고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

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Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K., Myers, K. A. High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (114), e54265, doi:10.3791/54265 (2016).

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Abstract

Introduction

혈관 신생은 편광 방향 특이 마이그레이션 및 혈액 공급을 필요로 조직에 새로운 혈관을 형성하는 내피 세포되는 EC () 촉진 세포 외 신호 단서에 의해 트리거됩니다. 혈관 생성을 유도하는 것으로 생각 요인은 세포 외 기질 (ECM)로부터의 신호이다. 물리적 단서에 대한 응답으로되는 EC는 혈관 네트워크 1, 2의 형성 방향 이동을 안내하는 방향 특이성과 새로운 지점을 확장합니다. EC의 형태와 분기의 아키텍처는 공작 - 마이 오신 수축력 (3)의 규정을 조정하는 방식으로 미세 소관 (MT) 세포 골격의 현지화 규정에 의해 정의된다. 형성하기 위해 EC 분기 위해서는, 마이 오신-II는 로컬 현지화 막 돌기 (4)의 결과로 하향 조절해야합니다. 동시에 셀 내의 동일한 위치에, MT 성장 역학 분기 엘론 홍보 느리고 지속적인 MT 성장 결과 수정 될gation과 안정성 오. 이 조정 골격 규제되는 EC는 방향 마이그레이션을 용이하게하기 위해 자신의 형태를 극화 할 수 있습니다.

편광 세포 형태의 개발은 편광 MT 어셈블리 (6)가 필요합니다. 상피 세포 마이그레이션에서, 이동 단말은 셀 7-9의 최첨단 천천히 그리고 지속적으로 특히 성장; 신경 세포에있는 동안, 축삭 또는 수상 돌기의 시작과 신장은 이동 단말뿐만 아니라 존재해야하지만 그들은 동적으로 조립 및 분해 10 ~ 15의 과정을 겪고있다. 이와 같이, MT 성장 역학 국부 제어는 셀의 구조를 결정하고, EC를 ECM들이 탐색으로 세포 형태의 신속한 개장을 허용한다.

MT 성장 동역학 분자 모터 단백질 및 비 모터 단백질 패밀리에 의해 조절되고, 미세 소관 연관 단백질 또는 미세 소관 상호 작용 단백질 (이하, REFE 지칭) MAP에로 rred. 지도는 로컬 일반적으로 세포 ECM 인터페이스 (16, 17)에서 시작 폭포 신호를 활성화 또는 비활성화 할 수 있습니다. 이동 단말에 결합 및 MT 조립 및 분해의 반응 속도를 변경하여 일단 활성,지도 기능; 따라서 로컬 셀 모양과 극성 18-20을 촉진하기 위해 MT 역학을 조절하는 기능. 유사 분열 센트로 관련 키네신 (MCAK)는 MT 끝나고 커플 MT 분해 21-23로 ATP 가수 분해에 결합하는 키네신-13 가족 MAP입니다. MCAK의 기능적 역할이 방추사 24-28 내의 중요한뿐만 아니라 계면 29,30 동안 알려져있다. 계면되는 EC 내에서 MCAK 매개 MT의 분해는 상처 가장자리하는 RAC1 작은는 GTPase의 유도 활성화를 응답 MCAK 지역화 오로라-A에 의한 인산화에 의해 조절된다. 이 신호 전달 캐스케이드의 결과 르 향하여 편광 MT 성장 초래되는 EC의 선단에 MCAK의 억제이다되는 EC (31)를 마이그레이션의 후행 가장자리에 가장자리와 MCAK 유도 MT 분해를 ading.

MT 성장 역학을 측정하는 전통적인 방법은 일반적으로 형광 표지 튜 불린이나, 최근에는 형광 표지 MT 최종 바인딩 단백질 1 또는 3 (각각 EB1 또는 EB3) 중 하나의 손 추적을 사용했다. 형광 튜 불린 방식은 전체 MT 어레이 라벨의 이점을 갖는다. 유사 분열 세포 유형의 대부분은 계면 8,32,33 동안 이동 단말의 방사 방향 어레이를 유지하기 때문에, 중심체 주변의 MTS는 매우 조밀하고, 그 결과, 형광 튜 불린으로 MT 성장 분해 추적 보통 주변에 한정 셀 영역. 이러한 제한으로 인해, 형광 표지 EB 단백질 (EB1 또는 EB3)의 활용 MT 역학을 측정하는 일반적인 방법이었다. 사채는 이동 단말의 증가 플러스 엔드 레이블 있기 때문에 밝은 형광 올 (1-3 μm의) 작은 표시TS, 따라서 매우 제한된 배경 형광 34-37로 MT 중합 쉽게 식별 할 마커를 제공한다. 이동 단말 어레이의 일부만 사채 라벨은 EB 접근법의 중요한 강도를 나타낸다는 사실은, 또한 하나의 중요한 한계가 강조되지만, 그 이외의 성장 이동 단말은 EB3 방식으로 분류되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 측정하고 시간이 지남에 EB3 혜성을 추적하고 하위 세포 영역 내에서 MT 성장을 시각화 할 수있는 능력은 MT 조직의 지역 평가를 필요로하는 응용 프로그램이 접근 방식에 이상적이다.

측정 MT 성장 역학에 대한 전통적인 방법의 다른 주요 한계는 매우 큰 데이터 세트 및 데이터 분석에 필요한 시간이었다. 이 제한은 높은 시간 해상도에서 EB 혜성 수백의 손 추적을위한 필요성에서 유래한다. 또한, 이들 측정은 세포의 유의 한 숫자를 이루어도 제어 experime 다양한 하에서 수행 될 필요ntal 조건. 최근, 이러한 제약은 살아있는 세포 35 시간 경과 현미경을 사용하여 구체적으로 추적 EB3 혜성에 관한 전산 분석 기법을 통해 극복하고있다. 적절하게 사용되는 경우, 이러한 계산 방법은 모두 중합 MT를 측정하는 높은 처리량 방법에 대해 제공 할뿐만 아니라 손 추적과 관련된 실수의 가능성을 제한하는 역할을한다. matlab에 기반 소프트웨어 패키지를 사용하여 MT 역학의 전산 분석, plusTipTracker는 형광 표지 EB3 혜성 5,31,35,38을 추적하여 MT 성장을 측정 할 수 있습니다. 또한, plusTipTracker 소프트웨어는 성장 MT 트랙 내에서 EB3 혜성의 실종에 따라 MT 재앙 이벤트 (일명 분해)의 계산을 가능하게하고, 관심의 사용자 정의 영역 내에서 MT 성장 역학의 서브 세포 (일명 지역) 분석이 가능 . 우리의 연구의 경우, MT 성장 역학 내에서 비​​교 하​​였다비 분지 영역 대 또는 셀 에지 후행 대 선도 내의 지형 영역. plusTipTracker 소프트웨어로부터의 데이터 출력은 각각의 셀과 하위 셀 영역에 대한 컬러 코드 트랙 오버레이를 생성하는데 사용될 수있다.

여기에서 우리는 MT 성장 역학과 형태 및 방향 이동을 분기 EC의 규정이 MT의 depolymerase의 기여를 변조에 MCAK의 역할을 조사하기 위해 사용하는 방법을 설명합니다. 우리의 접근이 용이하게 배양하고 플라스미드 cDNA를 전기 유도 일시적인 형질 감염에 매우 의무이다 차 인간 세포주, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를)를 사용 하였다. 우리는 그 다음 높은 해상도를 사용, 단백질 3 (EB3)와 유사 분열 센트로 관련 키네신 (MCAK) - 특정 cDNA를 바인딩 MT 끝으로 형질 전환 된 HUVEC의 시간 경과 형광 현미경은 MT 역학에 효과가 HUVECs를 형질 평가하는 구성한다. EB3의 PlusTipTracker 기반 연산 화상 해석라벨이 지정된 MT 플러스 끝 측정하고 MT 성장 역학에 대한 실험 조작의 효과를 비교하기 위해, 시간 경과 이미지에서 MT 성장 속도와 MT 성장 수명을 측정 하였다. 이 방법론은 MT 역학의 연구 및 서브 셀룰러 지역 내에서 MT 역학의 지역화 된 규정은 EC가 분기 및 마이그레이션의 혈관 신생 과정에 기여하는 방법의 식별이 가능합니다. 이러한 기술은 형광으로 표지 생균 및 발현 될 수있는 임의의 MAP의 연구에 적용 할 수있다.

Protocol

1. HUVEC 문화 및 유지 관리

  1. (자세한 내용은 자재 / 장비 목록 참조) 붉은 무료 내피 기초 매체를 페놀 내피 세포 성장 매체 보충 패키지와 5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제 혼합물의 전체 내용을 추가하여 완전한 내피 기초 매체를 준비합니다. 수욕에서 37 ° C로 예열 완료 내피 기초 매체.
  2. 액체 질소 저장에서 한 HUVEC의 cryovial을 제거하고 2 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에 급속 해동. ~ 80-90% 해동되면 상기 cryovial 가온 완전한 내피 기본 배지 500 μl를 추가 페팅에 의해 혼합하고, 가온 완전한 내피 기저 배지 15 ml를 함유하는 100mm 플라스틱 조직 배양 접시에 균일하게 세포를 분배.
  3. 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에 배치 세포. 세포가 하룻밤을 준수 할 수 있습니다. 제거 또는 세포 배양 배지를 변경하지 않는다.
  4. 100 밀리 접시> 90 % 합류하면, HUVEC를 I 전송할와 75cm 조직 문화 처리 플라스크 NTO 항상 60>에서 %의 합류를 유지 (단계 1.5 참조).
    주 : 밀도> 60 %로 유지하면 HUVEC 배가 시간이 지속적으로 18 ~ 20 시간이다.
    1. (밀도가 <90 %, 즉) 세포를 계대하는 것은 필요하지 않다 상황, 매체를 대기음 신선한 전체 내피 기초 매체마다 48 시간으로 대체합니다.
  5. HUVEC를가> 90 % 합류점에 도달하면, 1X PBS 10 mL로 2 회 헹군 후, 37 ℃에서 1-2 분 동안이를 1.5 ml의 0.25 % 트립신으로 처리하여 조직 배양 접시에서 세포들을 제거한다. 참고 된 HUVEC의 생존율은 크게 트립신 노광의 길이를 연장함으로써 감소된다.
  6. (4)의 비율로 트립신 / HUVEC 액에 8.5 ml의 완전한 내피 기초 배지를 첨가하여 세포 구조 1 내피 기저 미디어 완성 : 트립신 (최소의 비), 및 15 ml의 원추형 튜브에 수집한다.
  7. 4 분 동안 1,400 XG에 원심 분리기. 대기음상층 액.
  8. 완전한 내피 기저 배지 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁하고 완전한 내피 기저 배지 25 ㎖를 함유하는 새로운 225cm 2 조직 배양 플라스크에 세포를 추가한다.

HUVEC 문화 2. 커버 슬립 준비 이전

  1. 피브로넥틴 기판에 코팅 coverslips를.
    1. 100 % 에탄올을 실온 (RT)에서 삐걱 깨끗한 22mm 호 1.5 된 커버 (39) 및 저장소를 준비한다.
    2. 커버 슬립 불꽃과 핀셋을 사용하여 35mm 페트리 접시에 배치하는 분젠 버너를 사용합니다.
    3. PBS 990 μL와 피브로넥틴 재고 10 μL (1 ㎎ / ㎖)을 혼합하여, 피브로넥틴 / PBS 혼합물을 준비한다.
    4. 피펫 35 밀리미터 접시에 coverslip에 상 피브로넥틴 / PBS 혼합물의 250 μL. 커버 슬립의 표면을 덮도록 고르게 확산.
    5. 37 ° C에서 3 시간 이상 동안 접시를 부화 사용 전에 PBS 1X 2 ㎖로 3 회 헹군다.
  2. 커버 슬립 활성화
    1. 저어 접시에 10 분 동안 50 % 3 aminopropyltrimethyloxysilane에서 22mm 제 1.5 coverslip에 배치합니다. 배양 후, 각 2 분 동안 10 번 씻어 두 번 증류수 H 2 O (DDH 2 O).
    2. 저어 접시에 30 분 동안 0.5 % 글루 타르 알데히드의 커버 슬립을 품어. 배양 후, DDH 2 O.에서 2 분 동안 10 회 반복한다
  3. 폴리 아크릴 아미드의 제조
    1. , 3.75 ml의 40 % 아크릴 아미드를 추가하여 0.7 킬로 파스칼 (kPa의)의 준수와 PA 젤을 준비 0.3 ml의 2 % 비스 - 아크릴 아미드, 및 DDH 2 O.의 0.95 ml의
    2. 과 황산 암모늄 (APS)의 10 % 작업 솔루션을 준비하고 사용할 때까지 얼음에 저장합니다.
    3. DDH 2 O 0.83 μL, 비스 - 아크릴 아미드 용액 41.7 μL를 추가 한 커버 슬립 (전체 부피 = 166.7 μL)에 PA 용액을 제조하기 위해, 10 % APS 124 μl를 (단계 2.2.2.1 제) 및TEMED의 0.25 μL.
    4. 즉시 소수성 유리 슬라이드에 PA 솔루션의 15 μl를 피펫 (시약 목록 참조) 활성화 22mm 번호 1.5 coverslip에 함께 다룹니다. 펜실바니아는 실온에서 20 분 동안 중합하도록 허용합니다.
    5. 커버 슬립을 제거하고 35mm 접시에 전송할 수 있습니다. 1X PBS 2 ㎖로 3 회 반복한다. 4 ° C에서 <2 주간 보관하십시오.
    6. 폴리 아크릴 아미드 겔에 피브로넥틴을 바인드하려면, 자외선 7,500 J (해서 자외선)과 2 mM의 술포 SANPAH에 폴리 아크릴 아미드 코팅 된 커버를 노출합니다. DDH 2 O.로 한번 씻어
    7. PBS 990 μL와 피브로넥틴 재고 10 μL (1 ㎎ / ㎖)을 혼합하여, 피브로넥틴 / PBS 혼합물을 준비한다.
    8. 피펫 35 밀리미터 배양 접시에서 coverslip에 (들) 상에 피브로넥틴 / PBS 혼합물의 250 μL. 커버 슬립의 표면을 덮도록 고르게 확산.
    9. 37 ° C에서 3 시간 이상 동안 접시를 부화 사용 전에 PBS 1X 2 ㎖로 3 회 헹군다.
클래스 = "jove_title"> 3. 커버 슬립에 cDNA를 형질과 HUVEC 문화

  1. 완료 단계 1.5-1.6.
  2. 혈구를 이용하여 세포 수를 카운트하고 100,000 세포 / (비 이전 실험) 나 커버 슬립 (이전 실험) 500,000 세포 / 커버 슬립을 함유하는 부피를 모은다. 4 분 동안 1,400 XG에서 원심 분리를 통해 세포 펠렛.
    참고 : 마이그레이션 프로토콜은 아래 섹션 9에 설명되어 있습니다.
  3. 재현 탁 된 세포를 100 ㎕의 버퍼 전기 형질한다. 1 μg의 cDNA로 결합하고 전기 큐벳에 배치합니다. Electroporate 세포 : HUVEC 전기 천공을 위해 지정된 프로그램 (: A-034 프로그램 #)를 이용하여 DNA 혼합물.
  4. 구조 (위, 프로토콜 2.1 참조) 피브로넥틴 코팅 된 22mm 제 1.5 커버 슬립에 500 ㎕의 완전한 내피 기초 매체와 플레이트 세포와 세포를 형질 전환. cDNA의 구조의 표현을위한 시간을 허용하기 위해 3-4 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
이미징을위한 시료의 제작 "> 4. 준비

  1. 2.5 cm X 0.65 cm 스트립에 양면 테이프를 잘라.
  2. 깨끗한 유리 슬라이드를 얻습니다. 양면 테이프의 두 스트립을 가지고 슬라이드의 상단과 하단 가장자리를 따라 수평으로 고정합니다. 주의 : 단계 4.5)에 기재된 바와 같이, 챔버 밀봉 용 테이프와 슬라이드 가장자리 사이의 작은 공간을 허용하는 것이 중요하다.
  3. (단계 3.4에서, 세포 쪽 아래) 마운트 coverslip에 테이프의 커버 슬립 받침대 등이 2 가장자리. 커버 슬립을 확보하기 위해 부드럽게 아래로 눌러 집게를 사용합니다.
  4. 영상 매체의 40 μl를 추가, 마이크로 피펫을 사용하여 커버 슬립 및 슬라이드 사이 (완전 내피 기초 매체는 25 μm의 HEPES와 보충). 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 공간이 완전히 영상 매체로 가득되어 있는지 확인합니다. 대기음 초과 촬상 매체 (필요한 경우).
  5. (: 1 : 1 바셀린 : 라놀린 : 파라핀 1) 따뜻한 VALAP 모든 가장자리를 밀봉합니다. gentl을 밀어 누출 확인유리 커버 슬립에 y를.
  6. 설치 및 사전 예열 (37 ° C) 현미경 무대에 coverslip에 봉인 장소.

5. 현미경

  1. 60X, 1.40 개구 수 (NA) 미분 간섭 대비 (DIC) 오일 액침 대물 렌즈는, 자동 초점 제어 시스템 (PFS), 투과 조명 전자 셔터를 구비 한 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여, X 및-Y는 자동차를 탔다 단, 전자 필터 휠에 수납 대역 통과 필터, 및 모 놀리 식 레이저 결합기 모듈, 셀 / 커버 슬립의 계면 현미경 초점 단일 셀을 찾기 위해 현미경 스테이지 조이스틱을 사용한다.
  2. 이미지 소프트웨어 프로그램의 "카메라 설정"패널을 클릭합니다. 카메라 설정 패널의 "노출 시간"드롭 다운 창 내에서 400 밀리 초를 선택합니다.
    참고 : 노출 시간이 다를 수 있으며, 경험적으로 결정되어야한다.
  3. 에서 "ND 취득"패널을 클릭이미지 소프트웨어 프로그램입니다. ND 취득 패널의 람다 (λ) 탭 내에서, 488 및 561 nm의 레이저를 선택 확인란을 클릭합니다. ND 취득 패널의 "시간"탭에서, 2 초와 2 분의 총 시간에 획득 시간을 설정합니다.
  4. 모두 488-와 561 nm의 조명에 대한 400 밀리 초 노출 시간을 사용하여 2 초 취득 간격으로 2 분 시간 경과 이미지 시퀀스를 획득하기 위해 ND 취득 패널에서 "지금 실행"버튼을 클릭합니다.
  5. 은 "광학 구성"이미지 소프트웨어 프로그램의 패널 및 단계 5.2에 설명 된 카메라 설정을 사용하여, 파란색 형광 단백질의 하나의 이미지를 캡처하는 "취득"를 클릭 한 후 405 nm의 레이저 버튼을 클릭 (BFP) 라벨이 지정된 단백질 .
    참고 : 세포 노출 시간이 지남에 따라 세포를 손상시킬 수 있습니다이 파장 405 nm의 레이저 조명에 (이미지 캡처 및 / 또는 노출 시간의 주파수)를 제한하는 것이 일반적으로 좋습니다.
    1. MCAK-shRNA를 연구를 들면,BFP 표지 shRNA를 발현을 확인하기 위해 하나의 405 nm의 이미지 cquire.
  6. 이미지 소프트웨어 프로그램의 "광학 구성"패널 및 형태 분석을 분기에 대한 세포의 단일 DIC 이미지를 캡처하는 "취득"를 클릭 한 후 DIC 버튼을 클릭하고, 단계 5.2에 설명 된 카메라 설정을 사용하여 (10 항을 참조 아래).
  7. 화상 취득에 따라, 디지털 영상 신호를 증가시키기 위해 이미지 소프트웨어 프로그램 "밝기 / 콘트라스트"기능을 사용한다.
  8. 밝기 및 대비 조정 이미지를 내 보냅니다. 클릭 "파일"다음 "다른 이름으로 저장,"다음 이미지 파일 유형에 대해 "이 .tif"를 선택합니다.
    참고 : 단계 5.4에 설명 된대로 캡처 할 때 일반적으로 하나의 2 분의 시간 경과 인수 한 (61)이 .tif 이미지 파일을 생성합니다.

6. MT 역학 분석

  1. EB3 추적의 경우, plusTipTracker 소프트웨어 (35)를 사용하여, 오픈 소스,자동 감지, 추적, 분석 및 형광 표지 된 사채의 시각화를 위해 디자인 된 매트랩 기반의 전산 소프트웨어 패키지.
  2. plusTipGetTracks 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)
    1. plusTipGetTracks GUI를 입력 plusTipGetTracks에 액세스 할 수 있습니다.
    2. EB3 혜성 감지, 찾아보고 된 .tif 이미지가 포함 된 상위 디렉토리를 선택 GUI를 사용합니다.
    3. plusTipGetTracks GUI의 추적 매개 변수 패널 내에서 다음 값을 입력 : 검색 범위 반경 = 5-10을; 최소 하위 트랙 길이 = 3; 최대 간격 길이 (프레임) (12) =; 최대 수축 계수 = 1.0; 최대 각도 앞으로 25 =; 최대 각도 뒤로 = 10; 변동 반경 (픽셀) = 2; 프레임 속도 (초) = 2; 픽셀 크기 (μm의) = 110.
      참고 : 먼저 된 .tif 이미지 파일의 대표 세트에 plusTipParamSweepGUI를 사용하여 최적의 추적 매개 변수를 확인합니다. 픽셀 크기에 입력 한 값은 시간 경과 이미지를 획득하는 데 사용되는 대물 렌즈에 특정한S (위의 단계를 5.1-5.2 참조).
    4. 이자 (ROI) 선택의 영역에 대해 수동으로 다각형을 형성하는 셀의 DIC 이미지를 사용하여 셀 경계를 추적하여 전체 셀의 바이너리 마스크를 생성한다.
    5. 관심 (하위 ROI) 선택의 하위 지역의 경우, 선행 및 수동으로 수정 plusTipTracker 서브 ROI 선택 도구를 사용하여 관심있는 상처 가장자리 세포에 걸쳐 2 점 굵은 선을 그려 가장자리 마스크를 후행 만듭니다.
      주 : 라인 관심 셀 상처 가장자리 셀 (31) 주변을 넘어 연장되는 위치에 감긴 가장자리에 평행하게 그려 질 것이다.
  3. plusTipSeeTracks의 GUI
    1. 확인하고 시각적으로 클릭하여 "투자 수익 (ROI)"폴더에 저장 된 .tif 이미지의 트랙 오버레이를 검사 트랙 오버레이 열에서 버튼을 "플롯은 트랙". 모든 트랙 오버레이에 대해 반복합니다.
    2. 선택 사양의 설정 열에서 "만들기 그룹"버튼을 클릭하여 데이터 그룹화를 수행합니다. experim를 선택데이터 파일을 클릭하여 동일한 데이터 집합에 속하는 ental 데이터. "그룹"쉽게 (예를 들어, "대조군")를 식별 할 수있는 이름을 지정하여 선택을 저장합니다.
    3. 이미지가 하나 EB3 혜성의 궤도가 선행 및 후행 에지 ROI 내에서 MT 성장 소풍는 "트랙"으로 자격을 추출하기 위해 서브 ROI 내에서 검출되어야한다고 프레임의 하위 ROI MT 성장 역학 측정을 위해 최소 수를 입력 GUI의 "하위 로아"패널에서 "수동 선택"을 클릭하여.
      참고 : 예를 들어,로 추출 할 최소 검출 길이가 3 프레임 (6 초)를 사용하여 '트랙. " 서브 로아에서 추출 된 트랙이 각 셀에 대한 원래의 ROI 폴더 내에 하위 프로젝트 폴더에 저장됩니다.
    4. MT 성장 서브 트랙과 하위 집단 분석
      1. 인트를 참조하십시오 (평균 MT 성장 속도를 계산하고 각 투자 수익 (ROI)에 대한 "그룹"데이터 세트 (단계 6.3.2 참조)에 대한 MT 성장 수명을 의미각 서브 ROI에 대한 페이지 6.2.4) () 단계 6.2.5을 참조하십시오.
    5. plusTipSeeTracks GUI의 상한 분산 형 플롯 열 내에서 "그룹 선택"을 클릭하고 비교하기 (단계 6.3.2에서 만든) 그룹을 클릭합니다.
      1. x 축 옵션에 대해 "성장 속도"를 선택하고 상자에 (단계 6.3.4에서) 성장 속도에 대한 평균 값을 입력합니다. y 축 옵션에 대해 "성장 수명"을 선택하고 상자에 (단계 6.3.4에서) 성장 수명에 대한 평균 값을 입력합니다.
    6. '시작 / 끝에서 트랙을 제거 "옆과 옆의 체크 박스"그룹에 일괄 프로세스를. " MT 성장 전체 셀에 대한 트랙, 최고의 가장자리에 대한 배포 프로파일을 생성하기 위해 "플롯 만들기 '를 클릭 한 뒤 가장자리 서브 로아.
      참고 : 여기에 설명 된 연구의 경우, MT 성장 트랙은 네 개의 소집단으로 배포됩니다 느리고 수명이 짧은 느리고 수명이 긴 빠르고 수명이 짧은, 그리고 빠르고 수명이 긴.
    7. 를 클릭 "데이터"다음 데이터 드롭 다운 창에서 "데이터 분석"을 클릭합니다. "t-시험 : 동일 분산 가정 두 개의 샘플"을 선택 MT 성장 속도와 MT 성장 수명을 의미 비교. t-test를 비교은 p 값 <0.001 결과 스프레드 시트에서 데이터 셀을 강조 표시합니다.

7. colocalization을 분석

  1. 배경 공제 촬상 소프트웨어 프로그램의 "행"도구를 사용에서 녹색 채널 영상 (488 nm의 여기)에 10 ㎛의 2 인 정사각형 작성 화면을 클릭하여 ROI (region of interest)를 그리는 더 셀 형광 (배경)이없는 위치. 단계 5.8에서 이미지를 사용하여 빨강 채널 이미지 (561 nm의 여기)에 대해이 작업을 반복합니다.
  2. 이미징 소프트웨어 (PR)을 사용하여ogram, 바로 단계 7.1에서 투자 수익 (ROI)을 클릭하고 "배경 투자 수익 (ROI)로 설정합니다."를 클릭 "이미지"를 선택한 다음 전체에서 (단계 7.1에서) 평균 배경 값을 뺄 드롭 다운 창에서 "빼기 배경"을 클릭 영상. 엠 - 오로라 A와 하나 mCherry-MCAK, 매플-EB3, 또는 매플 - 튜 불린 공동 발현하는 세포에 대한 배경 빼기를 수행합니다.
  3. 배경 차감 빨강 채널 이미지 만, 이진 리본을 클릭하고 "임계 값을 정의"를 선택하고 지정된 형광 마커를 제외 할 "채널 당"기능을 선택합니다.
    참고 : 임계 단계는 구체적으로 공동 현지화 분석 (단계 7.4 참조)에 대한 역치 개체를 표시 선을 그릴 수 있도록 mCherry-MCAK, 매플-EB3, 또는 매플 - 튜 불린 이미지 중 하나를 수행 하였다.
  4. 이미징 소프트웨어에서 줄 도구를 사용하여 역치 이미지에서 제외 된 객체를 통해 2 포인트 굵은 선을 그립니다.
  5. 단계 7.4에 그려진 선 개체를 선택합니다. 복사 및 대응 녹색 채널 (엠 - 오로라 A) 이미지에 빨강 채널에서 선 개체를 붙여 넣습니다.
  6. 라인 이미징 소프트웨어 프로그램 내의 드롭 다운 창에서 "측정"하고 "강도 프로파일"을 선택하여 각각의 셀에 대한 공동 지역화 총 EM-오로라-A 값을 계산하는 개체에서 그레이 스케일 픽셀 강도 값을 측정한다.
    1. ( "control_grayscale_intensity.xls을"예를 들어) 스프레드 시트 소프트웨어 프로그램에 수출하고 형 .XLS으로 파일을 저장하여 실험적인 치료 및 서브 셀룰러 지역별 데이터를 구성합니다.
      주 :이 방법에서 제시된 데이터는 서브 셀 영역 당 총 측정 EM-오로라-A의 공동 파악 분획을 나타낸다.
  7. 단계 7.6 단계를 반복 6.3.7에서 측정 된 값을 사용하면 의미의 차단으로 P <0.05를 사용하여 통계적 유의성을 계산합니다.
  1. 파라 포름 알데히드 / 글루 타르 알데히드 공동 추출 / 고정 버퍼 (PGF-PHEM와 세포를 (단계 3.4 참조) 수정 4 % 파라 포름 알데히드, 0.15 %의 글루 타르 알데히드, 0.2 %의 세제를 60 mM의 파이프, 27.3 mM의 HEPES, 10 mM의 EGTA, 8.2 mM의 황산에 4, RT에서 10 분 동안의 pH 7.0).
  2. 1X PBS 2 ml를 5 분 동안 3 회 헹군다.
  3. 반응 알데히드을 해소하기 위해 0.01 g / ㎖의 NaBH 4 1X PBS로 15 분간 2 회 치료.
    주 : 커버 슬립이 떠 발생할 수 있습니다을 NaBH 4 형태의 거품을. 커버 슬립이 배양 동안 침수 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 커버 슬립이 떠하기 시작하면 거품이 탈출 할 수 있도록하기 위해 커버 슬립 중 하나 가장자리를 상승 집게를 사용합니다.
  4. 실온에서 1 시간 동안 흔들 플랫폼에 1X PBS에서 5 % 무 지방 우유를 차단하기 전에 1X PBS로 두 번 씻어.
  5. (쥐 안티 α-tubulin의 : 일차 항체의 세포 (1,000) 토끼 항 pT288 - 오로라 A (1)을 품어1 : 1X PBS 용액으로 제조 500). 락 플랫폼 하룻밤에 4 ° C에서 품어.
  6. 2 시간 동안 5 % 무 지방 우유에서 제조 된 이차 항체와 배양하기 전에 1X PBS에서 5 분 동안 3 회 차 항체를 제거하고 린스 (1,000) 당나귀 항 - 토끼 (1 : 1,000)와 염소 항 - 쥐 (1) 37 ° C에서.
  7. 형광 최적화 장착 매체에서 유리 슬라이드에 마운트 coverslip에. 4 ° C에서 어둠 속에서 투명 매니큐어를 사용하여 슬라이드 및 저장소에 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다.

9. 셀 마이그레이션 분석

  1. 상술 한 바와 같이 마이그레이션 분석에 대한 HUVEC 문화를 수행합니다 (프로토콜 3 : 커버 슬립에 cDNA를 형질과 HUVEC 문화, 3.2-3.3 단계).
  2. 세포 형질 전환, 80 ㎕의 완전한 내피 기초 매체와 구조 형질 감염된 세포에 따라. 건조 피브로넥틴 코팅 된 22 mm 라운드 제 1.5 커버 슬립의 중심 상에 한 방울로 80 μl의 샘플을 피펫. 80 μL의 DRO를 확산하지 마십시오피. 합류 단층에 세포 부착을위한 시간을 허용하기 위해 3 ~ 4 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    주 : 커버 슬립을 건조하여 커버 슬립의 접촉시 확산에서 80 μL의 저하를 방지 할 필요가있다. 이러한 접근 방식은 상기 된 HUVEC 커버 슬립의 작은 지역에 집중되는 허용함으로써 세포의 융합 단층의 신속한 형성을 촉진한다.
  3. 미 부착 된 세포를 제거하는 완전한 내피 기초 배지에서 2 번 씻어.
  4. "상처 가장자리의"를 만들려면 부드럽게 (단계 9.2에서)이 HUVEC 단일 층에 걸쳐 깨끗한 면도날을 드래그하여 멸균 면도날로 커버 슬립을 긁어. 긁어 중 면도날의 미끄러짐을 방지하기 위해 집게와 장소에 부드럽게 커버 슬립을 잡으십시오.
  5. 세포가 3 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에 복구 할 수 있습니다. 조립 및 이미징을위한 coverslip에 (들)을 마운트 (프로토콜 4 참조).
  6. 사용 a 현미경에서 12 시간 동안 10 분 간격으로 위상차와 488 nm의 이미지를 수집0.45 배 NA 대물 단계 및 화상 획득 소프트웨어 프로그램의 "ND 취득"패널을 사용하여 0.52 NA LWD 응축기 (단계 5.3에 기재되어 있음).

HUVEC 분기 및 마이그레이션 10. 정량

  1. 분석 분기 심지어 세포 조명 공평 부량, 형질 HUVEC의 미세한 화상을 취득 할 수 있도록 (3.3 단계 참조), 매플 C1-cDNA를, 셀 용적 마커를 구성 표현.
  2. 이미징 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 매플-C1 화상을 열고 막 곡률 큰 각도를 표시하는 지점의 양측에 위치 라벨. 직선으로 두 점을 연결합니다. 이 줄은 "분기 원"입니다.
  3. 이미징 소프트웨어의 줄 도구를 사용하여 시각적으로 단계 10.2에서 결정된 "분기 원"에서 길이> 10 μm의 측정 지점을 식별합니다. 제으로부터의 거리를 측정함으로써 상기 분기 길이를 계산E 지점 선단부의 가장 먼 지점에 "분기 원"(도 4 참조).
  4. 얻기 길이> 10 μm의 측정 분기 돌기의 수를 계산 "셀 지점 수를."
  5. 실험이 관련된 경우 마이그레이션 분석을 위해, 단계 9.6에서 수집 된 이미지를 사용하여 시각적으로 실제 위치에 기초하여 (상처의 가장자리 물리적 세포), 식 프로필 상처 가장자리 HUVEC 식별 (즉, 녹색, 상처 가장자리 셀 선택 GFP의 발현).
  6. 시각적 핵 (셀의 중앙 근처에 반투과성 구형 구조)를 식별, 셀의 위상차 이미지를 사용하고 시각에 핵소체 (핵 내의 작은 어두운 색 구형 구조)를 식별 타임 랩스 영상의 처음 지점. 핵소체의 x 및 y 좌표에 라벨을 붙이기 위해 핵소체의 위치를​​ 클릭합니다.
  7. 이미지 소프트웨어를 이용하여, 손으로 추적시간 경과 동영상 (그림 4)의 각 프레임에 핵소체의 x 및 y 좌표에 라벨을 할 수있는 핵소체의 위치에 클릭하여 연속적인 시간 경과 이미지에서 핵소체.
  8. 이미징 소프트웨어를 사용하여, "파일"을 클릭 한 다음 .XLS "다음 이미지 파일 형식을 선택합니다"다른 이름으로 저장을 클릭합니다. "
  9. 스프레드 시트 소프트웨어 프로그램을 사용한다 (단계 10.8)에서 손 추적 데이터 파일을 연다. 평균 이동 속도를 계산하고 원점 이동 거리를 의미한다.
  10. 스프레드 시트 소프트웨어 프로그램을 사용하여 다음 데이터 드롭 다운 창에서 "데이터 분석"을 클릭합니다 "데이터"를 클릭합니다. 통계적 유의성에 대한 차단으로> 95 % 신뢰와 분산 시험의 페로 니 보정, 편도 분석을 선택합니다.

Representative Results

라이브 세포 현미경 HUVEC 문화
형광 단백질을 발현 된 HUVEC의 라이브 세포 이미징 HUVEC를 정상 세포의 성장 및 유지 보수뿐만 아니라, 통상의 단백질 발현 및 기능에 적합한 환경에서 유지되는 것을 요구한다. 1 프로토콜의 개략도가 버퍼링을 제조하는데 사용 나타낸다 닫힌 시스템 살아있는 세포의 시간 경과 이미지를 수집하기위한 광학 특성을 최적화 유지합니다. 양면 테이프의 얇은 스트립은 유리 슬라이드 (도 1a) 상에 배치 된 후 배양 된 HUVECs를 함유하는 커버 슬립은 세포 슬라이드 (도 1b)에 대향되도록 상기 테이프 위에 반전된다. 이러한 방식으로, 테이프는 두 유리 표면 사이에 작은 갭을 제공하고, 세포를 적절한 세포 배양 배지에 목욕을 할 수있는 공간을 생성한다 (도 1C 위에서, 프로토콜 4 참조). 나는폐쇄 된 시스템을 구축하기 위해, (도 1d 한 혼합물 VALAP 1 : 1) 라놀린 : 파라핀 왁스 (NA)의 마지막 단계는 유리 커버 슬립은 석유 젤리를 사용하여 슬라이드 유리로 밀봉된다. 이 세포 배양 방법은 짧은 시간 시퀀스 EB3 혜성의 이미징 긴 분지 시계열 이전 실험에서 모두 사용되었다. 또한 VALAP의 왁스 형 일관성 고정하고 immunolabelling 포함한 보조 접근법 (프로토콜 8 참조)되도록 실험 촬상 끝에 유리 슬라이드 및 커버 슬립에서 쉽게 제거 할 수 있으며, 동일한 커버 슬립 세포 샘플에 대해 수행 될 수있다 즉 라이브 셀 이미징 방식을 사용하여 시각화 하였다.

그림 1
그림 1 :. 라이브 세포 현미경 이미징을위한 HUVEC 문화의 방법론 (A)는 0.65 cm × 2에 양면 테이프 2 개를 잘라.50cm 직사각형 스트립 및 상기 슬라이드의 하단을 따라 가로 슬라이드의 상부 가장자리를 따라 양면 테이프 조각, 다른 부재를 고정. 이 (D)에 기재된 바와 같이, 챔버 밀봉 용 테이프와 슬라이드 가장자리 사이의 작은 공간을 허용하는 것이 중요하다. (B) 집게 된 HUVEC를 함유하는 커버 슬립을 제거 테이프 조각 위에 커버 슬립 (아래 셀측)을 거꾸로 사용. 마이크로 피펫 (C)는, 커버 슬립하고 유리 슬라이드 사이 (25 μM HEPES가 보충 완전한 내피 기초 배지) 영상 매체의 40 μL를 추가한다. 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 공간이 완전히 영상 매체로 가득되었는지 확인하고 거품을 피하십시오. 필요한 경우, 초과 용지를 제거하기 위해 커버 슬립의 가장자리를 따라 흡입기를 사용합니다. (D) 따뜻한 VALAP를 사용하여 (1 : 1 : 1 바셀린 : 라놀린 : 파라핀)은 커버 슬립의 가장자리 주위에 밀봉하기. 영상 미디어 누설 확인커버 슬립에 조심스럽게 주위를 밀어들. 해결하기 위해 추가 VALAP를 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형광 표지 EB3의 자동화 된 추적은 전체 세포 및 지역 MT 성장 역학의 포괄적 인 분석이 가능합니다. EB3 단백질의 명확한 구별 높은 시공간 - 분해 현미경 이미지의 수집은 셀 내의 EB3 운동의 분석에 필수적이다. 형광 표지 EB3의 발현 HUVEC 세포와 형광 강도는 전형적으로 시간의 기간에 걸쳐 동일한 셀 내에서 증가하는 세포에서 광범위하게 다양하다. 따라서, 고려 MT 성장 역학 증가 EB 발현의 잠재적 인 효과를 식별하기 위해서 발현 프로파일의 변경을 모니터링하는 것이 중요하다. 이것은, 평가 계조 형광 intensit함으로써 달성된다Y 각 묘화 셀에 대한 정보, 다음 계조 발현 프로파일의 정의 된 범위를 표시하는 해당 셀에 데이터 분석을 제한. 발현 프로파일 데이터 세트의 초기 평가가 중요하며, 각 셀 plusTipTracker 소프트웨어에 의해 얻어지는 MT 성장 동역학 데이터와 비교한다. 발현 양상은 순서 계조 표현의 원하는 범위를 결정하고 잠재적 인 특이점을 식별하기 위해서는, MT 성장 속도 실험 그룹 내의 각 셀에 대해 MT 성장 수명에 대해 도시 될 수있다.

HUVEC은 피브로넥틴 기판 상에 배양 그림 2 하이라이트 (위의 프로토콜 2.1 참조) 및 매플 표지 EB3의 최적 수준 근처 표현. 형광 EB3 혜성이 12 초 (도 2a)에 걸쳐 이미지의 저속 직렬로 도시되어있다. plusTipTracker 소프트웨어를 사용하여 EB3 혜성의 분석 자동화, 프레임 별 EB3 혜성의 DETE을 포함ction (녹색과 노란색 점, 그림 2B). 각 프레임 내에서 검출 혜성은 다음 EB3 트랙과 시각적 EB3 트랙 오버레이 (그림 2C-F)를 생성하기 위해, 프레임 간에서의 위치에서 자신의 변화에 의존, 연결되어 있습니다. 트랙 오버레이 컬러 코딩 및 색 차이는 사용자에 의해 입력 된 파라미터에 의해 결정될 수있다. 일반적으로, 이러한 차이는 MT의 성장 속도와 MT 성장 수명 5,31의 전체 평균을 사용하여 네 개의 그룹들로 데이터를 분할 : 느리고 단명 (적색), 느리고 장수 (황색), 빠르고 단기 (녹색) 살고, 빠르고 수명이 긴 MT 성장 (파란색도 2G). EB3 표지 MT 성장 역학의 PlusTipTracker 매개 추적도 관심 (로아)의 사용자 정의 영역 수 있습니다. PlusTipTracker하여 MT 성장 dynam의 비교를 허용하는 사용자 정의 ROI (도 2A, BF) 내에서 MT 성장 트랙 데이터를 추출동일한 셀의 다른 지역에서 ICS.

그림 2
그림 2 : EB3 혜성 탐지, 추적 및 plusTipTracker 데이터 출력 HUVEC 표현 매플의 EB3의 (A) 시간 경과 영화.. 왼쪽 패널은 셀 경계를 demarking 전체 셀보기 및 전체 셀 마스크 (흰색 선)를 보여줍니다. 빨간색 상자는 시간 경과 이미지 (오른쪽 패널)에 표시된 확대 된 영역을 나타냅니다. 오른쪽 패널은 연속 영상 프레임 (- t = 12 초 t = 0 초)에 EB3 혜성의 원시 그레이 스케일 시간 경과 이미지를 보여줍니다. (A)에 도시 된 이미지에서 EB3 혜성의 (B) plusTipTracker 검출. 왼쪽 패널은 검출 혜성 (노란색 점)의 전체 셀보기를 보여줍니다. 빨간색 상자는 시간 경과 이미지 (오른쪽 패널)에 표시된 확대 된 영역을 나타냅니다. 오른쪽 패널은 오 검출 EB3 혜성 (빨간색 화살표)를 선택하고 12 초 영상 기간 동안 5 개의 혜성을 추적. 녹색 점은 이전 시간 간격에 존재하지 않는 (또는 검출되지 않았다) EB3 혜성 검출 나타낸다. (C) (A)에 도시 EB3 혜성의 61 프레임 (2 분 동영상)의 최대 강도 투사. (D) (C)에 도시 된 바와 같은 프레임 (61) (2 분 동영상)의 plusTipTracker MT 트랙 오버레이. 최대 강도 투사 (E)(C에서 빨간색 상자). 최대 강도 투사의 plusTipTracker MT 트랙 오버레이 (F)(D에 빨간색 상자). (G) 트랙 (D)에 도시 오버레이 (F)에 대한 전설 색상은 구분. 지정 느린, 빠른, 짧은 수명 또는 오래 살았다는 열 매플-EB3 표현 된 HUVEC의 그룹에서 측정 된 모든 성장 트랙에 대한 평균 값을 기반으로합니다. 쉽게 시각화, (D) 및 (F)의 트랙 오버레이 (A)에 도시 된 셀의 반전 이미지 픽셀의 강도를 사용하여 생성된다. 스케일 바는 20 μm의 =./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

HUVEC은 분기 및 마이그레이션 패턴은 ECM에서 신호 물리을 메카에 민감하다.

HUVEC를 잘 특정 시그널링 큐 (들)에 대한 적절한 36,40-42 세포 반응을 지시 형태 학적 변화를 겪는 데, 그렇게함으로써 시그널링 큐의 여러 유형에 반응하는 것으로 알려져있다. HUVECs를가 피브로넥틴 코팅 된 유리 기판 (그림 3A)에 배양, 또는 뻣뻣한 2 차원 폴리 아크릴 아미드 ECM들에 (55 kPa의)는 일반적으로 몇 가지 독특한 지형 돌출부 (그림 3B)와 원형 또는 긴 형태를 표시합니다. 그러나, 배양 매우 부드러운 2 차원 폴리 아크릴 아미드 ECM들 (0.7 kPa의)에, HUVECs를가 발생하는 것으로 알려져있다 높은 분지 형태 표시 아래의 준수를 유도마이 오신-II의 수축력 4,5,31 (그림 3C)의 규제. 따라서, HUVECs를은 ECM의 mechanosensing를 통해 자신의 세포 형태를 조절하고,이 MT 역학과 공작 - 마이 오신의 수축성의 지역화 변조를 통해 달성된다.

HUVEC를 분지 HUVEC를 측정하기 위해, 형태 학적 특성의 다양한 표시 때문에 제 분지 돌기가 무엇인지 정의하고 지형 돌출부를 객관적으로 측정하는 방법을 정의하는 것이 중요하다. 하나의 기술은 셀 경계 또는 "마스크"셀 가장자리 (도 3D)을 정의하는 형광 볼륨 마커를 발현하는 세포의 화상을 사용하여 상기 셀의 가장자리를 추적 수동으로 생성하는 4 단계 접근법을 사용한다. 마스크 생성 후, 분기 기원은 지형 돌출부와 전지 본체 사이 곡률 큰 각도의 위치에 의해 정의된다. 라인은 DEMA에 그려진RK은 "분기 원"(보라색 각진 라인도 3E). 분기의 수가 정의 된 분기 원 (도 3f)와 분기 횟수를 카운트하는 것만으로 측정된다. 분기 길이는 말단 지점 팁 (도 3G)로 분기 원점으로부터의 거리를 측정한다. 데이터 분석에서 작은 lamellipodial 돌기의 포함을 방지하기 위해, 추가 기준은 (이하 "분기 원"에서) 폭보다 분기 ( "분기 길이") 이상이어야 할 것을 요구하고, 가지의 길이는 5에서 적어도 10 미크론해야 31.

그림 3
. 그림 3 : HUVEC 분기 형태의 분석 (A - C) 된 HUVEC의 DIC 이미지 예 피브로넥틴 코팅 유리 ECM들 (A) 딱딱한 (55 kPa의) 폴리 아크릴 아미드 ECM들 (B) 및 소프트에서 배양 (0.7kPa의) 폴리 아크릴 아미드 ECM들 (C). 엄격한 ECM들 (A, B)에 비해 극적으로 0.7 kPa의 폴리 아크릴 아미드 ECM들 (C)에서 배양 된 HUVECs 증가된다 분지. (D). 매플-C1 cDNA를 구축 발현하는 형질 전환 된 HUVEC의 DIC 현미경 이미지 (왼쪽 이미지) (셀 볼륨 마커를 우측 이미지). (상기 멤브레인은 최대 곡률을 표시하는 위치, 즉, 자주색 라인) (E)의 곡률의 큰 각도로 배치함으로써 분기 원을 정의하는 직선과의 각도를 연결 한 다음 분기의 양쪽과 (청색 선) . (F) 확인 및 (E에 정의)은 "분기 원"에서> 10 μm의 연장 분기 돌기을 선택. 수득 지형 돌기의 수를 카운트 "분기 참조." (G)는 MO에게 "분기 원"의 중심으로부터의 거리를 측정얻기 위해 NIS 요소 소프트웨어의 주석과 측정 응용 프로그램에서 줄 도구를 사용하여 지점의 일 말단 지점 "지점의 길이를." 스케일 바는 20 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

감지 ECM 준수뿐만 아니라, HUVECs를 또한 감지하고 스크래치 상처에 의해 유도로 인접 세포 접촉의 제거에 응답합니다. 마이그레이션 분석에서, HUVECs를이 단층에서 배양는 스크래치 상처를 실시하고 마이그레이션 특성 (위의 프로토콜 9 참조)를 측정한다. 단층을 긁어서 상처 유도 후, 상처 가장자리 HUVEC를 상처 (도 4a, t = 0 시간)로 연장 돌출 선단을 개발하여 편광. 10-12 시간의 시간 과정 동안, 편광 상처 가장자리 HUVEC를 상처 영역으로 이전하고 채우기상처 새로운 합류 단층 확립 (도 4A는, t는 시간을 11 =). HUVEC가 분기와 마찬가지로, 현재 증거는 편광 및 마이그레이션이 (가) MT의 조정을 다시 조직과 액틴 cytoskeletons 43-49에 따라 비판적으로 종속되어 있음을 시사한다. 이 아닌 상처 가장자리 된 HUVEC (31)의 후단에, 선단에 MCAK 유도 MT 분해 지역화 억제를 통해 부분적으로 달성된다. MT 역학의 감도는 상처 유발하는 오로라-A 인산화 및 최첨단 MCAK을 억제 키나제 및지도를 억제하거나 활성화 할 수있는 다른 키나제 등 다양한 다운 스트림 조절 단백질을 대상으로하는 RAC1는 GTPase에 의해 시작 편광 로컬에 MT 성장을 조절하고 18,31,36,48,50-53을 수축. 광범위한 실험 증거는 가장자리 돌기를 선행 및 후행 에지 수축의 조정이 RAC1 활성화의 사이클을 통해 적용되는 개념을 지원이에 관한 운동 9,41,51,52,54-58 운전, 트레일 링 에지에서 공작 - 마이 오신의 수축성에 최첨단의 MT 어셈블리에서 RhoA의 활성화를 촉진합니다.

지금까지, 세포 이동을 자동 추적을 수행하는 설정 방법이 없다. 이는 계산적으로 감긴 가장자리 셀 편광 및 이주로 일관 변화 셀 ECM 경계를 분석하는데 어려움의 결과이다. 다양한 소프트웨어 프로그램이 형광 표지 된 세포를 59-64 추적 할 수 있지만, 상처 가장자리 이전 실험에서 HUVEC를 표지 형광 인구 총 HUVEC 인구의 30-40 %로, 따라서 상처 가장자리 세포의 대부분은 반드시 위상 대비 또는 DIC 영상으로 시각화 될 수있다. 또한, 상처 가장자리의 이동을 측정하는 특정 식별하기 위해 동일한 상처 내에 형광 및 비 형광 세포를 평가할 때 중요표현의 효과는 실험적 연구 그룹 내에서 실험적 연구 그룹 사이에 모두 구성한다. 현재 HUVEC 이동을 측정하는 가장 좋은 방법은 상처 가장자리 셀 먼저 식별하고 핵과 핵소체는 (도 4b)에 의해 식별 된 손 추적 방법을 사용하는 것이다. 핵소체 인해 높은 광산란 밀도가 상대적으로 작은 크기로 휴대 추적, 위치 결정 요소로서 사용된다. 핵소체의 이러한 두 특징은 쉽게 식별하고, 사용자가 각각의 트랙 위치에 배치 할 수있는 영역을 제한함으로써 측정 오차를 줄일 수 있도록. HUVEC 마이그레이션 트랙이 후 연속적인 시간 경과 이미지 프레임에서 핵소체를 클릭하여 생성됩니다. 마지막으로, 원점 이동 속도와 이동 거리 측정 및 제어 및 실험 셀 그룹 (그림 4B)에 대한 분석된다.

그림 4 그림 4 : 상처 가장자리 된 HUVEC 및 마이그레이션 추적 분석 스크래치 상처 가장자리 된 HUVEC (일명 "마이그레이션 분석")의 11 시간 시간 경과 영상 시리즈의 (A) 20X 위상 콘트라스트 이미지.. 이주의 상처와 방향은 패널 t = 0 시간으로 표시됩니다. 세포 단층이 형성 될 때까지 HUVEC를 상처에 상처 가장자리 미리 교차하도록 도시되​​어있다 (이 t = 3.5 시간이 - t는 시간을 11 =). (B) 이동 분석 시간 경과 영상 분석 (A에 도시 된 바와 같이) 제 1 셀의 위치에 기초하여 추적 가능한 상처 가장자리 HUVEC의 식별 (물리적 상처의 가장자리, 즉 세포) 및 발현 프로필 (나는 전화부 필요하다. 실험이 GFP의 발현을 포함하는 경우) 녹색 상처 가장자리 셀을 선택합니다. 위상 콘트라스트 이미지를 사용하여, 핵 및 핵소체를 식별한다. 손은 An을 사용하여 연속적인 시간 경과 이미지에서 핵소체를 추적NIS 요소 소프트웨어의 표기법과 측정 응용 프로그램 원점 이동 속도와 거리를 결정합니다. 스케일 바 = 100 μm의 (A), 20 μm의 (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

형태학 및 마이그레이션 실험에서 HUVECs를 사용.
HUVEC를 내 EB3 표지 MT 성장 역학 라이브 세포 이미징 그들이 다음 ECM 시그널링 큐에 할당 될 수있는 MT 성장 HUVEC 형태의 변화를 측정하고 평가하기 위하여 적절하고 재생 가능한 세포 배양 조건을 필요로한다. HUVECs를 세포 모양과 운동성을 연구를위한 훌륭한 모델을 나타냅니다. 그들은 모두 가용 물리적 신호 큐에 응답하여 극적인 모폴로지를 나타내는, 형광 표지 된 cDNA를 가진 형질 감염에 매우 의무이며, 그들은 적절한 세포 배양 조건 65-70를 제공 할 때 혈관 튜브로 자신을 구성 할 수있는 능력을 유지한다. HUVEC를 예로서 일차 세포 배양은 세포가 건강 보장하기 위해 그들이 실험 동안 정상적으로 동작 할 것으로 취급에주의 세포 통로 번호 모니터링을 필요로한다. 예를 들어,시 cytoskele 조사 실험을 실시HUVEC를 전형적으로 다섯 통로 열두 주위 불균일 모폴로지를 표시하기 시작 톤 및 / 또는 세포 형태가 된 HUVEC는 열째 세포 배양 통로 이후 실험에 사용되어서는 안된다.

세포 밀도는 HUVEC의 건강과 확산의 중요한 레귤레이터이다. HUVEC 분기 조사 (상기 프로토콜을 10.1-10.4 참조) 세포 그들의 ECM과 상호 작용하는 물리적 공간을 제공하는 분 지형 돌출부를 확장하기 위해 상대적으로 낮은 밀도 세포 배양 물을 사용한다. 대조적으로, 상처 가장자리 이전 연구에서 HUVEC를 전에 상처에 단층 배양이다 (프로토콜 10.5-10.8 참조). 예컨대, 상처 가장자리 HUVEC를 비교적 비 - 분지 형태를 표시하는 바와 같이, 모서리 돌기 선도 연장, 그들은 상처에 마이그레이션 그들의 바로 이웃 세포 - 세포 상호 작용을 나타낸다.

주의 사항 및 생활 된 HUVEC에서 추적 MT 역학의 장점.
디스크 현미경을 회전하기에 좋은 방법입니다높은 시간 해상도와 공 초점 이미지 선명도를 필요로 실험 가설을 테스트합니다. 적절한 카메라와 레이저 모듈과,이 현미경의 접근 방식은 낮은 방출 형광에 민감하고 형광 현미경의 다른 유형에 비해 감소 광표백에 도움이 될 수 있습니다. 다른 다양한 종류의 세포에서 EB3 라벨링 방식을 사용하여 MT 성장 역학의 광범위한 측정을 생성하기 위해 필요로 중요한 것은이 방법은 또한 높은 시간 - 해상도 이미징 중등도 적합하다.

라벨의 EB3 방법론 MT 플러스 단부 성장 동안 형광 표지 이동 단말의 다른 방법에 비해 뚜렷한 장점을 보유하고, 또한 고유의 단점이있다. 예를 들어, 적극적으로 분해, 이동 단말의 인구 안정된 비 동적 이동 단말 (71 내지 74)의 인구 모두 포함하는 임의의 주어진 시간에 성장되지 않는 MT 어레이의 비율이 존재한다. EB3는 이동 단말이 두 집단 라벨 않을 것와따라서 이러한 두 집단의 기여는 실험 데이터의 분석에 포함되지 않는다. 전체 MT 배열을 평가하기위한 대체 방법은 형광 표지 된 이동 단말의 모든 인구로 통합하고, 성장 감소의 식별을 가능하게 튜 불린, 그리고 안정된 이동 단말의 표현에 초점을 맞추고있다. 그러나, 전체 MT 어레이 라벨링 미세 소관 조직 센터 (MTOC)으로 상기 셀의 중심에 인접 근처 MT 어레이의 비교적 높은 밀도의 세포 근처 아닌 MT 단부의 이미지 분석을 수행하는 단점이 만들어 주변 75-77. 살아있는 세포에 형광 튜 불린 형광 EB3와 이동 단말의 2 색 공동 라벨을 사용하여 실험 튜 불린 표지 이동 단말의 대부분은 또한 EB3 표지 (78)를 것을, 질적으로, 밝혀졌다. 또한, 형광 튜 불린으로 표시 이동 단말의 자동 추적하는 효율적인 방법이 없었다. 이 데이터의 폐기물 수집을 의미한다기 형광 튜 불린을 발현하는 세포에 MT 역학의 측정​​은 오류가 발생하기 쉬운하고 지루한 과정을 개별 이동 단말의 손 추적을 필요로한다. 그 결과, 표지 EB3 이동 단말의 자동 계산 분석이 다수의 세포 유형에 걸쳐 실험 체제 35,79 다양한 내에 MT 역학 실험에 적용 할 수있는 MT 동성을 측정하기위한 바람직한 방법이되었다.

HUVEC 형태학 및 마이그레이션에 MT 성장 역학을 연결.
세포 골격 연구자의 관점에서 볼 때, plusTipTracker 자동 추적 분석 한 매우 유용한 적응 측정하고 MT 성장 역학 모두 전체 셀과 지역 변화를 평가하는 기능입니다. 셀 편광되기위한 요구 사항은 방향 세포 이동을위한 필수적인 전제 조건이다. 같은 편광 신호 단서는 긴 방향 세포 이동 30,31,51,54,56,80,81 주요 운전 인자로 알려져있다으로 2,82-87에서 VEGF 큐 향해 액틴 중합 및 MT의 성장을 유도한다. 또한, (예를 들어, 규격 및 차원의 mechanosensing 용) ECM 물리적 상호 작용에 대한 응답으로, HUVEC를 로컬 맵 지형 돌기 신장 내의 MT 성장을 촉진하도록 조절함으로써 MT 역학을 조절하고,이 방향의 HUVEC 이동을 안내하는 역할 큐 5,31,88. 따라서, 세포 외 신호에 응답 큐 편광 골격 역학 국부 변화의 평가 실험의 필요성을 강조한다.

합니다 (EB3 방식을 사용) MT 성장 역학 HUVEC 세포 이동의 동시 실시간 세포 이미징은 이동 단말이 초의 타임 스케일에 성장하기 때문에 세포 형태 및 방향 이동의 변화는 시간의 시간 스케일로 발생하지만, 수행하기가 매우 어렵다. 그러나 두 프로세스가 긴밀하게 LINKE 있습니다디. 또, 제 2 시간 스케일상의 형광 표지 EB3 연속 신속한 촬영은 EB3 신호의 photobleaching에 리드. EB3 (1-2 분 취득 시리즈) 30 분마다 성공적이었다 짧은 촬상 시리즈를 수행하여이 문제를 해결하려고하지만 EB3 최적 발현했다 EC를 소수로 달성 될 수 있고, 그 악영향이 표시되지 않았다 반복 레이저 조명 (5)에 효과.

MT 성장 역학 세포 형태 및 이동의 변화에 기여하는 방법의 해석을 가능하게하는 다른 방법은이자 (ROI) 도구 (35) (프로토콜 6.6 참조)의 plusTipTracker 지역이다. 전체 셀 MT 성장 세분화 MT 성장 트랙 후 추출하여 분석 할 수있는 사용자 정의 된 영역으로 할 트랙이 방법은 허용한다. 예를 들어, 셀 '비 분지 "대 영역"분지 "의 비교는 이동 단말의 더 성장할 것으로 밝혀졌다낮은 더욱 지속적으로 지형 영역 내의 비 분지 셀 주변부 5 비교. 편광 상처 가장자리 된 HUVEC에서 리딩 에지​​와 트레일 링 에지 MT 성장 역학의 비교는 MCAK 유도 MT 분해가 트레일 링 에지를 최첨단 내에서 구체적으로 금지되지 않지만 것으로 나타났습니다. 선도 RAC1 및 / 또는 MCAK의 인산화 돌연변이 표현 된 HUVEC의 가장자리 MT 성장 역학 후행 지역의 평가는 더 오로라-A 키나아제의 RAC1 유도 활성화는 특히 로컬 HUVEC의 편광 방향 이동을 구동하기 위해 최첨단 내에서 MCAK 활동을 억제하는 것으로 나타났다 31. 따라서, MT 성장 역학과 지형 돌출부 및 / 또는 상처 가장자리 된 HUVEC의 최첨단에서 MT 성장 역학의 지역 평가의 자동화 된 추적의 조합은 우리가 HUVEC 형태 및 마이그레이션에 MT 성장 역학을 연결 할 수있다.

기술 된 프로토콜이다 고안d를 HUVEC 문화와 실험 조사를 위해 일반적으로 간단하고 매우 반복적 인 방법을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 프로토콜 세부 여러 차례의 실험 방법을 수행하거나 오류 문제에 대한 기회를 제공하는 복잡하고 시간 소모적이다. 이 프로토콜을 통해 잠재적 인 문제를 해결하기 위해 시도하는 동안, 여기에 많이 사용하거나 다른 방법 프로토콜 내에서 노트로 약칭이다 잠재적 인 문제의 추가, 자세한 문제 해결을 제공한다.

폴리 아크릴 아미드 기판에 코팅 된 커버 (프로토콜 2.2), 커버 글라스를 활성화 유리에 폴리 아크릴 아미드 결합, 폴리 아크릴 아미드를 활성화 한 다음 폴리 아크릴 아미드에 ECM 커플 링의 복잡한 특성상 발생하는 일반적인 문제 관련. 하나 특히 어려운 잠재적으로 문제가있는 단계는 폴리 -A의 노출 다음 피브로넥틴 / 폴리 아크릴 아미드 겔에 HUVECs를 배양한다2 mM의 설포 SANPAH에 crylamide 코팅 된 커버 (위의 단계 2.2.2.6). 이는 이러한 기판상의 HUVEC를 배양의 성공에 중요 술포을-SANPAH 완전히 ECM 공액 다음 실험 시스템에서 제거 될 수있다. 이것은, DDH 2 O로 세척하고 밤새 진탕에 DDH 2 O의 커버 슬립을 배양하여 수행 할 수 있습니다. 폴리 아크릴 아미드의 ECM들에 배양 된 세포가 생존하지 않으면 생존이 예상 증가 및 피브로넥틴 (단계 2.2.2.9)에 접합 한 후 술포 SANPAH의 세척을 반복보다 작은 경우 잠재적으로이 문제를 완화하기 위해, 또는 추천합니다.

프로토콜 3 (커버 슬립에 대한 cDNA를 형질 감염 및 HUVEC 배양)에 관련된 전기 천공 절차의 성공에 큰 영향은 세포의 트립신 동안 모두 HUVEC를 취급이 체결 다음 플라스틱 플라스크에서 제거하는 것입니다 일렉트로 (위, 3.3-3.4 단계). 걱정하는 것이 중요합니다트립신에, 플라스크 (일반적으로 1-2 분)의 표면에 "올림"로 세포에 필요한 시간을 초과하지 않는 상태에서 완전히 HUVEC를 모니터링. 트립신 과도한 시간은 세포가 피브로넥틴 - 코팅 된 커버 (34 단계)로 도금 한 후, 기판에 부착하지 않을 때까지 통상적으로 실현되지 않은 HUVEC의 사망의 주요 원인이다.

일렉트로 버퍼에 긴 시간이 정지 할 때와 유사한 중요한 것은, HUVECs를 (대부분의 일차 전지 유형) 잘 지내지 않는다. 더 큰 규모의 실험을하는 동안, 사용자는 전기를 필요로 5 개 이상의 조건​​을 가지고 예를 들어, 하나-A-시 개별 튜브 펠렛 세포 (형질 전환 당 1 개의 튜브)를 유지하고, 이들을 혼합하는 것이 좋다 , 전기 이전에 즉시 전기 버퍼입니다. 이 방법은 전기 버퍼 최대화 HUVEC 생존의 배양 시간을 최소화한다. 또한, 전체 문화 미디어에서 즉시 구조는 CR이다itical 다음 전기. 일분 이상의 다음과 같은 전기의 구조 지연이 완료 HUVEC 죽음 근처에서 발생할 수 있으므로 피해야한다.

관련된 세포 이동 분석 (프로토콜 9), 매우 높은 밀도에서 HUVEC를 배양하는 기술은 피브로넥틴 피복 된 커버 슬립의 건조를 요구 (프로토콜 3에 기재되어 있음) 기존 HUVEC 세포 배양 방법의 (단계 9.2에 기재되어 있음) 임계 변형에 따라 커버 슬립은 매우 작은 면적으로 HUVEC 배양을 가능하게하기 위해서이다. 커버 슬립이 완전히 건조되지 않았거나 피브로넥틴 커버 슬립의 사전 코팅 (단계 2.1 또는 2.2) 경우 비효율적 인 경우 종종, 커버 슬립 상에 배치되고 상기 미디어 - 함유 세포가 그 표면 장력을 잃고로 확장된다 하여 커버 슬립에서 세포의 밀도를 감소 커버 슬립 가장자리. 이 잠재적 인 문제를 해결하는 한 가지 방법은 커버 슬립에서 다음 미디어를 대기음하는 것입니다5 ~ 10 분 동안 바이오 안전성 캐비닛의 뒷면에 (여전히 35mm 접시에) 커버 슬립을 배치합니다. 이러한 조정은 접시 건조 돕기 위해 캐비​​넷 내의 공기 흐름을 허용하도록 도울 수있다. 눈에 보이는 액체가 공기 건조 후 커버 슬립에 남아있는 경우, 액체 관광 명소를 대기음 다시 바이오 안전성 캐비닛에 5-10 추가 분 동안 공기 건조를 할 수 있습니다. 완전히 이러한 잠재적 문제점을 방지 할 수있는 방법이 없다는 것을 유의하는 것이 중요하지만,이 프로토콜의 반복 실시에 문제가 덜 않는다. 또한 세포 이동 분석 (또는 일반적으로 어떤 분석)에 대한 커버 슬립을 준비 할 때, 추가 된 커버를 준비하고 여분의 HUVECs를 준비 - 투 - 갈 길을 따라 문제가있는 경우에 가지고있는 문제 해결 권장합니다.

염두에두고 이러한 문제 해결 고려, 논의 된 프로토콜과 미래 세포 생물학 연구에 그 의미의 유용성을 강조하는 것도 중요합니다. polyacr에 적용아미드 접근 방식은 광범위하고, (전술) 세포 ECM 참여의 2 차원 연구뿐만 아니라 입체 조사 (5)뿐만 아니라이 포함되어 있습니다. 이 응용 프로그램은 HUVECs를 생리적 환경에서 세포의 모양과 이동을 조절하는 방법에 대한 우리의 이해를 증가시키는 중요하며, 연구자들에게 세포 골격 변화를 조정하는 방법을 형태 학적 변화에 대한 기본적인 이해를 제공해야합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 MT 성장 동역학 측정에 집중하고 있지만, 프로토콜의 대부분은 세포 - ECM 상호 작용의 다른 측정 가능한 현미경으로 임의의 개수의 양상을 측정하도록 구성되어야 할 수있다. MT 역학에 대해, 제시된 프로토콜을 사용하여 조사 할 수있다 적어도 14 키네신 89 가족, HUVEC 극성 감독 마이그레이션에 기여의 잠재적 인 역할 각, 모든의를 포함하여, 다수의 MAP에가 있습니다.

미래 연구해야LSO 병에 걸린 상태 대 정상에서 세포 ECM 참여 대상으로 될 수있다. 여기서 제시 HUVEC 프로토콜 정상적인 혈관 항상성 과정 연구에 적용 할뿐만 아니라, 몇 가지 이름, 심장 질환, 망막 병증, 종양 성장 및 전이를 포함하여 질환 상태에있다. 내피 세포의 혈관 신생 혈관이 높은 공간 및 시간 해상도로 모니터링 할 수 있도록 세포 ECM 참여 연구에 수 현미경 연구와 의무 준수의 눈에 띄게 투명 ECM들과 폴리 아크릴 아미드 기판을 접합. 실험 방법의 이러한 종류의 이미 중요한 내피 세포의 모양, 극성, 이전의 차이 및 이들 프로세스 5,31,90을 조절 단백질의 효과를 나타 내기 위해 시작했다. 미래의 노력은 ECM 준수 및 차원의 mechanosensing의 조합이 대상과 세포 골격 역학을 조절하는 로컬 제어 단백질 역할을 할 수있다 방법을 식별하는 것을 목표로한다.

Acknowledgments

plusTipTracker MT 분석 소프트웨어 개발을위한 멘토링과이 연구에 사용 된 형광의 cDNA 구조의 대부분을 제공하는 토론, 미셸 베어드와 마이크 데이비슨 박사 클레어 M. 워터맨, 그리고 캐서린 애플게이트와 Gaudenz Danuser 특별 감사. 이 작품에서 KAM에 부여에 의해 부분적으로 지원되었다 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI)와 국립 보건원 (NIH). (부여 : 4K22HL113069).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aurora A Inhibitor I Selleck Chemicals S1451
2% Bis solution Bio-Rad 1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilane Sigma-Aldrich A3648
40% acrylamide Bio-Rad 1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module Agilent Technologies 99462
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter Chroma Technology Corp. ET455/50m
ET525/36m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET525/36m
ET605/70m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET605/70m
ET700/75m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction V RPI Products A30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device camera Andor Technology 77026010
Cy3 donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250
Dyelight 649 goat anti-rat Jackson ImmunoResearch 112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) Lonza CC-4143
Fetal bovine serum 25 ml
Bovine brain extract 2.0 ml
Gentamycin sulfate 0.5 ml
Epidermal growth factor 0.5 ml
Hydrocortisone 0.5 ml
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)  10.0 ml
EGTA Sigma-Aldrich E3884-100G
Electronic shutter Sutter instrument 77016099
Fibronectin EMD Millipore FC010
Glutaraldehyde Thermo Fisher Scientific S80026
HALT Protease inhibitor Thermo Fisher Scientific PI-78425
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HRP goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-036-062
HRP goat anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 162-0174
Lanolin Thermo Fisher Scientific 8006-54-0
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643-500G
Microscope Nikon TiE MEA53100
Motorized stage ASI Technologies MS-2000
Mounting medium Dako CS70330-2
Mouse anti-Aurora A Abcam ab130156
Mouse anti-GAPDH Abcam ab9484
Mouse anti-MCAK Abcam ab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A) Cell Signaling Technology 3873S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NIS Elements software Nikon MQS310000
Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 Contains the electroporation buffer
Paraffin Thermo Fisher Scientific P31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) MP Biomedicals 91670249
Petroleum jelly Dow Corning 2021854-1113
Pipes Sigma-Aldrich P6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFP Abcam ab290
Rabbit anti–pT288–Aurora A Abcam ab18318
Rat anti–α-tubulin AbD Serotec MCA78G
Sodium borohydride Thermo Fisher Scientific 678-10
Spinning disk  Andor Technology Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH Thermo Fisher Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP151-500
Trypsin Corning MT25053CI
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337

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