Snabb och förenklad metod för High Genom sätta Isolering av miRNA från högrenat high density lipoprotein

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

MicroRNAs spelar en viktig reglerande roll och växer fram som nya terapeutiska mål för olika mänskliga sjukdomar. Det har visats att miRNA transporteras i lipoproteiner med hög densitet. Vi har utvecklat en förenklad metod för att snabbt isolera renat HDL lämplig för miRNA analys från human plasma.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Insamling av blodprover

  1. Samla fasta perifera venösa blodprover i 10 ml plaströr som innehåller antikoagulant etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (som har flera fördelar jämfört med andra antikoagulantia) genom standard venpunktion av en framstående ven i armvecket.
  2. Centrifugera blodproven vid 1600 xg under 20 min vid 4 ° C i en bordscentrifug för att erhålla plasma fri från röda blodceller och små mängder av RNA.
  3. Centrifugera sekventiellt supernatanten vid 3000 g (4 ° C) i en svängande hink-rotor under 10 minuter för avlägsnande av WBC & Trombocyter och ytterligare därefter 15 min för att avlägsna kvarvarande celldebris respektive.
  4. Mäta densiteten hos plasma med användning av en densitometer vid RT enligt tillverkning instruktioner.
    OBS: Justering av densiteten (d = 1,023 g / ml) med 0,9% saltlösning kan krävas efter avlägsnande av exosomes men före densitetsgradient-ultracentrifugering.
  5. 2. Exosome Removal från plasma

    1. Ta bort de cirkulerande exosomes som har en densitet som liknar HDL och utgör en kvantitativt viktig källa till miRNA 3.
      1. Gör detta genom att tillsätta 252 | il Exosome fällningslösningen till 1 ml plasma följt av inkubation under 30 min vid 4 ° C. För att pelletera ut de exosomes, centrifugera blandningen i 30 min vid 1500 g vid 4 ° C.
      2. För att isolera HDL, överföring 1 ml av den resulterande supernatanten till ett polykarbonat tjockväggigt ultracentrifugrör för vidare bearbetning med densitetsgradient-ultracentrifugering (se nedan).

    3. densitetsgradient Ultracentrifugering (Figur 1).

    1. Att skilja HDL använda en 3-stegsprocess som utnyttjar ett golv ultracentrifugen med en fast vinkel rotor arbetar vid 448.811 x G och 8 ° C, respektive.
    2. Förbered tre olika densitet lösningar sekventiellt och färskt för varje isolering.
      1. Förbereda Lösning A (isolering av VLDL, d = 1,006 g / ml) genom att lösa 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na och 1 ml 1 N NaOH i 1000 ml autoklaverat-destillerat vatten. Tillsätt sedan ytterligare 3 ml autoklaverat destillerat vatten.
      2. Förbereda Lösning B (isolering av LDL, d = 1,182 g / ml) genom att tillsätta 25,2 g NaBr till 100 ml lösning A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
      3. Förbered Lösning C (isolering av HDL, d = 1,470 g / ml) genom att blanda 78,8 g NaBr med 100 ml av lösning A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Bekräfta lämplig täthet vid RT med hjälp av en densitometer. Håll alla lösningar vid 4 ° C tills vidare användning.

    4. Isolering av VLDL

    1. Blanda 1 ml plasma (genomsnittlig täthet = 1.023 g / ml) och nukleasfritt 200 pl av Fat Red 7B i en 6,5 ml polykarbonat tjockväggigt ultracentrifugrör.
    2. Sedan försiktigt skikt 5 ml av lösning A på toppen av blandningen. Om det behövs, lägga till ytterligare Fat Red 7B ovanpå lösning A to balansera vikten av varje rör. Centrifugera i 2 h (acceleration - 5), (retardation - 7).
      OBS! Under centrifugering, är lipoproteiner ackumuleras som ett band på sina jämviktstäthet.
    3. Vid slutet av körningen observera 2 lager. Ta bort 1,5 ml av VLDL-fraktionen som representerar det översta lagret och förvara vid 4 ° C.
    4. Slutligen, med hjälp av en pipett överföring 4 ml från botten av röret innehållande LDL, HDL, albumin och fettsyrafraktionen i ett annat polykarbonat rör för LDL isolering.

    5. Isolering av LDL

    1. Blanda 2 ml lösning B och 100 pl nukleasfritt Fat Red 7B i röret som innehåller LDL och HDL-fraktionen (avsnitt 4), respektive.
    2. centrifugera sedan ut under 3 h (acceleration 9, retardation 7). Därefter, ta bort 1,5 ml av LDL-fraktionen som representerar det översta lagret och hålla vid 4 ° C eller förvara vid -80 ° C. Slutligen överför 4 ml från botten av röret innehållande HDLfraktion till en ny polykarbonat rör.

    6. Isolering av HDL

    1. Blanda 2 ml av lösning C, 100 | j, l nukleasfritt Fat Red 7B och 15 pl av 98% β-merkaptoetanol till röret innehållande HDL-fraktionen, respektive.
    2. Centrifugera i 3 h (acceleration 9, retardation 7). Därefter avlägsna 2 ml av HDL-fraktionen som representerar det översta lagret och antingen hålla vid 4 ° C eller förvara vid -80 ° C.

    7. Avsaltning och Koncentration av lipoproteinfraktioner

    1. För att undvika störningar med efterföljande agarosgelelektrofores och PCR, ta bort alltför salt tillsätts under densitetsgradient ultracentrifugering med hjälp av centrifugal filteranordningar med lämplig molekylvikt cutoff (3K rör för VLDL och 10K rör för LDL / HDL) som beskrivs i tillverkarens instruktioner.
      1. I korthet, efter tillsats av 2,5 ml kall PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifugege hela VLDL-fraktionen samlas-under densitetsgradient ultracentrifugering vid 4 ° C under 60 min med hjälp av en svängande hink rotor.
      2. Avsalta LDL-fraktionen två gånger med 10 ml iskall PBS under 30 min vardera. Därefter Använd 13 ml iskall PBS två gånger för avsaltning av HDL-fraktionen. Ju högre PBS volymen är nödvändig för att förbättra rörligheten med agarosgelelektrofores. Efter centrifugering, avlägsna lipoprotein innehåller lösta ämnen och hålla vid 4 ° C eller lagras vid -80 ° C.

    8. agarosgelelektrofores

    1. Perfrom lipoprotein agarosgelelektrofores utnyttjar kit med smärre ändringar av tillverkarens anvisningar som följer.
      OBS: Detta steg är bara att bedöma kvaliteten och renheten hos de koncentrerade lipoprotein prover.
      1. I korthet erhålla 6 pl av avsaltade lipoprotein fraktionen med densitetsgradient ultracentrifugering och laddar in en pre-cast lipoprotein gel. Använda humant lipoprotein standarder för VLDL, LDL och HDL som storlek referens. Utför elektrofores vid RT vid 100 V under 60 min med hjälp av tekniker Prep buffert.
      2. Torka gelén under 10 min och sedan färgas under 10 minuter vid RT med Fat Red 7B. Avfärgning gelén i en blandning av metanol-vatten 75:25 (volym / volym) och torr igen i 5 min.

    9. RNA-extraktion och rening

    1. Perfrom isolering av miRNA av renat humant HDL med hjälp av serum / plasma miRNA isolering och rening kit.
      1. I korthet, tillsätt 1 ml av RNA lysisreagens till 200 | il renad HDL, blanda med en virvelblandare och inkuberades sedan under 5 min vid RT för att säkerställa fullständig dissociation av nukleoprotein komplex och inaktivering av RNaser.
      2. Spik därefter 3,5 pl av syntetisk Caenorhabditis elegans mikroRNA (cel-miR-39; 1,6 x 10 8 kopior / | il) in i blandningen. Utför sedan RNA-extraktion enligt tillverkarens anvisningar.
    2. utföra purificatipå av extraherat-miRNA med eluerade spinnkolonner enligt tillverkarens anvisningar. Mäta koncentrationen av miRNA från renat HDL med en spectrophorometer.
      OBS: Eluering av miRNA från spinnkolonner användes 16 pl RNase-fritt vatten.

    10. Omvänd transkription (RT-PCR)

    1. Isolera 100 ng av miRNA från HDL spiked med syntetiskt miRNA (cel-miR-39) och omvänd-transkriberas i en 20 | il reaktionsvolym med användning av den omvända transkriptionen kit och enligt tillverkarens instruktioner.
    2. Genomföra lämpliga kontroller utan mall miRNA (NTC) och utan omvänt transkriptas enzymblandning (NRT).

    11. Realtids-PCR (QRT-PCR)

    1. Perfrom Realtids-PCR i en total volym av 20 | il med 2 pl av en 1: 2 utspädning av cDNA, 10 | al PCR-blandning, 2 | j, l universell primer, 2 | il av miRNA primrar och 4 | j, l RNas-fritt vatten.
    2. Köra Reactipå i 96-brunnsplattor vid 95 ° C under 15 minuter, följt av 45 cykler av 94 ° C under 15 sek och 55 ° C under 30 s och en förlängningsfasen vid 70 ° C under 30 s.ec perfrom alla reaktioner i triplikat .
    3. Härnäst Calcuate relativa mängderna av miRNA med hjälp av två -ΔΔ Ct metod efter normalisering till den syntetiska housekeepinggen enligt tillverkarens instruktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av high density lipoprotein Efter avlägsnande av exosomes
För att få miRNA från högrenat HDL är det nödvändigt att avlägsna exosomes som utgör en källa till miRNA förorening 7. Detta gjordes före densitetsgradient-ultracentrifugering med ett kommersiellt tillgängligt kit. Av praktiska skäl en trestegs standard densitetsgradient ultracentrifugering protokoll som utvecklats av kommersiellt företag ändrades (Figur 1). Detta protokoll kräver centrifugering med en fast vinkelrotor med en hastighet av 140.000 rpm som är betydligt snabbare än som vanligen används protokoll med centrifugalkraft upp till 54.000 rpm 3, 8, 9, och 10. Använda en allmänt tillgänglig T-1270 rotor med en maximal kraft 70.000 rpm, var centrifugering initialt med polyallomer rör som har misslyckats med att motstå centrifugalkraft. För att undvika kollaps av rören,polykarbonatrör ades med framgång använts. Centrifugeringstiden är avgörande för lipoproteinoxidation och potentiellt miRNA nedbrytning 11. Därför flera olika centrifuge gånger, allt från totalt 8-96 timmar testades. Dessutom temperatur vid vilken centrifugering genomfördes justerades baserat på centrifugeringstiden och kraft, respektive.

Renhet av high density lipoprotein fraktioner
Renhet av isolerade hög density lipoprotein fraktioner kontrollerades med agarosgelelektrofores. Figur 2. visar en typisk elektrofores resultat för HDL subtraktion isolerades genom ultracentrifugering. Det visade tydligt att HDL saknade kontaminering av VLDL och uppvisar typiskt α-mobilitet. Avsaknaden av a-migrering lipoproteiner i VLDL- och LDL-fraktioner visar fullständig återhämtning från HDL under ultracentrifugation steget. HDL-fraktionen visade dock också några spår av β-mobilitet, en känd elektroforebandmönster på grund av kontaminering med lipoproteiner (Lp (a)) 12.

Eliminering av Lp (a) från isolerade HDL
Att studera miRNA transporteras i HDL kräver isolering av HDL av högsta renhet. Störningar av Lp (a) med HDL potentiellt bidrar till korskontaminering av HDL med miRNA transporteras i LDL. För att minimera denna kontaminering av HDL, var 15 | il av β-merkaptoetanol 10 sattes till lösning C under det sista centrifugeringssteget (figur 1). Tillsats av β-merkaptoetanol har visat att inte ändra HDL densitet egenskaper 10. Såsom visas i figur 3., tillsats av β-merkaptoetanol resulterade i frånvaro av varje B-migrerande lipoproteiner som överensstämmer med mycket effektiv borttagning av Lp (a).

Rening av miRNA från HDL
Isolering av miRNA initialt försök med användning av lyseringsreagens som vanligtvis används för RNA-extraktion från blod. Även om denna metod resulterade i en mycket bra RNA avkastning (91,45 ng / l), men efter spektrofotometrisk analys visade otillfredsställande RNA renhet. Ytterligare rening av det isolerade RNA genom att ta bort fenol förbättrade renheten men RNA utbytet var nu mycket låga. Därefter tillsattes en annan sats testades som uppvisade acceptabel RNA renhet (260/280 nm förhållande av 1,7) men RNA-utbytet var 26-faldigt lägre jämfört med lyseringsreagens (3,45 vs. 91,45 ng / | il). De bästa resultaten för acceptabel RNA renhet med ett gott utbyte erhölls med miRNeasy serum / plasma-kit (48,2 ng / ul; 260/280 nm-förhållande av 1,6) och därför är detta extraktionsförfarande därefter användes för detektion av miRNA från det isolerade HDL lipoprotein fraktionen.

3 och visade sig undertrycka HDL-kolesterol upptag 5. Figuren 4A. visar en typisk log plot av amplifieringskurvor som jämför baslinjen tröskel- och tröskelcykelvärden efter optimering av PCR-reaktionen för MIR-223 och den spetsade-i Cel-mir-39. Denna syntetiska gen användes som intern kontroll eftersom det inte finns några rapporter om kända normaliseringskontroll för miRNA i plasma. Dessutom har flera potentiella etablerade endogena housekeeping-gener som RNU6-2, RNU-48, HY3 kunde inte detekteras och SNORD95 kunde detekteras i renat HDL, men är mindre än fem (skillnaden i Ct-värden av MIR-223 och SNORD95 data visas ej). Smältkurvanalys visas i fig 5. visar tydligt en distinkt endatopp i överensstämmelse med förstärkning av en selektiv miRNA i föregående PCR. Såsom illustreras i figur 4B., Kunde både miR-223 och referens Cel-mir-39 genomgående detekteras i alla sex pro band. Relativt små variationer mellan alla personer observerades för Cel-mir-39 jämfört med MIR-223. Dessa resultat stöder isolering av HDL vid hög renhet för att medge detektering av dess miRNA last.

Detektion av MIR-223 i renat HDL
Realtid kvantitativ PCR-metod användes för att kvantifiera dubbel hårnålsstruktur miRNA prekursorer till enkelsträng miRNA. Denna metod kräver en fram / back-genspecifika primrar och ett termostabilt omvänt transkriptas för att omvandla hårnålstrukturen av miRNA till cDNA. CDNA förstärks därefter och kvantifieras med hjälp av realtids-qPCR med hjälp av SYBR grön upptäckt. MicroRNA från serum, plasma och renas HDL plasma kan vara exakt profiled hjälp av miRNA RT PCR-system.

Vår experimentella produkt av medelvärdet miR-223 genuttryck visade ett Ct-värde av 30,9 i renat HDL och dess motsvarande negativa kontroller var över cut-off 35 (NTC = 38,1 Ct värde var NRT och NAC inte förstärkt). I detta experiment, såg vi i de renade HDL prover bildandet av primerdimerer med låg smälttemperatur (73 ° C i MIR-223 och 75,5 ° C i Cel-miR-39) och högre C t-värdet än de specifika miRNA analyser (tabell 1). De primerdimerer i tabell 1. uppträder troligen på grund av hög koncentration av primrar i lösningen. Detta sker oftast när primermolekyler fästa vid varandra efter 30 PCR-cykler 13. Detta gör det möjligt för dem att para till andra primermolekyler och i själva verket bli linjära mini-mallar och det kommer att orsaka högre bakgrund och kan leda till en generation av C t-värdet <40 för NTC (nr Template kontroll) prover.

Figur 1
Figur 1. Schematisk representation av HDL isoleringsproceduren. HDL framställdes genom densitetsgradient-ultracentrifugering i en serie av tre centrifugeringssteg. Fördelning av lipoprotein band och mellanfraktioner i densitetsgradienten illustreras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. agarosgelelektrofores av lipoproteiner isoleras utan β-merkaptoetanol. VLDL, LDL och HDL fraktioner isoleras genom densitetsgradient ultracentrifugering utan att β-merkaptoetanol till lösning C demonstgradera närvaron av Lp (a) i HDL-fraktionen. Banorna 1, 2, 9 och 10 vardera representerar storleksmarkör; Lanes 3/4, 5/6 och 7/8 representerar VLDL, LDL och HDL respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. agarosgelelektrofores av HDL Isolerad med β-merkaptoetanol. Lägga β-merkaptoetanol till lösning C innan det sista centrifugeringssteget resulterade i avlägsnandet av Lp (a) från HDL-fraktionen. Banorna 1, 2, 9 och 10 var och en representerar den storleksmarkör; Banorna 3-8 representerar HDL. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 4. Amplification Plot av två olika miRNA och uttryck av Cel-MIR-39 och MIR-223. (A) i realtid kvantitativ PCR med användning av isolerade HDL utfördes såsom beskrivits. PCR kördes under 45 cykler och den punkt, vid vilken kurvan skär tröskeln är den K T Värde. Data visar uttrycket av Cel-MIR-39 (till vänster) och MIR-223 (högra panelen), respektive. Den horisontella linjen representerar detekteringströskeln. En cykel antal 35 fastställdes som cutoff för positiv förstärkning. (B) representant realtids-PCR-data från isolerade HDL erhållits från 6 prover visas. Raw menar Ct-värden visas för Cel-MIR-39 och MIR-223, vars uttryck nivåerna varierar mindre än två Ct värde i renat HDL plasmafraktionen mellan 6 prover, vardera från en annan donator. Uttrycksprofilering genomfördes med användning av PCR-systemet och den Human Serum & plasma miRNEn QRT-PCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. smältkurvor för Cel-miR-39 och miR-223. Såsom illustreras, närvaron av en enda topp indikerar specifik amplifiering av Cel-miR-39 (höger panel) och miR-223 (vänster fält), respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1
Tabell 1. Rad C t-värdet av negativ och positiv kontroll av syntetiskt Cel-miR-39 och miR-223, kännetecknat av serum, plasma, cDNA, och renat HDL-fraktionen. NTC (nr Template kontroll), NRT (Ingen omvänd transkription enzym), NAC (ingen förstärkning kontroll, endast vatten och reagens av QRT-PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifiering av nya biomarkörer från blod kommer att hjälpa i klinisk diagnos och prognos av olika sjukdomar. MicroRNAs har kända för att ha alla de egenskaper av biomarkörer och har visats i olika studier 14-17. I denna studie har vi visat en snabb och enkel enkel metod för att isolera miRNA från plasma HDL. Konventionell densitetsgradient ultra-centrifugering metod för isolering av VLDL, LDL och HDL är beroende av korrekt provtagning av plasma, exakt beredning av buffertlösningen, mätning av densitet och kvantitativ överföring av botten lipoproteinfraktioner 8. Det finns många metoder som har beskrivits för att isolera HDL 8 -11. Dessa metoder är ofta antingen mycket mödosam eller kräver stora volymer av plasma och omfattande dialys för avsaltning isolerade lipoproteiner och inte helt ta bort exosomes och lipoproteiner som en källa till miRNA 3. Att ta itu med dessa brister har vi etablerat denna simple och snabb metod för isolering av miRNA från plasma HDL.

Det centrala målet och primära syftet med denna studie var att separera och isolera HDL-miRNA komplexet genom ultracentrifugering utan RBC, buffycoat, exosomes, sekretoriska vesiklar, VLDL, LDL och lipoprotein (a) störning, sedan isolera miRNA från renat HDL. Kontaminering och interferens för någon av dessa komponenter med HDL kommer att ändra de förväntade experimentella resultat och miRNA profileringsdata. Isolering av DNA, RNA och miRNA från blod är en mycket svår uppgift på grund av dess komplexa natur. Det har alltid ställts med många tekniska utmaningar för nukleinsyror (inklusive miRNA) utvinning och rening jämfört med celler, vävnader och organprov 18. Det finns också relativt mindre miRNA gener som finns i cirkulerande blodkroppar. Blod är en känd bärare för exosomes, sekretoriska vesiklar och HDLs tillsammans med fritt cirkulerande miRNA, som är relativt mindre 18. Därför större enmontera av blodplasma provvolym krävs för bearbetning och isolering av HDL-miRNA komplex. Dessutom gör den korta naturen av miRNA och deras målsekvenser, det ännu svårare att uppnå tillräcklig specificitet med standard-PCR-oligonukleotid-teknik. Cellkomponentema hos blod alltid veta att utsöndra miRNA och mRNA som svar på förändringar i omvärlden, inklusive temperatur, mikroorganismer och gifter eller stress. Även närvaro av nukleaser, RNas, cirkulerande proteiner och andra enzymer i blod kommer att påverka dessa miRNA isolering.

Den cirkulerande miRNA förstärkning saknar också en väletablerad kända housekeeping-gener som β-aktin eller GAPDH för data normalisering när du använder ΔΔCt metod för QRT-PCR. Detta innebär återigen en av de stora hinder för miRNA profilering från cirkulerande blodserum eller plasma 19. Vanligen används korta icke kodande snoRNAs och snRNA sällan uttrycks i blod och detta mÅkes det vidare svårt att utnyttja dem som intern kontroll gener. För att lösa dessa nackdelar med snoRNAs och snRNA och för att undvika eventuella tekniska svårigheter som vi använde Serum / Plasma syntetisk Spike-In kontroll i analyserna som gen intern kontroll som följde enligt tillverkarens protokoll. Det hjälper i normalisering för någon ospecifik förstärkning och förändringar skett under miRNA rening och PCR-reaktion 18. Även när det gäller nedbrytning av miRNA eller frånvaro av några specifika miRNA förstärkningssignaler, det spik kontroll bör förstärka i QRT-PCR-reaktioner och ge en förväntad signal med en någorlunda konstant och enhetlig Ct värde. Baserat på spiken i styr förstärkning tillsammans med tre negativa kontroller och positiva kontroller vi fick bra optimal datavalidering för MIR-223-genen. Detta bekräftade att vi har fått god avkastning på MIR-223 från plasma HDL från denna enkla metod.

Sammanfattningsvis har vi etablerat en metod of densitetsgradient-ultracentrifugering (DGUC) med tillsats av β-merkaptoetanol för rening av miRNA från plasma HDL. Metoden har flera fördelar: (a) VLDL, LDL och HDL separeras inom en kort tidsperiod genom golvultracentrifug jämföras med andra metoder som behöver 24-96 tim 8-11; (b) LDL och HDL dialys, avsaltning / koncentrera ske inom en timme jämföra med andra metoder som tog 24 timmar eller mer 8,9; (C) Förorening av Lipoproteiner avlägsnas genom β-merkaptoetanol i HDL-fraktionen, men är inte avsedd att användas i LDL-fraktionen; (D) Den provvolym som krävs är bara en ml för alla stegvis VLDL, LDL och HDL isoleringar jämföra med andra metoder som behöver mer provvolym; (e) Det minimerade oxidativ skada HDL under isolering 11; (F) Högst 12 prover kan analyseras i ett enda lipoprotein separation analytisk körning; (G) 250 pl provvolym av extraherat HDL är tillräckligt för att analysera mIRNA koncentration / renhet, agarosgelelektrofores, proteinkoncentration, microarray och RT-qPCR förfaranden. Begränsningarna i vår metod är att liten andel av HDL-miRNA kan förlora under Exosome utfällningssteget och erforderlig plasmaprovvolymen bör vara mer än 200 l att isolera HDL-miRNA.

Slutligen plasma mikroRNA inte bara härrör från skadade eller löpare blodkroppar i cirkulationen utan också från friska normala blodceller och celler från andra delar av kroppen som omfattar olika friska och sjuka vävnader och organ som påverkas av pågående hälsotillstånd i kroppen 20. Den här studien har systematiskt renat moget miR-223 från isolerade HDL av human plasma. Denna studie visar tydligt att nivåerna av mogna miR-223 i högrenat HDL plasma är detekterbara, stabil, reproducerbar och konsekvent bland individer prov, vilket i hög grad underlättar klinisk användning av Futurity test för lipoproteiner, liver, kardiovaskulära och andra metabolt syndrom. Överraskande, mogna miRNA, särskilt miR-223 från HDL plasma är förmodligen resistenta mot nukleasspjälkning och andra svåra förhållanden som potentiellt förklara stabiliteten hos MIR-223 i renat HDL. Mekanismen för motståndet hos MIR-223 till RNaser kräver ytterligare studier. Självklart skulle studera miRNA uttryck profiler i dessa renade HDL plasma belysa framtida miRNA markörer för att studera olika sjukdomar. Dessa HDL associerade mikroRNA i plasma kan användas som en potentiell kliniska diagnostiska biomarkörer och personlig medicin i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  2. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (12), 5003-5008 (2011).
  3. Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, (4), 423-433 (2011).
  4. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
  5. Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33, (10), 1956-1964 (2013).
  6. Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114, (1), 183-192 (2014).
  7. Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16, (4), 415-421 (2004).
  8. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  9. Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
  10. Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
  11. Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
  12. Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
  13. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
  14. Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717, (1-2), 85-90 (2011).
  15. Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
  16. Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2, (19), (2014).
  17. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
  18. Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. www.qiagen.com (2015).
  19. Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
  20. Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics