تصور HIV-1 الكمامة ملزم لالعملاق Unilamellar الحويصلة (GUV) الأغشية

1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School, 2Department of Biophysics, University of Michigan
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (113), e54293, doi:10.3791/54293 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البروتين الهيكلي للHIV-1، Pr55 الكمامة (أو الكمامة)، بربط غشاء البلازما في الخلايا أثناء عملية التجميع الفيروس. غشاء ملزمة من الكمامة هو خطوة أساسية لتكوين جسيمات الفيروس، منذ وجود خلل في نتائج ملزمة غشاء الكمامة في انخفاض حاد في إنتاج الجسيمات الفيروسية. للحصول على تفاصيل الميكانيكية للتفاعلات غشاء الكمامة-الدهون، في المختبر أساليب تعتمد على الرنين المغناطيسي، البصمة البروتين، سطح مأكل الرنين، الطرد المركزي الحويصلية التعويم، أو حبة مضان الدهون ملزمة تم وضعها حتى الآن. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب في المختبر لها حدودها. للتغلب على بعض هذه القيود وتوفير نهج متكامل لطرق المحددة سابقا، قمنا بتطوير فحص في المختبر الذي التفاعلات بين HIV-1 الكمامة والأغشية الدهنية تتم في بيئة "تشبه الخلايا". في هذا الاختبار، الكمامة ملزمة لالأغشية الدهنية وبصريا تحليلها باستخدام YFP-taggeد الكمامة توليفها في القمح الجرثومية والتى ترتكز في نظام الترجمة المختبر وGUVs بواسطة تقنية electroformation أعد. نحن هنا وصف الخلفية وبروتوكولات للحصول على myristoylated كامل طول البروتينات الكمامة والأغشية GUV اللازمة للفحص والكشف عن الكمامة-GUV ملزمة بواسطة المجهر.

Introduction

نقص المناعة البشري نوع الفيروس 1 (HIV-1) هو فيروس يلفها أن تجمع في والبراعم من غشاء البلازما (بعد الظهر) في معظم أنواع الخلايا. هو الدافع وراء تجميع جزيئات الفيروس HIV-1 من 55 كيلو دالتون البروتين الأساسية فيروسي يسمى Pr55 الكمامة (الكمامة). ويتم تصنيع هفوة كما polyprotein السلائف تتألف من أربعة مجالات هيكلية رئيسية، وهي مصفوفة، القفيصة، قفيصة منواة، وP6، وكذلك الببتيدات اثنين فاصل SP1 و SP2. وخلال الاجتماع، ومصفوفة (MA) للنطاق هو المسؤول عن استهداف الكمامة إلى موقع التجمع، قفيصة (CA) نطاق يتوسط التفاعلات الكمامة الكمامة، وقفيصة منواة (NC) نطاق المجندين RNA الجيني الفيروسي، والعوامل المضيفة P6 المجندين أن المعونة فيروس الجسيمات انفصال من غشاء البلازما. كما يخضع هفوة تعديل المشارك متعدية من خلال إضافة الأحماض الدهنية-14 الكربون أو شاردة ميريستات في دورته N-محطة.

غشاء ملزمة من الكمامة شرط أساسي لتجميع الفيروسي، منذ مترutants التي هي معيبة في غشاء ملزمة تفشل في إنتاج جزيئات الفيروس. نحن وآخرون قد أظهرت أن غشاء ملزمة من الكمامة بوساطة إشارات ثنائية في مجال MA: شاردة ميريستات N-الطرفية التي تتوسط التفاعلات الطاردة للماء مع طبقة ثنائية الدهون ومجموعة من بقايا الأساسية في المجال MA توصف بأنها المنطقة الأساسية للغاية ( دورية هارفارد) التي تتفاعل مع الدهون الحمضية على رئيس الوزراء 1-4. دراسات الكمامة غشاء التفاعلات باستخدام التعبير خارج الرحم من polyphosphoinositide 5 الفوسفاتيز الرابع (5ptaseIV)، وهو الإنزيم الذي يحفز التحلل من phosphatidylinositol- فوسفورية الحمضية PM محددة (4،5) -bisphosphate [PI (4،5) ف 2] لفوسفتيدلينوستول-4-الفوسفات، في الخلايا اقترح أن الكمامة-PM توطين بوساطة PI (4،5) ف 2 3،5. ومع ذلك، في الدراسات المختبرية التي تهدف إلى فهم المزيد من التفاصيل الميكانيكية للالكمامة-PI (4،5) ف أثبتت 2 التفاعلات ليكون تحديا لعدد من الأسباب. إلىسبيل المثال، كان تنقية كامل طول myristoylated HIV-1 الكمامة لإجراء التجارب الكيميائية الحيوية الصعب من الناحية الفنية على الأقل جزئيا بسبب ميل الكمامة لتجميع خلال تنقية. وبالتالي، أشكال اقتطاع من HIV-1 الكمامة، مثل MYR-MA أو MYR-MA-CA، أو شكل غير myristoylated تم يكثر استخدامها في الدراسات التي تتطلب تنقية الكمامة (على سبيل المثال، الرنين المغناطيسي النووي والبروتين البصمة، والسطحية مأكل صدى 6-9). بدلا من ذلك، بالإضافة إلى ردود فعل النسخ الترجمة المختبر قد استخدمت لانتاج كامل طول myristoylated HIV-1 الكمامة في الدراسات البيوكيميائية أخرى 1،2. عادة في هذا النظام، يتم نسخه البلازميد الكمامة ترميز وترجمتها مع لست] خلية حقيقية النواة (على سبيل المثال، لست] أرنب الخلايا الشبكية) أن تخلو من أي الأغشية الخلوية والرنا المرسال ولكنها تحتوي على آلات النسخ والترجمة. بعد رد الفعل، لست] الخلية التي تحتوي الكمامة تختلط معيmbranes لتحليل التفاعلات الكمامة مع الدهون. بالإضافة إلى سهولة إعداد كامل طول myristoylated الكمامة، وأساليب استخدام في المختبر نظام الترجمة النسخ لديها ميزة أن التوليف الكمامة وردود الفعل ملزمة غشاء لاحق تحدث في "حقيقيات النوى مثل العصارة الخلوية 'الوسط التي قد تمثل أفضل الظروف الفسيولوجية. وساهمت هذه الخاصية إلى الدراسات التي أظهرت أن جزيئات الحمض النووي الريبي بد أن المجال MA تنظم الكمامة ملزم الدهون الحمضية بطريقة تنافسية 1،2،10-12. ومع ذلك، منذ المبلغ الإجمالي من البروتينات الكمامة التي تم الحصول عليها في هذه الخلية لست] ليست عالية، ووضع العلامات التمثيل الغذائي للبروتينات مع الأحماض الأمينية رديولبلد ضروري للكشف عنها.

اعتمادا على طريقة لقياس التفاعلات الكمامة-الدهون، وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الاستعدادات الغشاء. كل من هذه الطرق لها قوتها والقيود. تتطلب معظم فحوصات الرنين المغناطيسي النووي استنادا-استخدام الدهون مع أسيل قصيرةالسلاسل التي هي للذوبان في الماء (على سبيل المثال، C4- وC8-PI (4،5) ف 2) 6،8. بينما الأساليب الرنين المغناطيسي النووي لاختبار ملزمة من الكمامة على الدهون التي لديها سلاسل أسيل طويلة وجدت في خلايا يجري تطويرها، وأنها لم تستخدم إلا مع MA myristoylated أو nonmyristoylated حتى الآن 8،13. بدلا من ذلك، تم استخدام الجسيمات الشحمية المحضرة من الدهون التي لديها سلاسل طول أسيل الأم في الطرق الحيوية مثل تعويم الحويصلية أو الفلورسنت الحويصلية حبة المقايسات ملزمة 2،3،10،14-16. ومع ذلك، الجسيمات الشحمية المستخدمة في هذه المقايسات لها أقطار صغيرة، وبالتالي الأغشية يكون انحناءات حادة وإيجابية. في المقابل، خلال المرحلة المبكرة من تجميع الجسيمات في الخلايا المصابة HIV-1، الكمامة بربط PM، التي مستو تقريبا على مقياس من الكمامة، وبعد ذلك يدفع انحناء سلبي خلال مهدها. لذلك، قد الأغشية الحويصلية مع انحناء حاد وإيجابي لا تكون طبقات ثنائية الدهون مثالية لدراسة التفاعلات الكمامة الدهون. أما بالنسبة FLOT الحويصليةالمقايسات أوجه، التحذير محتمل آخر هو أن التعرض المجمعات الكمامة-الدهون إلى التدرج السكروز مفرط التوتر أثناء الطرد المركزي قد تؤثر على نتائج تجريبية. لتخفيف هذه القيود وتوفير نظام تجريبي مكملة، تم وضع المقايسات لالكمامة ملزمة لالحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) في السنوات الأخيرة. GUVs هي واحدة الحويصلات الدهون طبقة ثنائية التي تمتد إلى عدة عشرات ميكرومتر الأقطار. وهكذا، فإن انحناء هذه الأغشية يشبه PM على مقياس من الكمامة. وعلاوة على ذلك، نظرا لحجمها الكبير، والتي تمكن الفحص البصري تحت المجاهر الضوئية، غشاء ملزمة البروتينات الكمامة من الموسومة fluorescently أو المسمى لهذه الحويصلات على أن تحدد بسهولة من دون معالجة لاحقة من المجمعات الكمامة-الدهون خلط.

نحن هنا وصف البروتوكول لدراسة HIV-1 الكمامة غشاء ملزمة باستخدام GUVs تم الحصول عليها من طريقة electroformation. أساليب مختلفة مثل ترطيب لطيف، بمساعدة جل الترطيب، هيئة التصنيع العسكريوقد استخدمت النفث rofluidic، وelectroformation 17-22 للحصول على GUVs. لبروتوكول الموصوفة هنا، يتم استخدام طريقة electroformation في المقام الأول بسبب كفاءتها في تشكيل GUVs مع الدهون الحمضية وسهولة النسبية للاستخدام دون الحاجة إلى الاجهزة باهظة الثمن. منذ التصور من الكمامة يستوجب مراسل فلوري، يضاف الأصفر بروتين فلوري (YFP) وراثيا إلى C-محطة من الكمامة (GAG-YFP). ويتم الحصول على البروتينات هفوة-YFP من النسخ في المختبر والترجمة ردود الفعل في لست] جرثومة القمح على أساس تدفق التكنولوجيا التبادل المستمر مستمرة (CECF). في هذه التكنولوجيا، وتتحقق على حد سواء إزالة المخلفات المثبطة لردود الفعل وتوريد ركائز التفاعل ومكونات الطاقة في آلية القائم على غسيل الكلى. لردود الفعل هذه، يتم استخدام ترميز البلازميد الكمامة-YFP تحت سيطرة أحد المروجين T7. وتجدر الإشارة، كما هو مبين في وقت سابق، لست] جرثومة القمح تدعم myristoylation دون مكونات إضافية 23،24. باستخدام هذه الطريقة، فقد كان من الممكن الحصول على كميات كافية من كامل طول myristoylated الكمامة-YFP لرؤية الكمامة على الأغشية GUV 24. نحن هنا تصف البروتوكول الذي HIV-1 الكمامة ملزمة لPI (4،5) ف 2 المحتوية على الأغشية GUV يمكن دراستها دون معالجة لاحقة طويلة بعد ردود الفعل ملزمة وأقترح أن هذه الطريقة يكمل قبل الإيجاد الكمامة غشاء المقايسات ملزمة ويمكن أن يكون مدد لمزيد من فهم HIV-1 الكمامة غشاء ملزمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يوم 1: التعبير عن البروتينات الكمامة عن طريق ومقرها المحللة-جرثومة القمح في المختبر النسخ، ترجمة النظام

1. إعداد HIV-1 الكمامة

  1. إزالة كافة الكواشف من جرثومة القمح عدة CECF التجارية من المجمدات (يتم تخزين لست] جرثومة القمح في -80 درجة مئوية، الكواشف الأخرى في -20 درجة مئوية). ذوبان الجليد منهم على الجليد وتخلط المكونات كما هو مبين في الجدول رقم 1.
مزيج 1 (تغذية مزيج)
حل التغذية 900 ميكرولتر
أحماض أمينية 80 ميكرولتر
ميثيونين 20 ميكرولتر
مجموع 1000 ميكرولتر
مزيج 2 (المحللة مزيج)
لست] بذرة الحنطة 15 ميكرولتر
ريبونوكلياز المياه مجانا 7 ميكرولتر
أحماض أمينية 4 ميكرولتر
ميثيونين 1 ميكرولتر
DNA البلازميد في المخزن TE (1 ميكروغرام / ميكرولتر) ** 4 ميكرولتر
رد فعل العازلة 15 ميكرولتر
RNasin * 4 ميكرولتر
مجموع 50 ميكرولتر

الجدول 1: الأغاني من الخلطات المطلوبة لردود الفعل جنين القمح.
ملاحظة: اذا كان الهدف من التجربة لدراسة تأثير إزالة الحمض النووي الريبي ريبونوكلياز على غشاء الكمامة ملزمة، استبدال مثبطات ريبونوكلياز مع ريبونوكلياز خالية من المياه. يجب أن يكون DNA البلازميد خالية من الشوائب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ومع ذلك، صأعد lasmids باستخدام التقليدية، ولكن لا يخلو الذيفان الداخلي، مجموعات البلازميد العزلة استخدمت بنجاح. يوصي تعليمات الشركة المصنعة أيضا باستخدام الحمض النووي المذاب في الماء nuclease خالية. في حالة استخدام الحمض النووي مع وقف التنفيذ في الشركة المصرية للاتصالات [10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة) التي تحتوي على 1 ملم EDTA]، وتجنب استخدام تركيزات أقل من الحمض النووي، منذ EDTA في الشركة المصرية للاتصالات قد تؤثر على العائد. وقد تم بنجاح استخدام البلازميدات الذائبة في TE العازلة في مجموعة تركيز 0،8-1 ميكروغرام / ميكرولتر.

  1. أولا إضافة تغذية خليط (مزيج-1) في كاسيت رد فعل (غرفة شفافة). ثم يضاف مزيج المحللة (ميكس 2) إلى غرفة أخرى (الحمراء). لا يعرض أي فقاعات مع إضافة خليط إلى غرف كل منها، لأن ذلك قد يؤدي إلى صرف فعالة من مكونات الحل، وبالتالي يقلل من كفاءة التفاعل.
  2. تغطية الدوائر مع فيلم لاصق المقدمة مع عدة.
  3. إدراج الكاسيت رد فعل في حامل الكاسيت وincubaالشركة المصرية للاتصالات التجمع لمدة 24 ساعة على 24 درجة مئوية في سرعة اهتزاز ثابتة من 900 دورة في الدقيقة في إيبندورف thermomixer R.

يوم 2: إعداد GUVs التي كتبها Electroformation وحصاد القمح جرثومة لست]

2. إعداد GUVs

  1. الدهون قسامة يذوب في المذيبات العضوية مثل الكلوروفورم أو خليط من الكلوروفورم والميثانول في قوارير زجاجية مع قبعات المسمار اصطف مع المتشددين تفلون وملفوفة مع بارافيلم. التعامل مع الدهون مع الحقن الزجاجية هاميلتون من نوع، أو إذا كان متوفرا، نصائح بلاستيكية مقاومة للالكلوروفورم. أخرج قارورة زجاجية تحتوي على الدهون لاستخدامها في إعداد GUV من درجة مئوية الفريزر -20.
    1. مرة واحدة يتم معايرتها قارورة لدرجة حرارة الغرفة، تأكد من الفحص البصري أن تعليق الدهون واضحة. نوعية الدهون، وخاصة الدهون الحمضية، مثل فسفاتيديل-بالميتويل oleoyl (POPS) و PI (4،5) ف مهم للتجارب الناجحة. لا تستخدم الدهون التي هيفي قسامات لفترة أطول من 2 أشهر.
  2. قبل تدفئة كتلة الحرارة إلى درجة الحرارة المطلوبة. ويجب أن تكون درجة الحرارة هذه 5 درجة مئوية على الأقل أعلى من درجة حرارة انصهار (T م) من المادة الدهنية (s) مع أعلى T م.
  3. حساب كميات الدهون اللازمة وفقا لنسب الدهون المولي المطلوب. لدراسة HIV-1 الكمامة ملزم هنا، استخدام النسب المولية التالية كما هو مبين في الجدول رقم (2).
مزيج الدهن نسبة المولي حجم (في ميكرولتر) تركيز الأسهم
POPC + POPS + تشول 46.6 + 23.3 + 30 19.74 + 10.18 + 6.57 POPC، الملوثات العضوية الثابتة، تشول: 10 ملغ / مل
POPC + POPS + شول + الدماغ-PI (4،5) ف 2 16.11 + 8.3 + 6.25 + 58.19 POPC، الملوثات العضوية الثابتة، تشول: 10 ملغ / مل
الدماغ-PI (4،5) ف 2: 1 ملغ / مل

الجدول 2: وحدات التخزين من الدهون المختلفة المستخدمة للحصول على GUVs.

  1. إضافة الكميات المطلوبة من الدهون في قارورة زجاجية المغطاة المسمار نظيفة.
  2. الشرائح ذات أبعاد 25 × 50 × 1.1 ملم 3 والمقاومة 70-100 Ω (كما هو موضح في الكتالوج) استخدام ايتو المغلفة. وضع شريحتين المغلفة ايتو على مقاعد البدلاء نظيفة. يتطلب كل غرفة electroformation اثنين الإنديوم وأكسيد القصدير (ايتو) الشرائح الزجاجية المغلفة. تحقق من أن الجانب موصل من شريحة زجاجية يكون مواجها لها عن طريق التحقق من المقاومة باستخدام المتعدد. يجب أن تظهر قيمتها حوالي 200 Ω. تأكد من سطح الشرائح نظيفة عن طريق المسح برفق مع 70٪ من الإيثانول باستخدام مناديل خالية من الوبر.
  3. تنظيف السطح الخارجي للإبرة حقنة بواسطة ريnsing مع الكلوروفورم ووضع حقنة في كتلة الحرارة.
  4. وضع شريحة زجاجية المغلفة ايتو جديدة على كتلة الحرارة مع الجانب موصل مواجهة والسماح لها لكي تتوازن إلى درجة الحرارة المطلوبة عادة حوالي 2-3 دقائق. لا إعادة استخدام الشرائح الزجاجية المغلفة ايتو لخطر محتمل أن ايتو طلاء على الشرائح الزجاجية قد يكون معطوبا أثناء التنظيف الإجراءات.
  5. استخدام حجم 40-50 ميكرولتر من خليط الدهن لكل شريحة على الزي المدرسي وبعد سريعة الانتشار من الدهون على شريحة زجاجية. ضبط الحجم الكلي مع مذيب عضوي مناسب مثل الكلوروفورم.
    1. ضع نصف الحجم الكلي للخليط الدهن على شريحة زجاجية وانتشر كالنار في الهشيم الدهون باستخدام حقنة تنظيف (الخطوة 2.6) إلى ترك الفيلم الدهون موحد (تحريك الإبرة 2-3 مرات عبر الشريحة). نشر فيلم الدهون بلطف (ولكن سرعان ما) لتجنب أي ضرر للطلاء ايتو رقيقة. غير موحدة نشر أو خشنة نشر قد تؤدي إلى دون المستوى الأمثلعوائد أو عدم التجانس الحسابية من GUVs.
    2. لذلك، تأكد من انتشار موحد عن طريق التفتيش الفيلم الدهون بعد نشر قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. إذا كان التعتيم من الفيلم يبدو مفرط غير موحدة، إعادة الإجراء باستخدام شريحة جديدة.
  6. ضع الشريحة المغلفة داخل طبق بيتري مع الجانب المغلفة مواجهة.
  7. كرر الخطوات من 2،6-2،9 لبقية الخليط باستخدام شريحة أخرى المغلفة ايتو.
  8. وضع طبق بتري تحتوي على كل الشرائح في فراغ الغرفة تجفيف التقليدية ل60-90 دقيقة لإزالة أي أثر للمذيبات العضوية.
  9. وخلال هذه العملية، تعيين حاضنة لنفس درجة الحرارة كما ان من كتلة الحرارة (65 درجة مئوية في معظم الحالات)، وقبل الدافئة 300 ملي حل السكروز في الحاضنة.
  10. بعد التجفيف، ليصبح طبق بتري على مقاعد البدلاء ووضع شريحة زجاجية على سطح نظيف.
  11. تنظيف بلطف طوقا PDMS (الشكل 1) باستخدام الايثانول 70٪ والجافة عليه مجمعاتtely.
  12. وضعه على الشريحة الزجاجية المغلفة الدهون كما هو مبين في الشكل (1) وبلطف وبحزم اضغط بحيث أشكال طوقا ختم ضيق المياه. تأكيد غياب وجود فجوات بين طوقا PDMS والشرائح. وهذا يؤدي إلى تشكيل غرفة الضحلة التي تتولى حل السكروز.

شكل 1
الشكل 1: تخطيط الشريحة الزجاجية المغلفة ايتو المستخدمة لelectroformation الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تملأ الغرفة مع محلول السكروز قبل تحسنت دون أي فقاعات.
  2. ضع الشريحة المغلفة أخرى على رأس لجعل ختم مشددة. تأكد من عدم وجود فقاعات. يجب أن تظهر التجميع النهائي كما هو موضح في الشكل (2). ربط النقيب الغرفةمقاطع ز الموثق.

الشكل 2
الشكل 2: تمثيل تخطيطي للغرفة electroformation (عرض الجانب) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إزالة السكروز الزائد عن طريق الطموح وتنظيف الشرائح باستخدام مناديل خالية من الوبر. ربط الشرائح إلى شريط النحاس بحيث الجانبين الموصلة على اتصال موحدة مع شريط. ضمان أن واحدا فقط الجانب موصل من شريحة زجاجية في اتصال مع شريط النحاس واحد.
  2. ربط شريط النحاس إلى الإخراج وظيفة مولد باستخدام مقاطع التمساح. وضع التجمع داخل الحاضنة للسماح للجمعية لكي تتوازن إلى درجة الحرارة المطلوبة.
  3. تطبيق تردد موجة جيبية من 10 هرتز وفرق الجهد من 1 الخامس لمدة 90 دقيقة. يكفل له أن الجهد 1 الخامس قبل المتعدد كما هو مبين في الشكل (3). مواصلة عملية لمدة 90 دقيقة.

الشكل (3)
الرقم 3: مواقف التي توضع الأقطاب من متعدد لقياس التردد والتيار الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. بعد 90 دقيقة، وانخفاض ببطء وتيرة إلى 2 هرتز ومواصلة electroformation لمدة 10 دقيقة أخرى. خلال هذا الوقت، والحصاد في التفاعلات الترجمة المختبر (الخطوات 3،1-3،2).
  2. إيقاف المولد وظيفة، والسماح للجمعية ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة ببطء (عن طريق إيقاف الحاضنة وترك الباب حاضنة فتحت قليلا).
  3. بعد التبريد، وقطع الكابلات إلى المولدمن المجالس الشرائح. GUVs قد تكون هشة جدا، وبالتالي تحتاج إلى التعامل معها بلطف شديد. جلب بعناية التجميع إلى مقاعد البدلاء.
  4. تفكيك الغرفة عن طريق إزالة بلطف الشريحة العليا باستخدام ملقط. حصاد تعليق يحتوي GUVs السكروز باستخدام قطع 1000 ميكرولتر طرف ونقل إلى أنبوب نظيفة. التعامل مع أنبوب بلطف لمنع تعطيل GUVs.
  5. استخدام GUVs على الفور. GUVs مستقرة لمدة 90 دقيقة على الأقل بعد الحصاد عند تخزينها في درجة حرارة الغرفة.

3. ردود الفعل الحصاد في المختبر الترجمة

  1. حصاد في المختبر ردود فعل الترجمة التي تحتوي البروتينات المطلوبة من الغرفة الحمراء باستخدام micropipette في أنبوب.
  2. لإزالة البروتينات المجمعة، وتدور لست] في 16200 x ج لمدة 15 دقيقة على جهاز للطرد المركزي الطاولة ونقل بعناية طاف في أنبوب آخر.

4. GUV الفحص تجليد

  1. باستخدام قطع طرف، مزيج 51؛ ل في المختبر ردود فعل الترجمة التي تحتوي البروتينات ترجمتها و5 ميكرولتر من GUVs في أنبوب ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقيقة.
  2. إرفاق ورقة PDMS مع وجود ثقب صغير (مم 3-4) على زلة غطاء نظيف وضمان ختم مشددة من قبل بلطف وبحزم الضغط عليه ضد ساترة.
  3. ضع الخليط 10 ميكرولتر من الخطوة 4.1 في حفرة صغيرة.
  4. صورة الخليط تحت epi- أو متحد البؤر مضان المجهر المقلوب في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: لمنع التبخر، غرفة التصوير يمكن أن تغطيها ساترة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام بروتوكول أعلاه، نحن على استعداد GUVs تتألف من POPC + POPS + تشول (نسبة المولي: 4.66: 2.33: 3). وقد تم اختيار هذا التكوين لتعكس تقريبا PS والكوليسترول تركيزات PM. وقد لوحظ قوية وفعالة ملزمة من الكمامة فقط عندما-PI الدماغ (4،5) أدرج ف 2 إلى الخليط POPC + POPS + تشول (POPC + POPS + شول + الدماغ-PI (4،5) ف 2 [نسبة المولي : 4: 2: 3: 1] في هذا المثال) (الشكل 4، مقارنة وحات B و D مع ألف وجيم). هفوة-YFP ملزمة لGUVs تتألف من POPC + POPS + شول + الدماغ-PI (4،5) ف 2 هو واضح من خلال الزيادة في كثافة مضان على سطح الغشاء. هذه الزيادة يمكن أن ينظر أيضا في التشكيلات كثافة مضان (الشكل 4، أسفل) على طول خط عبور الحدود GUV (XX 'في الشكل 4C و D).

تحميل / 54293 / 54293fig4.jpg "/>
الشكل 4: الكمامة بربط الدماغ-PI (4،5) ف 2 -contianing GUVs والمقطع العرضي متحد البؤر من POPC + POPS + تشول (A و C) وPOPC + POPS + شول + PI (4،5) ف 2. GUVs (B و D). ويرد توزيع الكمامة-YFP باللون الأخضر. وأظهرت صور مكبرة للGUVs مختارة (صناديق صفراء) في لوحات جيم ودال الإسفار كثافة لمحات على طول خطوط اختيارها عشوائيا الانتباه إلى عبور طرفي نقيض من GUVs (X إلى X ') وترد أدناه الصور. شريط = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مقايسة ملزمة GUV على النحو المبين أعلاه يوفر بديلا جيدا في سيناريوهات حيث لديها أخرى المقايسات التفاعل البروتين الدهني حدودها. هذا الاختبار يسمح لنا لدراسة التفاعلات بين myristoylated الكمامة كامل طول والدهون الحمضية مع سلاسل أسيل طول الأم في سياق الدهون طبقة ثنائية وتفعل ذلك دون الطرد المركزي تعويم طويلة من خلال التدرجات السكروز عالية الكثافة أو غيرها بعد تجهيز الملزم الكمامة-الدهون المجمعات. ميزة أخرى هي أن سلوك الكمامة يمكن فحص في خليط معقد (على سبيل المثال، في وجود مكونات عصاري خلوي)، وهو ما لا يتحقق بسهولة في تقنيات في الوقت الحقيقي الأخرى مثل فحوصات القائم على الرنين مأكل السطح. لذلك، يمكن للمرء أن يجادل بأن مقايسة الموصوفة هنا يمكن تقييم في الوقت الحقيقي من التفاعلات الدهون الكمامة الحمضية في سياق أكثر الأصلي من المقايسات الأخرى المستخدمة في هذا المجال.

ومع ذلك، هناك القيود المرتبطة الأسلوب كماحسنا. لضمان أن GUVs في إعداد تعطى لها تركيبة مشابهة لبعضها البعض، وإلى الخليط الأصلي، ويجب أداء electroformation أعلى بكثير من درجة حرارة التحول من الدهون التي لديها أعلى درجة حرارة التحول في المزيج 25،26. ومع ذلك، فمن الممكن أن التعرض للدهون للارتفاع درجات الحرارة لوقت أطول قد يؤدي إلى انهيار الدهون 25،27. لذلك، لمراقبة نوعية GUVs، بالإضافة إلى الفحص البصري مكن إدراج الأصباغ الدهون فلوري (على سبيل المثال، لم)، فمن المستحسن لاختبار وظيفة الدهون من الفائدة [على سبيل المثال، PI (4،5) ف 2 ] باستخدام مسبار الدهون محددة. بالإضافة إلى ذلك، مع التراكيب GUV التي تؤدي إلى التخلص الفصل عند درجة حرارة معينة، يجب توخي الحذر للحفاظ على وجه التحديد على درجة الحرارة المطلوبة عند مراقبة التفاعل بين البروتين GUV. الحد الآخر هو أن الحلول لارتفاع القوة الأيونية تتنافى مع الكهربائيةوصف بروتوكول تشكيل هنا، وبالتالي تزرع GUVs وصيانتها في 300 ملي حل السكروز 26. والجدير بالذكر، ومع ذلك، استخدمت بعض الدراسات بنجاح مخازن في القوة الأيونية الفسيولوجية في بروتوكولات electroformation تعديل من 28.

واحد الجانب الحاسم هو مقدار الكمامة. وكثيرا ما يستخدم النظام القائم على المحللة أرنب الخلايا الشبكية لإعداد كامل طول HIV-1 الكمامة في المقايسات الحويصلية التعويم. ومع ذلك، فإن كمية الموسومة YFP-الكمامة كامل طول تم الحصول عليها في هذا النظام غير كافية لرؤية الكمامة ملزمة لGUVs. لمعالجة هذه المشكلة، ونظام النسخ الترجمة جنين القمح على أساس المحللة خالية من الخلايا، والتي ينتج ما يقرب من 8-10 أضعاف كمية أعلى من الكمامة، وكان يستخدم في فحص الحالي. ومع ذلك، إذا لا بد من القيام بها في حالة عدم وجود عناصر خلية المحللة حقيقية النواة التجارب ملزمة GUV، يمكن للمرء أن استخدام تنقية البروتينات المسمى مع fluorophore كما حدث مؤخرا (موضح أدناه).

وقد تبين أن محددة وفعالة ملزمة من الكمامة على الأغشية هي عملية تعاونية ينظمها عوامل مختلفة مثل ميريستات، RNA، headgroups الدهون وسلاسل أسيل، والتفاعلات الكمامة-الكمامة (إعادة النظر في المرجع 29). النظام في المختبر يصف هنا يمكن أن تمتد إلى معالجة دور العوامل منفردة أو مجتمعة لفهم ترتيب الأحداث في عملية تعاونية من غشاء الكمامة ملزمة. حتى الآن، إجمال نظام فحص وصفه دورا غير متوقع من غير المشبعة PI (4،5) ف 2 سلاسل أسيل في ربط الكمامة ولكن ليس من المقبول PI الثدييات خلايا المنشأ (4،5) ف 2 -binding المجال ( المجال pleckstrin تناظر من فسفوليباز C دلتا 1) 24، وهو الاكتشاف الذي لم يكشف النقاب عن المقايسات الحويصلية التعويم. كما تم استخدام أنظمة الفحص القائمة على GUV لفهم جوانب أخرى من الأحياء هفوة. باستخدام مشتقات الكمامة التي تحتوي على multim محرض الاصطناعيعزر erization وGUVs مع مجموعة كبيرة تشبه وغير طوف مثل المجالات، كيلر وآخرون. وتناولت العلاقة بين التقسيم الكمامة إلى مجالات "مثل طوف" وmultimerization 30. وقد استخدمت دراسة أجراها كارلسون وآخرون. النظام GUV والنقاء وfluorescently المسمى الكمامة لفهم ترتيب تسلسلي للتوظيف مختلف المجمعات endosomal الفرز المطلوبة للنقل (ESCRT) البروتينات التي بغشاء الكمامة 31. في الآونة الأخيرة، وذكرت دراسة أخرى إعادة تشكيل حويصلة في مهدها عملية الناجم عن الكمامة على GUV باستخدام الكمامة مترافق مع fluorophore 32. HIV-1 الكمامة multimerization يؤدي إلى تشكيل شعرية الكمامة submembrane أن يعتقد أن منحنى الأغشية خلال التجمع. لذلك، مع مزيد من التحسن في أنظمة الفحص الكمامة-GUV، والعلاقة بين التغيرات غشاء انحناء وغشاء الكمامة الملزمة، التي يمكن القول إن الجانب الأقل مفهومة جيدا التجمع فيروس نقص المناعة البشرية، ويمكن تحليلها كما يجري FOص غيرها من البروتينات الحساسة للانحناء الخلوية 33.

وخلاصة القول، وذلك باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء الحصول على كميات كافية من myristoylated الكمامة كامل طول وتصور الكمامة ملزمة لأغشية GUV. هذا البروتوكول يمكن تطويرها لدراسة مراحل مختلفة من HIV-1 التجمع والعمليات في مهدها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

ونود أن نشكر محمد سليم، جينغ وو وكريشنان هوناتان لإجراء مناقشات مفيدة. كما نشكر بريا Begani للمساعدة أثناء التصوير. ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 AI071727 (لAO) وR01 GM110052 (إلى السلفادور).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Meterman 30XR A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator Instek GFG-8216A A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO CG-90IN
Incubator Hoefer Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber Nalgene
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Syringe Hamilton 80400 Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit BiotechRabbit,
Berlin, Germany
BR1401001
DiD Life Technologies, Carlsbad, CA  D7757
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL  850457C
POPS Avanti Polar Lipids 840034C
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700041P
Brain-PI(4,5)P2  Avanti Polar Lipids 840046X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87, (12), 7155-7159 (2013).
  2. Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (4), 1600-1605 (2010).
  3. Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82, (5), 2405-2417 (2008).
  4. Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68, (4), 2556-2569 (1994).
  5. Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (41), 14889-14894 (2004).
  6. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  7. Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45, (13), 4077-4083 (2006).
  8. Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (9), 3525-3530 (2013).
  9. Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49, (25), 5109-5116 (2010).
  10. Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87, (11), 6441-6454 (2013).
  11. Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85, (8), 3802-3810 (2011).
  12. Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5, (6), e02202 (2014).
  13. Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18, (1), 9-16 (2010).
  14. Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), 18761-18766 (2012).
  15. Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87, (24), 13598-13608 (2013).
  16. Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83, (23), 12196-12203 (2009).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42, (2), 125-130 (2005).
  18. Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27, (13), 4668-4673 (1988).
  19. Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (1), 239-243 (1980).
  20. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
  21. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
  22. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (12), 4697-4702 (2008).
  23. Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277, (17), 3596-3607 (2010).
  24. Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89, (15), 7861-7873 (2015).
  25. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798, (7), 1324-1332 (2010).
  26. Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
  27. Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91, (6), 2172-2183 (2006).
  28. Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
  29. Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
  30. Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15, (2), 237-247 (2013).
  31. Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (42), 16928-16933 (2012).
  32. Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41, (2), 135-149 (2015).
  33. Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics