طريقة سريعة والمبسطة لارتفاع العزلة من خلال وضع-من ميرنا من نظافة البروتين الدهني عالي الكثافة

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

الرنا الميكروية تلعب الدور التنظيمي المهم والناشئة كأهداف علاجية جديدة لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تبين أن تتم miRNAs في البروتينات الدهنية عالية الكثافة. لقد قمنا بتطوير طريقة مبسطة لعزل بسرعة HDL النقي مناسبة لتحليل ميرنا من البلازما البشرية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. جمع عينات الدم

  1. جمع الصيام عينات من الدم الوريدي المحيطية إلى 10 مل الأنابيب البلاستيكية التي تحتوي على حمض تخثر Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (التي لديها العديد من المزايا أكثر من مضادات التخثر الأخرى) من خلال بزل الوريد القياسية من الوريد بارز في الحفرة المرفقية.
  2. أجهزة الطرد المركزي لعينات الدم في 1600 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي الطاولة للحصول على البلازما خالية من خلايا الدم الحمراء وكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي.
  3. بالتتابع أجهزة الطرد المركزي لطاف في 3000 غ (4 درجة مئوية) في الدلو المتأرجح الدوار لمدة 10 دقيقة لإزالة WBC والصفائح الدموية ومن ثم إضافي 15 دقيقة لإزالة الحطام الخلية المتبقية على التوالي.
  4. قياس كثافة البلازما باستخدام مقياس الكثافة في RT حسب تعليمات التصنيع.
    ملاحظة: تعديل كثافة (د = 1.023 جم / مل) مع 0.9٪ محلول ملحي قد تكون هناك حاجة بعد إزالة exosomes ولكن قبل تنبيذ فائق الكثافة التدرج.
  5. 2. إزالة Exosome من البلازما

    1. إزالة exosomes المتداولة التي لها كثافة مماثلة لHDL، وتمثل مصدرا هاما من الناحية الكمية من ميرنا 3.
      1. القيام بذلك عن طريق إضافة 252 ميكرولتر حل exosome هطول الأمطار إلى 1 مل البلازما تليها الحضانة لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. لتكوير خارج exosomes، الطرد المركزي الخليط لمدة 30 دقيقة في 1500 غرام عند 4 درجات مئوية.
      2. لعزل HDL، نقل 1 مل من طاف مما أدى إلى البولي سميكة الجدران أنبوب نابذة لمزيد من المعالجة مع تنبيذ فائق التدرج الكثافة (أنظر أدناه).

    3. التدرج الكثافة تنبيذ فائق (الشكل 1).

    1. لفصل HDL استخدام 3 خطوة عملية توظيف نابذة أرضية مع الدوار زاوية ثابتة تعمل على 448811 س G و 8 درجة مئوية، على التوالي.
    2. إعداد ثلاثة حلول مختلفة الكثافة بالتتابع وجديدة لكل العزلة.
      1. إعداد الحل ألف (عزل VLDL، د = 1.006 جم / مل) عن طريق إذابة 11.4 غرام كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم: 0.195 مول)، 0.1 غرام EDTA2Na و 1 مل 1N هيدروكسيد الصوديوم في 1000 مل من الماء المقطر تعقيمها. ثم إضافة 3 مل إضافية من المياه وتعقيمها المقطر.
      2. إعداد الحل ب (عزل LDL، د = 1.182 جم / مل) وذلك بإضافة 25.2 غرام NaBr إلى 100 مل من محلول ألف (كلوريد الصوديوم 0.195 مول، NaBr 2.44 مول).
      3. إعداد الحل C (عزل HDL، د = 1.470 جم / مل) عن طريق خلط 78.8 غرام NaBr مع 100 مل من محلول ألف (كلوريد الصوديوم 0.195 مول، NaBr 7.7 مول). تأكيد الكثافة المناسبة في RT باستخدام جهاز قياس شدة الضوء. إبقاء جميع الحلول في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

    4. عزل VLDL

    1. خلط 1 مل من البلازما (متوسط ​​الكثافة = 1.023 جم / مل)، ونوكلياز حرة 200 ميكرولتر من الدهون الأحمر 7B في أنبوب نابذة 6.5 مل البولي سميكة الجدران.
    2. ثم طبقة بعناية 5 مل من محلول وعلى أعلى من الخليط. إذا لزم الأمر، إضافة إضافي الدهون الأحمر 7B على رأس حل تيس موازنة وزن كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 ساعة (التسارع - 5)، (التباطؤ - 7).
      ملاحظة: أثناء الطرد المركزي، يتم تجميع البروتينات الدهنية والفرقة في مناطق الكثافة توازنها.
    3. في نهاية المدى مراقبة 2 طبقات. إزالة 1.5 مل من الكسر VLDL يمثلون الطبقة العليا وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    4. وأخيرا، وذلك باستخدام ماصة نقل 4 مل من أسفل الأنبوب الذي يحتوي على LDL، HDL، الزلال والحامض الدهني جزء من أنبوب البولي الجديد لعزل LDL.

    5. عزل LDL

    1. مزيج 2 مل من محلول B و 100 نوكلياز ميكرولتر خالية من الدهون الأحمر 7B إلى الأنبوب الذي يحتوي على LDL و HDL جزء (القسم 4)، على التوالي.
    2. ثم الطرد المركزي من ل3 ساعات (تسارع 9، تباطؤ 7). بعد ذلك، قم بإزالة 1.5 مل من الكسر LDL يمثلون الطبقة العليا والحفاظ على 4 درجات مئوية أو مخزن في -80 درجة مئوية. وأخيرا، ونقل 4 مل من أسفل الأنبوب الذي يحتوي على HDLجزء من أنبوب البولي الجديد.

    6. عزل HDL

    1. مزيج 2 مل من محلول C، 100 نوكلياز ميكرولتر خالية من الدهون الأحمر 7B و 15 ميكرولتر من 98٪ β-المركابتويثانول إلى الأنبوب الذي يحتوي على نسبة HDL، على التوالي.
    2. الطرد المركزي لمدة 3 ساعات (تسارع 9، تباطؤ 7). بعد ذلك إزالة 2 مل من الكسر HDL يمثلون الطبقة العليا وإما الحفاظ على 4 درجات مئوية أو مخزن في -80 درجة مئوية.

    7. تحلية وتركيز البروتين الدهني الكسور

    1. لتجنب التداخل مع احق الكهربائي للهلام الاغاروز وPCR، وإزالة الملح الزائد وأضاف خلال تنبيذ فائق الكثافة التدرج باستخدام أجهزة الطرد المركزي فلتر مع قطع الوزن الجزيئي المناسب (أنبوب 3K لVLDL وأنبوب 10K ل LDL / HDL) كما وصفها تعليمات الشركة الصانعة.
      1. لفترة وجيزة، بعد إضافة 2.5 مل PBS الباردة (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 8 ملي Na2HPO4، 2 مم KH2PO4، ودرجة الحموضة 7.4) centrifuجنرال الكتريك VLDL جزء كامل جمعت خلال التدرج الكثافة تنبيذ فائق في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة باستخدام الدوار الدلو المتأرجح.
      2. تحلية جزء LDL مرتين مع 10 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة لكل منهما. بعد ذلك، استخدم 13 مل الجليد الباردة PBS مرتين لتحلية جزء HDL. حجم برنامج تلفزيوني العالي ضروري لتحسين التنقل مع الكهربائي للهلام الاغاروز. بعد الطرد المركزي، وإزالة البروتين الدهني يحتوي على الأملاح والحفاظ على 4 درجات مئوية أو تخزينها في -80 درجة مئوية.

    8. الاغاروز جل الكهربائي

    1. Perfrom البروتين الدهني الاغاروز الكهربائي للهلام توظيف عدة مع تعديلات طفيفة من إرشادات الشركة المصنعة على النحو التالي.
      ملاحظة: هذه الخطوة هي فقط لتقييم جودة ونقاء عينات البروتين الدهني المركزة.
      1. لفترة وجيزة، الحصول على 6 ميكرولتر من الكسر البروتين الدهني المحلاة مع تنبيذ فائق الكثافة التدرج وتحميل على جل البروتين الدهني مسبقة الصب. استخدام lipop الإنسانمعايير rotein لVLDL، LDL و HDL كمرجع الحجم. تنفيذ الكهربائي في RT على 100 فولت لمدة 60 دقيقة باستخدام عازلة النائب الإعدادية.
      2. يجف الجل لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك وصمة عار لمدة 10 دقيقة في RT مع الدهون الأحمر 7B. يزيل اللون هلام في خليط من الميثانول في الماء 75:25 (ت / ت) والجافة مرة أخرى لمدة 5 دقائق.

    9. استخراج الحمض النووي الريبي وتنقية

    1. Perfrom عزل ميرنا بواسطة HDL البشري النقي باستخدام عدة المصل / البلازما ميرنا العزل والتنقية.
      1. لفترة وجيزة، إضافة 1 مل من الحمض النووي الريبي تحلل الكاشف 200 ميكرولتر من HDL النقى الاختلاط مع vortexer ثم حضنت لمدة 5 دقائق على RT لضمان التفكك الكامل للمجمعات البروتين النووي وتثبيط RNases.
      2. ثم ارتفاع 3.5 ميكرولتر من الاصطناعية انواع معينة ايليجانس الرنا الميكروي (سل-مير-39؛ 1.6 × 10 8 نسخ / ميكرولتر) إلى الخليط. ثم تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. أداء purificatiعلى من استخراج ميرنا مع الأعمدة تدور أزل حسب تعليمات الشركة الصانعة. قياس تركيز ميرنا من HDL النقي مع spectrophorometer.
      ملاحظة: شطف من ميرنا من الأعمدة تدور توظيف 16 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه.

    10. النسخ العكسي (RT-PCR)

    1. عزل 100 نانوغرام من ميرنا من HDL ارتفعت مع ميرنا الاصطناعية (سل-مير-39) وكتب العكسي في حجم رد الفعل 20 ميكرولتر توظيف مجموعة النسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. أداء الضوابط المناسبة دون قالب ميرنا (NTC) ودون العكسي مزيج أنزيم الناسخ (NRT).

    11. في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)

    1. Perfrom في الوقت الحقيقي PCR في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر مع 2 ميكرولتر من التخفيف 1: 2 من كدنا]، 10 ميكرولتر مزيج PCR، 2 ميكرولتر التمهيدي العالمي، 2 ميكرولتر من التمهيدي ميرنا و 4 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز.
    2. تشغيل reactiعلى في لوحات 96-جيدا في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها 45 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ومرحلة التمديد على 70 درجة مئوية لمدة 30 s.ec Perfrom جميع ردود الفعل في يثلث .
    3. بعد ذلك، Calcuate الكميات النسبية من ميرنا باستخدام 2 طريقة -ΔΔ ط م بعد تطبيع إلى التدبير المنزلي الجينات الاصطناعية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عزل البروتين الدهني العالي الكثافة بعد إزالة Exosomes
للحصول ميرنا من HDL عالي النقاء فمن الضروري إزالة exosomes التي تمثل مصدرا للتلوث ميرنا 7. وقد تم ذلك قبل تنبيذ فائق الكثافة التدرج مع مجموعة المتاحة تجاريا. لأغراض عملية تم تعديل معيار بروتوكول تنبيذ فائق الكثافة التدرج ثلاث خطوات التي وضعتها شركة تجارية (الشكل 1). يتطلب هذا البروتوكول الطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة بسرعة 140،000 دورة في الدقيقة وهو أسرع بكثير من البروتوكولات المستخدمة مع القوات الطرد المركزي ما يصل الى 54000 دورة في الدقيقة 3 و 8 و 9 و 10. توظيف الدوار T-1270 على نطاق واسع مع قوة قصوى تبلغ 70،000 دورة في الدقيقة، وأجري الطرد المركزي في البداية كان خارجا مع أنابيب polyallomer التي فشلت في مقاومة القوات الطرد المركزي. لتجنب انهيار أنابيب،تم استخدام أنابيب البولي بنجاح. الوقت الطرد المركزي أمر بالغ الأهمية للأكسدة البروتين الدهني وربما تدهور ميرنا 11. تم اختبار عدة مرات ومن ثم الطرد المركزي مختلفة، تتراوح بين مجموعه من 8-96 ساعة. وعلاوة على ذلك تم تعديل درجة الحرارة التي تم تنفيذ الطرد المركزي من أساس الوقت الطرد المركزي وقوة، على التوالي.

نقاء عالية الكثافة البروتين الدهني الكسور
تم فحص نقاء معزولة كسور البروتين الدهني عالي الكثافة مع الكهربائي للهلام الاغاروز الشكل 2. يوضح نتيجة الكهربائي نموذجية للالطرح HDL معزولة من قبل تنبيذ فائق التدرج. وبينت بوضوح أن HDL كانت خالية من أي تلوث VLDL ويسلك نموذجي α-التنقل. عدم وجود أي البروتينات الدهنية المهاجرة α في VLDL وLDL كسور يدل على الشفاء الكامل من HDL خلال ultracent خطوة rifugation. جزء HDL، ولكن، أيضا أظهر بعض أثر للβ-التنقل، وهو نمط النطاقات الكهربي المعروف بسبب التلوث مع البروتينات الدهنية (ليرة لبنانية (أ)) 12.

القضاء على يرة لبنانية (أ) من HDL متفرقة
دراسة miRNAs نفذت في HDL يتطلب عزل HDL من أعلى نقاء. تدخل ليرة لبنانية (أ) مع HDL يحتمل أن يساهم في انتقال التلوث من HDL مع miRNAs نفذت في LDL. للحد من هذا التلوث من HDL، تم إضافة 15 ميكرولتر من β-المركابتويثانول 10 إلى حل مئوية خلال خطوة الطرد المركزي الأخيرة (الشكل 1). وقد تبين إضافة β-المركابتويثانول لا لتغيير خصائص الكثافة HDL 10. كما هو معروض في الشكل 3. أسفرت إضافة β-المركابتويثانول في غياب أي البروتينات الدهنية المهاجرة ب متسقة مع إزالة فعالة جدا ليرة لبنانية (أ).

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> تنقية ميرنا من HDL
عزل ميرنا وحاولت في البداية استخدام كاشف تحلل والذي يستخدم عادة لاستخراج الحمض النووي الريبي من الدم. على الرغم من أن هذه الطريقة أدت إلى العائد RNA جيد جدا (91.45 نانوغرام / ميكرولتر) ولكن بعد أن أظهر التحليل الطيفي مرضية نقاء الحمض النووي الريبي. تنقية إضافية من الحمض النووي الريبي معزولة عن طريق إزالة الفينول تحسن نقاء ولكن كان العائد RNA الآن منخفضة بشكل ملحوظ. بعد ذلك، تم اختبار مجموعة أخرى والتي أظهرت نقاء مقبول RNA (260/280 نسبة نانومتر 1.7) ولكن كان 26 أضعاف أقل مقارنة العائد RNA مع كاشف تحلل (3.45 مقابل 91.45 نانوغرام / ميكرولتر). تم الحصول على أفضل النتائج لنقاء RNA مقبول مع تحقيق عائد جيد مع miRNeasy المصل / البلازما عدة (48.2 نانوغرام / ميكرولتر، ونسبة 260/280 نانومتر 1.6)، وبالتالي هذا الإجراء استخراج كان يعمل في وقت لاحق للكشف عن ميرنا من عزلة HDL البروتين الدهني الكسر.

الآثار البيئية-together.within الصفحات = "1"> لإثبات جدوى لتحديد miRNAs نفذت في HDL البشري تنقيته مع هذا الأسلوب، اخترنا لتضخيم مير-223. وقد تم اختيار هذا ميرنا لتم التعرف مير-223 في شحنة من HDL وتبين لقمع الكوليسترول الحميد امتصاص 5. الشكل 4A. يظهر مؤامرة سجل نموذجية من منحنيات التضخيم مقارنة عتبة ودورة عتبة القيم الأساسية بعد التحسين للتفاعل PCR لمير-223 وارتفعت في سيل-مير-39. وقد استخدم هذا الجين الاصطناعية كما الرقابة الداخلية التي لا توجد تقارير عن نطاق السيطرة تطبيع المعروف ميرنا في البلازما. وبالإضافة إلى ذلك، عدة أنشئت الجينات التدبير المنزلي الذاتية المحتملة مثل RNU6-2، RNU-48، HY3 لا يمكن الكشف عن ويمكن أن يتم الكشف عن SNORD95 في تنقية HDL، ولكن الفرق في القيم ط مير-223 وSNORD95 أقل من خمس ( البيانات غير ظاهرة). ذوبان تحليل المنحنى هو موضح في الشكل 5. ويظهر بشكل واضح متميز واحدةالذروة بما يتفق مع التضخيم من ميرنا انتقائية في PCR السابقة. كما هو موضح في الشكل رقم 4B، يمكن دائما يتم الكشف عن كل من مير-223 والإشارة سل-مير-39 في جميع نطاقات الموالية ستة. ولوحظت اختلافات صغيرة نسبيا بين جميع الأفراد لسيل-مير-39 مقارنة مع مير-223. هذه النتائج تدعم عزل HDL في نقاء عالية للسماح للكشف عن البضائع ميرنا لها.

الكشف عن مير 223 في تنقية HDL
في الوقت الحقيقي كان يستخدم طريقة PCR الكمي لقياس مزدوج دبوس هيكل السلائف ميرنا إلى ضفيرة واحدة ميرنا. ويحتاج هذا الأسلوب إلى الأمام / الخلف الاشعال الجينات المحددة وعكس الناسخ بالحرارة لتحويل هيكل القاسي من ميرنا إلى كدنا]. تم تضخيم [كدنا] في وقت لاحق وكميا في الوقت الحقيقي باستخدام QPCR بمساعدة كشف الأخضر SYBR. الرنا الميكروي من مصل الدم والبلازما وتنقية البلازما HDL يمكن أن يكون بدقة التخصيصاتإد باستخدام نظام ميرنا RT PCR.

لدينا منتج تجريبي في التعبير الجيني مير-223 يعني أظهر قيمة ط م من 30.9 في HDL المنقى وكانت الضوابط السلبية المقابلة لها فوق 35 قطع (NTC = 38.1 قيمة ط م، والعلاج ببدائل النيكوتين وNAC لا تضخيم). في هذه التجربة، رأينا في عينات HDL النقاء تشكيل التمهيدي-ديمر مع درجة حرارة انصهار منخفضة (73 درجة مئوية في مير 223 و 75.5 درجة مئوية في سيل-مير-39) وارتفاع C قيمة ر من المقايسات ميرنا محددة (الجدول 1). و-dimers التمهيدي في الجدول رقم 1. تحدث على الأرجح بسبب تركيز عال من الاشعال في الحل. يحدث هذا في الغالب عندما تعلق الجزيئات التمهيدي لبعضهم البعض بعد 30 دورات PCR 13. وهذا يتيح لهم يصلب لجزيئات التمهيدي الأخرى وفي الواقع، أصبحت الخطية مصغرة القوالب وذلك سيكون سببا في ارتفاع الخلفية وربما يؤدي إلى جيل من C قيمة ر <40 للمجلس الوطني الانتقالي (لا أي نماذجالسيطرة) عينات ه.

شكل 1
الشكل 1. التمثيل التخطيطي لإجراء HDL العزلة. وقد قام تنبيذ فائق التدرج الكثافة HDL أعدت في سلسلة من ثلاث خطوات الطرد المركزي. ويوضح توزيع نطاقات البروتين الدهني وكسور متوسطة في التدرج الكثافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الاغاروز جل الكهربائي من البروتينات الدهنية معزولة دون β-المركابتويثانول. VLDL، LDL و HDL كسور معزولة من قبل تنبيذ فائق الكثافة التدرج دون إضافة -mercaptoethanol β إلى حل C demonst معدل وجود ليرة لبنانية (أ) في جزء HDL. الممرات 1 و 2 و 9 و 10 لكل تمثل حجم علامة. الممرات 3/4، 5/6 و 7/8 تمثل VLDL، LDL و HDL على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
أدى الشكل 3. الاغاروز جل الكهربائي من HDL المعزولة مع β-المركابتويثانول. إضافة -mercaptoethanol β إلى حل مئوية قبل خطوة الطرد المركزي الأخيرة في إزالة ليرة لبنانية (أ) من جزء HDL. الممرات 1 و 2 و 9 و 10 تمثل كل منها في حجم علامة. الممرات 3-8 تمثل HDL. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جنرال الكتريك = "1"> الشكل (4)
الشكل 4. التضخيم قطعة اثنين من miRNAs مختلفة والتعبير عن سيل-مير 39 و مير-223. (A) وقد أجريت في الوقت الحقيقي الكمي PCR تستخدم HDL معزولة خارج كما هو موضح. تم تشغيل PCR لمدة 45 دورات والنقطة التي يتقاطع منحنى عتبة سي تي -Value. وتشير البيانات إلى التعبير عن سيل-مير-39 (اللوحة اليسرى) ومير-223 (اللوحة اليمنى)، على التوالي. ويمثل الخط الأفقي عتبة الكشف. تم تعيين عدد من دورة 35 كما قطع لتضخيم إيجابي. وترد (ب) الممثل في الوقت الحقيقي PCR البيانات من HDL معزولة تم الحصول عليها من 6 عينات. يعني أولية تظهر القيم ط م لسيل-مير 39 و مير-223، التي تختلف أقل من 2 قيمة ط م في المنقى جزء HDL البلازما بين 6 عينات، كل من متبرع مختلف مستويات التعبير. تم إجراء التنميط التعبير باستخدام نظام PCR والمصل والبلازما miRN الإنسانوQRT-PCR. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. منحنيات ذوبان لسيل-مير 39 و مير-223. وكما هو موضح، وجود ذروة واحدة يشير التضخيم معين من سل-مير-39 (اللوحة اليمنى) ومير-223 (اللوحة اليسرى)، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1. الصف C قيمة طن من السيطرة السلبية والإيجابية للالاصطناعية سل-مير 39 و مير-223 تتميز في مصل الدم والبلازما، كدنا]، وتنقيته جزء HDL. المجلس الوطني الانتقالي (لا أي نماذجه السيطرة)، NRT (لا إنزيم النسخ العكسي)، NAC (لا تحكم التضخيم والمياه والكواشف فقط من QRT-PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتحديد المؤشرات الحيوية جديدة من الدم تساعد في التشخيص السريري والتشخيص للأمراض المختلفة. لقد عرف الرنا الميكروية لامتلاك كل الصفات من المؤشرات الحيوية وثبت في دراسات مختلفة 14-17. في هذه الدراسة أننا أظهرنا طريقة سهلة سريعة وبسيطة لعزل ميرنا من HDL البلازما. كثافة التقليدية التدرج طريقة فائقة الطرد المركزي من العزلة من VLDL، LDL و HDL يعتمد على عينات دقيقة من البلازما، وإعداد دقيق للحل العازلة، وقياس الكثافة ونقل كمية من كسور البروتين الدهني أسفل 8. هناك طرق عديدة التي تم وصفها لعزل HDL 8 -11. وهذه الأساليب هي في الغالب إما شاقة جدا أو تتطلب كمية كبيرة من البلازما وغسيل الكلى واسعة النطاق لتحلية عزل البروتينات الدهنية ولا تزيل تماما exosomes والبروتينات الدهنية كمصدر للmiRNAs 3. ولمعالجة هذه العيوب أنشأنا هذه الاشتراكيةmple وسيلة سريعة لعزل ميرنا من HDL البلازما.

وكان الهدف الرئيسي والهدف الأساسي من هذه الدراسة لفصل وعزل مجمع HDL-ميرنا بواسطة تنبيذ فائق دون كرات الدم الحمراء، ومعطف بافي، exosomes، حويصلات إفرازية، VLDL، LDL والبروتينات الدهنية (أ) تدخل، ثم عزل miRNAs من HDL النقي. والتلوث والتدخل في أي من هذه المكونات مع HDL يغير من النتائج التجريبية المتوقعة والبيانات التنميط ميرنا. عزل DNA و RNA وmiRNAs من الدم هو مهمة صعبة للغاية نظرا لطبيعتها المعقدة. لطالما طرحت مع الكثير من التحديات التقنية للأحماض النووية (بما في ذلك miRNAs) الاستخلاص والتنقية مقارنة مع الخلايا والأنسجة والعينات الجهاز 18. أيضا هناك أقل نسبيا الجينات ميرنا موجودة في خلايا الدم. الدم هو الناقل المعروف exosomes، الحويصلات الإفرازية وهدلس جنبا إلى جنب مع miRNAs تعميم الحرة، والتي هي أقل نسبيا 18. ولذلك، فإن أكبرمطلوب جبل الدم حجم العينة البلازما لمعالجة وعزل مجمع HDL-ميرنا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطبيعة قصيرة من miRNAs وتسلسل هدفهم، حتى يجعل من الصعب تحقيق خصوصية كافية مع التقنيات النوكليوتيد PCR القياسية. المكونات الخلوية من الدم ويعرف دائما أن تفرز ميرنا ومرنا في الاستجابة للتغير في البيئة الخارجية بما في ذلك درجة الحرارة، والكائنات الحية الدقيقة والسموم أو الإجهاد. أيضا وجود nucleases، RNases والبروتينات تعميم والإنزيمات الأخرى في الدم وتؤثر هذه ميرنا العزلة.

كما يفتقر إلى ميرنا التضخيم تعميم راسخة الجينات التدبير المنزلي المعروفة مثل β-الأكتين أو GAPDH للتطبيع البيانات أثناء استخدام طريقة ΔΔCt من QRT-PCR. وهذا يطرح ثانية واحدة من العقبات الرئيسية لميرنا التنميط من تعميم مصل الدم أو البلازما 19. يشيع استخدامها snoRNAs قصير غير الترميز، ونادرا ما يتم التعبير عن snRNAs في الدم وهذا ماكيس أكثر من ذلك صعوبة في الاستفادة منها كما الجينات الرقابة الداخلية. لحل هذه عيوب snoRNAs وsnRNAs ولتجنب أي صعوبات تقنية كنا الاصطناعية ضبط مسمار في المصل / البلازما في المقايسات كما الجينات الرقابة الداخلية على النحو التالي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. وهو يساعد في تطبيع لأي التضخيم غير محددة وحدثت تغييرات خلال تنقية ميرنا وتفاعل PCR 18. حتى في حالة تدهور ميرنا أو عدم وجود أي إشارات محددة التضخيم ميرنا، وارتفاع في السيطرة يجب أن يتضاعف في ردود الفعل QRT-PCR وإعطاء إشارة المتوقعة بقيمة ط ثابتة إلى حد معقول وموحدة. واستنادا إلى ارتفاع في التضخيم التحكم جنبا إلى جنب مع ثلاثة ضوابط السلبية والضوابط الإيجابية وصلنا جيد التحقق من صحة البيانات الأمثل لمير 223 جين. وأكد هذا أننا قد حصلت على عائد جيد من مير-223 من تعميم HDL البلازما من هذه الطريقة البسيطة.

في الختام، أنشأنا الأسلوب سو تنبيذ فائق التدرج الكثافة (DGUC) مع إضافة β-المركابتويثانول لتنقية ميرنا من HDL البلازما. طريقة ديها العديد من المزايا: (أ) يتم فصل VLDL، LDL و HDL في غضون فترة قصيرة من الوقت عن طريق نابذة أرضية مقارنة مع الطرق الأخرى التي تحتاج 24-96 ساعة 8-11. (ب) LDL و HDL غسيل الكلى، وتحلية / التركيز، وتجري داخل 1 ساعة مقارنة مع الطرق الأخرى التي أخذت 24 ساعة أو أكثر 8،9. إزالة (ج) تلوث البروتينات الدهنية التي كتبها β-المركابتويثانول في جزء HDL، ولكن ليس المقصود أن تستخدم في جزء LDL. (د) حجم العينة المطلوب هو فقط 1 مل لكل تدريجي VLDL، LDL والعزلة HDL مقارنة مع الطرق الأخرى التي تحتاج الى مزيد من حجم العينة. (ه) والتقليل من الضرر التأكسدي للHDL خلال عزل 11؛ (و) كحد أقصى 12 عينة يمكن تحليلها في المدى التحليلي فصل البروتين الدهني واحد؛ (ز) حجم العينة 250 ميكرولتر من HDL استخراج ما يكفي لتحليل مالجمهورية الاسلامية الايرانية تركيز / النقاء، الاغاروز الكهربائي للهلام، وتركيز البروتين، ميكروأري والإجراءات RT-QPCR. القيود المفروضة على طريقتنا هي أن نسبة صغيرة من HDL-ميرنا قد تفقد خلال الخطوة exosome هطول الأمطار ويجب أن يكون حجم العينة المطلوبة البلازما أكثر من 200 ميكرولتر لعزل HDL-ميرنا.

وأخيرا، لا تستمد الرنا الميكروية البلازما فقط من خلايا الدم التالفة أو منشقا في الدورة الدموية ولكن أيضا من خلايا الدم الطبيعية السليمة والخلايا من أجزاء أخرى من الجسم الذي يشمل مختلف الأنسجة والأعضاء السليمة والمريضة يتأثر الوضع الصحي المستمر من الجسم تمت تنقيته 20. هذه الدراسة منهجية ناضجة مير 223 من HDL معزولة من البلازما البشرية. وتوضح هذه الدراسة بوضوح أن مستويات النضج مير-223 في البلازما HDL عالي النقاء قابلة للكشف ومستقرة وقابلة للتكرار ومتسقة بين عينة الأفراد، مما يسهل إلى حد كبير استخدام السريري من الاختبارات المنفعة في المستقبل لالبروتينات الدهنية، ليالاصدار، القلب والأوعية الدموية وغيرها من متلازمة أيضية. والمثير للدهشة، miRNAs ناضجة، وخاصة مير-223 من HDL البلازما هي على الارجح مقاومة للنوكلياز الهضم والظروف القاسية الأخرى التي يحتمل أن يفسر استقرار مير-223 في HDL النقي. آلية مقاومة مير-223 لRNases تتطلب مزيدا من الدراسة. من الواضح، ودراسة ملامح التعبير ميرنا في هذه تنقية البلازما HDL أن تسليط الضوء على علامات ميرنا المستقبلية في دراسة الأمراض المختلفة. هذه الرنا الميكروية HDL المرتبطة في البلازما ويمكن استخدام المحتملة على المؤشرات الحيوية التشخيص السريري وشخصية الطب في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  2. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (12), 5003-5008 (2011).
  3. Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, (4), 423-433 (2011).
  4. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
  5. Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33, (10), 1956-1964 (2013).
  6. Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114, (1), 183-192 (2014).
  7. Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16, (4), 415-421 (2004).
  8. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  9. Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
  10. Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
  11. Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
  12. Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
  13. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
  14. Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717, (1-2), 85-90 (2011).
  15. Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
  16. Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2, (19), (2014).
  17. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
  18. Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. www.qiagen.com (2015).
  19. Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
  20. Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics