Rask og enkel metode for høy gjennomstrømning Isolering av miRNA fra høyt renset High Density Lipoprotein

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

MicroRNAs spille en viktig regulerende rolle og fremstår som nye terapeutiske mål for ulike menneskelige sykdommer. Det har vist seg at mirnas gjennomføres i lipoproteiner med høy tetthet. Vi har utviklet en forenklet metode for raskt å isolere rensede HDL egnet for miRNA analyse fra humant plasma.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Innsamling av blodprøver

  1. Samle faste perifere venøse blodprøver i 10 ml plastrør inneholdende antikoagulerende Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (som har flere fordeler sammenlignet med andre antikoagulanter) ved hjelp av standard venepunktering av en fremstående vene i antecubital fossa.
  2. Sentrifuger blodprøver ved 1600 xg i 20 min ved 4 ° C i en bordsentrifuge for å oppnå plasma fri for røde blodceller og små mengder av RNA.
  3. Sekvensielt sentrifuger supernatanten på 3000 g (4 ° C) i en svingende spannrotor i 10 minutter for å fjerne hvite blodlegemer og blodplater og deretter i ytterligere 15 minutter for å fjerne gjenværende cellerester hhv.
  4. Måle tettheten av plasmaet ved hjelp av et densitometer ved RT i henhold til fabrikantens an-.
    MERK: Justering av densiteten (d = 1,023 g / ml) med 0,9% saltoppløsning kan være nødvendig etter fjerning av exosomes men før densitetsgradient-ultrasentrifugering.
  5. 2. Exosome fjerning fra plasma

    1. Fjern de sirkulerende exosomes som har en tetthet lik HDL og representere et kvantitativt betydelig kilde til miRNA tre.
      1. Dette gjøres ved å tilsette 252 ul exosome presipiteringsoppløsning til 1 ml plasma, etterfulgt av inkubasjon i 30 minutter ved 4 ° C. Å pelletere ut exosomes, sentrifuger av blandingen i 30 minutter ved 1500 g ved 4 ° C.
      2. For å isolere HDL, overføre 1 ml av den resulterende supernatanten til et polykarbonat tykkvegget ultrasentrifugerør for videre behandling med densitetsgradient-ultrasentrifugering (se nedenfor).

    3. Tetthet ultrasentrifugering (figur 1).

    1. Å skille HDL bruke en tre-trinns prosess ved anvendelse av en etasje ultrasentrifuge med en fast vinkelrotor som drives ved 448 811 x G, og 8 ° C, respektivt.
    2. Forbered tre forskjellige tetthet løsninger sekvensielt og frisk for hver isolasjon.
      1. Fremstille Oppløsning A (isolering av VLDL, d = 1,006 g / ml) ved å oppløse 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na og 1 ml 1 N NaOH i 1000 ml autoklaveres-destillert vann. Deretter legger ytterligere 3 ml autoklaveres-destillert vann.
      2. Fremstille Oppløsning B (isolering av LDL, d = 1,182 g / ml) ved tilsetning av 25,2 g NaBr til 100 ml oppløsning A (0,195 mol NaCl, NaBr 2,44 mol).
      3. Fremstille Oppløsning C (isolering av HDL, d = 1,470 g / ml) ved å blande 78,8 g NaBr med 100 ml av oppløsning A (0,195 mol NaCl, NaBr 7,7 mol). Bekreft passende tetthet ved RT bruker en densitometer. Hold alle løsninger ved 4 ° C inntil videre bruk.

    4. Isolering av VLDL

    1. Bland 1 ml plasma (gjennomsnittlig tetthet = 1,023 g / ml) og nuklease frie 200 ul Fat Red 7B i et 6,5 ml polykarbonat tykkvegget ultrasentrifugerør.
    2. Deretter forsiktig laget 5 ml av oppløsning A på toppen av blandingen. Om nødvendig, legge til ekstra fett Red 7B på toppen av løsning A to balansere vekten av hvert rør. Sentrifuger i 2 timer (akselerasjon - 5), (retardasjon - 7).
      MERK: Under sentrifugering blir lipoproteiner kommet som et band på regionene sine likevekt tetthet.
    3. Ved slutten av kjøringen observere 2 lag. Fjern 1,5 ml av VLDL fraksjonen representerer det øverste laget og oppbevar ved 4 ° C.
    4. Til slutt, ved hjelp av en pipette overføring 4 ml fra bunnen av rør inneholdende LDL, HDL, albumin og fettsyrefraksjon til en ny polykarbonat rør for LDL isolasjon.

    5. Isolering av LDL

    1. Bland 2 ml av oppløsning B og 100 pl nuklease fri Fat Red 7B i røret inneholdende LDL og HDL-fraksjonen (seksjon 4), respektivt.
    2. Sentrifuger deretter ut i 3 timer (9 akselerasjon, retardasjon 7). Deretter fjerne 1,5 ml av LDL-fraksjonen representerer det øverste laget og holde ved 4 ° C eller oppbevar ved -80 ° C. Til slutt, overføre 4 ml fra bunnen av røret inneholdende HDLfraksjon til en ny polykarbonat-rør.

    6. Isolering av HDL

    1. Bland 2 ml av oppløsning C, 100 pl nuklease fri fett Red 7B og 15 ul 98% β-merkaptoetanol inn i rør inneholdende HDL-fraksjonen, respektivt.
    2. Sentrifuger i 3 timer (9 akselerasjon, retardasjon 7). Deretter fjerner 2 ml av HDL-fraksjonen som representerer det øverste laget og enten holde ved 4 ° C eller oppbevar ved -80 ° C.

    7. Avsalting og Konsentrasjon av lipoproteinfraksjoner

    1. For å unngå interferens med påfølgende agarosegelelektroforese og PCR, fjerne overdreven salt lagt under tetthet ultrasentrifugering ved hjelp av sentrifugal filter enheter med riktig molekylvekt cutoff (3K tube for VLDL og 10K tube for LDL / HDL) som beskrevet i produsentens instruksjoner.
      1. I korthet, etter tilsetning av 2,5 ml kald PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifuge hele VLDL-fraksjon i løpet av densitetsgradient-ultrasentrifugering ved 4 ° C i 60 min ved hjelp av en svingende spannrotor.
      2. Avsalte LDL-fraksjonen to ganger med 10 ml iskald PBS i 30 minutter hver. Deretter Bruk 13 ml iskald PBS to ganger for avsalting av HDL-fraksjonen. Jo høyere PBS volumet er nødvendig for å forbedre mobiliteten med agarosegelelektroforese. Etter sentrifugering fjerne lipoprotein inneholder oppløste stoffer og holde ved 4 ° C eller lagret ved -80 ° C.

    8. agarosegelelektroforese

    1. Perfrom lipoprotein agarosegelelektroforese ansette kit med mindre modifikasjoner av produsentens instruksjoner som følger.
      MERK: Dette trinnet er bare for å vurdere kvaliteten og renheten av de konsentrerte lipoprotein prøvene.
      1. Kort fortalt får 6 ul av avsaltet lipoprotein fraksjon med tetthet ultrasentrifugering og laste inn en pre-cast lipoprotein gel. Bruk menneskelig lipoprotein standarder for VLDL, LDL og HDL som størrelse referanse. Gjennomføre elektroforese ved RT på 100 V i 60 min ved hjelp Rep Prep buffer.
      2. Tørk gelen i 10 minutter og deretter sette flekker i 10 min ved RT med Fat Red 7B. Destain gelen i en blanding av metanol-vann 75:25 (v / v) og tørr igjen i 5 min.

    9. RNA ekstraksjon og rensing

    1. Perfrom isolering av miRNA av renset humant HDL bruke serum / plasma miRNA isolering og rensing kit.
      1. I korthet, tilsett 1 ml av RNA lysereagensen til 200 ul renset HDL, bland med en vortex og deretter inkubert i 5 minutter ved romtemperatur for å sikre fullstendig dissosiasjon av nukleoprotein komplekser og inaktivering av RNaser.
      2. Deretter spike 3,5 mL av syntetisk Caenorhabditis elegans mikroRNA (cel-MIR-39, 1,6 x 10 8 kopier / mikroliter) i blandingen. Deretter utføre RNA ekstraksjon i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Utfør rensing;på ekstrahert-miRNA med eluere spin kolonner som per produsentens instruksjoner. Måle konsentrasjonen av miRNA fra renset HDL med en spectrophorometer.
      MERK: Eluering av miRNA fra spin kolonner ansatt 16 mL av RNase-fritt vann.

    10. Reverse Transcription (RT-PCR)

    1. Isoler 100 ng av miRNA fra HDL tilsatt syntetisk miRNA (cel-MIR-39) og revers-transkribert i et 20 ul reaksjonsvolum ansette revers transkripsjon kit og i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Utføre hensiktsmessige kontroller uten mal miRNA (NTC) og uten revers transkriptase enzym mix (NRT).

    11. Real-time PCR (QRT-PCR)

    1. Perfrom Sanntids-PCR i et totalvolum på 20 ul med 2 ul av en 1: 2 fortynning av cDNA, 10 pl PCR-blanding, 2 ul universal primer, 2 ul av miRNA primere og 4 pl RNase-fritt vann.
    2. Kjør Reactipå i 96-brønners plater ved 95 ° C i 15 minutter, etterfulgt av 45 sykluser ved 94 ° C i 15 sekunder og 55 ° C i 30 s og en forlengelse ved 70 ° C i 30 s.ec perfrom alle reaksjoner i tre paralleller .
    3. Deretter Calcuate relative mengder av miRNA ved hjelp av to -ΔΔ Ct metode etter normalisering av syntetisk husholdningsgenet i henhold til produsentens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av High Density Lipoprotein Etter fjerning av Exosomes
For å oppnå miRNA fra høyrenset HDL er det nødvendig å fjerne exosomes som representerer en kilde til forurensning miRNA 7. Dette ble gjort før densitetsgradient-ultrasentrifugering med et kommersielt tilgjengelig kit. For praktiske formål en tretrinns standard densitetsgradient-ultrasentrifugering protokoll som er utviklet av kommersielt firma ble modifisert (figur 1). Denne protokollen krever sentrifugering med en fast vinkelrotor ved en hastighet på 140 000 rpm som er vesentlig hurtigere enn vanlig brukte protokoller med sentrifugering styrker opp til 54 000 rpm 3, 8, 9, og 10. Ved hjelp av et allment tilgjengelig T-1270 rotor med en maksimal kraft på 70000 rpm, sentrifugering ble først gjennomført med polyallomer rør som har mislyktes i å motstå sentrifugeringskrefter. For å unngå kollaps av rør,polykarbonat rør ble brukt med hell. Sentrifugering tid er kritisk for lipoprotein oksidasjon og potensielt miRNA degradering 11. Derfor er flere forskjellige sentrifugeringstider, som strekker seg fra en total på 8 til 96 timer ble testet. Videre er temperaturen ved hvilken sentrifugering ble utført ble regulert på grunnlag av sentrifugering tid og kraft, henholdsvis.

Renheten av High Density Lipoprotein Fraksjoner
Renheten av isolerte lipoproteinfraksjoner høy tetthet ble sjekket med agarosegelelektroforese. Figur 2. viser et typisk resultat for elektroforese HDL subtraksjon isolert ved ultrasentrifugering. Det viste tydelig at HDL var blottet for enhver forurensning av VLDL og viser typiske α-mobilitet. Fraværet av noen a-migrering lipoproteiner i VLDL og LDL fraksjoner demonstrerer fullstendig gjenoppretting fra HDL under ultracentrifugation trinn. HDL-fraksjonen, men viser også noen spor av β-mobilitet, en kjent elektro banding mønster på grunn av forurensning med lipoproteiner (Lp (a)) 12.

Eliminering av Lp (a) fra Isolert HDL
Studerer mirnas gjennomført i HDL krever isolering av HDL av høyeste renhet. Forstyrrelser av Lp (a) med HDL potensielt bidrar til krysskontaminering av HDL med mirnas gjennomført i LDL. For å redusere denne forurensning av HDL, ble 15 ul β-merkaptoetanol 10 tilsatt til løsning C i løpet av den siste sentrifugeringstrinnet (figur 1). Tilsetting av β-mercaptoethanol har vist seg ikke å endre tetthetsegenskaper 10 HDL. Som vist i figur 3, tilsetning av β-merkaptoetanol resulterte i fravær av hvilken som helst B-migrering lipoproteiner i samsvar med meget effektiv fjerning av Lp (a).

Rensing av miRNA fra HDL
Isolering av miRNA ble først forsøkt å ansette lysereagensen som vanligvis brukes for RNA ekstraksjon fra blod. Selv om denne metoden resulterte i en meget god RNA utbytte (91,45 ng / pl), men etter spektrofotometrisk analyse viste tilfredsstillende RNA renhet. Ytterligere rensing av den isolerte RNA ved å fjerne fenol forbedret renhet, men RNA utbyttet var nå betydelig lav. Deretter ble en annen kit testet som viste akseptabel RNA renhet (260/280 nm ratio på 1,7), men RNA utbyttet var 26 ganger lavere sammenlignet med lysereagensen (3,45 vs 91,45 ng / mL). De beste resultatene for å oppnå akseptabel renhet RNA med et godt utbytte ble oppnådd med miRNeasy serum / plasma-kit (48,2 ng / ul; 260/280 nm forhold på 1,6), og derfor er denne fremgangsmåte ekstraksjon ble deretter anvendt for påvisning av miRNA fra den isolerte HDL lipoprotein fraksjon.

tre og ble vist å undertrykke HDL kolesterol opptak fem. Den 4A. viser en typisk log plott av forsterkningskurver sammenligne baseline terskelen og terskelen sykkel verdier etter optimalisering av PCR reaksjon for Mir-223 og piggete-in Cel-mir-39. Dette syntetisk gen ble brukt som intern kontroll som det er ingen rapporter om kjent normalisering kontroll for miRNA i plasma. I tillegg er flere potensielle etablerte endogene husholdningsgener som RNU6-2, RNU-48, HY3 kunne ikke påvises og SNORD95 kunne påvises i renset HDL, men, er forskjellen i Ct-verdier av MIR-223 og SNORD95 mindre enn fem ( data ikke vist). Smelting kurve analyse er vist i figur 5. viser klart en tydelig enkelttopp i samsvar med amplifikasjon av en selektiv miRNA i det foregående PCR. Som vist i figur 4B., Kan begge MIR-223 og referanse Cel-mir-39 gående påvises i alle seks pro band. Relativt små variasjoner mellom alle personer ble observert for Cel-mir-39 sammenlignet med MIR-223. Disse funnene støtter isolering av HDL ved høy renhet for å tillate deteksjon av sin miRNA last.

Påvisning av MIR-223 i Renset HDL
Sanntid kvantitativ PCR-metoden ble brukt til å kvantifisere dobbelt hårnål-struktur miRNA forløpere til enkelt strand miRNA. Denne metoden er behov for en forover / bakover-gen-spesifikke primere og et termostabilt revers transkriptase for å omdanne den hårnål strukturen i miRNA til cDNA. CDNA ble deretter amplifisert og kvantifisert ved anvendelse av sanntids qPCR med hjelp av SYBR grønn deteksjon. MikroRNA fra serum, plasma og renset HDL plasma kan være nøyaktig profiled hjelp av miRNA RT PCR system.

Vår eksperimentelle produkt av gjennomsnittlig MIR-223 genuttrykk viste en Ct verdi på 30,9 i renset HDL og dets tilsvarende negative kontrollene var over cut-off 35 (NTC = 38,1 Ct verdi, NRT og NAC ble ikke forsterket). I dette eksperimentet, vi så i de rensede HDL prøvene dannelsen av primer-dimer med lav smeltetemperatur (73 ° C i MIR-223 og 75,5 ° C i Cel-MIR-39), og høyere C-t-verdi enn de spesifikke miRNA analyser (tabell 1). Primeren-dimerer i tabell 1. oppstår sannsynligvis på grunn av høy konsentrasjon av primere i oppløsningen. Dette skjer stort sett når primer molekyler fester seg til hverandre etter 30 PCR-sykluser 13. Dette gjør det mulig for dem å bindes til andre primermolekyler og i effekt, blir lineære mini-maler, og det vil føre til høyere bakgrunn og kan føre til en dannelse av C-t-verdi <40 for NTC (No template kontroll) prøver.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk fremstilling av HDL isoleringsprosedyren. HDL ble fremstilt ved densitetsgradient-ultrasentrifugering i en serie på tre sentrifugeringstrinn. Fordeling av lipoprotein band og mellomfraksjoner i tettshetsgradient den er illustrert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. agarosegelelektroforese av Lipoproteiner Isolerte Uten β-merkaptoetanol. VLDL, LDL og HDL-fraksjoner isolert ved densitetsgradient-ultrasentrifugering uten tilsetning av β p-merkaptoetanol til oppløsning C demonstrerer atvurdere tilstedeværelse av Lp (a) i HDL-fraksjonen. Baner 1, 2, 9 og 10 som hver representerer størrelsesmarkør; Lanes 3/4, 5/6 og 7/8 representerer VLDL, LDL og HDL hhv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. agarosegelelektroforese av HDL Isolert med β-merkaptoetanol. Legger β p-merkaptoetanol til oppløsning C før den siste sentrifugeringstrinnet resulterte i fjerning av Lp (a) fra HDL-fraksjonen. Baner 1, 2, 9 og 10 hver representerer en størrelsesmarkør; Lanes 3-8 representerer HDL. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 4. Amplification Plot av to forskjellige miRNAs og ekspresjon av Cel-MIR-39 og MIR-223. (A) Sanntids kvantitativ PCR som anvender isolerte HDL ble utført som beskrevet. PCR ble kjørt i 45 sykluser og det punkt hvor kurven krysser terskelen er C T -verdi. Dataene viser uttrykket av Cel-MIR-39 (venstre panel) og Mir-223 (høyre panel), henholdsvis. Den horisontale linjen representerer deteksjonsgrensen. En syklus rekke 35 er angitt som cutoff for positiv forsterkning. (B) Representative real-time PCR data fra isolerte HDL oppnådd fra 6 prøver er vist. Raw bety Ct-verdier vises for Cel-MIR-39 og MIR-223, som uttrykk nivåene varierer mindre enn 2 Ct-verdien i renset HDL plasmafraksjon mellom 6 prøver, hver fra en annen donor. Expression profilering ble utført ved hjelp av PCR System og Human Serum & Plasma miRNEn QRT-PCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Smelte Kurver for Cel-MIR-39 og MIR-223. Som illustrert, tilstedeværelsen av en enkel topp indikerer spesifikk forsterkning av-Cel MIR-39 henholdsvis (høyre panel) og Mir-223 (venstre panel),. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1. Rad C t verdien av negativ og positiv kontroll av syntetisk Cel-MIR-39 og MIR-223, karakterisert ved serum, plasma, cDNA, og renset HDL-fraksjonen. NTC (No template-kontroll), NRT (Ingen revers transkripsjon enzym), NAC (Ingen forsterkning kontroll, bare vann og reagenser for QRT-PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifisering av nye biomarkører fra blod vil hjelpe i den kliniske diagnose og prognose av ulike sykdommer. MicroRNAs har kjent for å ha alle kvaliteter av biomarkører og har vært vist i flere studier 14-17. I denne studien har vi vist rask og enkel enkel metode for å isolere miRNA fra plasma HDL. Konvensjonell densitetsgradient-ultrasentrifugering fremgangsmåte for isolering av VLDL, LDL og HDL er avhengig av nøyaktig prøvetaking av plasma, nøyaktig utarbeidelse av bufferoppløsningen, måling av tetthet og kvantitativ overføring av bunn lipoproteinfraksjoner 8. Det finnes mange metoder som er beskrevet for å isolere HDL 8 -11. Disse metodene er ofte enten svært arbeidskrevende eller krever store volum av plasma og omfattende dialyse for avsaltings isolert lipoproteiner, og ikke fullstendig fjerne exosomes og lipoproteiner som en kilde for miRNAs 3. For å møte disse svakhetene vi har etablert dette simple og rask metode for isolering av miRNA fra plasma HDL.

Nøkkelen mål og primære formålet med denne studien var å separere og isolere HDL-miRNA kompleks av ultrasentrifugering uten RBC, buffy coat, exosomes, sekretoriske vesikler, VLDL, LDL og lipoproteiner (a) forstyrrelser, deretter isolere mirnas fra renset HDL. Forurensning og innblanding av noen av disse komponentene med HDL vil endre de forventede eksperimentelle resultatene og miRNA profilering data. Isolering av DNA, RNA og mirnas fra blodet er en svært vanskelig oppgave på grunn av sin komplekse natur. Det har alltid vært stilt med mange tekniske utfordringer for nukleinsyrer (inkludert mirnas) ekstraksjon og rensing sammenlignet med celler, vev og organprøver 18. Det er også relativt mindre miRNA gener som finnes i sirkulerende blodceller. Blod er en kjent bærer for exosomes, sekretoriske vesikler og HDL med gratis sirkulerende mirnas, som er relativt mindre 18. Derfor større enmontering av blodplasma-prøvevolumet er nødvendig for behandling og isolering av HDL-miRNA kompleks. I tillegg er den korte typen av mirnas og deres målsekvenser, gjør det enda vanskeligere å oppnå tilstrekkelig spesifisitet med standard PCR oligonukleotid-teknologier. De cellulære komponenter av blod er alltid vite å utskille miRNA og mRNA som respons på endringer i ytre miljø, inkludert temperatur, mikroorganismer og toksiner eller stress. Også nærvær av nukleaser, RNases, utegående proteiner og andre enzymer i blodet vil påvirke disse miRNA isolasjon.

Den sirkulerende miRNA forsterkning mangler også en veletablert kjente housekeeping gener som β-aktin eller GAPDH for data normalisering mens du bruker ΔΔCt metode for QRT-PCR. Det igjen utgjør en av de største hinder for miRNA profilering fra sirkulerende blod serum eller plasma 19. Vanligvis brukes korte ikke koding snoRNAs og snRNAer er sjelden uttrykt i blod og dette mÅkes det ytterligere vanskelig å utnytte dem som interne kontroll gener. For å løse disse demerits av snoRNAs og snRNAer og for å unngå eventuelle tekniske problemer vi brukte serum / plasma syntetisk Spike-In kontroll i analysene som intern kontroll genet som følges i henhold til produsentens protokoll. Det hjelper på normalisering for enhver spesifikk forsterkning og endringer skjedd i løpet av miRNA rensing og PCR reaksjon 18. Selv i tilfelle av nedbrytning av miRNA eller fravær av noen spesifikke amplifiseringsprodukter miRNA signaler, nagle kontroll skal forsterke i QRT-PCR-reaksjoner og gir et forventet signal med en rimelig konstant og ensartet Ct verdi. Basert på topp i kontroll forsterkning sammen med tre negative kontroller og positive kontroller fikk vi god optimal datavalidering for MIR-223 genet. Dette bekreftet at vi har fått godt utbytte av MIR-223 fra sirkulerende plasma HDL fra denne enkle metoden.

Avslutningsvis har vi etablert en metode of densitetsgradient-ultrasentrifugering (DGUC) med tillegg av β-merkaptoetanol for rensing av miRNA fra plasma HDL. Fremgangsmåten har flere fordeler: (a) VLDL, LDL og HDL er adskilt i løpet av et kort tidsrom ved gulv ultrasentrifuge sammenlignet med andre metoder som trenger 24-96 timer 8-11; (b) LDL og HDL dialyse, avsalting / konsentrere seg, finne sted innen en time sammenligne med andre metoder som tok 24 timer eller mer 8,9; (C) Forurensning av Lipoproteiner ble fjernet ved β-merkaptoetanol i HDL-fraksjonen, men er ikke ment å bli brukt i LDL-fraksjonen; (D) prøvevolumet som kreves er bare ett ml for alle trinnvis VLDL, LDL og HDL isoleringer sammenligne med de andre metodene som trenger mer prøven volum; (e) Det minimalisert oksidativ skade på HDL i løpet av isolasjon 11; (F) Maksimalt 12 prøver kan analyseres i en enkelt lipoprotein separasjon analytiske kjøring; (G) 250 pl prøvevolum på ekstraheres HDL er nok til å analysere mIRNA konsentrasjon / renhet, agarosegelelektroforese, proteinkonsentrasjon, microarray og RT-qPCR prosedyrer. Begrensningene i vår metode er at liten prosentdel av HDL-miRNA kan miste under exosome utfellingstrinnet og den nødvendige plasmaprøvevolumet bør være mer enn 200 pl for å isolere HDL-miRNA.

Til slutt blir plasma microRNAs ikke bare avledet fra skadede eller løper blodlegemer i omløp, men også fra friske normale blodceller og celler fra andre deler av kroppen som omfatter en rekke friske og syke vev og organer som påvirkes av pågående helsetilstanden i legemet 20. Denne studien har systematisk renset moden MIR-223 fra isolerte HDL av humant plasma. Denne studien viser tydelig at nivåene av modne MIR-223 i høyt renset HDL plasma kan påvises, stabil, reproduserbar og konsistent mellom individer prøven, og dermed i stor grad legge til rette for klinisk bruk av Futurity tester for lipoproteiner, liver, hjerte og andre metabolske syndromer. Overraskende, modne mirnas, særlig MIR-223 fra HDL plasma er sannsynligvis motstandsdyktig mot Nukleasefordøyelse og andre tøffe forhold som potensielt forklare stabiliteten av MIR-223 i renset HDL. Mekanismen for motstand fra Mir-223 til RNases krever videre studier. Selvfølgelig, studere miRNA uttrykk profiler i disse renset HDL plasma ville belyse fremtidige miRNA markører i å studere ulike sykdommer. Disse HDL knyttet microRNAs i plasma kan brukes som en potensiell kliniske diagnostiske biomarkører og personlig medisin i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  2. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (12), 5003-5008 (2011).
  3. Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, (4), 423-433 (2011).
  4. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
  5. Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33, (10), 1956-1964 (2013).
  6. Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114, (1), 183-192 (2014).
  7. Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16, (4), 415-421 (2004).
  8. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  9. Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
  10. Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
  11. Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
  12. Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
  13. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
  14. Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717, (1-2), 85-90 (2011).
  15. Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
  16. Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2, (19), (2014).
  17. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
  18. Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. www.qiagen.com (2015).
  19. Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
  20. Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics