Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

Biology

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Summary

I microRNA svolgono un ruolo regolatore importante e stanno emergendo come nuovi bersagli terapeutici per varie malattie umane. E 'stato dimostrato che i miRNA sono effettuate in lipoproteine ​​ad alta densità. Abbiamo sviluppato un metodo semplificato per isolare rapidamente HDL purificata per l'analisi miRNA dal plasma umano.

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Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Raccolta dei campioni di sangue

  1. Raccogliere digiuno periferico campioni di sangue venoso in apposite provette 10 ml di plastica contenenti acido anticoagulante etilendiamminotetraacetico (EDTA) (che ha diversi vantaggi rispetto ad altri anticoagulanti) per venopuntura standard di una vena di primo piano nella fossa antecubitale.
  2. Centrifugare i campioni di sangue a 1.600 xg per 20 min a 4 ° C in una centrifuga da tavolo per ottenere plasma privo di globuli rossi e piccole quantità di RNA.
  3. Sequenziale centrifugare il surnatante a 3,000 g (4 ° C) in un rotore secchio oscillante per 10 minuti per rimuovere WBC e piastrine e quindi ulteriori 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari restante rispettivamente.
  4. Misurare la densità del plasma utilizzando un densitometro a RT come da istruzioni fabbricazione.
    NOTA: la regolazione della densità (d = 1,023 g / ml) con soluzione fisiologica allo 0,9% può essere richiesto dopo la rimozione del esosomi ma prima gradiente di densità ultracentrifugazione.
  5. 2. Rimozione Exosome dal plasma

    1. Rimuovere le exosomes circolanti che hanno una densità simile a HDL e rappresentano una quantitativamente rilevante fonte di miRNA 3.
      1. Fare questo aggiungendo 252 microlitri soluzione exosome precipitazione di 1 ml di plasma seguita da incubazione per 30 minuti a 4 ° C. Per sedimentare le esosomi, centrifugare la miscela per 30 minuti a 1500 ga 4 ° C.
      2. Per isolare HDL, trasferire 1 ml del supernatante risultante a un policarbonato a pareti spesse tubo ultracentrifuga per ulteriore trattamento con gradiente di densità ultracentrifugazione (vedi sotto).

    3. gradiente di densità Ultracentrifugazione (Figura 1).

    1. Per separare HDL utilizzare un processo in 3 fasi che impiega un ultracentrifuga pavimento con un rotore ad angolo fisso che operano a 448.811 x G e 8 ° C, rispettivamente.
    2. Preparare tre diverse soluzioni di densità in sequenza e fresco per ogni isolamento.
      1. Preparare la soluzione A (isolamento di VLDL, d = 1.006 g / ml) sciogliendo 11,4 g di NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na e 1 ml 1N NaOH in 1000 ml di acqua distillata autoclave-. Quindi aggiungere un ulteriore 3 ml di acqua distillata autoclave-.
      2. Preparare la soluzione B (isolamento di LDL, d = 1.182 g / ml), aggiungendo 25,2 g NaBr a 100 ml di soluzione A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
      3. Preparare la soluzione C (isolamento di HDL, d = 1.470 g / ml) mescolando 78,8 g NaBr con 100 ml di soluzione A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confermare la densità appropriata a temperatura ambiente utilizzando un densitometro. Conservare tutte le soluzioni a 4 ° C fino all'utilizzo.

    4. Isolamento di VLDL

    1. Mescolare 1 ml di plasma (densità media = 1.023 g / ml) e nucleasi libere 200 ml di grasso Red 7B in 6,5 ml in policarbonato tubo ultracentrifuga pareti spesse.
    2. Poi strato accuratamente 5 ml di soluzione A in cima alla miscela. Se necessario, aggiungere ulteriori rosso grasso 7B sulla sommità della soluzione A to bilanciare il peso di ciascun tubo. Centrifuga per 2 ore (accelerazione - 5), (decelerazione - 7).
      NOTA: Durante la centrifugazione, le lipoproteine ​​sono accumulati come una banda a loro regioni di densità di equilibrio.
    3. Alla fine della corsa osservare 2 strati. Rimuovere 1,5 ml della frazione VLDL che rappresenta lo strato superiore e conservare a 4 ° C.
    4. Infine, utilizzando una pipetta di trasferimento 4 ml dal fondo della provetta contenente il LDL, HDL, albumina e frazione di acido grasso in un tubo in policarbonato per l'isolamento LDL.

    5. Isolamento di LDL

    1. Mescolare 2 ml di soluzione B e 100 microlitri di nucleasi senza grassi Red 7B nella provetta contenente la frazione LDL e HDL (sezione 4), rispettivamente.
    2. Poi centrifugare per 3 ore (accelerazione 9, decelerazione 7). Successivamente, rimuovere 1,5 ml della frazione LDL che rappresenta lo strato superiore e mantenere a 4 ° C o conservare a -80 ° C. Infine, trasferire 4 ml dal fondo della provetta contenente il HDLfrazione in un nuovo tubo in policarbonato.

    6. L'isolamento di HDL

    1. Mescolare 2 ml di soluzione C, 100 microlitri di nucleasi senza grassi Red 7B e 15 ml di 98% β-mercaptoetanolo nella provetta contenente la frazione HDL, rispettivamente.
    2. Centrifuga per 3 ore (accelerazione 9, la decelerazione 7). rimuovere Successivamente 2 ml della frazione HDL rappresentano lo strato superiore e sia mantenere a 4 ° C o conservare a -80 ° C.

    7. Dissalazione e concentrazione delle lipoproteine ​​Frazioni

    1. Per evitare interferenze con la successiva elettroforesi su gel di agarosio e PCR, rimuovere eccesso di sale aggiunto durante gradiente di densità ultracentrifugazione utilizzando dispositivi di filtro centrifugo con cutoff peso molecolare appropriato (tubo 3K per VLDL e tubo 10K per LDL / HDL), come descritto nelle istruzioni del produttore.
      1. In breve, dopo aver aggiunto 2,5 ml di PBS freddo (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mm Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifuge l'intera frazione VLDL raccolte-in gradiente di densità ultracentrifugazione a 4 ° C per 60 minuti utilizzando un rotore oscillante.
      2. Desalt la frazione LDL due volte con 10 ml di PBS freddo ghiaccio per 30 minuti ciascuno. Successivamente, utilizzare 13 ml di ghiaccio freddo PBS due volte per la demineralizzazione della frazione HDL. Il volume PBS superiore è necessario per migliorare la mobilità con elettroforesi su gel di agarosio. Dopo la centrifugazione, rimuovere le lipoproteine ​​contenenti soluti e mantenere a 4 ° C o conservati a -80 ° C.

    8. Agarosio elettroforesi su gel

    1. Perfrom lipoproteina elettroforesi su gel di agarosio utilizzando il kit con modifiche minime di istruzioni del produttore come segue.
      NOTA: Questo passaggio è solo per valutare la qualità e la purezza dei campioni lipoproteine ​​concentrati.
      1. In breve, è necessario ottenere 6 ml della frazione lipoproteine ​​dissalato con gradiente di densità ultracentrifugazione e caricare su un gel di lipoproteina pre-cast. Utilizzare lipop umananorme rotein per VLDL, LDL e HDL come riferimento le dimensioni. Effettuare elettroforesi a temperatura ambiente a 100 V per 60 minuti utilizzando tampone Rep Prep.
      2. Essiccare il gel per 10 minuti e poi colorare per 10 min a temperatura ambiente con Fat Red 7B. Decolorare il gel in una miscela di metanolo-acqua 75:25 (v / v) e asciugare ancora per 5 min.

    9. RNA estrazione e purificazione

    1. Perfrom isolamento dei miRNA da purificata HDL umano utilizzando il kit di siero / plasma isolamento miRNA e purificazione.
      1. In breve, aggiungere 1 ml di RNA reagente di lisi a 200 ml di HDL purificata, mescolare con un vortex e poi incubate per 5 minuti a temperatura ambiente per garantire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici e l'inattivazione di RNasi.
      2. Poi spike 3,5 ml di sintetico Caenorhabditis elegans microRNA (miR-cel-39; 1,6 x 10 8 copie / mL) nella miscela. Poi effettuare l'estrazione di RNA in base alle istruzioni del produttore.
    2. eseguire purificatisu di estratto-miRNA con colonne di rotazione eluire come da istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione di miRNA da HDL purificato con un spectrophorometer.
      NOTA: eluizione di miRNA dalle colonne di spin impiegato 16 ml di acqua RNase-free.

    10. trascrizione inversa (RT-PCR)

    1. Isolare 100 ng del miRNA da HDL a spillo con miRNA sintetico (cel-miR-39) e reverse-trascritte in un volume di reazione di 20 microlitri utilizzando il kit di trascrizione inversa e secondo le istruzioni del produttore.
    2. Effettuare controlli adeguati senza modello miRNA (NTC) e senza mix trascrittasi inversa enzima (NRT).

    11. Real-time PCR (qRT-PCR)

    1. Perfrom Real-time PCR in un volume totale di 20 ml con 2 ml di una diluizione 1: 2 del cDNA, 10 microlitri PCR mix, 2 ml primer universale, 2 l di primer miRNA e acqua priva di RNasi 4 ml.
    2. Eseguire i riattion in piastre da 96 pozzetti a 95 ° C per 15 minuti, seguiti da 45 cicli di 94 ° C per 15 sec e 55 ° C per 30 s ed una fase di estensione a 70 ° C per 30 s.ec perfrom tutte le reazioni in triplicato .
    3. Avanti, calcuate quantità relative di miRNA utilizzando il metodo 2 -ΔΔ Ct dopo la normalizzazione al gene housekeeping sintetico secondo le istruzioni del produttore.

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Representative Results

Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità dopo la rimozione di Esosomi
Per ottenere miRNA da HDL altamente purificato è necessario rimuovere esosomi che rappresentano una fonte di contaminazione miRNA 7. Ciò è stato fatto prima gradiente di densità ultracentrifugazione con un kit disponibile in commercio. Per scopi pratici standard gradiente di densità protocollo ultracentrifugazione tre fasi sviluppato dalla società commerciale è stato modificato (Figura 1). Questo protocollo richiede centrifugazione con un rotore ad angolo fisso ad una velocità di 140.000 giri al minuto, che è sostanzialmente più veloce protocolli comunemente usati con le forze di centrifugazione fino a 54.000 rpm 3, 8, 9 e 10. Impiegando un rotore T-1270 ampiamente disponibili con forza massima di 70.000 giri al minuto, la centrifugazione è stata inizialmente realizzata con tubi polyallomer che non sono riusciti a resistere alle forze di centrifugazione. Per evitare il collasso dei tubi,tubi in policarbonato sono stati utilizzati con successo. Tempo di centrifugazione è un fattore critico per l'ossidazione delle lipoproteine ​​e potenzialmente miRNA degradazione 11. Quindi più volte di centrifugazione diversi, che vanno da un totale di 8 a 96 ore sono stati testati. Inoltre temperatura alla quale è stata effettuata la centrifugazione è stato regolato in base al tempo di centrifugazione e di forza, rispettivamente.

La purezza del lipoproteine ​​ad alta densità Frazioni
Purezza di lipoproteine ​​ad alta densità isolato è stato controllato con elettroforesi su gel di agarosio. Figura 2. illustra un tipico risultato elettroforesi per la sottrazione HDL isolato mediante ultracentrifugazione gradiente. E 'chiaramente dimostrato che HDL era privo di qualsiasi contaminazione di VLDL ed espone tipica α-mobilità. L'assenza di lipoproteine ​​alfa-migrazione nelle VLDL e LDL frazioni dimostra la completa guarigione dalla HDL durante la ultracentpasso rifugation. La frazione HDL, tuttavia, ha anche mostrato qualche traccia di β-mobilità, un noto disegno a strisce elettroforetico a causa della contaminazione con lipoproteine ​​(Lp (a)) 12.

Eliminazione di Lp (a) da Isolato HDL
Studiare miRNA trasportati nel HDL richiede l'isolamento di HDL di massima purezza. Interferenza di Lp (a), con HDL contribuisce potenzialmente per la contaminazione incrociata delle HDL con miRNA trasportati in LDL. Per minimizzare questa contaminazione di HDL, 15 ml di β-mercaptoetanolo 10 è stato aggiunto alla soluzione C durante l'ultima fase di centrifugazione (Figura 1). L'aggiunta di β-mercaptoetanolo ha dimostrato di non modificare le proprietà di densità HDL 10. Come mostrato in Figura 3., aggiunta di β-mercaptoetanolo portato assenza di lipoproteine ​​B-migrazione coerenti con rimozione molto efficace di Lp (a).

Purificazione di miRNA da HDL
Isolamento di miRNA inizialmente tentato impiegando reagente di lisi che è comunemente utilizzato per l'estrazione di RNA da sangue. Anche se questo metodo ha comportato un ottimo rendimento di RNA (91.45 ng / ml), ma dopo l'analisi spettrofotometrica ha dimostrato insoddisfacente purezza RNA. Ulteriori purificazione del RNA isolato rimuovendo fenolo migliorato la purezza, ma la resa RNA era ora notevolmente bassa. Successivamente, un altro kit è stato testato che ha dimostrato la purezza accettabile RNA (260/280 rapporto nm di 1,7), ma la resa RNA è stato 26 volte inferiore rispetto al reagente di lisi (3.45 vs 91.45 ng / ml). I migliori risultati per accettabile purezza RNA con una buona resa sono stati ottenuti con il siero kit miRNeasy / plasma (48,2 ng / ml; rapporto 260/280 nm di 1,6) e quindi questa procedura di estrazione è stato successivamente impiegato per la rivelazione di miRNA dal isolato frazione lipoproteine ​​HDL.

3 e ha dimostrato di reprimere colesterolo HDL assorbimento 5. La Figura 4A. mostra un tipico grafico log di curve di amplificazione confrontando i valori di soglia e ciclo soglia basali dopo l'ottimizzazione della reazione PCR per il miR-223 e l'spillo-in-Cel mir-39. Questo gene sintetico è stato utilizzato come controllo interno in quanto non vi sono segnalazioni di nota controllo normalizzazione per miRNA nel plasma. Inoltre, diversi potenziali stabiliti geni housekeeping endogeni come RNU6-2, RNU-48, HY3 non potevano essere rilevati e SNORD95 potrebbero essere rilevati nel purificata HDL, ma la differenza di valori Ct di miR-223 e SNORD95 è inferiore a cinque ( dati non mostrati). Melting analisi della curva illustrata in figura 5. mostra chiaramente una netta singolapicco coerente con amplificazione di un miRNA selettiva nella precedente PCR. Come illustrato in Figura 4B., Sia miR-223 e il riferimento Cel-mir-39 potrebbe essere costantemente rilevata in tutte le sei bande pro. Sono stati osservati relativamente piccole variazioni tra tutti gli individui per Cel-mir-39 rispetto al miR-223. Questi risultati sostengono l'isolamento di HDL ad elevata purezza per consentire il rilevamento del suo carico miRNA.

Rilevazione di miR-223 in purificata HDL
Real time PCR quantitativa è stata utilizzata per quantificare doppio tornante a struttura miRNA precursori di miRNA singolo filamento. Questo metodo ha bisogno di un avanti / indietro primer gene-specifici e un inibitore della termostabile per convertire la struttura tornante del miRNA di cDNA. Il cDNA è stato successivamente amplificato e quantificato mediante real-time qPCR con l'aiuto di SYBR rilevamento verde. MicroRNA dal siero, plasma e plasma HDL purificato può essere accuratamente profilEd usando il sistema di miRNA RT PCR.

Il nostro prodotto sperimentale di media miR-223 l'espressione genica ha mostrato un valore Ct di 30,9 in HDL purificato e dei suoi corrispondenti controlli negativi erano al di sopra di 35 cut-off (NTC = 38.1 valore Ct, NRT e NAC non sono stati amplificati). In questo esperimento, abbiamo visto nei campioni di HDL purificati la formazione di Primer-dimero con bassa temperatura di fusione (73 ° C in miR-223 e 75,5 ° C in Cel-miR-39) e il più alto valore t C rispetto ai dosaggi miRNA specifici (Tabella 1). Il primer-dimeri in Tabella 1. verificano probabilmente a causa dell'alta concentrazione di primer nella soluzione. Questo si verifica soprattutto quando le molecole di primer attaccano l'un l'altro dopo 30 cicli di PCR 13. Questo permette loro di temprare ad altre molecole di primer e in effetti, diventano mini-modelli lineari e causerà sfondo superiore e possono portare a una generazione di valore t C <40 per NTC (No templatcontrollo) campioni e.

Figura 1
Figura 1. Rappresentazione schematica della procedura di isolamento HDL. HDL è stato preparato da ultracentrifugazione gradiente di densità in una serie di tre fasi di centrifugazione. Distribuzione di bande di lipoproteine ​​e frazioni intermedie nel gradiente di densità sono illustrati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Agarosio elettroforesi su gel di lipoproteine ​​isolate Senza β-mercaptoetanolo. VLDL, LDL e HDL frazioni isolate dal gradiente di densità ultracentrifugazione senza aggiungere -mercaptoetanolo β alla soluzione C demonstvalutare la presenza di Lp (a) nella frazione HDL. Lanes 1, 2, 9, e 10 ciascuno rappresentano il marcatore dimensioni; Lanes 3/4, 5/6 e 7/8 rappresentano rispettivamente VLDL, LDL e HDL. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Gel di Agarosio di HDL Isolato con β-mercaptoetanolo. Aggiunta -mercaptoetanolo β alla soluzione C prima dell'ultima fase di centrifugazione comportato la rimozione di Lp (a) dalla frazione HDL. Lanes 1, 2, 9 e 10 rappresentano ciascuno il marcatore dimensioni; Corsie 3-8 rappresentano HDL. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 4. Amplificazione Terreno di due miRNA diversi ed espressione di Cel-miR-39 e miR-223. (A) Real-time PCR quantitativa utilizzando HDL isolato è stata effettuata come descritto. La PCR è stata eseguita per 45 cicli e il punto in cui la curva interseca la soglia è il C T -Value. I dati mostrano l'espressione di Cel-miR-39 (pannello di sinistra) e miR-223 (pannello di destra), rispettivamente. La linea orizzontale rappresenta la soglia di rilevamento. Un certo numero di ciclo 35 è stato fissato come soglia per l'amplificazione positivo. (B) Rappresentante real-time PCR dati da HDL isolato ottenuto da 6 campioni sono mostrati. Raw significa valori Ct sono indicati per Cel-miR-39 e miR-223, i cui livelli di espressione variare a meno di 2 valore Ct della frazione HDL plasma purificata tra 6 campioni, ciascuno da un donatore diverso. Profili di espressione è stata effettuata utilizzando il sistema PCR e la Human Serum & Plasma MiròUn qRT-PCR. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Curve di fusione per Cel-miR-39 e miR-223. Come illustrato, la presenza di un unico picco indica l'amplificazione specifica di Cel-miR-39 (pannello di destra) e miR-223 (pannello di sinistra), rispettivamente. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1. C valore t Fila di controllo negativo e positivo di sintesi Cel-miR-39 e miR-223 caratterizzato nel siero, plasma, cDNA, e la frazione HDL purificata. NTC (No template di controllo), NRT (No trascrizione inversa enzima), NAC (nessun controllo di amplificazione, solo acqua e reagenti di qRT-PCR).

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Discussion

L'identificazione di nuovi biomarcatori dal sangue sarà di aiuto nella diagnosi clinica e la prognosi di varie malattie. I microRNA sono noti per possedere tutte le qualità di biomarcatori e hanno dimostrato in vari studi 14-17. In questo studio abbiamo dimostrato metodo facile rapida e semplice per isolare miRNA da HDL plasma. Densità convenzionale gradiente metodo ultra-centrifugazione di isolamento di VLDL, LDL e HDL dipende accurata campionamento di plasma, preparazione precisa della soluzione tampone, la misurazione della densità e trasferimento quantitativa di lipoproteine ​​fondo 8. Ci sono numerosi metodi che sono stati descritti per isolare HDL 8 -11. Questi metodi sono spesso o molto laborioso e richiede grande volume di plasma e ampia la dialisi per la dissalazione isolato lipoproteine ​​e non rimuovere completamente exosomes e lipoproteine ​​come fonte di miRNA 3. Per far fronte a queste carenze abbiamo stabilito questo simple e metodo veloce di isolamento di miRNA da HDL plasma.

L'obiettivo principale e lo scopo primario di questo studio è stato quello di separare e isolare complesso HDL-miRNA da ultracentrifugazione senza globuli rossi, buffy coat, esosomi, vescicole secretorie, VLDL, LDL e lipoproteine ​​(a) interferenza, quindi isolare miRNA da HDL purificata. La contaminazione e l'interferenza di uno qualsiasi di questi componenti con HDL altereranno i risultati sperimentali attesi e dati di profiling di miRNA. Isolamento di DNA, RNA e miRNA dal sangue è un compito molto difficile, a causa della sua natura complessa. E 'sempre stata posta con molte sfide tecniche per gli acidi nucleici (compresi miRNA) estrazione e purificazione rispetto alle cellule, tessuti e campioni di organi 18. Inoltre ci sono relativamente meno geni miRNA presenti in cellule del sangue circolante. Il sangue è un vettore noto per esosomi, vescicole secretorie e HDL insieme con miRNA circolanti liberi, che sono relativamente meno 18. Pertanto, più grande di unmonte di volume del campione di plasma di sangue è necessario per l'elaborazione e l'isolamento del complesso HDL-miRNA. Inoltre, il breve natura del miRNA e loro sequenze bersaglio, rende ancora difficile ottenere sufficiente specificità con tecnologie oligonucleotide PCR standard. I componenti cellulari del sangue sono sempre sanno a secernere miRNA e mRNA in risposta al cambiamento di ambiente esterno tra cui temperatura, microrganismi e tossine o stress. Anche la presenza di nucleasi, RNasi, proteine ​​circolanti e altri enzimi nel sangue influenzerà questi miRNA isolamento.

L'amplificazione miRNA che circola manca anche una consolidata noti geni housekeeping come β-actina o GAPDH per la normalizzazione dei dati, mentre con il metodo ΔΔCt di qRT-PCR. Ciò pone ancora una volta uno dei maggiori ostacoli per miRNA profilatura di circolare siero del sangue o plasma 19. Comunemente utilizzato brevi snoRNAs non codificanti e snRNAs raramente sono espressi nel sangue e questo mAkes ulteriormente difficile in utilizzarli come i geni di controllo interno. Per risolvere questi demeriti di snoRNAs e snRNAs ed evitare eventuali difficoltà tecniche che abbiamo usato sintetico controllo Spike-In Siero / Plasma nei saggi come gene di controllo interno seguita secondo il protocollo del produttore. Aiuta a normalizzazione per qualsiasi amplificazione aspecifici e cambiamenti si sono verificati durante miRNA purificazione e reazione PCR 18. Anche nel caso di degradazione dei miRNA o assenza di specifici segnali di amplificazione miRNA, il picco-controllo dovrebbe amplificare in reazioni di qRT-PCR e dare un segnale previsto con un valore ragionevolmente costante ed uniforme Ct. Sulla base del picco di amplificazione del controllo insieme a tre controlli negativi e controlli positivi abbiamo ottenuto un buon convalida dei dati ottimale per miR-223 gene. Ciò ha confermato che abbiamo avuto una buona resa di miR-223 dalla circolazione HDL plasma da questo semplice metodo.

In conclusione, abbiamo stabilito un metodo of gradiente di densità ultracentrifugazione (DGUC) con l'aggiunta di β-mercaptoetanolo per la purificazione di miRNA da HDL plasma. Il metodo presenta diversi vantaggi: (a) VLDL, LDL e HDL sono separati in un breve periodo di tempo ultracentrifuge piano confrontarle con altri metodi che richiede 24 - 96 ore 8-11; (b) LDL e HDL dialisi, dissalazione / concentrazione, avvenire entro 1 ora confrontare con altri metodi che hanno 24 o più ore 8,9; (C) Contaminazione di lipoproteine ​​viene rimosso dal β-mercaptoetanolo in frazione HDL, ma non è destinato ad essere utilizzato nella frazione LDL; (D) Il volume del campione richiesto è di soli 1 ml per tutti graduale VLDL, LDL e HDL isolamenti confrontare con gli altri metodi che ha bisogno di più volume di campione; (e) E 'minimizzato il danno ossidativo a HDL durante l'isolamento 11; (F) un massimo di 12 campioni possono essere analizzati in una seduta analitica sola separazione delle lipoproteine; (G) Il volume del campione 250 ml di estratto HDL è sufficiente analizzare mconcentrazione iRNA / purezza, agarosio elettroforesi su gel, la concentrazione di proteine, microarray e le procedure di RT-qPCR. I limiti del nostro metodo è quella piccola percentuale di HDL-miRNA potrebbe perdere durante la fase di exosome precipitazioni e il volume del campione di plasma necessario dovrebbe essere più di 200 ml per isolare HDL-miRNA.

Infine, i microRNAs plasma non solo sono derivati ​​da cellule sanguigni danneggiati o rinnegati nella circolazione ma anche da cellule normali e cellule da altre parti del corpo che comprende vari tessuti e organi sani e malati affetti da stato di salute costante del corpo di sangue sani 20. Questo studio ha purificato sistematicamente maturo miR-223 da isolato HDL del plasma umano. Questo studio dimostra chiaramente che i livelli di miR-223 nel plasma HDL altamente purificato sono rilevabili, stabile, riproducibile e coerente tra gli individui del campione, facilitando così notevolmente l'uso clinico di test Futurity per lipoproteine, liver, sindromi metaboliche e cardiovascolari altri. Sorprendentemente, miRNA maturi, in particolare miR-223 da HDL plasma sono probabilmente resistenti alla nucleasi digestione e altre condizioni difficili che potenzialmente spiegare la stabilità del miR-223 in HDL purificata. Il meccanismo di resistenza di miR-223 per RNasi richiede ulteriori studi. Ovviamente, studiando i profili di espressione dei miRNA in questi plasma HDL purificato potrebbe far luce sulle future marcatori miRNA a studiare varie malattie. Questi HDL associato microRNA nel plasma può essere utilizzato come un potenziale biomarker diagnostici clinici e Medicina Personalizzata in futuro.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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