויות עם paraformaldehyde 4% במשך 20 דקות, לשטוף את monolayer עם DPBS, ולאחר מכן צביעה עם Alizarin האדום S פי הוראות מייצרת. אינדוקצית Adipogenic הוערכה על ידי aspirating את המדיום, לתקן את התרבויות עם paraformaldehyde 4% במשך 20 דקות, לשטוף את monolayer, והכתים עם פתרון האדום O שמן על פי הוראות מייצרות. משקעי סידן מוכתמים vacuoles שמן אז היו דמיינו עם מיקרוסקופ אור, ותמונות הצילו לשימוש עתידי.

בפרסומים קודמים, יש לנו מאופיין פוטנציאל ההתמיינות של MSC נגזרת שליה יותר בהרחבת 4,5. Osteogenesis MSC נגזרת השליה דומה MSC מח נגזרות עצם, תוך adipogenesis הוא פחות יעיל בדרך כלל MSC נגזרת שליה 5 </ Sup>. אנחנו לא שגרתי לבצע בידול chondrogenic מכמה סיבות, אם כי זה כבר דווח בעבר על ידינו עבור השליה-MSC 5. ראשית, בעוד יכולת התמיינות mesodermal היא מאפיין מגדיר של MSC, סביר להניח חשיבות משנית 23-25, במיוחד כאשר היתרון הטיפולי עשוי להיגזר פרשות paracrine MSC 26. שנית, למרות דומיניסיני et al. המוצעת קריטריונים מינימאליים לייצור הקליני של MSC מח נגזרות עצם בוגרת אדם 16, מחקרים מאוחרים יותר מצביעים MSC מ נישות שונות יש תכונות ויכולות בידול ובאופיין 5,13,27-32. למעשה, Parolini et al. מוצע כי MSC נגזרת שליה צריכה להתמיין "אחד או יותר mesodermal" שושלות ולא כל שלוש השושלות 10. לבסוף, מחקרים MSC רבים לכלול בידול chondrogenic כפי שהוא מתרחש דרך דומה מסלול איתות תאי כמו osteogenesis (מסלול משפחתי TGFβ) 33-35.

השליה ל- MSC כוללות אימהית המוצא בשיטה זו של התרבות, למרות המיקום האנטומי של חומר המוצא.
פרסומים רבים מניחים כי תאים מבודדים מן MSC העוברית התשואה סיסית העוברת על תרבות 14. עם זאת, כפי שכבר דווחו בעבר 5, בכל ההתרבויות נגזרות סיסי עובר, שימוש בפרוטוקול זה, ועשיית עושר במהירות אימהי MSC כפי שניתן היה לצפות באופן אינטואיטיבי עבור תרבויות MSC decidual האימהיות. בתוצאות נציג אלה השתמשנו רקמת השליה מן התינוקות הזכרים כך ניתן היה להתוות בקלות התרומה תא היולדת והעובר בבית אוכלוסיות תאים מורחבת. עבור מחקרים אלה השתמשנו ערכת FISH XY הנזכרת בטבלה של חומרים / ציוד, ועקב אחר הוראות היצרן.

יפ-together.within-page = "1"> בנתוני הנציג המוצגים כאן, התרבויות נגזרות decidua האימהי היו ~ 90 תאים אימהיים% (XX) ו ~ 10% תאים עובריים (XY) בשעה מעברת 0 (איור 6) . על ידי מעבר 2, אוכלוסיות התאים שמקורם ברקמות האימהיות היו ~ 100 תאים אימהיים% (XX), ותאי עובר (XY) היו בלתי מורגשים. הדבר מצביע על כך לנתיחה פיזית של רקמות אימהיות הובילה להעשרת תא אימהי התרבויות שלאחר מכן. עם זאת, חשוב לשקול את תוצאות התרבות מן villi כוריוני העוברי ותרבויות צלחת נגזרות שליה. בשעה מעברת 0, שתי התרבויות צלחת נגזר villi כוריוני העוברי כוריוני היו ~ 85% XY, או ממוצא עוברי, המציין כי לנתיחה ממוקדת מועשרת עבור תאים עובריים (איור 6). בשעה מעברת 0, שתי התרבויות הכילו תא אימהי ~ 15% (XX) זיהום. באופן מפתיע, על מעבר 2, שתי ההתרבויות העובריות היו מאוכלסות עם ~ 100% תאים אימהיים (XX), ותאי עובר (XY)כבר לא היו מורגשים. ניתוח FISH XY מגלה כי תאי אימהי (כרומוזומים XX) במהירות ובעקביות השתלטות התרבויות נגזר מן הרקמות כוריוני עוברית. זוהי הערת תרבות קריטית כי הוא לעתים קרובות התעלם 5. הפירוט של ניתוח זה נכלל בפרוטוקול זה משום שהוא משקף את התצפית מאוד חשוב כי תאי אימהי במהירות לאכלס בכל התרבויות כאשר DMEM בתוספת 10% FBS משמש ללא גורמים נוספים שנועדו לתמוך באוכלוסיות עוברי הנגזרות.

איור 1
איור 1:. סיכום של הליך בידוד MSC שליה (שלב 1) להתמצא עצמך עם האנטומיה השליה. (שלב 2) באופן ידני לנתח 10 גרם של רקמות מאחד את decidua, chorionic villi או צלחת כוריוני באמצעות מספריים. (שלב 3) בשר טחון t הוא גזור חלקים של decidua, chorionic villi או ברקמות צלחת כוריוני לחתיכות בסדר עם מספריים או סכין מנתחים.
(שלב 4) לשחרר את התאים מן רהיטים מצוינים באמצעות עיכול hr 1-2 במלחמת dispase ו collagenase
(שלב 5) הפרד את התאים מן הרקמה הסיבית על ידי צנטריפוגה הדופק ו / או לשטוף אותם דרך מסננת תא. אסוף ו resuspend תאים במדיום התרבות והניח לתוך צלוחיות תרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תאי סטרומה mesenchymal (MSC) ייבחרו על בסיס נטייתן לדבקות וקיבולת פלסטיק כדי לשרוד ולהתרבות במדיום התרבות. לבסוף, בסעיף התוצאות, MSC המורחבת ניתן לאפיין ומאוחסן לשימוש בניסויים עתידיים.

ther.within-page = "1"> איור 2
איור 2:. האנטומיה של שלית המונח האנושית ורקמות מבודדות בהליך זה הרקמה הראשונה להיות שנקטפה הוא decidua האימהי. Decidua הוא רקמה נשארת כמו שכבה דקה על פני השטח של השליה לאחר זה מזיל מדופן הרחם (decidua מזוהה על ידי הסמנים הירוקים). הרקמה השנייה כי יהיה לקצור מן הפנים של השליה היא villi כוריוני העוברית (סמנים כחולים). הרקמה השלישית להיות שנקטפה הוא צלחת כוריוני עוברית (סמנים אדומים) (מותאמת בהפניה 36). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: מורפולוגיה של תרבויות 48 שעות לאחר הבידוד מחדשהזזת פסולת הרקמות. (א) הופעתו של supernatant התרבות יכולה להשתנות באופן משמעותי בין תורמי שליה לפני הכביסה את העפר. דוגמא תרבויות 1 ו -2 להפגין וריאציה זו. הבידודים שני אלה בוצעו בו זמנית, אבל משתי השליות שונות. לאחר תרבויות שטף תהיינה ברורות של RBCs ופסולת רקמות כפי שניתן לראות בדוגמא 3. התוצאות הרחבות לאחר מכן הם בדרך כלל בקנה אחד. (ב) בעקבות חילופי תקשורת 48 שעות, רק כמה תאים יצורפו הבקבוק. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. מורפולוגיה של תרבויות MSC לאורך זמן (א) שבעה ימים לאחר בידוד, f קטןמושבות MSC ibroblastic גלויות למרות תאים שאינם MSC גם יהיו נוכחים עגולים או תאים מחוברים באופן רופף. (ב) 13 ימים לאחר בידוד, מושבות MSC fibroblastic גדולות ולעתים קרובות בשכבה של MSC היא ומחובר ומוכנים למעבר. (C) עולה מדבר 2 ואילך, בשכבת MSC תפתח מורפולוגיה מערבולת דמוית מאפיינת בנקודת המפגש. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. אפיון MSC על ידי זרימת cytometry והבחנה mesodermal (א) MSC הנגזרות villi כוריוני השליה להציג פרופיל סמן MSC קלאסי ידי ניתוח תזרים cytometry, למרות עבור סמנים פני התא אלה, הבעהשיאון דומה לכל סוגי MSC אדם. היסטוגרמה כל מציגה את עוצמת האות (ציר x) לעומת ספירת תאים המנורמלת על ציר y (% של מקס). בנתוני נציג זה להגדיר את התאים היו חיוביים עבור CD73, CD105 ו CD44, ושליליים עבור סמני hematopoietic CD45 ו CD34 ו- HLA-DR. (ב) השליה MSC בדרך כלל לעבור התמיינות osteogenic חזקה, אולם (C) בידול adipogenic יכול להיות פחות יעיל מאשר עם MSC מח נגזרות עצם. תמונות ב כיתובים B ו- C נלקחו בהגדלה 40X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: MSC שליה הוא אימהיים המוצא בשיטה זו של תרבות, למרות המיקום האנטומי של החומר המוצא.המגרשים להראות כימות של העובר (זכר, XY) ואמהית רכב תא (נקבה, XX) של תרבויות MSC שליה המבודדות decidual, chorionic villi ורקמות צלחת כוריוני בכל קטע שני. תאים אימהיים (XX) במהירות reproducibly להשתלט על התרבויות שמקורם ברקמות כוריוני העובריות. עוברי = זכר = הכרומוזומים XY זוהו תא יחיד, אימהי = נקבה = XX הכרומוזומים זוהו תא יחיד. נתונים המוצגים כאן היו בין ה- N = 3 שליות תורם עצמאיות תינוקות זכרים, עם מינימום של 100 תאים מוכתמים עבור FISH XY וספרו לכל נקודת נתונים. ברים מייצגים ממוצעים, וברי שגיאה לשקף סטיית תקן אחת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

השליה היא איבר fetomaternal גדול פיזית, שממנו MSC עוברית או אימהית ניתן לבודד 22. בזאת, אנו ספקנו סקירה מפורטת של האנטומיה שליה והדרכה על איך לנתח במיוחד decidua (מצד אמו), chorionic villi (עובר), צלחת כוריוני (עובר) רקמה (שלב 2.2-2.4). בהמשך לכך, אנו התווינו פרוטוקול חזק המאפשר בידוד MSC מכל אחד משלוש רקמות אלה (שלב 2.5-2.6). הרחבת השליה MSC יעילה ותרבויות להופיע דומות תרבויות MSC עצם שמקורם במח (איורים 3 ו -4). בידול osteogenic הוא אמין (איור 5), בעוד בידול adipogenic הוא פחות יעיל בדרך כלל (איור 5 ג) 5.

עולים חדשים רבים לשדה יהיה להניח כי תרבויות נגזר villi כוריוני עוברית או רקמות צלחת כוריוני יהיה מועשר עבור העובר MSC. עם זאת, בידינו Feעשרת תא טל הוא רק חולפים כאשר בינוני הרחבת MSC סטנדרטי כגון DMEM-LG + 10% FBS מנוצל 5. כאן אנו מספקים תוצאות נציג באמצעות רקמות השליה נגזרו תינוק זכר. באמצעות רקמת השליה מתינוק זכר, בהתנהגותם של התאים העובריים הם בקלות המאפשר לזהותו כבעל הכרומוזומים XY, בעוד תאים אימהיים ניתנים לזיהוי כבעל כרומוזומים XX. איור 6 מציג תוצאות FISH XY לתרבות נציג. בעוד MSC העוברית (XY) מועשרת (עד 80%) בתרבויות הראשוניות נגזרות villi כוריוני עוברי או רקמות צלחת כוריוני, התרבויות אותן הם עקפו במהירות (~ 100%) על ידי אימהי (XX) MSC בשנתי הקטעים הראשונים . במדיום סטנדרטי, מורכב DMEM-LG + 10% FBS, המעטים MSC אימהי הנגזרות כי לזהם את רקמות העובר outcompete התאים שמקורם בעובר בתרבות.

שלב קריטי המפורטים בפרוטוקול זה הוא הערכה של האנטומיה השליה ומאיפה עובריתורקמות אימהיות ניתן לקצור בצורה היעילה ביותר. כפי שתואר בסעיף תוצאות נציג, דיסקציה של רקמה עוברית אין לאפשר העשרה חולף עבור MSC הנגזרות עוברית. שיפורים בניסוח בינוני רחבה, באמצעות תוספת בינוני פקטור גדילה מסוימת אקסוגניים אמורים לאפשר רחבה סלקטיבית של האוכלוסיות העובריות נגזרות MSC, ולייצר מוצר תא כי הוא מועשר עבור עובר ולא תא אימהי (הקבוצה שלנו בפיתוח פורמולציות בינוניות כאלה כרגע). הייצור של אוכלוסיות MSC עובריות עשוי להיות מספר היתרונות, כפי MSC העובר הם התיימרו להיות אנגיוגנזה יותר ומאפייני אימונוסופרסיבי מאשר אוכלוסיות MSC אימהיות שווות 37.

בכל אחד מהפרוטוקולים בידוד תיאר, השתמשנו כ 10 גרם של רקמת גוף. שליה שלמה היא בדרך כלל 500-750 גר ', ו בעבודה קודמת הראינו כי דרך רקמות אוטומטיות לעכל וכן proc bioreactor הרחבת תאesses כי זה צריך להיות אפשרי כדי לייצר יותר מ -7,000 מנות תא קליניות מ יחיד השליה 4. מספרים אלה מדגישים את התאמותיו פוטנציאל של MSC נגזרת שלית טיפולי MSC אלוגנאית, ואת המשמעות של שיטה זו שאינה מותנית במוצא MSC (עוברי או אימהי). מנקודת מבט טיפולי, חשוב ביותר שלמשתמשים הבנה מלאה של מוצר התא ואת היכולת מהימנה מייצרת מוצר תא זה. אנו מקווים כי הווידאו שלנו יסייע לחוקרים להבין האנטומיה שליה, לבודד MSC מן השליה, ולצפות את הרכב של התא עוברי או אימהי הסביר של תרבותם.

Acknowledgements

RP נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר בריאות ורפואה (NHMRC) אחוות עבודת הפוסט דוקטורט. VS נתמכה על ידי מלגה לסטודנטים לתארים מתקדמים הבינלאומי של אוניברסיטת קווינסלנד. MRD נתמכה על ידי NHMRC והפנימית גלגל אוסטרליה.

אנו מודים צוות קליני וסיעוד לסיוע בהסכמה חולה אוסף מדגם. אנו מודים פרופ 'לניקולאס פיסק, פרופ' קרי אטקינסון וד"ר רוהאן לוריא לדיונים תובנה במיילדות, פיתוח feto-שליה ואנטומיה השליה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Gibco/Invitrogen 14185-052 Long name: Hanks Balanced Salt Solution
FBS Gibco/Invitrogen Long name: Fetal Bovine Serum
trypsin-substitute Gibco/Invitrogen 12563-029 Long name: TrypLE Select
DMEM-LG Gibco/Invitrogen 11885-092 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose
DMEM-HG Gibco/Invitrogen 11965118 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)
PBS (Mg+Ca+ free) Gibco/Invitrogen 14190-250 Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free
Anti- anti- Gibco/Invitrogen 15240-062 Long name: antibiotic-antimycotic solution x100
paraformaldehyde powder or 4% solution any 
Collagenase I Invitrogen 17100-017  2,500 U/ml
Dnase I Sigma D5025 10 mg/ml in  0.15 M NaCl
Dispase Invitrogen 17105-041  10 mg/ml in water (20,000 U/ml).
Material Company Catalog Number Comments
Disposables:
50 ml centrifuge tubes Falcon or any brand
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) Nunc
Cell strainers (100 μm) Becton Dickinson 352340
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks Nunc
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes any brand
Material Company Catalog Number Comments
Equipment:
 Centrifuge  
 tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2
Biological safety cabinet
 Sterile scissors and tweezers
Tube racks 
Pipette-boy or equivalent
Gilson type pipetters and sterile tips 1,000 µl, 200 µl, 20 µl.
rocking or shaking incubator (37 °C)
personal protective equipment
cleaning solutions (suitable for blood)
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood
Reagents for MSC characterization
Antibody (Clone ID) Manufacturer Catalogue No. Isotype
CD73 (AD2) Miltenyi Biotec 130-095-183 Mouse IgG1
CD105 (43A4E1) Miltenyi Biotec 130-094-941 Mouse IgG1
CD90/Thy-1 (AC122) Miltenyi Biotec 130-095-403 Mouse IgG1
CD45 (5B1) Miltenyi Biotec 130-080-202 Mouse IgG2a
CD34 (AC136) Miltenyi Biotec 130-090-954 Mouse IgG2a
HLA-DR (AC122) Miltenyi Biotec 130-095-298 Mouse IgG2a
CD31 (PECAM-1) BD Pharmingen 555446 Mouse IgG1
CD146 (541-10B2) Miltenyi Biotec 130-092-849 Mouse IgG1
CD44 (DB105) Miltenyi Biotec 130-095-180 Mouse IgG1
Isotype Controls (Clone ID) Manufacturer Catalogue No.
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) Miltenyi Biotec 130-092-214
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) Miltenyi Biotec 130-092-212
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) Miltenyi Biotec 130-092-213
Mouse IgG2a (S43.10) Miltenyi Biotec 130-091-837
Mouse IgG2a (S43.10) Miltenyi Biotec 130-098-849
MACS Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Osteogenic differentation Manufacturer Catalogue No.
DMEM-HG Gibco/Invitrogen 11965118 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)
FBS Gibco/Invitrogen Long name: Fetal Bovine Serum
Anti- anti- Gibco/Invitrogen 15240-062 Long name: antibiotic-antimycotic solution x100
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol Phophate Sigma 50020
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
Alizarin Red S Sigma A5533-25G For calcium matrix staining
Adipogenic differentation Manufacturer Catalogue No.
DMEM-HG Gibco/Invitrogen 11965118 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)
FBS Gibco/Invitrogen Long name: Fetal Bovine Serum
Anti- anti- Gibco/Invitrogen 15240-062 Long name: antibiotic-antimycotic solution x100
insulin Sigma I2643
Dexamethasone Sigma D4902
Indomethacin Sigma I7378
3-isobutyl-1-methyl xanthine Sigma I5879
Oil Red O solution Sigma O1391-250ML For lipid vacuole staining
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells
XY chomosome FISH kit Vysis (Abbott Molecular) 07J20-050 Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).
  2. Wei, X., et al. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).
  3. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21, 216-225 (2014).
  4. Timmins, N. E., et al. Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells. Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).
  5. Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).
  6. Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells. Placenta. 28, 1174-1181 (2007).
  7. Parolini, O., et al. Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table. Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).
  8. Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. 6 edn (2012).
  9. Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. The developing human: clinically oriented embryology. Elsevier/ Saunders. (2013).
  10. Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem cells. 26, 300-311 (2008).
  11. Brooke, G., et al. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).
  12. Pelekanos, R. A., et al. Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells. BMC cell biology. 15, 15 (2014).
  13. Chen, Y. S., et al. Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells. Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).
  14. Heazlewood, C. F., et al. High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).
  15. Horn, P., Bork, S., Wagner, W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis. Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).
  16. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  17. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).
  18. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9, 641-650 (1991).
  19. Futrega, K., et al. The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues. Biomaterials. 62, 1-12 (2015).
  20. Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating. PloS one. 7, 33225 (2012).
  21. Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).
  22. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
  23. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).
  24. Bianco, P., et al. The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine. Nature med. 19, 35-42 (2013).
  25. Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).
  26. Caplan, A. I., Correa, D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).
  27. Wegmeyer, H., et al. Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin. Stem Cell Dev. (2013).
  28. Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem cells. 25, 646-654 (2007).
  29. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).
  30. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  31. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem cell res. 8, 58-73 (2012).
  32. da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).
  33. James, A. W. Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Scientifica (Cairo). 2013, 684736 (2013).
  34. Xu, C., et al. Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. (2015).
  35. Zhuang, H., et al. Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. (2015).
  36. Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects. Elsevier Health Sciences. 8 edn (2011).
  37. Zhu, Y., et al. Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials. Stem Cell Res Ther. 5, 48 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics