Визуализация ВИЧ-1 Gag Связывание с Giant однослойные везикулы (ГУВ) Мембраны

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (113), e54293, doi:10.3791/54293 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Структурный белок ВИЧ-1, Pr55 Затычка (или ГАГ), связывается с плазматической мембраной в клетках в процессе сборки вируса. Мембрана связывание Gag является важным шагом для формирования вирусной частицы, так как дефект в Gag мембраны связывания приводит к тяжелым нарушениям производства вирусных частиц. Чтобы получить подробную информацию о механистической Gag-липидных мембранных взаимодействий, методы в пробирке на основе ЯМР, белка футпринтинга, поверхностного плазмонного резонанса, липосомная флотационного центрифугирования или флуоресценции липидного бусинки связывания были разработаны до сих пор. Тем не менее, каждый из этих методов в пробирке имеет свои ограничения. Для того, чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений и обеспечить дополнительный подход к ранее установленным методам, мы разработали анализ в пробирке , в которой взаимодействие между ВИЧ-1 Gag и липидных мембран происходят в среде "клеточноподобного". В этом анализе, Затычка связывание с липидными мембранами визуально анализируют с использованием YFP-tagged Gag синтезируется в зародышей пшеницы на основе в пробирке системы перевода и GUVs , приготовленных с помощью методики electroformation. Здесь мы опишем фона и протоколы для получения myristoylated полнометражных Gag белки и ГУВ мембраны, необходимые для анализа и выявления Gag-ГУВ связывания с помощью микроскопии.

Introduction

Человеческий вирус иммунодефицита типа 1 (ВИЧ-1) представляет собой оболочечный вирус, который собирает в и почки из плазматических мембран (ПМ) в большинстве типов клеток. Сборка вирусных частиц ВИЧ-1 приводится в движение с помощью вирусного белка ядра 55 кДа под названием Pr55 Затычка (ГАГ). Gag синтезируется в виде полипротеина предшественника, состоящего из четырех основных структурных доменов, а именно, матрица, капсида, нуклеокапсиде и P6, а также два распорных пептидов SP1 и SP2. Во время сборки матрица (MA) домен отвечает за нацеливание Gag к месту сборки капсида (CA) домен опосредует Gag-Gag взаимодействий, нуклеокапсида (NC) домена вербует геномной РНК вируса и P6 новобранцы принимающие факторы, которые содействуют вирус разрезка частиц из плазматической мембраны. Затычка также подвергается со-трансляционной модификации путем добавления жирной кислоты 14-углерода или миристатной фрагмента на его N-конце.

Мембрана связывание Gag является необходимым условием для вирусной сборки, так как тutants, которые имеют дефекты в мембране связывания не производят вирусные частицы. Мы и другие показали, что мембраны связывание Gag опосредуется двудольных сигналов в пределах домена Массачусетс: N-концевой миристат фрагмент, который опосредует гидрофобные взаимодействия с липидный бислой и кластером основных остатков в домене МА называется, как высоко основной области ( HBr) , который взаимодействует с кислыми липидами на ПМ 1-4. Исследования Gag-мембранных взаимодействий с использованием эктопической экспрессии polyphosphoinositide 5-фосфатазы IV (5ptaseIV), фермент , который катализирует гидролиз PM-специфической кислой фосфолипидного phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] к фосфатидилинозитол-4-фосфат, в клетках предположил , что локализация Gag-ПМ опосредуется PI (4,5) P 2 3,5. Тем не менее, в пробирке исследования , направленные на понимание более механистические детали Gag-PI (4,5) P 2 взаимодействия оказались быть сложным по целому ряду причин. ДляНапример, очистка полнометражных myristoylated ВИЧ-1 Затычка для биохимических экспериментов было технически сложно, по крайней мере частично из-за тенденции ГАГ агрегировать во время очистки. Следовательно, усеченные формы ВИЧ-1 Gag, такие как Myr-MA или Myr-MA-CA, или не-myristoylated форме были часто используются в исследованиях , которые требуют Gag очистки (например, ядерный магнитный резонанс, белок футпринтинга, и поверхность плазмонного резонанса 6-9). В качестве альтернативы, в сочетании в пробирке реакций транскрипции-трансляции, были использованы для получения полной длины myristoylated ВИЧ-1 кляп в других биохимических исследований 1,2. Как правило , в этой системе, плазмиду Затычка-кодирование транскрибировать и транслировать с эукариотические лизаты клеток (например, кролик лизатов ретикулоцитов), которые лишены каких - либо клеточных мембран и с матричными РНК , но содержат механизм для транскрипции и трансляции. После реакции, клеточные лизаты, содержащие Gag смешиваются со мнойmbranes для анализа Gag взаимодействий с липидами. В дополнение к легкости приготовления полной длины myristoylated Затычка, методы , использующие систему перевода в пробирке транскрипции имеют преимущество , что синтез Затычка и последующее мембранные реакции связывания происходят в 'эукариотической цитозоле типа "среды , которая может лучше представлять физиологических условиях. Это свойство способствовало исследований , которые показали , что молекулы РНК , связанные с доменом MA регулируют Gag связывания с кислыми липидов на конкурентной основе 1,2,10-12. Тем не менее, так как общее количество Gag белков, полученных в этих клеточных лизатов не высоки, метаболическое мечение белков с радиоактивно меченных аминокислот необходимо для их обнаружения.

В зависимости от метода измерения Затычка-липидных взаимодействий, которые были использованы разнообразные мембранных препаратов. Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки. Большинство анализов ЯМР на основе требуют использования липидов с коротким ацилцепи , которые растворимы в воде (например, С4 и С8-PI (4,5) P 2) 6,8. В то время как ЯМР - методы тестирования связывание Gag с липидами , которые имеют длинные ацильные цепи , найденные в клетках на стадии разработки, они были использованы только с myristoylated или nonmyristoylated MA до сих пор 8,13. В качестве альтернативы, липосомы , приготовленные из липидов , которые имеют родные длины ацильных цепей были использованы в биохимических методов , таких как липосомы флотацией или флуоресцентного липосомного буртика анализы связывания 2,3,10,14-16. Тем не менее, липосомы, используемые в этих анализах имеют небольшие диаметры, и, таким образом, их мембраны имеют крутые и положительную кривизну. В противоположность этому, на ранней стадии сборки частиц ВИЧ-1-инфицированных клеток, Gag связывается с ПМ, который почти Planar по шкале Gag, а затем вызывает отрицательную кривизну во время бутонизации. Таким образом, мембраны липосом с крутыми и положительной кривизны не может быть идеальным липидные двухслойные для изучения Gag-липидных взаимодействий. Что касается липосом FlotAtion анализы, еще один потенциальный нюанс в том, что воздействие Gag-липидных комплексов до гипертонического градиент сахарозы во время центрифугирования может повлиять на экспериментальный результат. Чтобы смягчить эти ограничения и предоставить дополнительную экспериментальную систему, анализы для Gag связывания с гигантскими однослойные везикулы (GUVs) были разработаны в последние годы. GUVs единичные липидный бислой везикул, диаметр которых распространяется на несколько десятков микрометров. Таким образом, кривизна этих мембран напоминает ПМ по шкале Gag. Кроме того, из-за его большого размера, что позволяет визуальный осмотр под оптическим микроскопом, мембрана связывание флуоресцентно помеченная или меченых белков Gag этих везикул при смешивании можно легко определить без последующей обработки Gag-липидных комплексов.

Мы здесь опишем протокол для изучения ВИЧ-1 Gag мембрану связывания с использованием GUVs, полученные из метода electroformation. Различные методы, такие как нежный гидратации, гель-помощь гидратации, микрофонrofluidic струйное и electroformation 17-22 были использованы для получения GUVs. Для протокола, описанного здесь, метод electroformation используется в первую очередь из-за его эффективности в формировании GUVs с кислыми липидами и его относительной простоте использования без необходимости дорогостоящих установок. Поскольку визуализация Gag требует флуоресцентного репортеру, желтый флуоресцентный белок (YFP) генетически добавлен к С-концу Gag (ГАГ-YFP). Gag-YFP белки получают в пробирке транскрипции и трансляции реакций в зародышей пшеницы лизатов на основе технологии непрерывного обмена-непрерывным потоком (CECF). В этой технологии, как удаление ингибирующих побочных продуктов реакции и операции подачи субстратов реакции и энергетических компонентов достигаются в механизме диализной основе. Для этих реакций, используют плазмиду, кодирующую Gag-YFP под контролем промотора Т7. Следует отметить, что, как было показано ранее, зародыши пшеницы лизаты поддерживают миристоилированию без дополнительных компонентов 23,24. Используя этот метод, удалось получить достаточное количество полнометражных myristoylated Gag-YFP для визуализации Gag на ГУВ мембран 24. Здесь мы опишем протокол , с которым ВИЧ-1 Gag связывания с PI (4,5) P 2 -содержащие ГУВ мембраны могут быть рассмотрены без длительной последующей обработки следующие реакции связывания и предполагают , что этот метод дополняет существовавшие ранее Gag-мембраны анализов связывания и может быть расширен для более глубокого понимания связывания ВИЧ-1 Gag-мембрану.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

День 1: Экспрессия белков Gag Используя Зародыши пшеницы лизат на основе In Vitro транскрипции-трансляции системы

1. Получение ВИЧ-1 Gag

  1. Удалите все реагенты комплекта CECF коммерческих зародышей пшеницы из морозильников (зародыши пшеницы лизаты хранили при -80 ° С; другие реагенты при -20 ° С). Разморозить их на лед и смешивать компоненты , как показано в таблице 1.
Mix-1 (Feeding смесь)
Кормление решение 900 мкл
Аминокислоты 80 мкл
метионин 20 мкл
Всего 1000 мкл
Mix-2 (лизат смесь)
лизаты зародышей пшеницы 15 мкл
РНКазы свободной воды 7 мкл
Аминокислоты 4 мкл
метионин 1 мкл
Плазмидной ДНК в ТЕ-буфере (1 мкг / мкл) ** 4 мкл
Реакционный буфер 15 мкл
Rnasin * 4 мкл
Всего 50 мкл

Таблица 1: Составы смесей , необходимых для зародышей пшеницы реакций.
Примечание: Если эксперимент предназначен для изучения влияния удаления РНК РНКазой на Gag мембране связывания, заменить рибонуклеазы ингибиторы с РНКазы водой. Плазмидную ДНК должен быть свободен от примесей в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Тем не менее, рlasmids получены с использованием обычного, но не эндотоксина, наборы выделения плазмид были успешно использованы. Инструкция производителя также рекомендует использовать ДНК, растворенной в нуклеазы без воды. При использовании ДНК суспендируют в ТЕ [10 мМ Трис-HCl (рН 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТА], избегать использования более низких концентраций ДНК, так как ЭДТА в ТЭ могут влиять на выход. Плазмиды, растворенные в ТЕ-буфере в диапазоне концентраций 0,8-1 мкг / мкл были успешно использованы.

  1. Сначала добавьте Подачу смеси (Mix-1) в реакционную кассету (прозрачную камеру). Затем добавьте смесь лизатов (Mix-2) в другую камеру (красный). Не вводить какие-либо пузырьки при добавлении смесей в их соответствующие камеры, так как это может привести к неэффективному обмену компонентов раствора и, следовательно, снижает эффективность реакции.
  2. Накройте камеры с клейкой пленки, снабженной с комплектом.
  3. Вставьте кассету реакции в держатель кассеты и Инкубаторыт.е узел в течение 24 ч при 24 ° С с постоянной скоростью встряхивания 900 оборотов в минуту в Эппендорф Thermomixer Р.

День 2: Подготовка GUVs по Electroformation и Harvest Зародыши пшеницы лизатов

2. Получение GUVs

  1. Аликвотные липиды растворенные в неорганических растворителях, таких как хлороформ, или смеси хлороформа и метанола в стеклянные флаконы с винтовой крышкой, выровненных с тефлоновыми прокладками, оборачивают Parafilm. Ручка липидов со стеклянными шприцами Hamilton типа, или если таковые имеются, хлороформ-стойкие пластиковые наконечники. Выньте стеклянные флаконы, содержащие липиды, которые будут использоваться для приготовления ГУВ от -20 ºC с морозильной камерой.
    1. После того, как флаконы уравновешивали до комнатной температуры, убедитесь, что при визуальном осмотре, что липидные суспензии очевидны. Качество липидов, особенно кислых липидов, таких как пальмитоил-олеоильная фосфатидилсерина (ПТП) и PI (4,5) P 2, имеет важное значение для успешных экспериментов. Не следует использовать липиды, которые являютсяв аликвотах более 2-х месяцев.
  2. Предварительно нагреть нагревательный блок до желаемой температуры. Эта температура должна быть не менее 5 ° С выше , чем температура плавления (Тпл) липида (ов) с самой высокой Тпл.
  3. Рассчитывают объемы липидов, необходимых в соответствии с желаемыми молярных соотношениях липидов. Для изучения ВИЧ-1 Gag связывания здесь, используют следующие мольные соотношения , как показано в таблице 2.
Липидный смесь Молярный коэффициент Объем (в мкл) концентрация Фото
POPC + POPS + Чхоль 46,6 + 23,3 + 30 19,74 + 10,18 + 6,57 POPC, POPS, Чхоль: 10 мг / мл
POPC + POPS + Чхоль + Brain-PI (4,5) P 2 + 8,3 16,11 + 6,25 + 58,19 POPC, POPS, Чхоль: 10 мг / мл
Мозг-PI (4,5) P 2: 1 мг / мл

Таблица 2: Объемы различных липидов использовали для получения GUVs.

  1. Добавьте желаемые объемы липидов в стеклянную ампулу чистую завинчивающейся крышкой.
  2. Используйте ITO покрытием слайды размерами 25 х 50 х 1,1 мм 3 и сопротивление 70-100 Ом (как описано в каталоге). Поместите два слайда ITO-покрытием на чистом столе. Каждая electroformation камера требует двух индий-олово-оксид (ITO) -покрытие стеклянные слайды. Убедитесь в том, что проводящая сторона стекло обращена вверх, проверяя сопротивление с помощью мультиметра. Он должен показать значение приблизительно 200 Ω. Убедитесь, что поверхность скользит чистые, аккуратно протерев с 70% -ным этанолом с использованием безворсовой салфетки.
  3. Очистите внешнюю поверхность иглы шприца Р.И.nsing его хлороформом и поместите шприц на тепловой блок.
  4. Поместите новый ITO покрытием предметное стекло на блоке тепла с проводящей стороной вверх и дайте ему уравновешиваться до нужной температуры обычно около 2-3 мин. Не используйте повторно ITO-покрытые стеклянные слайды для потенциального риска, что ITO-покрытие на стеклах могут быть повреждены во время чистки процедур.
  5. Используйте объем 40-50 мкл липидной смеси для каждого слайда для равномерного и быстрого распространения еще липидов на предметном стекле. Регулировать общую громкость с соответствующим органическим растворителем, таким как хлороформ.
    1. Поместите одну половину от общего объема липидной смеси на предметное стекло и сразу распространить липида с использованием очищенного шприца (шаг 2.6), чтобы оставить однородную липидную пленку (перемещения иглы в 2-3 раза по стеклу). Распространение липидной пленки мягко (но быстро), чтобы избежать повреждения тонкой ITO покрытия. Неравномерное распространение или грубое распространение может привести к неоптимальнойвыходы или вычислительная неоднородность GUVs.
    2. Таким образом, обеспечить равномерное распространение путем проверки липидной пленки после того, как распространилась, прежде чем перейти к следующему шагу. Если помутнение пленки появляется чрезмерно неоднородная, повторить процедуру с помощью нового слайда.
  6. Поместите слайд с покрытием внутри чашки Петри стороной с покрытием лицевой стороной вверх.
  7. Повторите шаги 2.6-2.9 для остальной части смеси, используя другой слайд ИТО покрытием.
  8. Поместите чашку Петри, содержащую оба слайдов в обычной вакуумной усыхание камере в течение 60-90 мин для удаления следов органических растворителей.
  9. Во время этого процесса, установить инкубатор до той же температуры, что и теплового блока (65 ºC в большинстве случаев) и предварительно теплой 300 мМ раствора сахарозы в инкубаторе.
  10. После сушки принести чашку Петри на скамью и поместите предметное стекло на чистую поверхность.
  11. Аккуратно очистить PDMS прокладку (рисунок 1) с использованием 70% этанола и высушить его КомплексыДЕТАЛЬ.
  12. Поместите его на липидный покрытием предметное стекло , как показано на фиг.1 , и мягко и плотно прижмите так, чтобы прокладка образует водонепроницаемого уплотнения. Проверьте отсутствие зазоров между прокладкой PDMS и горкой. Это приводит к образованию мелкой камеры, которая содержит раствор сахарозы.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Компоновка ITO покрытием стекло используется для electroformation Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Заполните камеру с подогретым раствором сахарозы без пузырьков.
  2. Поместите другой слайд с покрытием на вершине, чтобы сделать герметичное уплотнение. Убедитесь в том, что нет никаких пузырей. Окончательная сборка должна выглядеть , как показано на рисунке 2. Закрепить камеры USINг зажимы.

фигура 2
Рис . 2: Схематическое представление electroformation камеры (вид сбоку) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Удалите излишки сахарозы путем аспирации и очистить слайды, используя безворсовые салфетки. Закрепите салазки на медный стержень так, чтобы проводящие стороны находятся в равномерном контакте с баром. Убедитесь, что только одна проводящая часть предметного стекла находится в контакте с одним медным бруском.
  2. Подключите медный стержень к выходу функционального генератора с помощью зажимов-крокодилов. Поместите сборку внутри инкубатора, чтобы позволить сборку уравновешиваться до нужной температуры.
  3. Применение синусоидальной волны частотой 10 Гц и разность потенциалов в 1 В в течение 90 мин. Ensurе , что напряжение 1 V с помощью мультиметра , как показано на рисунке 3. Продолжайте процесс , в течение 90 мин.

Рисунок 3
Рис . 3: Положение , при котором электроды из мультиметра размещаются для измерения частоты и тока Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть большую версию этой фигуры.

  1. Через 90 мин медленно уменьшать частоту до 2 Гц и продолжают electroformation в течение еще 10 мин. За это время сбора урожая в пробирке реакции перевода (шаги 3.1-3.2).
  2. Выключите функцию генератора и дайте сборку остыть до комнатной температуры медленно (путем выключения инкубатора и оставляя инкубатор дверь приоткрытой).
  3. После охлаждения, отсоедините кабели к генераторуиз слайдов сборок. GUVs может быть очень хрупки и поэтому они должны быть обработаны очень аккуратно. Осторожно довести сборку на скамейку запасных.
  4. Разберите камеру, аккуратно удалив верхний слайд с помощью щипцов. Урожай сахарозы суспензию, содержащую GUVs, используя вырезать 1000 мкл наконечник и перенос в чистую пробирку. Ручка трубки осторожно, чтобы предотвратить разрушение GUVs.
  5. немедленно Используйте GUVs. GUVs стабильны в течение по крайней мере, через 90 мин после сбора урожая при хранении при комнатной температуре.

3. Реакции Harvest In Vitro Translation

  1. Заготавливают реакции перевода в пробирке , содержащие нужные белки из красной камеры с помощью микропипетки в трубку.
  2. Для удаления агрегированных белков, спина лизаты в 16200 мкг в течение 15 мин на центрифуге и настольным осторожно перенести надосадочную жидкость в другую пробирку.

4. GUV Анализ на связывание

  1. Использование вырезать наконечник, смешать 51; л реакций перевода в пробирке , содержащих переведенных белков и 5 мкл GUVs в трубке и инкубировать при комнатной температуре в течение 2-3 мин.
  2. Приложить PDMS лист с небольшим отверстием (диаметром 3-4 мм) на чистую покровным и обеспечить герметичное уплотнение, аккуратно и плотно прижимая его к покровным.
  3. Поместите 10 мкл смеси со стадии 4.1 в маленькое отверстие.
  4. Изображение смесь под инвертированным эпи или конфокальной флуоресцентной микроскопии при комнатной температуре.
    Примечание: Для того, чтобы предотвратить испарение, изображения камеры может быть покрыта покровным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя вышеупомянутый протокол, мы подготовили GUVs состоящие из POPC + POPS + Чхором (мольное отношение: 4,66: 2,33: 3). Эта композиция была выбрана приблизительно отражают концентрацию PS и холестерина ПМ. Надежный и эффективное связывание Gag наблюдалось только тогда , когда мозг-PI (4,5) P 2 был включен в смесь POPC + POPS + Чхоль (PI-мозга (4,5) P 2 [молярное отношение POPC + POPS + Чхоль + : 4: 2: 3: 1] в этом примере) (рис 4, сравнить панели в и D с а и с). Затычка-YFP связывание с GUVs , состоящих из POPC + POPS + Чхор + энцефалий-PI (4,5) P 2 видно по увеличению интенсивности флуоресценции на поверхности мембраны. Это увеличение можно также увидеть в профилях интенсивности флуоресценции (рис 4, внизу) вдоль линии , пересекающей границу ГУВ (XX 'на рисунке 4C и D).

нагрузка / 54293 / 54293fig4.jpg "/>
Рисунок 4: Gag связывается с брейн-PI (4,5) P 2 -contianing GUVs Конфокальный сечение POPC + ШИПУЧЕК + Чхоль и С) и POPC + ШИПУЧЕК + холь + PI (4,5) P 2. GUVs (B и D). Распределение Gag-YFP отображается зеленым цветом. Увеличенные изображения выбранных GUVs (желтые коробки) показаны в панели C и D. Интенсивность флуоресценции профилей вдоль случайно выбранных линий, нарисованных пересечь противоположные стороны GUVs (X в X ') показаны ниже изображения. Bar = 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ связывания ГУВ, как описано выше, обеспечивает хорошую альтернативу в сценариях, где другие белково-липидных анализы взаимодействия имеют свои ограничения. Этот анализ позволяет изучить взаимодействие между myristoylated полнометражного Gag и кислых липидов с носителями длины ацильных цепей в контексте липидного бислоя и сделать это без длительных флотационного центрифугирования через высокой плотности градиентов сахарозы или других после связывания обработки ГАГ-липида комплексы. Еще одно преимущество состоит в том, что поведение Gag может быть рассмотрен в сложной смеси (например, в присутствии цитозольных компонентов), которое не легко достигается в других методах в режиме реального времени , такие как поверхностного плазмонного резонанса на основе анализов. Таким образом, можно утверждать, что анализ, описанный здесь позволяет проводить оценку в реальном времени Затычка-кислотных липидных взаимодействий в более нативного контексте, чем другие анализы, используемые в этой области.

Тем не менее, существуют ограничения, связанные с методом,Что ж. Для того, чтобы гарантировать , что GUVs в данном препарате имеют сходный состав друг к другу и к исходной смеси, electroformation должны быть выполнены значительно выше температуры перехода липидов , которые имеют самую высокую температуру перехода , присутствующего в смеси 25,26. Тем не менее, возможно , что воздействие липидов до более высоких температур в течение длительного времени может привести к липидной пробой 25,27. Поэтому, чтобы контролировать качество GUVs, в дополнение к визуальным осмотром позволило включением флуоресцентных липидных красителей (например, DiD), желательно , чтобы проверить функциональность липида интереса [например, PI (4,5) P 2 ] с использованием липидной-специфического зонда. Кроме того, с ГУВ композиций, которые приводят к разделению фаз при определенной температуре, необходимо соблюдать осторожность, чтобы точно поддерживать желаемую температуру при наблюдении взаимодействия белка-ГУВ. Другим ограничением является то, что растворы высокой ионной силы несовместимы с электроПротокол формирования , описанный здесь, и , следовательно , GUVs выращивают и выдерживают в 300 мМ растворе сахарозы 26. Примечательно, однако, некоторые исследования успешно использовали буферы при физиологических значениях ионной силы в их модифицированных протоколов electroformation 28.

Одним из наиболее важных аспектов является количество Gag. Система лизат на основе ретикулоцитов кролика часто используется для получения полноразмерного ВИЧ-1 Gag в липосомная флотационных анализах. Тем не менее, количество YFP-меченый полнометражного Gag, полученные в этой системе была недостаточной для визуализации Gag связывания с GUVs. Для решения этой проблемы, то зародыши пшеницы лизат на основе бесклеточной системы транскрипции-трансляции, которая дает примерно в 8-10 раз более высокое количество Gag, был использован в текущем тесте. Тем не менее, если необходимо выполнить в отсутствие эукариотических компонентов клеточных лизатов GUV экспериментов по связыванию, можно использовать очищенные белки, меченные флуорофором, как это было сделано недавно (описано ниже).

Было показано , что конкретные и эффективное связывание Gag с мембранами является совместный процесс регулируется различными факторами , такими как миристат, РНК, липидов и полярных головных групп ацильных цепей и Затычка-Gag взаимодействий (обзор в ссылке 29). Система в пробирке описать здесь может быть продлен по решению роли факторов по отдельности или в комбинации , чтобы понять последовательность событий в кооперативном процессе связывания Gag мембраны. До сих пор, описанная система анализа выяснены неожиданную роль ненасыщенными PI (4,5) P 2 ацильных цепей в связывание Gag , но не то, что канонической млекопитающее-клеточного происхождения PI (4,5) P 2 -связывающим домен ( pleckstrin гомологии домен фосфолипазы с дельта 1) 24, нахождения , которые не были выявлены с помощью липосомная флотационных анализов. GUV на основе системы анализа также использовались, чтобы понять другие аспекты Gag биологии. Использование Gag производного, содержащего искусственный индуцируемый Сбщ MMSerization мотив и GUVs с плота, как и не плоту подобными доменами, Келлер и др. исследовали взаимосвязь между Gag разделения на "плоту типа" домены и мультимеризация 30. Исследование, проведенное Карлсона и др. Использовал систему ГУВ и очищенную и флуоресцентно меченого Gag понять последовательный порядок набора различных комплексов эндосомальных сортировки , необходимых для транспортировки (ESCRT) белков с помощью мембраносвязанного Gag 31. В последнее время , в другом исследовании сообщалось воссоздание процесса многообещающий везикул Gag-индуцированной на GUV с использованием Gag сопряженную с флуорофором 32. ВИЧ-1 Gag мультимеризация приводит к образованию подмембранное Gag решетки, которая считается кривой мембраны во время сборки. Таким образом, с дальнейшим совершенствованием в системах анализа Gag-ГУВ, взаимосвязь между изменениями мембраны кривизны и Gag мембраны связывания, которая, возможно, менее хорошо понимал аспект сборки ВИЧ, можно проанализировать, как это делается FOг других клеточных кривизну-светочувствительных белков 33.

Таким образом, с использованием этого протокола, можно получить достаточное количество myristoylated полнометражного Gag и визуализировать Затычка связывания с ГУВ мембран. Этот протокол может быть дополнительно разработаны для изучения различных стадий ВИЧ-1 сборки и многообещающий процессов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Мохаммад Салем, Цзинь Ву и Кришнан Рагунатан за полезные обсуждения. Мы также благодарим прия Begani за помощь во время съемок. Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов R01 AI071727 (для АО) и R01 GM110052 (для SLV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Meterman 30XR A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator Instek GFG-8216A A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO CG-90IN
Incubator Hoefer Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber Nalgene
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Syringe Hamilton 80400 Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit BiotechRabbit,
Berlin, Germany
BR1401001
DiD Life Technologies, Carlsbad, CA  D7757
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL  850457C
POPS Avanti Polar Lipids 840034C
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700041P
Brain-PI(4,5)P2  Avanti Polar Lipids 840046X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87, (12), 7155-7159 (2013).
  2. Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (4), 1600-1605 (2010).
  3. Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82, (5), 2405-2417 (2008).
  4. Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68, (4), 2556-2569 (1994).
  5. Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (41), 14889-14894 (2004).
  6. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  7. Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45, (13), 4077-4083 (2006).
  8. Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (9), 3525-3530 (2013).
  9. Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49, (25), 5109-5116 (2010).
  10. Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87, (11), 6441-6454 (2013).
  11. Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85, (8), 3802-3810 (2011).
  12. Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5, (6), e02202 (2014).
  13. Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18, (1), 9-16 (2010).
  14. Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), 18761-18766 (2012).
  15. Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87, (24), 13598-13608 (2013).
  16. Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83, (23), 12196-12203 (2009).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42, (2), 125-130 (2005).
  18. Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27, (13), 4668-4673 (1988).
  19. Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (1), 239-243 (1980).
  20. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
  21. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
  22. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (12), 4697-4702 (2008).
  23. Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277, (17), 3596-3607 (2010).
  24. Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89, (15), 7861-7873 (2015).
  25. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798, (7), 1324-1332 (2010).
  26. Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
  27. Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91, (6), 2172-2183 (2006).
  28. Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
  29. Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
  30. Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15, (2), 237-247 (2013).
  31. Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (42), 16928-16933 (2012).
  32. Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41, (2), 135-149 (2015).
  33. Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics