Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Het verzamelen van bloedmonsters

  1. Verzamel vasten perifere veneuze bloedmonsters in 10 ml plastic buizen die anticoagulant Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (dit kan enkele voordelen boven andere anticoagulantia heeft) door standaard venapunctie een prominente ader in de antecubitale fossa.
  2. Centrifugeer de bloedmonsters bij 1600 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een tafelblad centrifuge plasma vrij van rode bloedcellen en kleine hoeveelheden RNA te verkrijgen.
  3. Opeenvolgend centrifugeer het supernatant bij 3000 g (4 ° C) in een swinging bucket rotor gedurende 10 min WBC en bloedplaatjes en bijkomende 15 min verwijderen respectievelijk verwijderen van alle resterende celresten.
  4. Meet de dichtheid van het plasma met een densitometer bij kamertemperatuur volgens vervaardiging instructies.
    OPMERKING: Aanpassing van de dichtheid (d = 1,023 g / ml) met 0,9% zoutoplossing vereist kan na verwijdering van exosomen maar vóór dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie.
  5. 2. exosome Verwijdering van Plasma

    1. Verwijder de circulerende exosomes dat een dichtheid vergelijkbaar HDL hebben en vormen een kwantitatief belangrijke bron van miRNA 3.
      1. Do hierop door 252 pi precipitatie exosome oplossing van 1 ml plasma, gevolgd door incubatie gedurende 30 min bij 4 ° C. Om pellet de exosomes, centrifuge het mengsel gedurende 30 minuten bij 1500 g bij 4 ° C.
      2. HDL, breng 1 ml van de supernatant tot een polycarbonaat dikwandige ultracentrifuge buis voor verdere verwerking met dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie isoleren (zie hieronder).

    3. dichtheidsgradiëntcentrifugatie (figuur 1).

    1. Te scheiden HDL gebruik van een 3-staps proces waarbij een vloer ultracentrifuge met vaste hoek rotor werkt bij 448.811 x G en 8 ° C.
    2. Bereid drie verschillende dichtheid oplossingen sequentieel en fris voor elke isolement.
      1. Bereid Oplossing A (isolatie van VLDL, d = 1,006 g / ml) door het oplossen van 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na en 1 ml 1N NaOH in 1000 ml van geautoclaveerd gedestilleerd water. Voeg vervolgens nog eens 3 ml geautoclaveerd gedestilleerd water.
      2. Bereid Oplossing B (isoleren van LDL, d = 1,182 g / ml) door toevoeging van 25,2 g NaBr aan 100 ml oplossing A (0,195 mol NaCl, NaBr 2,44 mol).
      3. Bereid Oplossing C (isoleren van HDL, d = 1,470 g / ml) door mengen van 78,8 g NaBr met 100 ml oplossing A (0,195 mol NaCl, NaBr 7,7 mol). Bevestig de juiste dichtheid bij kamertemperatuur met behulp van een densitometer. Houd alle oplossingen bij 4 ° C tot verder gebruik.

    4. Isolatie van VLDL

    1. Meng 1 ml plasma (gemiddelde dichtheid = 1,023 g / ml) en nuclease vrij 200 gl Fat Red 7B in een 6,5 ml polycarbonaat dikwandige buis ultracentrifuge.
    2. Vervolgens voorzichtig laag 5 ml oplossing A bovenop het mengsel. Indien nodig, voeg extra Fat Red 7B op de top van de oplossing A to balanceren het gewicht van elke buis. Centrifugeer gedurende 2 uur (versnelling - 5), (vertraging - 7).
      LET OP: Tijdens het centrifugeren, worden de lipoproteïnen opgebouwd als een band bij hun evenwicht dichtheid.
    3. Aan het einde van de run te observeren 2 lagen. Verwijderen 1,5 ml van de VLDL breuk welke de toplaag en bewaar bij 4 ° C.
    4. Bovendien zullen, met een pipet overdracht 4 ml van de bodem van de buis met het LDL, HDL, albumine en vetzuurfractie in nieuw polycarbonaat buis LDL isolatie.

    5. Isolatie van LDL

    1. Meng 2 ml oplossing B en 100 ul nuclease vrij Fat Red 7B in de buis met de LDL en HDL-fractie (hoofdstuk 4), respectievelijk.
    2. centrifugeren vervolgens gedurende 3 uur (9 versnelling, vertraging 7). Daarna verwijdert 1,5 ml van de LDL fractie die de bovenste laag en laten 4 ° C en bewaar bij -80 ° C. Breng tenslotte 4 ml van de bodem van de buis met het HDLfractie om een ​​nieuwe polycarbonaat buis.

    6. Isolatie van HDL

    1. Meng 2 ml oplossing C, 100 ul nuclease vrij vet Red 7B en 15 pl 98% β-mercaptoethanol in de buis met de HDL-fractie, respectievelijk.
    2. Centrifugeer gedurende 3 h (9 versnelling, vertraging 7). Daarna verwijdert 2 ml van de HDL-fractie die de bovenste laag en deze behouden bij 4 ° C en bewaar bij -80 ° C.

    7. Het ontzouten en concentratie van lipoproteïnefracties

    1. Om interferentie met daaropvolgende agarose gelelektroforese en PCR vermijden de buitensporig zout toegevoegd tijdens dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie middels centrifugale filterinrichtingen met het geschikte molecuulgewicht cutoff (3K buis VLDL en 10K buis LDL / HDL) volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Kort na het toevoegen van 2,5 ml koude PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifugalege de gehele VLDL-fractie verzameld tijdens dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie bij 4 ° C gedurende 60 min met een swinging bucket rotor.
      2. Ontzouten de LDL fractie tweemaal met 10 ml ijskoud PBS gedurende 30 minuten elk. Gebruik vervolgens 13 ml ijskoud PBS twee keer voor het ontzouten van de HDL-fractie. Hoe hoger volume PBS moet mobiliteit agarosegelelektroforese verbeteren. Na centrifugeren, verwijderen lipoproteïne bevattende opgeloste stoffen en bewaar bij 4 ° C en bewaard bij -80 ° C.

    8. agarosegelelektroforese

    1. Perfrom lipoproteïne agarosegelelektroforese onder toepassing van de kit met kleine modificaties van de instructies van de fabrikant als volgt.
      OPMERKING: Deze stap is alleen maar om de kwaliteit en zuiverheid van de geconcentreerde lipoproteïne monsters te beoordelen.
      1. In het kort verkrijgen 6 ui van het ontzoute lipoproteïne fractie met dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en laden op een prefab lipoproteïne gel. Gebruik menselijke lipopProtein normen voor VLDL, LDL en HDL als maat referentie. Uit te voeren elektroforese bij KT bij 100 V gedurende 60 min met behulp van Rep Prep buffer.
      2. Droog de gel gedurende 10 minuten en daarna kleur wordt 10 minuten bij kamertemperatuur met Fat Red 7B. Destain de gel in een mengsel van methanol-water 75:25 (v / v) en droog weer gedurende 5 minuten.

    9. RNA extractie en zuivering

    1. Perfrom isolatie van miRNA door gezuiverde humane HDL met behulp van de serum / plasma miRNA isolatie en zuivering kit.
      1. Kort samengevat, voeg 1 ml RNA lysis reagens 200 gl gezuiverd HDL, mengen met een vortexer en vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om complete dissociatie van nucleoproteïne complexen en inactiveren van RNasen waarborgen.
      2. Spike dan 3,5 pi van synthetische Caenorhabditis elegans microRNA (CEL-miR-39; 1,6 x 10 8 kopieën / ul) in het mengsel. Voer daarna RNA extractie volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Voer purificatiop geëxtraheerde-miRNA met elueren spinkolommen volgens instructies van de fabrikant. Meet de concentratie van miRNA uit gezuiverd HDL met een spectrophorometer.
      LET OP: Elutie van miRNA uit de spin-kolommen toegepast 16 pi RNase-vrij water.

    10. Reverse transcriptie (RT-PCR)

    1. Isoleren 100 ng van het miRNA van HDL verrijkt met synthetische miRNA (CEL-miR-39) en reverse getranscribeerd in een 20 pl reactievolume onder toepassing van de reverse transcriptie en kit volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Voer de juiste controles zonder template miRNA (NTC) en zonder reverse transcriptase-enzym mix (NRT).

    11. Real-time PCR (qRT-PCR)

    1. Perfrom real-time PCR in een totaalvolume van 20 pi met 2 ui van een 1: 2 verdunning van de cDNA, 10 pi PCR-mix, 2 gl universele primer 2 ui miRNA primers en 4 pi RNase-vrij water.
    2. Voer het Reaction in 96-well platen bij 95 ° C gedurende 15 min, gevolgd door 45 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec en 55 ° C gedurende 30 s en verlenging fase bij 70 ° C gedurende 30 s.ec alle reacties in drievoud perfrom .
    3. Vervolgens calcuate relatieve hoeveelheden miRNA met de 2 -ΔΔ Ct werkwijze na normalisatie naar de synthetische huishoudgen volgens instructies van de fabrikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolatie van high density lipoproteïne na verwijdering van exosomes
Om miRNA verkrijgen van sterk gezuiverd HDL moet worden exosomes die een bron van verontreiniging miRNA 7 vertegenwoordigen verwijderen. Dit werd gedaan vóór dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie met een commercieel verkrijgbare kit. Voor praktische doeleinden een driestaps standaard dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie protocol ontwikkeld door commercieel gemodificeerd (figuur 1). Dit protocol vereist centrifugeren met vaste hoek rotor bij een snelheid van 140.000 rpm die aanzienlijk sneller dan gebruikelijke protocollen met centrifugeren krachten tot 54.000 tpm 3, 8, 9 en 10. Gebruikmakend van een alom beschikbare T-1270 rotor met een maximale kracht van 70.000 rpm, centrifugeren werd aanvankelijk met polyallomer buizen die er niet in geslaagd om het centrifugeren krachten te weerstaan ​​uitgevoerd. Om ineenstorting van de buizen te voorkomen,polycarbonaat buizen werden met succes gebruikt. Centrifugeren tijd is van cruciaal belang voor lipoprotein oxidatie en potentieel miRNA degradatie 11. Daarom verschillende keren centrifugeren, van in totaal 8 tot 96 uur getest. Verder temperatuur waarbij centrifugeren werd uitgevoerd werd aangepast op basis van centrifugeren tijd en kracht, respectievelijk.

Zuiverheid van de High Density Lipoproteïne Fracties
Zuiverheid van geïsoleerde high density lipoproteïne fracties werden gecontroleerd met agarosegelelektroforese. Figuur 2. illustreert een typische elektroforese resultaat voor de HDL aftrekken geïsoleerd door gradiënt ultracentrifugatie. Het is duidelijk gebleken dat HDL was zonder enige verontreiniging van VLDL en vertoont typische α-mobiliteit. Het ontbreken van een-α migreren lipoproteïnen in de VLDL en LDL fracties toont het volledige herstel van HDL tijdens de ultracentrifugation stap. De HDL-fractie toonde echter ook enkele sporen van β-mobiliteit, een bekende elektroforetische bandenpatroon door vervuiling met lipoproteïnen (Lp (a)) 12.

Afschaffing van Lp (a) van Geïsoleerde HDL
Studeren miRNAs vervoerd in HDL vereist isolatie van HDL van de hoogste zuiverheid. Interferentie van Lp (a) met HDL potentieel bijdraagt ​​aan kruisbesmetting van HDL met miRNAs uitgevoerd in LDL. Deze verontreiniging van HDL minimaliseren, werd 15 ul van β-mercaptoethanol 10 gedurende de laatste centrifugatiestap (figuur 1), waarbij oplossing C toegevoegd. Toevoeging van β-mercaptoethanol is aangetoond HDL dichtheid eigenschappen 10 niet te veranderen. Zoals weergegeven in figuur 3, toevoeging van β-mercaptoethanol resulteerde in de afwezigheid van elke migratie-b lipoproteïnen overeenstemming met zeer effectieve verwijdering van Lp (a).

Zuivering van miRNA van HDL
Isolatie van miRNA aanvankelijk geprobeerd gebruik lysis reagens dat gewoonlijk wordt gebruikt voor RNA-extractie uit het bloed. Hoewel deze methode resulteerde in een zeer goede opbrengst RNA (91,45 ng / ul) maar na spectrofotometrie toonde unsatisfactory RNA zuiverheid. Extra zuivering van het geïsoleerde RNA door het verwijderen van fenol verbeterde de zuiverheid, maar de RNA-opbrengst was nu beduidend laag. Vervolgens werd een kit getest aanvaardbare RNA zuiverheid (260/280 nm verhouding 1,7), maar de RNA opbrengst was 26-voudig lager in vergelijking met de lysis reagens (3,45 vs. 91,45 ng / pl) vertoonde. De beste resultaten voor RNA aanvaardbare zuiverheid heeft met een goede opbrengst verkregen met de miRNeasy serum / plasma kit (48,2 ng / ul; 260/280 nm-verhouding van 1,6) en daarom is deze extractieprocedure werd vervolgens gebruikt voor de detectie van miRNA uit de geïsoleerde HDL lipoproteïne-fractie.

3 en bleek te onderdrukken HDL-cholesterol opname 5. De figuur 4A. toont een typische log plot van de versterking curves vergelijken basislijn drempel en drempel cyclus waarden na optimalisatie van de PCR-reactie voor de miR-223 en de spiked-in Cel-mir-39. Dit synthetische gen werd gebruikt als interne controle er geen meldingen van bekende normalisatie besturing voor miRNA in plasma. Bovendien hebben verschillende mogelijke vastgesteld endogene housekeeping genen zoals RNU6-2, RNU-48, HY3 kon niet worden gedetecteerd en SNORD95 kon gezuiverd HDL worden gedetecteerd, maar het verschil in Ct waarden van miR-223 en SNORD95 minder dan vijf ( data niet weergegeven). Smeltcurveanalyse weergegeven in figuur 5. toont duidelijk een andere enkelvoudigepiek overeen met amplificatie van een selectieve miRNA in de voorgaande PCR. Zoals geïllustreerd in figuur 4B. Zouden beide miR-223 en de referentie-Cel-mir-39 consequent worden gedetecteerd in alle zes pro bands. Relatief kleine verschillen tussen alle personen werden waargenomen voor Cel-mir-39 ten opzichte van miR-223. Deze bevindingen ondersteunen isoleren van HDL bij hoge zuiverheid detectie van de miRNA lading mogelijk.

Detectie van miR-223 in gezuiverd HDL
Real-time kwantitatieve PCR-methode werd gebruikt om dubbele haarspeld-structuur miRNA voorlopers van enkele streng miRNA kwantificeren. Deze methode heeft een vooruit / achteruit genspecifieke primers en een thermostabiel reverse transcriptase aan de haarspeldstructuur van het miRNA zetten in cDNA. Het cDNA werd vervolgens geamplificeerd en gekwantificeerd met behulp van real-time qPCR met behulp van SYBR groen detectie. MicroRNA uit serum, plasma en gezuiverd HDL plasma nauwkeurig kan worden profiled met behulp van de miRNA RT-PCR-systeem.

Onze experimentele product van de gemiddelde miR-223 genexpressie vertoonden een Ct-waarde van 30,9 in gezuiverde HDL en de bijbehorende negatieve controles waren boven cut-off 35 (NTC = 38,1 Ct-waarde, NRT en NAC waren niet versterkt). In dit experiment, zagen we in het gezuiverde HDL monsters de vorming van primer-dimeer met lage smelttemperatuur (73 ° C in miR-223 en 75,5 ° C in Cel-miR-39) en hogere Ct waarde dan de specifieke miRNA assays (Tabel 1). De primer-dimeren in Tabel 1 komen waarschijnlijk vanwege de hoge concentratie primers in de oplossing. Dit komt meestal als primer moleculen hechten aan elkaar na 30 PCR-cycli 13. Zo kunnen ze hybridiseren aan andere primer moleculen en in feite worden lineaire mini-templates en hoger achtergrond veroorzaken en kan leiden tot de generatie Ct waarde <40 voor NTC (nr template controle) monsters.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van de HDL isolatiewerkwijze. HDL werd bereid door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie in een reeks van drie centrifugatiestappen. Verdeling van lipoproteïne bands en intermediaire fracties in de dichtheidsgradiënt worden geïllustreerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. agarosegelelektroforese lipoproteïnen Geïsoleerde Zonder β-mercaptoethanol. VLDL, LDL en HDL fracties geïsoleerd door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie zonder toevoeging van β-mercaptoethanol bij oplossing C demonstbeoordeling van de aanwezigheid van Lp (a) in de HDL-fractie. Lanen 1, 2, 9 en 10 elk voor de grootte marker; Lanes 3/4, 5/6 en 7/8 vertegenwoordigen VLDL, LDL en HDL respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Agarose gelelektroforese van HDL Geïsoleerd met β-mercaptoethanol. Β-mercaptoethanol bij oplossing C toevoegen vóór de laatste centrifugatiestap geleid tot de verwijdering van Lp (a) van de HDL-fractie. Lanen 1, 2, 9 en 10 elk voor de grootte marker; Lanen 3-8 vertegenwoordigen HDL. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 4. Amplification Plot van twee verschillende miRNAs en expressie van Cel-miR-39 en miR-223. (A) Real-time kwantitatieve PCR in dienst geïsoleerde HDL werd uitgevoerd zoals beschreven. De PCR werd uitgevoerd gedurende 45 cycli en het punt waar de curve snijdt de drempel de CT-waarde genoemd. De gegevens tonen de expressie van de Cel-miR-39 (linker paneel) en miR-223 (rechter paneel), respectievelijk. De horizontale lijn stelt de detectiedrempel. Een aantal cycli van 35 werd ingesteld cutoff positieve amplificatie. (B) Representatieve real-time PCR data van geïsoleerd HDL verkregen van 6 monsters worden getoond. Raw gemiddelde Ct-waarden worden getoond voor Cel-miR-39 en miR-223, waarvan de expressieniveaus variëren minder dan 2 Ct waarde HDL gezuiverde plasmafractie tussen 6 monsters, elk uit een andere donor. Expressie profilering werd uitgevoerd met de PCR System en Human Serum en plasma miRNEen qRT-PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. smeltcurven voor Cel-miR-39 en miR-223. Zoals getoond, de aanwezigheid van een enkele piek geeft specifieke amplificatie van respectievelijk Cel-miR-39 (rechterpaneel) en miR-223 (linker paneel). Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

tafel 1
Tabel 1. Rij Ct waarde van negatieve en positieve controle van synthetische Cel-miR-39 en miR-223 kenmerk, serum, plasma, cDNA en gezuiverd HDL-fractie. NTC (No template controle), NRT (geen reverse transcriptie enzym), NAC (No versterking controle, alleen water en reagentia van qRT-PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identificatie van nieuwe biomarkers uit bloed zal helpen bij de klinische diagnose en prognose van verschillende ziekten. MicroRNA's zijn bekend bij alle kwaliteiten van biomarkers te bezitten en er is aangetoond in diverse studies 14-17. In deze studie hebben we aangetoond dat een snelle en eenvoudige eenvoudige methode om miRNA isoleren van HDL. Conventionele dichtheidsgradiënt ultra-centrifugatie isolatiemethode van VLDL, LDL en HDL afhankelijk nauwkeurige bemonstering van plasma, nauwkeurige opstelling van de bufferoplossing, de meting van dichtheid en kwantitatieve overdracht van bottom lipoproteïnefracties 8. Er zijn talrijke werkwijzen die zijn beschreven HDL 8 -11 isoleren. Deze methoden zijn vaak ofwel zeer omslachtig en vereisen grote volume plasma en uitgebreide dialyse geïsoleerd ontzouten lipoproteïnen en niet volledig exosomes en lipoproteïnen te verwijderen als een bron van miRNAs 3. Om deze tekortkomingen we dit si hebben vastgesteld aan te pakkenmple en snelle methode van isolatie van miRNA uit plasma HDL.

Het belangrijkste doel en primaire doel van deze studie was het scheiden en isoleren van HDL-miRNA complex door ultracentrifugatie zonder RBCs, buffy coat, exosomes, secretoire vesicles, VLDL, LDL en Lipoproteïnen (a) storing, dan isoleren van miRNAs gezuiverd HDL. Verontreinigingen en storingen van elke van deze componenten met HDL zal de verwachte experimentele resultaten en miRNA profielgegevens veranderen. Isolatie van DNA, RNA en miRNAs uit het bloed is een zeer moeilijke taak vanwege zijn complexiteit. Het is altijd gesteld met veel technische uitdagingen nucleïnezuren (waaronder miRNAs) extractie en zuivering vergelijking met cellen, weefsels en orgaanmonsters 18. Ook zijn er relatief minder miRNA genen die aanwezig zijn in circulerende bloedcellen. Bloed is een bekende drager voor exosomes, secretorische blaasjes en HDLs samen met gratis circulerende miRNAs, die relatief minder 18 zijn. Daarom is een groteremount bloedplasma monstervolume vereist is voor de verwerking en isolatie van HDL-miRNA complex. Bovendien, de korte duur van de miRNAs en de doelsequenties, maakt het nog moeilijker om voldoende specificiteit standaard PCR oligonucleotide technologieën beschikken. De cellulaire componenten van het bloed zijn altijd weten om miRNA en mRNA uitscheiden als gevolg van veranderingen in de externe omgeving zoals temperatuur, micro-organismen en toxines of stress. Ook aanwezigheid van nucleasen, RNases, circulerende eiwitten en andere enzymen in het bloed is van invloed op deze miRNA isolement.

De circulerende miRNA versterking ontbreekt ook een gevestigde bekende housekeeping genen, zoals β-actine en GAPDH voor data normalisatie, terwijl het gebruik van de ΔΔCt methode qRT-PCR. Dit vormt opnieuw een van de belangrijke hindernis voor miRNA profilering circuleert bloedserum of plasma 19. Veelgebruikte korte non-codering snoRNAs en snRNAs worden zelden uitgedrukt in bloed en dit maakt hiertoe het verder moeilijk in hen gebruik te maken van interne controle genen. Om deze nadelen van snoRNAs en snRNA's op te lossen en om eventuele technische problemen we Serum / Plasma synthetische Spike-In control gebruikt in de assays als interne controle-gen als volgt volgens de fabrikant protocol te vermijden. Het helpt bij normalisatie voor alle niet-specifieke amplificatie en veranderingen opgetreden tijdens miRNA zuivering en PCR-reactie 18. Zelfs in het geval van degradatie van miRNA of afwezigheid van specifieke miRNA amplificatie signalen, de piek-controle moeten amplificeren in qRT-PCR reacties en geeft een verwacht signaal met een redelijk constant gelijkmatig Ct waarde. Op basis van de piek in de controle versterking samen met drie negatieve controles en positieve controles kregen we een goede optimale data validatie van miR-223-gen. Dit bevestigde dat we een goede opbrengst van miR-223 zijn door de circulerende plasma HDL uit deze eenvoudige methode.

Concluderend, hebben wij een methode o vastgesteldf dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DGUC) met toevoeging van β-mercaptoethanol voor zuivering van miRNA uit plasma HDL. De werkwijze heeft verschillende voordelen: (a) VLDL, LDL en HDL worden gescheiden binnen een korte tijd per verdieping ultracentrifuge vergelijken met andere methoden die 24 nodig - 96 uur 8-11; (b) LDL en HDL dialyse, ontzouten / concentreren, vindt plaats binnen 1 uur te vergelijken met andere methoden die 24 uur of meer 8,9 nam; (C) Vervuiling van lipoproteïnen wordt verwijderd door β-mercaptoethanol in HDL-fractie, maar is niet bedoeld voor gebruik in de LDL-fractie; (D) Het monster volume nodig is, is slechts 1 ml voor alle stapsgewijs VLDL, LDL en HDL isolatie te vergelijken met de andere methoden die meer specimen volume nodig heeft; (e) Het geminimaliseerd oxidatieve schade aan HDL in isolatie 11; (F) Er kunnen maximaal 12 monsters kunnen worden geanalyseerd in een enkele lipoproteïne scheiding analytische run; (G) De 250 ul monstervolume geëxtraheerde HDL hebben een m analysereniRNA concentratie / zuiverheid agarose gelelektroforese, eiwitconcentratie, microarray en RT-qPCR procedures. De beperkingen van onze methode is dat kleine percentage HDL-miRNA verliezen tijdens de exosome neerslaan en de vereiste plasma monstervolume dient meer dan 200 ul isoleren HDL-miRNA.

Tenslotte wordt het plasma microRNA niet alleen afkomstig van beschadigde of afvallige bloedcellen in de circulatie, maar ook van gezonde normale bloedcellen en cellen uit andere delen van het lichaam die verschillende gezonde en zieke weefsels en organen die door continue gezondheidsstatus lichaamsoppervlak 20. De huidige studie heeft systematisch gezuiverd volwassen miR-223 van geïsoleerde HDL van menselijk plasma. Deze studie toont duidelijk aan dat niveaus van rijpe miR-223 in het sterk gezuiverde plasma HDL detecteerbaar zijn, stabiel, reproduceerbaar en consistent tussen individuen monster, waardoor klinisch gebruik van futuriteit tests voor lipoproteïnen, li veel gemakkelijkerver, cardiovasculaire en andere metabool syndroom. Verrassend, volwassen miRNAs, met name miR-223 van HDL plasma zijn waarschijnlijk resistent tegen de spijsvertering en andere barre omstandigheden die mogelijk de stabiliteit van miR-223 in gezuiverd HDL verklaren nuclease. Het mechanisme van de resistentie van miR-223 tot RNases vereist verdere studie. Het is duidelijk dat het bestuderen van miRNA expressie profielen in deze gezuiverd HDL plasma zou licht werpen op de toekomst miRNA markers in het bestuderen van verschillende ziekten. Deze HDL geassocieerde miRNA bij het plasma kan worden gebruikt als potentiële biomarkers klinische diagnostische en gepersonaliseerde geneeskunde in de toekomst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  2. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (12), 5003-5008 (2011).
  3. Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, (4), 423-433 (2011).
  4. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
  5. Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33, (10), 1956-1964 (2013).
  6. Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114, (1), 183-192 (2014).
  7. Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16, (4), 415-421 (2004).
  8. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  9. Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
  10. Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
  11. Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
  12. Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
  13. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
  14. Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717, (1-2), 85-90 (2011).
  15. Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
  16. Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2, (19), (2014).
  17. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
  18. Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. www.qiagen.com (2015).
  19. Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
  20. Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics