Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Biology

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Summary

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

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Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Recolección de Muestras de Sangre

  1. Recoger el ayuno muestras de sangre venosa periférica en tubos de 10 ml de plástico que contienen ácido anticoagulante etilendiaminotetraacético (EDTA) (que tiene varias ventajas sobre otros anticoagulantes) por punción venosa estándar de una vena prominente en la fosa antecubital.
  2. Centrifugar las muestras de sangre a 1.600 xg durante 20 min a 4 ° C en una centrífuga de mesa para obtener plasma libre de células rojas de la sangre y pequeñas cantidades de ARN.
  3. Secuencialmente centrifugar el sobrenadante a 3.000 g (4 ° C) en un cubo de rotor de balanceo por 10 min para eliminar WBC y plaquetas y luego adicional 15 min para eliminar los desechos de células restante, respectivamente.
  4. Medir la densidad del plasma utilizando un densitómetro a TA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: El ajuste de la densidad (d = 1,023 g / ml) con solución salina al 0,9% puede ser necesaria después de la eliminación de los exosomas pero antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad.
  5. 2. Eliminación de exosoma de Plasma

    1. Retire los exosomas circulantes que tienen una densidad similar a la HDL y representan una fuente cuantitativamente significativo de miARN 3.
      1. Para ello, agregue 252 l solución de precipitación exosome a 1 ml de plasma seguido de incubación durante 30 min a 4 ° C. Para sedimentar los exosomas, centrifugar la mezcla durante 30 minutos a 1500 g a 4 ° C.
      2. Para aislar HDL, la transferencia de 1 ml del sobrenadante resultante a un tubo de ultracentrífuga de policarbonato de paredes gruesas para su procesamiento posterior con la ultracentrifugación en gradiente de densidad (véase más adelante).

    3. La ultracentrifugación en gradiente de densidad (Figura 1).

    1. Para separar HDL utilizar un proceso de 3 pasos empleando una ultracentrífuga suelo con un rotor de ángulo fijo que opera a 448.811 x G y 8 ° C, respectivamente.
    2. Preparar tres soluciones diferentes de densidad secuencialmente y fresco para cada aislamiento.
      1. Preparar la solución A (aislamiento de VLDL, d = 1,006 g / ml) mediante la disolución de 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na y 1 ml de NaOH 1 N en 1.000 ml de agua destilada-autoclave. A continuación, añadir un adicional de 3 ml de agua destilada en autoclave.
      2. Preparar la solución B (aislamiento de LDL, d = 1,182 g / ml) mediante la adición de 25,2 g de NaBr a 100 ml de solución A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
      3. Preparar la solución de C (aislamiento de HDL, d = 1,470 g / ml) mediante la mezcla de 78,8 g de NaBr con 100 ml de solución A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmar la densidad adecuada a temperatura ambiente usando un densitómetro. Mantenga todas las soluciones a 4 ° C hasta su uso posterior.

    4. Aislamiento de VLDL

    1. Mezclar 1 ml de plasma (densidad media = 1.023 g / ml) y nucleasa libre 200 l de Fat Red 7B en un tubo de ultracentrífuga de pared gruesa 6,5 ​​ml de policarbonato.
    2. A continuación, la capa cuidadosamente 5 ml de la solución A en la parte superior de la mezcla. Si es necesario, añadir grasa adicional Red 7B en la parte superior de la solución A to equilibrar el peso de cada tubo. Centrifugar durante 2 horas (aceleración - 5), (deceleración - 7).
      NOTA: Durante la centrifugación, las lipoproteínas se acumulan como una banda en sus regiones de densidad de equilibrio.
    3. Al final de la carrera observar 2 capas. Retirar 1,5 ml de la fracción VLDL que representa la capa superior y se almacena a 4 ° C.
    4. Finalmente, utilizando una pipeta de transferencia 4 ml de la parte inferior del tubo que contiene el LDL, HDL, la albúmina y la fracción de ácido graso a un nuevo tubo de policarbonato para el aislamiento de LDL.

    5. Aislamiento de LDL

    1. Mezclar 2 ml de la solución B y 100 l de nucleasa libre de grasa Red 7B en el tubo que contiene la fracción LDL y HDL (sección 4), respectivamente.
    2. Centrifugar a cabo durante 3 horas (aceleración 9, deceleración 7). A partir de entonces, retirar 1,5 ml de la fracción LDL que representa la capa superior y mantener a 4 ° C o almacenar a -80 ° C. Finalmente, la transferencia de 4 ml de la parte inferior del tubo que contiene la HDLfracción a un nuevo tubo de policarbonato.

    6. Aislamiento de HDL

    1. Mezclar 2 ml de la solución C, 100 nucleasa l libre Fat Red 7B y 15 l de 98% β-mercaptoetanol en el tubo que contiene la fracción HDL, respectivamente.
    2. Centrifugar durante 3 horas (aceleración 9, deceleración 7). A partir de entonces retire 2 ml de la fracción HDL representan la capa superior y, o bien mantener a 4 ° C o almacenar a -80 ° C.

    7. La desalación y concentración de la lipoproteína de fracciones

    1. Para evitar la interferencia con la electroforesis en gel de agarosa posterior y PCR, eliminar el exceso de sal añadida durante la ultracentrifugación en gradiente de densidad usando dispositivos de filtro centrífugos con el corte de peso molecular apropiado (tubo 3K para VLDL y el tubo de 10K para LDL / HDL) como se describe por las instrucciones del fabricante.
      1. En pocas palabras, después de la adición de 2,5 ml de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM; pH 7,4) frío centrifuge toda la fracción VLDL recogió-durante ultracentrifugación en gradiente de densidad a 4 ° C durante 60 min usando un rotor de cubeta oscilante.
      2. Desalar la fracción LDL dos veces con 10 ml de PBS enfriado en hielo durante 30 minutos cada uno. A continuación, utilizar 13 ml de PBS helado dos veces para la desalación de la fracción HDL. El volumen de PBS más alto es necesario para mejorar la movilidad con electroforesis en gel de agarosa. Después de la centrifugación, eliminar los solutos que contienen lipoproteínas y mantenerse a 4 ° C o se almacena a -80 ° C.

    8. gel de agarosa La electroforesis

    1. Perfrom electroforesis en gel de agarosa empleando el kit de lipoproteínas con modificaciones menores de las instrucciones del fabricante de la siguiente manera.
      NOTA: Este paso es sólo para evaluar la calidad y la pureza de las muestras concentradas de lipoproteínas.
      1. En pocas palabras, obtener 6 l de la fracción de lipoproteínas de desalado con ultracentrifugación en gradiente de densidad y cargar en un gel de lipoproteína pre-cast. Utilice LipoP humanarotein normas de VLDL, LDL y HDL como referencia de tamaño. Llevar a cabo la electroforesis a temperatura ambiente a 100 V durante 60 minutos usando tampón Rep Prep.
      2. Secar el gel durante 10 min y luego manchar durante 10 min a RT con Fat Red 7B. Destain el gel en una mezcla de metanol-agua 75:25 (v / v) y se seca de nuevo por 5 min.

    9. RNA Extracción y Purificación

    1. Perfrom aislamiento de los genes miARN HDL humano purificado utilizando el kit de suero / plasma de aislamiento y purificación de miRNA.
      1. En pocas palabras, añadir 1 ml de reactivo de lisis de ARN de 200 l de HDL purificada, se mezcla con un vórtice y luego se incubaron durante 5 min a RT para asegurar la disociación completa de los complejos de nucleoproteína y la inactivación de las RNasas.
      2. Entonces pico de 3,5 l de Caenorhabditis Elegans sintética microARN (miR-cel-39, 1,6 x 10 8 copias / l) en la mezcla. A continuación, llevar a cabo la extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. realizar Purificatien extraída de los genes miARN con columnas de centrifugación eluir según las instrucciones del fabricante. Medir la concentración de miARN de HDL purificada con un spectrophorometer.
      NOTA: La elución de miRNA de las columnas de centrifugación empleó 16 l de agua libre de RNasa.

    10. transcripción inversa (RT-PCR)

    1. Aislar 100 ng de los genes miARN de HDL enriquecida con los genes miARN sintético (cel-miR-39) y a transcripción inversa en un volumen de reacción de 20 l que emplea el kit de transcripción inversa y de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Realizar controles apropiados sin plantilla miRNA (NTC) y sin mezcla de enzima transcriptasa inversa (NRT).

    11.-PCR en tiempo real (QRT-PCR)

    1. Perfrom PCR en tiempo real en un volumen total de 20 l con 2 l de una dilución 1: 2 del ADNc, 10 l de la mezcla PCR, 2 l cebador universal, 2 l de cebadores miARN y 4 l de agua libre de RNasa.
    2. Ejecutar los reactien en placas de 96 pocillos a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos y 55 ° C durante 30 s y una fase de extensión a 70 ° C durante 30 s.ec perfrom todas las reacciones por triplicado .
    3. A continuación, calcuate cantidades relativas de los genes miARN utilizando el método 2 -ΔΔ Ct después de la normalización para la limpieza de genes sintética según las instrucciones del fabricante.

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Representative Results

Aislamiento de lipoproteína de alta densidad después de eliminar las exosomas
Para obtener los genes miARN de HDL altamente purificada es necesario para eliminar los exosomas que representan una fuente de contaminación miRNA 7. Esto se hizo antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad con un kit disponible en el mercado. Para fines prácticos un protocolo de ultracentrifugación en gradiente de densidad estándar de tres pasos desarrollado por la empresa comercial se modificó (Figura 1). Este protocolo requiere centrifugación con un rotor de ángulo fijo a una velocidad de 140 000 rpm que es sustancialmente más rápido que los protocolos utilizados comúnmente con las fuerzas de centrifugación hasta 54.000 rpm 3, 8, 9, y 10. El empleo de un rotor T-1270 ampliamente disponibles con una fuerza máxima de 70.000 rpm, centrifugación se llevó a cabo inicialmente con tubos de polialómero que no han podido resistirse a las fuerzas de centrifugación. Para evitar el colapso de los tubos,Se han usado con éxito tubos de policarbonato. Tiempo de centrifugación es crítico para la oxidación de las lipoproteínas y, potencialmente, la degradación miARN 11. Por lo tanto varios tiempos de centrifugación diferentes, que van desde un total de 8 a 96 horas fueron probados. Además temperatura a la que se llevó a cabo la centrifugación se ajustó en base al tiempo y la fuerza de centrifugación, respectivamente.

La pureza de la lipoproteína de alta densidad fracciones
La pureza de las fracciones aisladas de lipoproteínas de alta densidad se comprobaron con electroforesis en gel de agarosa. Figura 2. ilustra un resultado típico de electroforesis para la resta de HDL aislada por ultracentrifugación en gradiente. Se puso claramente de manifiesto que el HDL estaba desprovista de cualquier contaminación de las VLDL y exhibe α-movilidad típica. La ausencia de lipoproteínas a-migración en las fracciones VLDL y LDL demuestra la recuperación completa de HDL durante el ultracentrifugation paso. La fracción de HDL, sin embargo, también mostró algún rastro de β-movilidad, un patrón de bandas electroforética conocida debido a la contaminación con lipoproteínas (Lp (a)) 12.

Eliminación de la Lp (a) de HDL aislada
El estudio de miRNAs realizadas en HDL requiere el aislamiento de la HDL de más alta pureza. Interferencia de Lp (a) con HDL potencialmente contribuye a la contaminación cruzada de HDL con miRNAs realizadas en LDL. Para minimizar esta contaminación de HDL, se añadieron 15 l de β-mercaptoetanol 10 a la solución C durante la última etapa de centrifugación (Figura 1). La adición de β-mercaptoetanol se ha demostrado no para cambiar las propiedades de densidad HDL 10. Como se muestra en la Figura 3., la adición de β-mercaptoetanol dio como resultado la ausencia de lipoproteínas de b-migración coherente con la supresión muy efectiva de Lp (a).

Purificación de miARN de HDL
Aislamiento de los genes miARN se intentó inicialmente empleando reactivo de lisis que se utiliza comúnmente para la extracción de ARN a partir de sangre. Aunque este método resultó en un muy buen rendimiento de ARN (91,45 ng / l), pero después de un análisis espectrofotométrico mostró insatisfactoria pureza del ARN. La purificación adicional del ARN aislado mediante la eliminación de fenol mejoró la pureza, pero el rendimiento de ARN ahora era significativamente bajo. A continuación, otro kit fue probado que mostró pureza aceptable ARN (260/280 nm relación de 1,7) pero el rendimiento de ARN fue 26 veces menor en comparación con el reactivo de lisis (3,45 frente a 91,45 ng / l). Los mejores resultados para la pureza de ARN aceptable con un buen rendimiento se obtuvieron con el kit de suero miRNeasy / plasma (48,2 ng / l; relación de 260/280 nm de 1,6) y por lo tanto este procedimiento de extracción se empleó posteriormente para la detección de los genes miARN del aislado fracción de lipoproteínas HDL.

3 y se demostró que reprimir HDL absorción de colesterol 5. La Figura 4A. muestra un gráfico de registro típico de curvas de amplificación que comparan los valores de umbral y de ciclo umbral de la línea de base después de la optimización de la reacción de PCR para el miR-223 y la clavó en Cel-MIR-39. Este gen sintético se utilizó como control interno ya que no hay informes de control de normalización conocido por miARN en el plasma. Además, varios genes de limpieza endógenos establecidos potenciales como RNU6-2, RNU-48, HY3 podrían no ser detectados y SNORD95 podría ser detectada en HDL purificada, pero, la diferencia en los valores de Ct de miR-223 y SNORD95 es menos de cinco ( datos no mostrados). Melting análisis de la curva ilustrada en la Figura 5. muestra claramente una clara solopico consistente con amplificación de un miARN selectiva en la PCR anterior. Como se ilustra en la Figura 4B., Tanto miR-223 y la referencia Cel-mir-39 consistentemente se pudo detectar en los seis pro bandas. No se observaron variaciones relativamente pequeñas entre todas las personas de Cel-MIR-39 en comparación con el miR-223. Estos hallazgos apoyan el aislamiento de HDL a alta pureza para permitir la detección de su carga miARN.

La detección de miR-223 en HDL purificada
en tiempo real método de PCR cuantitativa se utilizó para cuantificar doble estructura de horquilla miARN precursores de cadena simple miARN. Este método necesita un avance / retroceso cebadores específicos del gen y una transcriptasa inversa termoestable para convertir la estructura de horquilla del miRNA en ADNc. El cDNA se amplificó posteriormente y cuantificado usando tiempo real qPCR con la ayuda de la detección de verde SYBR. Micro RNA a partir de suero, plasma y plasma HDL puede ser purificado con precisión profiled usando el sistema de miARN RT PCR.

Nuestro producto experimental de la expresión media de miR-223 genes mostraron un valor Ct de 30,9 en el HDL purificada y sus correspondientes controles negativos estaban por encima de corte 35 (NTC = 38.1 valor de Ct, NRT y NAC no se amplificaron). En este experimento, que vimos en las muestras de HDL purificados la formación de dímeros de cebadores con baja temperatura de fusión (73 ° C en el miR-223 y 75,5 ° C en Cel-miR-39) y mayor valor t C que en los ensayos de miARN específicos (Tabla 1). Los dímeros de cebadores de la Tabla 1. ocurren probablemente debido a la alta concentración de cebadores en la solución. Esto ocurre sobre todo cuando las moléculas de cebadores se unen entre sí después de 30 ciclos de PCR 13. Esto les permite hibridar con otras moléculas de cebador y, en efecto, se convierten en mini-plantillas lineales y causarán mayor fondo y pueden dar lugar a una generación de valor C t <40 para NTC (n templatcontrol) muestras e.

Figura 1
Figura 1. Representación esquemática del procedimiento de HDL aislada. HDL fue preparada por ultracentrifugación en gradiente de densidad en una serie de tres etapas de centrifugación. Distribución de las bandas de lipoproteínas y fracciones intermedias en el gradiente de densidad se ilustran. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa de las lipoproteínas aisladas sin β-mercaptoetanol. VLDL, LDL y HDL fracciones aisladas por ultracentrifugación en gradiente de densidad sin la adición de mercaptoetanol β a la solución C demonstevaluar la presencia de Lp (a) en la fracción de HDL. Los carriles 1, 2, 9 y 10 representan cada uno el marcador de tamaño; Los carriles de 3/4, 5/6 y 7/8 representan VLDL, LDL y HDL, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa de HDL aislada con el β-mercaptoetanol. La adición de mercaptoetanol β a la solución C antes de la última etapa de centrifugación como resultado la eliminación de la Lp (a) de la fracción de HDL. Los carriles 1, 2, 9 y 10 representan cada uno el marcador de tamaño; Los carriles 3-8 representan HDL. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 4. La amplificación Parcela de dos diferentes miRNAs y expresión de Cel-miR-39 y miR-223. (A) PCR en tiempo real cuantitativa empleando HDL aislado se llevó a cabo como se describe. La PCR se realizó durante 45 ciclos y el punto en que la curva cruza el umbral es la T -Valor C. Los datos muestran la expresión de miR-Cel-39 (panel izquierdo) y miR-223 (panel derecho), respectivamente. La línea horizontal representa el umbral de detección. Un número de ciclo de 35 se estableció como punto de corte para la amplificación positiva. Se muestra (B) Representante datos en tiempo real PCR a partir de HDL aislado obtenido a partir de 6 muestras. Prima significa Ct valores se muestran para Cel-miR-39 y miR-223, cuyos niveles de expresión varían de menos de 2 Ct valor de la fracción de plasma HDL purificada entre 6 muestras, cada una procedente de un donante diferente. De perfiles de expresión se realizó usando el sistema de PCR y el suero y plasma humano MIRNUn QRT-PCR. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Curvas de fusión para Cel-miR-39 y miR-223. Como se ilustra, la presencia de un único pico indica la amplificación específica de Cel-miR-39 (panel derecho) y miR-223 (panel izquierdo), respectivamente. Por favor, clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tabla 1
Tabla 1. Fila C t valor del control negativo y positivo de la sintética Cel-miR-39 y miR-223 se caracteriza en suero, plasma, ADNc, y la fracción HDL purificada. NTC (n template control), NRT (n enzima de transcripción inversa), NAC (control de amplificación No, sólo agua y reactivos de QRT-PCR).

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Discussion

Identificación de nuevos biomarcadores de la sangre será ayudar en el diagnóstico clínico y el pronóstico de diversas enfermedades. Los microARN han sabe que poseen todas las cualidades de biomarcadores y se ha demostrado en diversos estudios 14-17. En este estudio hemos demostrado método fácil rápido y sencillo para aislar los genes miARN de HDL plasma. Densidad convencional gradiente método de ultra-centrifugación de aislamiento de VLDL, LDL y HDL depende de muestreo preciso de plasma, una preparación precisa de la solución tampón, la medición de la densidad y la transferencia cuantitativa de fracciones de lipoproteínas inferior 8. Existen numerosos métodos que se han descrito para aislar HDL 8 -11. Estos métodos son a menudo sea muy laborioso o requieren grandes volúmenes de plasma y extensa diálisis por las lipoproteínas aisladas de desalación y no eliminan por completo los exosomas y lipoproteínas como fuente de miRNAs 3. Para hacer frente a estas deficiencias, hemos establecido este SImple y rápido método de aislamiento de miARN de HDL en plasma.

El objetivo fundamental y el propósito principal de este estudio fue separar y aislar complejo HDL-miARN por ultracentrifugación sin glóbulos rojos, la capa leucocitaria, exosomas, vesículas secretoras, VLDL, LDL y lipoproteínas (a) interferencias, a continuación, aislar miRNAs de HDL purificada. La contaminación y la interferencia de cualquiera de estos componentes con HDL alterarán los resultados experimentales esperados y los datos del perfil de miARN. Aislamiento de ADN, ARN y miRNAs de la sangre es una tarea muy difícil debido a su naturaleza compleja. Siempre se ha planteado con gran cantidad de retos técnicos a los ácidos nucleicos (incluyendo miRNAs) extracción y purificación en comparación con las células, tejidos y muestras de órganos 18. También hay relativamente menos genes miARN presentes en las células sanguíneas circulantes. La sangre es un portador conocido para exosomas, vesículas secretoras y HDLs junto con miRNAs circulantes libres, que son relativamente menos 18. Por lo tanto, más grande es unamonte de volumen de muestra de plasma sanguíneo se requiere para el procesamiento y el aislamiento del complejo de HDL-miARN. Además, la naturaleza de corto de la sus secuencias diana miRNAs y, hace que sea aún difícil de lograr suficiente especificidad con las tecnologías de oligonucleótidos de PCR estándar. Los componentes celulares de la sangre están siempre saben para secretar miARN y mRNA en respuesta a cambios en el ambiente externo, incluyendo la temperatura, microorganismos y toxinas o estrés. Además presencia de nucleasas, RNasas, proteínas circulantes y otras enzimas en la sangre afecta a estos miARN aislamiento.

La amplificación de los genes miARN en circulación también carece de un bien establecidos los genes de limpieza conocidos como β-actina o GAPDH para normalizar los datos mientras se usa el método de ΔΔCt de QRT-PCR. Esto plantea de nuevo uno de los principales obstáculos para el miARN perfiles de la circulación del suero de la sangre o plasma 19. Comúnmente utilizado snoRNAs cortas no codificantes y snARNs rara vez se expresan en la sangre y esto mAKES aún más difícil en utilizándolos como genes de control interno. Para solucionar estos inconvenientes de snoRNAs y snARNs y evitar cualquier dificultad técnica que utiliza el control de Pico-En sintética suero / plasma en los ensayos como gen de control interno de la siguiente manera de acuerdo con el protocolo del fabricante. Esto ayuda en la normalización de cualquier amplificación no específica y los cambios se produjeron durante la purificación miARN y la reacción de PCR 18. Incluso en el caso de la degradación de los genes miARN o ausencia de cualquier señal de amplificación específicos miARN, la espiga-en el control debe amplificar en las reacciones de QRT-PCR y dar una señal esperada con un valor razonablemente constante y uniforme Ct. Sobre la base de la espiga en la amplificación de control, junto con tres controles negativos y controles positivos nos dieron una buena validación de datos óptima para el gen miR-223. Esto confirmó que hemos conseguido un buen rendimiento de miR-223 de HDL circulante en plasma de este sencillo método.

En conclusión, hemos establecido un método of ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC) con la adición de β-mercaptoetanol para la purificación de los genes miARN de HDL plasma. El método tiene varias ventajas: (a) VLDL, LDL y HDL están separadas dentro de un corto período de tiempo por ultracentrífuga baja en comparación con otros métodos que necesita 24 a 96 hr 8-11; (b) LDL y HDL diálisis, desalado / concentrarse, tener lugar dentro de 1 hora comparación con otros métodos que tuvieron 24 o más horas 8,9; (C) La contaminación de las lipoproteínas se elimina por β-mercaptoetanol en la fracción HDL, pero no está destinado a ser utilizado en la fracción de LDL; (D) El volumen de muestra requerido es de sólo 1 ml para todo paso a paso VLDL, LDL y HDL aislamientos compara con los otros métodos que necesita más volumen de la muestra; (e) Se reduce al mínimo el daño oxidativo a HDL durante el aislamiento 11; (F) Un máximo de 12 muestras pueden ser analizadas en una serie de análisis separación única lipoproteína; (G) El volumen de muestra 250 l de HDL extraído es suficiente para analizar mconcentración de ARNi / pureza, la electroforesis en gel de agarosa, la concentración de proteínas, microarrays y RT-qPCR procedimientos. Las limitaciones de este método es ese pequeño porcentaje de HDL-miARN puede perder durante la etapa de precipitación exosome y el volumen de muestra de plasma requerido debe ser más de 200 l para aislar HDL-miARN.

Finalmente, los microRNAs plasma no sólo se derivan de células sanguíneas dañadas o renegadas en la circulación, sino también de las células sanguíneas normales sanas y células de otras partes del cuerpo que incluye diversos tejidos y órganos sanos y enfermos afectados por el estado de salud en curso del cuerpo 20. El presente estudio ha purificado sistemáticamente madura de miR-223 de HDL aislada de plasma humano. Este estudio demuestra claramente que los niveles de madurez miR-223 en el plasma HDL altamente purificada son detectables, estable, reproducible y consistente entre los individuos de la muestra, con lo que facilita en gran medida el uso clínico de pruebas futurity para lipoproteínas, liver, síndromes metabólicos cardiovasculares y otras. Sorprendentemente, madurez miRNAs, en particular el miR-223 a partir de plasma HDL son probablemente resistentes a la nucleasa digestión y otras condiciones adversas que potencialmente explicar la estabilidad de miR-223 en el HDL purificada. El mecanismo de resistencia de miR-223 a RNasas requiere más estudio. Obviamente, el estudio de los perfiles de expresión de genes miARN en estas plasma HDL purificada podría arrojar luz sobre los futuros marcadores miARN en el estudio de diversas enfermedades. Estos microRNAs HDL asociado en el plasma se pueden utilizar como un potencial de biomarcadores de diagnóstico clínico y la medicina personalizada en el futuro.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

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References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  2. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (12), 5003-5008 (2011).
  3. Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, (4), 423-433 (2011).
  4. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
  5. Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33, (10), 1956-1964 (2013).
  6. Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114, (1), 183-192 (2014).
  7. Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16, (4), 415-421 (2004).
  8. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  9. Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
  10. Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
  11. Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
  12. Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
  13. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
  14. Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717, (1-2), 85-90 (2011).
  15. Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
  16. Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2, (19), (2014).
  17. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
  18. Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. www.qiagen.com (2015).
  19. Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
  20. Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).

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