Méthode rapide et simplifié Haut Isolation Grâce-put de miARN de hautement purifiées High Density Lipoprotein

Biology

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Summary

Les microARN jouent un rôle régulateur important et sont en train de devenir de nouvelles cibles thérapeutiques pour diverses maladies humaines. Il a été montré que les miARN sont transportés dans des lipoprotéines à haute densité. Nous avons mis au point une méthode simplifiée pour isoler rapidement les HDL purifiée convenant pour l'analyse des miARN du plasma humain.

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Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Collecte des échantillons de sang

  1. Recueillir le jeûne des échantillons de sang veineux périphériques en 10 tubes ml en plastique contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique anticoagulant (EDTA) (qui a plusieurs avantages par rapport à d'autres anticoagulants) par ponction veineuse standard d'une veine de premier plan dans le pli du coude.
  2. Centrifuger les échantillons de sang à 1600 g pendant 20 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse pour obtenir un plasma exempt de globules rouges et de petites quantités d'ARN.
  3. Séquentiellement centrifuger le surnageant à 3000 g (4 ° C) dans un seau rotor oscillant pendant 10 minutes pour enlever WBC et plaquettes, puis 15 minutes supplémentaires pour éliminer les débris de cellules restant respectivement.
  4. Mesurer la densité du plasma en utilisant un densitomètre à température ambiante selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE: Le réglage de la densité (d = 1,023 g / ml) avec une solution saline à 0,9% peut être nécessaire après élimination des exosomes, mais avant l'ultracentrifugation en gradient de densité.
  5. 2. Exosome Radiation de plasma

    1. Retirez les exosomes circulants qui ont une densité similaire à HDL et représentent une source quantitativement importante de miRNA 3.
      1. Pour ce faire, en ajoutant une solution exosomes de précipitation 252 pi à 1 ml de plasma suivie d'une incubation pendant 30 min à 4 ° C. Pour sédimenter les exosomes, centrifuger le mélange pendant 30 minutes à 1500 g à 4 ° C.
      2. Pour isoler HDL, transférer 1 ml du surnageant résultant à un tube d'ultracentrifugation en polycarbonate à paroi épaisse pour un traitement ultérieur avec gradient de densité ultracentrifugation (voir ci-dessous).

    3. gradient de densité ultracentrifugation (Figure 1).

    1. Pour séparer HDL utiliser un processus en 3 étapes utilisant une ultracentrifugation de plancher avec un rotor à angle fixe fonctionnant à 448811 x G et 8 ° C, respectivement.
    2. Préparer trois solutions différentes de densité séquentiellement et frais pour chaque isolement.
      1. Préparer la solution A (isolement de VLDL, d = 1,006 g / ml) en dissolvant 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mole), de 0,1 g EDTA2Na et 1 ml de NaOH 1 N dans 1000 ml d'eau distillée autoclavée. Ensuite, ajoutez un 3 ml supplémentaires d'eau autoclavée-distillée.
      2. Préparer la solution B (isolement des LDL, d = 1,182 g / ml) par addition de 25,2 g de NaBr pour 100 ml de solution A (NaCl 0,195 mol, NaBr, 2,44 mol).
      3. Préparer la solution C (séparation des HDL, d = 1,470 g / ml) en mélangeant 78,8 g de NaBr avec 100 ml de solution A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmer la densité appropriée à la température ambiante en utilisant un densitomètre. Gardez toutes les solutions à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

    4. Isolement de VLDL

    1. Mélanger 1 ml de plasma (moyenne densité = 1,023 g / ml) et 200 ul de nuclease libre de graisse rouge 7B dans un tube d'ultracentrifugation à paroi épaisse de 6,5 ml de polycarbonate.
    2. Puis la couche avec précaution 5 ml de la solution A sur le dessus du mélange. Si nécessaire, ajoutez la graisse supplémentaire Red 7B sur le dessus de la solution A to équilibrer le poids de chaque tube. Centrifugeuse pendant 2 h (accélération - 5), (décélération - 7).
      NOTE: Lors de la centrifugation, les lipoprotéines sont accumulées en tant que groupe à leurs régions de densité d'équilibre.
    3. A la fin de la course d'observer 2 couches. Retirer 1,5 ml de la fraction VLDL représentant la couche supérieure et conserver à 4 ° C.
    4. Enfin, en utilisant un transfert de pipette 4 ml à partir du fond du tube contenant les LDL, HDL, de l'albumine et de la fraction d'acide gras dans un nouveau tube de polycarbonate pour l'isolement de la LDL.

    5. Isolement des LDL

    1. Mélanger 2 ml de solution B et 100 nucléase ul Fat libre Red 7B dans le tube contenant la fraction LDL et HDL (section 4), respectivement.
    2. Puis centrifuger pour 3 heures (accélération 9, décélération 7). Par la suite, retirer 1,5 ml de la fraction LDL représente la couche supérieure et de garder à 4 ° C ou conserver à -80 ° C. Enfin, le transfert de 4 ml à partir du fond du tube contenant les HDLla fraction à un nouveau tube de polycarbonate.

    6. Isolement du HDL

    1. Mélanger 2 ml de solution C, 100 ul de nuclease sans matières grasses rouge 7B et 15 ul de 98% β-mercaptoéthanol dans le tube contenant la fraction de HDL, respectivement.
    2. Centrifugeuse pendant 3 h (accélération 9, décélération 7). retirer ensuite 2 ml de la fraction HDL représentant la couche supérieure et soit conserver à 4 ° C ou conserver à -80 ° C.

    7. Le dessalage et concentration des fractions lipoprotéiques

    1. Pour éviter toute interférence avec la suite électrophorèse sur gel d'agarose et PCR, enlever le sel ajouté pendant gradient de densité ultracentrifugation en utilisant des dispositifs de filtre centrifuge avec la coupure de poids moléculaire approprié (3K tube pour le VLDL et 10K tube pour le LDL / HDL) comme décrit par les instructions du fabricant excessive.
      1. En bref, après avoir ajouté 2,5 ml de PBS froid (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM Na2HPO4 8, 2 mM KH2PO4; pH 7,4) centrifuge toute la fraction VLDL-recueillie pendant ultracentrifugation à gradient de densité à 4 ° C pendant 60 min en utilisant un rotor à godet oscillant.
      2. Dessaler la fraction LDL deux fois avec 10 ml de PBS refroidi à la glace pendant 30 minutes chacune. Ensuite, utiliser 13 ml PBS glacé deux fois pour dessaler la fraction HDL. Le volume PBS plus élevé est nécessaire pour améliorer la mobilité par électrophorèse sur gel d'agarose. Après centrifugation, retirer les contenant solutés de lipoprotéines et de garder à 4 ° C ou stocké à -80 ° C.

    8. Agarose Gel Electrophoresis

    1. Perfrom lipoprotéines électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant le kit avec des modifications mineures des instructions du fabricant comme suit.
      REMARQUE: Cette étape est juste pour évaluer la qualité et la pureté des échantillons de lipoprotéines concentrés.
      1. En bref, obtenir 6 pi de la fraction de lipoprotéine dessalé avec une ultracentrifugation à gradient de densité et le charger sur un gel de lipoprotéine de pré-coulée. Utilisez lipop humainenormes rotein pour VLDL, LDL et HDL comme référence de taille. Effectuer une électrophorèse à RT à 100 V pendant 60 minutes en utilisant un tampon Rep Prep.
      2. Sécher le gel pendant 10 min, puis la coloration pendant 10 min à température ambiante avec Fat Red 7B. Destain le gel dans un mélange de méthanol-eau 75/25 (v / v) et on sèche à nouveau pendant 5 min.

    9. RNA Extraction et purification

    1. Perfrom isolement de miARN par HDL humain purifié en utilisant le kit sérum / plasma isolement miARN et purification.
      1. En bref, ajouter 1 ml d'ARN réactif de lyse à 200 pi de HDL purifiée, mélanger avec un vortex puis incubé pendant 5 min à température ambiante pour assurer la dissociation complète des complexes de nucléoprotéine et l'inactivation de RNases.
      2. Puis pic de 3,5 pi de Caenorhabditis elegans synthétique microARN (cel-miR-39, 1,6 x 10 8 copies / ul) dans le mélange. Puis procéder à l'extraction d'ARN selon les instructions du fabricant.
    2. Effectuer Purificatisur des extraits-miARN avec des colonnes de spin éluées selon les instructions du fabricant. Mesurer la concentration de miARN de HDL purifiée avec un spectrophorometer.
      NOTE: Elution de miRNA des colonnes de centrifugation utilisé 16 pi d'eau sans RNase.

    10. Transcription inverse (RT-PCR)

    1. Isolât 100 ng du miARN des HDL dopés avec des miARN synthétique (cel-miR-39) et une transcription inverse dans un volume réactionnel de 20 ul en utilisant le kit de transcription inverse et selon les instructions du fabricant.
    2. Effectuer des contrôles appropriés sans modèle miRNA (NTC) et sans mélange inverse transcriptase enzyme (NRT).

    11. PCR en temps réel (qRT-PCR)

    1. Perfrom PCR en temps réel dans un volume total de 20 pi avec 2 ul d'une dilution 1: 2 de l'ADNc, 10 pi de mélange de PCR, 2 pi amorce universelle, 2 ul d'amorces miARN et de l'eau libre de RNase-4 pl.
    2. Exécutez les reactidans des plaques à 96 puits à 95 ° C pendant 15 min, puis 45 cycles de 94 ° C pendant 15 secondes et 55 ° C pendant 30 secondes et une phase d'élongation à 70 ° C pendant 30 s.ec perfrom toutes les réactions en triple exemplaire .
    3. Ensuite, les quantités relatives Calcuate de miARN en utilisant la méthode -ΔΔ Ct 2 après la normalisation du gène de ménage synthétique selon les instructions du fabricant.

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Representative Results

Isolement de lipoprotéines de haute densité après suppression des exosomes
Pour obtenir miRNA de HDL hautement purifié , il est nécessaire d'enlever les exosomes qui représentent une source de contamination miRNA 7. Ceci a été réalisé avant l'ultracentrifugation en gradient de densité avec un kit disponible dans le commerce. Pour des raisons pratiques un protocole standard d'ultracentrifugation à gradient de densité trois étapes développée par la société commerciale a été modifiée (figure 1). Ce protocole nécessite une centrifugation avec un rotor à angle fixe à une vitesse de 140 000 tours par minute , qui est sensiblement plus rapide que les protocoles couramment utilisés avec des forces de centrifugation à 54 000 tours par minute 3, 8, 9 et 10. En utilisant un rotor T-1270 largement disponible avec force maximale de 70 000 tours par minute, la centrifugation a été initialement réalisée avec des tubes de polyallomère qui ont échoué à résister aux efforts de centrifugation. Pour éviter l'effondrement des tubes,tubes en polycarbonate ont été utilisés avec succès. Temps de centrifugation est critique pour l' oxydation des lipoprotéines et potentiellement miRNA dégradation 11. Par conséquent, plusieurs différents temps de centrifugation allant d'un total de 8 à 96 h ont été testés. Par ailleurs la température à laquelle la centrifugation a été effectuée a été ajustée en fonction du temps de centrifugation et de force, respectivement.

Pureté de la lipoprotéine de haute densité Fractions
La pureté des fractions isolées de lipoprotéines de haute densité a été vérifiée par électrophorèse sur gel d' agarose. La figure 2 illustre un résultat d' une électrophorèse typique pour la soustraction de HDL isolées par ultracentrifugation en gradient. Il a clairement montré que HDL était dépourvue de toute contamination de VLDL et présente α-mobilité typique. L'absence de migration des alpha-lipoprotéines dans les fractions VLDL et LDL démontre la récupération complète des HDL au cours de la ultracentétape de rifugation. La fraction HDL, cependant, a également montré des traces de β-mobilité, un motif de bandes électrophorétiques connu en raison de la contamination par des lipoprotéines (Lp (a)) 12.

L' élimination de la Lp (a) de HDL isolé
Étude miARN transportés dans HDL nécessite l'isolement de HDL de la plus haute pureté. L'interférence de la Lp (a) avec HDL contribue potentiellement à une contamination croisée avec des HDL miARN transportés dans les LDL. Pour réduire au minimum la contamination des HDL, 15 ul de β-mercaptoéthanol 10 On a ajouté à la solution C au cours de la dernière étape de centrifugation (figure 1). L' addition de β-mercaptoéthanol a été montré de ne pas changer HDL propriétés de densité 10. Comme montré sur la figure 3., l' addition de β-mercaptoéthanol a donné lieu à l'absence de lipoprotéines B compatibles avec la migration élimination très efficace de la Lp (a).

Purification de miARN de HDL
L'isolement de miARN a d'abord été tentée en utilisant le réactif de lyse qui est couramment utilisé pour l'extraction d'ARN à partir de sang. Bien que cette méthode a donné lieu à un très bon rendement de l'ARN (91,45 ng / ul), mais après analyse spectrophotométrique a montré la pureté de l'ARN insatisfaisante. Une purification supplémentaire de l'ARN isolé en éliminant le phénol a amélioré la pureté, mais le rendement de l'ARN était maintenant très faible. Ensuite, un autre kit a été testée qui a montré une pureté acceptable d'ARN (260/280 nm rapport de 1,7) , mais le rendement en ARN a été 26 fois plus faible par rapport au réactif de lyse (3,45 par rapport à 91,45 ng / ul). Les meilleurs résultats pour la pureté de l'ARN acceptable avec un bon rendement, ont été obtenus avec le kit miRNeasy de sérum / plasma (48,2 ng / ul; rapport 260/280 nm de 1,6) et par conséquent, cette procédure d'extraction a ensuite été utilisées pour la détection de miARN de l'isolement la fraction de lipoprotéines HDL.

3 et a été montré pour réprimer le cholestérol HDL absorption 5. La figure 4A. montre un tracé de log typique des courbes d'amplification comparant les valeurs de seuil et de cycle de seuil de référence après optimisation de la réaction PCR pour le miR-223 et enrichis en Cel-mir-39. Ce gène synthétique a été utilisé comme contrôle interne, car il n'y a pas de rapports de contrôle de normalisation connu pour miARN dans le plasma. En outre, plusieurs gènes de ménage potentiels établis endogènes tels que RNU6-2, RNU-48, HY3 ne pouvaient pas être détectées et SNORD95 n'a pu être détectée dans les HDL purifiée, mais la différence dans les valeurs de Ct de miR-223 et SNORD95 est inférieure à cinq ( données non présentées). Melting analyse de la courbe illustrée à la figure 5. montre clairement une nette uniquecrête compatible avec l'amplification d'un miARN sélectif dans le PCR précédent. Comme cela est illustré sur la figure 4B., À la fois miR-223 et de la référence Cel-miR-39 peut toujours être détecté dans l' ensemble des six bandes pro. Relativement petites variations entre tous les individus ont été observés pour Cel-mir-39 par rapport à miR-223. Ces résultats confirment l'isolement de HDL à haute pureté pour permettre la détection de sa cargaison miARN.

Détection de miR-223 dans Purifié HDL
en temps réel méthode PCR quantitative a été utilisée pour quantifier épingle double-structure miRNA précurseurs à simple brin miARN. Cette méthode a besoin d'un avant / arrière amorces spécifiques du gène et un transcriptase inverse thermostable pour convertir la structure en épingle à cheveux du miRNA à l'ADNc. L'ADNc a été ensuite amplifié et quantifié à l'aide qPCR en temps réel à l'aide de la détection SYBR Green. MicroARN à partir de sérum, le plasma et le plasma HDL purifié peut être précisément profiled en utilisant le système miRNA RT PCR.

Notre produit expérimental de la moyenne miR-223 l'expression du gène a montré une valeur Ct de 30,9 HDL purifié et ses contrôles négatifs correspondants étaient au-dessus de 35 coupure (NTC = 38,1 valeur Ct, TRN et NAC ne sont pas amplifiés). Dans cette expérience, nous avons vu dans les échantillons de HDL purifiées la formation d'Primer-dimère avec basse température de fusion (73 ° C dans miR-223 et 75,5 ° C en Cel-miR-39) et supérieur t valeur de C que les essais de miARN spécifiques (Tableau 1). Les amorces-dimères dans le tableau 1. se produisent probablement à cause d'une concentration élevée d'amorces dans la solution. Cela se produit surtout lorsque des molécules d' amorces se fixent les unes aux autres après 30 cycles de PCR 13. Cela leur permet de recuire à d' autres molécules d' amorce et en vigueur, deviennent des mini-modèles linéaires et il causera plus de fond et peut conduire à une génération de t valeur de C <40 pour NTC (No template) contrôle des échantillons.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique du mode opératoire d'isolement HDL. HDL a été préparé par ultracentrifugation à gradient de densité dans une série de trois étapes de centrifugation. Répartition des bandes de lipoprotéines et des fractions intermédiaires dans le gradient de densité sont illustrés. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Agarose Gel Electrophoresis de lipoprotéines isolées Sans β-mercaptoéthanol. VLDL, LDL et HDL fractions isolées par gradient de densité ultracentrifugation sans ajouter mercaptoéthanol β à la solution C demonstévaluer la présence de la Lp (a) dans la fraction HDL. Les pistes 1, 2, 9 et 10 représentent chacune le marqueur de taille; Lanes 3/4, 5/6 et 7/8 représentent VLDL, LDL et HDL , respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
La figure 3. Agarose Gel Electrophoresis HDL isolé avec β-mercaptoéthanol. Ajout mercaptoéthanol β à la solution C avant la dernière étape de centrifugation a entraîné la suppression de la Lp (a) de la fraction HDL. Les pistes 1, 2, 9 et 10 représentent chacun le marqueur de taille; Lanes 3-8 représentent HDL. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 4. Amplification Plot de deux différents miARN et expression de Cel-miR-39 et miR-223. (A) , la PCR quantitative en temps réel en utilisant HDL isolé a été effectuée comme décrit. La PCR a été effectuée pendant 45 cycles et le point où la courbe coupe le seuil est le C T -Value. Les données montrent l'expression de Cel-miR-39 (à gauche) et miR-223 (panneau de droite), respectivement. La ligne horizontale représente le seuil de détection. Un certain nombre de cycle de 35 a été fixé comme seuil pour l' amplification positive. (B) des données représentant PCR en temps réel à partir de HDL isolé obtenu à partir de 6 échantillons sont présentés. Raw signifie valeurs Ct sont indiquées pour Cel-miR-39 et miR-223, dont les niveaux d'expression varient de moins de 2 valeur Ct dans la fraction purifiée HDL de plasma entre 6 échantillons, chacun à partir d'un donneur différent. Expression profilage a été réalisée en utilisant le système de PCR et le sérum humain et Plasma mirnUn qRT-PCR. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Courbes de fusion pour Cel-miR-39 et miR-223. Comme illustré, la présence d'un pic unique indique l' amplification spécifique de Cel-miR-39 (panneau de droite) et miR-223 (panneau de gauche), respectivement. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1. Ligne C t valeur de contrôle négatif et positif de synthèse Cel-miR-39 et miR-223 caractérisé en ce sérum, le plasma, l' ADNc, et la fraction de HDL purifiée. NTC (No template contrôle), NRT (No enzyme de transcription inverse), NAC (Pas de contrôle d'amplification, seulement de l'eau et des réactifs de qRT-PCR).

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Discussion

Identification de nouveaux marqueurs biologiques du sang aider au diagnostic clinique et le pronostic de différentes maladies. Les microARN ont connu pour posséder toutes les qualités de biomarqueurs et ont été montrés dans diverses études 14-17. Dans cette étude, nous avons démontré méthode facile simple et rapide pour isoler miRNA de HDL plasmatique. Gradient de densité conventionnel procédé d' ultracentrifugation d'isolement de VLDL, LDL et HDL dépend de l' échantillonnage précis du plasma, une préparation précise de la solution tampon, la mesure de la masse volumique et le transfert quantitatif des fractions de lipoprotéines de fond 8. Il existe de nombreuses méthodes qui ont été décrites pour isoler le HDL 8 -11. Ces méthodes sont souvent soit très laborieux ou exigent un grand volume de plasma et une dialyse pour dessalage isolé lipoprotéines et ne suppriment pas complètement exosomes et lipoprotéines comme une source de miARN 3. Pour remédier à ces lacunes, nous avons établi ce simple et méthode rapide d'isolement des miARN de HDL plasmatique.

L'objectif principal et le but principal de cette étude était de séparer et d'isoler complexe HDL-miARN par ultracentrifugation sans hématies, buffy coat, exosomes, vésicules sécrétoires, VLDL, LDL et lipoprotéines (a) des interférences, puis isoler miARN de HDL purifié. Contamination et interférence de l'un de ces composants avec HDL modifieront les résultats expérimentaux attendus et miRNA données de profilage. Isolement de l'ADN, l'ARN et miARN à partir du sang est une tâche très difficile en raison de sa nature complexe. Il a toujours été posé avec beaucoup de défis techniques à des acides nucléiques (y compris les miARN) extraction et de purification par rapport à des cellules, des tissus et des échantillons d'organes 18. En outre, il y a relativement moins de gènes de miARN présents dans les cellules sanguines circulantes. Le sang est un support connu pour exosomes, des vésicules sécrétoires et HDL ainsi miARN circulants libres, qui sont relativement moins 18. Par conséquent, une plus grandemontage de sang volume d'échantillon de plasma est nécessaire pour le traitement et l'isolement du complexe HDL-miARN. En outre, la brièveté du miARN et leurs séquences cibles, rend encore plus difficile l'obtention d'une spécificité suffisante avec les technologies d'oligonucléotides PCR standard. Les composants cellulaires du sang sont toujours savent sécréter miARN et ARNm en réponse au changement dans l'environnement externe, y compris la température, des micro-organismes et toxines ou stress. Aussi la présence de nucléases, RNases, protéines circulantes et d'autres enzymes dans le sang affectera ces miARN isolement.

L'amplification miRNA circulant manque aussi un bien établis gènes de ménage connus comme β-actine ou GAPDH pour la normalisation des données tout en utilisant la méthode ΔΔCt de qRT-PCR. Cela pose à nouveau l' un des principaux obstacle pour miRNA profilage de circuler le sérum ou le plasma sanguin 19. Couramment utilisé courtes snoRNAs de codage non et ARNsn sont rarement exprimés dans le sang et ce mperm et plus difficile de les utiliser comme des gènes de contrôle interne. Pour résoudre ces inconvénients de snoRNAs et ARNsn et d'éviter toute difficulté technique, nous avons utilisé le contrôle Spike-In synthétique sérum / plasma dans les essais comme gène de contrôle interne comme suit selon le protocole du fabricant. Il contribue à la normalisation pour toute amplification non spécifique et des changements produite pendant miRNA purification et de réaction PCR 18. Même dans le cas de dégradation de miRNA ou l'absence de tout signal d'amplification spécifiques miARN, la pointe dans le contrôle devrait amplifier dans les réactions qRT-PCR et de donner un signal attendu avec une valeur Ct raisonnablement constante et uniforme. Sur la base de la pointe dans le contrôle d'amplification avec trois contrôles négatifs et des témoins positifs que nous avons eu une bonne optimale validation des données pour miR-223 gènes. Cela confirme que nous avons obtenu un bon rendement de miR-223 de circulation HDL de plasma à partir de cette méthode simple.

En conclusion, nous avons établi une méthode of ultracentrifugation à gradient de densité (DGUC) avec l'addition de β-mercaptoéthanol pour la purification de miARN de HDL plasmatique. Le procédé présente plusieurs avantages: (a) les VLDL, LDL et HDL sont séparés dans un court laps de temps par le plancher ultracentrifugation comparer à d' autres méthodes qui a besoin 24-96 h 8-11; (b) LDL et HDL dialyse, dessalage / concentration, avoir lieu dans 1 h comparer avec d' autres méthodes qui ont eu 24 heures ou plus 8,9; (C) La contamination des lipoprotéines est éliminé par β-mercaptoéthanol dans la fraction HDL, mais ne sont pas destinés à être utilisés dans la fraction LDL; (D) Le volume de l'échantillon nécessaire est seulement 1 ml pour tous paliers VLDL, LDL et HDL isolements comparer avec les autres méthodes qui a besoin de plus de volume de l'échantillon; (e) Il réduit au minimum les dommages oxydatifs HDL lors de l' isolement 11; (F) Un maximum de 12 échantillons peuvent être analysés dans une série d'analyses de séparation des lipoprotéines unique; (G) Le volume d'échantillon de 250 ul d'extrait HDL est suffisant pour analyser mla concentration ARNi / pureté, une électrophorèse sur gel d'agarose, la concentration en protéines, puces à ADN et des procédures de RT-qPCR. Les limites de notre méthode est que petit pourcentage de HDL-miARN peut perdre lors de l'étape exosomes de précipitations et le volume d'échantillon de plasma nécessaire devrait être plus de 200 pi pour isoler HDL-miARN.

Enfin, les micro-ARN de plasma sont non seulement dérivées de cellules sanguines endommagées ou rebelles dans la circulation, mais aussi à partir de cellules sanguines normales en bonne santé et de cellules en provenance d'autres parties du corps qui comprend divers tissus et organes sains et malades affectés par l'état de santé en cours du corps 20. La présente étude a systématiquement mature purifié miR-223 de HDL isolé du plasma humain. Cette étude démontre clairement que les niveaux de maturité miR-223 dans le HDL plasmatique hautement purifié sont détectables, stable, reproductible et cohérente entre les individus échantillon, ce qui facilite grandement l'utilisation clinique des tests de futurités pour lipoprotéines, liver, syndromes cardiovasculaires et métaboliques. Étonnamment, miARN matures, en particulier miR-223 de HDL plasmatique sont probablement résistants à la digestion par la nuclease et d'autres conditions difficiles qui expliquent potentiellement la stabilité de miR-223 en HDL purifié. Le mécanisme de la résistance de miR-223 pour les RNases nécessite une étude plus approfondie. De toute évidence, l'étude des profils d'expression de miARN dans ces plasma HDL purifié pourrait faire la lumière sur les futurs marqueurs miARN dans l'étude de diverses maladies. Ces HDL associé microARN dans le plasma peuvent être utilisés en tant que biomarqueurs cliniques diagnostiques potentiels et de la médecine personnalisée dans le futur.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

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References

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