L'isolement des Cognate complexes ARN-protéine à partir des cellules en utilisant une élution Oligonucleotide-directed

1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University
* These authors contributed equally
Biochemistry

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Singh, G., Fritz, S. M., Ranji, A., Singh, D., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution. J. Vis. Exp. (119), e54391, doi:10.3791/54391 (2017).

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Abstract

Introduction

l'expression génique post-transcriptionnelle est régulée avec précision, en commençant par transcription de l'ADN dans le noyau. Contrôlée par des protéines de liaison d' ARN (RBP), l' ARNm de la biogenèse et le métabolisme se produisent dans les particules de ribonucléoprotéine hautement dynamiques (RNP), qui se dissocient et associé à un ARNm de précurseur de substrat au cours de la progression de l' ARN métabolisme 1-3. Les changements dynamiques dans les composants de RNP affectent le sort post-transcriptionnelle d'un ARNm et de fournir l'assurance de la qualité lors du traitement des transcrits primaires, leur trafic nucléaire et de la localisation, leur activité en tant que modèles d'ARNm pour la traduction, et le chiffre d'affaires éventuelle des ARNm matures.

De nombreuses protéines sont désignées comme RBP en raison de leurs domaines d'acides aminés conservés, y compris le motif de reconnaissance de l' ARN (RRM), l'ARN double brin domaine de liaison (RBD), et les portions de résidus basiques (par exemple, l' arginine, la lysine et la glycine) 4. RBP sont régulièrementisolé par des stratégies d'immunoprécipitation et sont criblées pour identifier leurs ARNs parentes. Certaines pratiques commerciales restrictives co-régulent pré-ARNm qui sont liées au plan fonctionnel, désignés comme régulons d'ARN 5-8. Ces pratiques commerciales restrictives, leurs ARNm parentes, et parfois non codant l'ARN, forment RNP catalytiques qui varient dans la composition; leur spécificité est due à différentes combinaisons de facteurs associés, ainsi que la séquence temporelle, l' emplacement et la durée de leurs interactions 9.

ARN immunoprécipitation (RIP) est une technique puissante pour isoler RNP à partir de cellules et d'identifier les transcriptions associées à l' aide de l' analyse de la séquence 10-13. Passer de la candidate à l' échelle du génome de dépistage est possible par le biais RIP combiné avec une analyse des microréseaux 14 ou séquençage à haut débit (RNA-seq) 15. De même, les protéines de coprécipitation peuvent être identifiées par spectrométrie de masse, si elles sont suffisamment abondantes et séparable de l'anticorps co-précipitation 16,17. Ici, nous examinons la méthode pour isoler les composants de RNP d'un ARN spécifique apparenté à partir de cellules humaines en culture, bien que l'approche peut être modifiée pour lysats solubles dans des cellules végétales, des champignons, des virus et des bactéries. Les analyses en aval du matériau comprennent l' identification des candidats et validation par immunotransfert, spectrométrie de masse, dosage enzymatique biochimique, la RT-PCR quantitative, puces à ADN et RNA-seq, comme le résume la figure 1.

Étant donné le rôle fondamental de la RNP dans le contrôle de l' expression des gènes au niveau post-transcriptionnel, des altérations de l'expression de RBP composants ou leur accessibilité aux Apparenté ARNs peuvent être préjudiciables pour la cellule et sont associés à plusieurs types de troubles, y compris la maladie neurologique 18. DHX9 / ARN hélicase A (RHA) est nécessaire pour la traduction des ARNm sélectionnés d'origines cellulaires et rétroviraux 6. Ces ARN parentes présentent des éléments agissant en cis structurellement apparentés au sein de leur5 'UTR, qui est désigné comme l'élément de contrôle post-transcriptionnel (PCE) 19. Activité RHA-PCE est nécessaire pour la traduction cap-dépendante efficace de nombreux retrovirus, y compris le VIH-1, et des gènes régulateurs de croissance, y compris junD 6,20,21. Encodée par un gène essentiel (de dhx9), ORS est essentielle à la prolifération cellulaire et la régulation vers le bas élimine la viabilité des cellules 22. L'analyse moléculaire de l'ORS-PCE RNP est une étape essentielle pour comprendre pourquoi l'activité RHA-PCE est nécessaire de contrôler la prolifération des cellules.

La caractérisation précise des composants de RNP RHA-PCE à l'état stationnaire ou sur la perturbation physiologique de la cellule nécessite l'enrichissement sélectif et la capture des RNP RHA-PCE en abondance suffisante pour l'analyse en aval. Ici, rétroviral PCEgag ARN a été marqué avec 6 copies du site de liaison d'ARN agissant en cis pour la protéine d'enveloppe MS2 (CP) dans le cadre de lecture ouvert. La protéine de capside MS2 a été exogenously co-exprimée avec PCEgag ARN par transfection du plasmide pour faciliter l'assemblage RNP dans les cellules en croissance. RNP contenant la protéine de capside MS2 avec PCEgag ARN MS2 cognât marqués ont été immunoprécipités à partir de l'extrait cellulaire et capturé sur des billes magnétiques (Figure 2a). Pour capturer de manière sélective les composants de RNP liés au PCE, RNP immobilisé a été mis en incubation avec un oligonucléotide complémentaire à des séquences distales de PCE, la formation d'un hybride ARN-ADN qui est le substrat pour l'activité RNase H. Etant donné que le PCE est positionné dans la région 5 'terminale de la région 5' non traduite, l'oligonucléotide est complémentaire des séquences d'ARN adjacentes au site d'initiation de traduction rétroviraux (codon de départ gag). RNase H clivage près du début de gag codon libéré complexe 5 'UTR du RNP immobilisé, qui a été recueilli comme éluant. Ensuite, l'échantillon a été évaluée par RT-PCR pour confirmer la prise de PCEgag et par SDS-PAGE et immunotransfert pour confirmer la capture de la protéine d'enveloppe cible MS2. Une validation de la protéine de liaison d'ARN PCE associée, DHX9 / ARN hélicase A, a ensuite été réalisée.

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Protocol

Buffer Compositions
Wash Buffer:
50 mM de Tris-HCl, pH 7,4
150 mM de NaCl
3 mM de MgCl2
Tampon à faible sel:
20 mM de Tris-HCl, pH 7,5
10 mM de NaCl
3 mM de MgCl2
2 mM de DTT
1x cocktail inhibiteur de protease EDTA-free
RNase Out 5 pl / ml (inhibiteur de RNase)
Cytoplasmique Lysis Buffer:
0,2 M Saccharose
1,2% de Triton X-100
NETN-150 Wash Buffer:
20 mM de Tris-HCl, pH 7,4
150 mMNaCl
0,5% de NP-40
3 mM de MgCl2
10% Glycérine
Binding Buffer:
10 mM d'HEPES pH 7,6
40 mM KCI
3 mM de MgCl2
2 mM de DTT
5% de glycérol

Tableau 2: compositions tampons.

1. Préparation des cellules et la matrice d'affinité

  1. La culture d'une lignée de cellules d'intérêt à la sous-confluence (80%) dans une boîte de 10 cm. Utilisez plaques de 10 cm pour les immunoprécipitations indépendants (IP) d'une NLS-MS2 protéine d'enveloppe étiquetée FLAG. Effectuer l'IP en utilisant des antiserums à l'étiquette FLAG-épitope. Lors de l' expression de la protéine d'enveloppe MS2 plasmide FLAG-marqué, les cellules transfecter 24-48 h avant la récolte 20.
    NOTE: Un RNP particulier peut être enrichi du nucléaire ou le cytoplasmelysats ic ou une préparation biochimiquement-fractionnés, tels que des fractions d'un gradient de saccharose. Il est recommandé de récolter le lysat à partir de cellules non transfectées en parallèle à instituer un contrôle négatif supplémentaire.
  2. Transfert de 60 ul par IP de la protéine G bille magnétique suspension à un tube de 1,7 ml de microcentrifugation.
  3. Placer le tube sur un support magnétique pour microtubes pour séparer les billes de la solution de stockage.
  4. Retirer la solution de stockage en tirant doucement vers le haut avec une micropipette.
  5. Retirer le tube du porte-aimant.
  6. Laver et équilibrer les billes avec 600 ul ( environ 10 fois le volume utilisé de perles) de 1 x tampon de lavage (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 3 mM et NaCl 150 mM) et l' extrémité sur l'autre extrémité rotation 3 min à température ambiante.
  7. Placer le tube sur le porte-aimant et enlever le tampon de lavage.
  8. Ajouter 10 volumes (600 pi) de tampon de lavage 1x et immunoprécipitation anticorps FLAG à la pr équilibréebilles magnétiques otein G (selon la quantité recommandée par le fabricant pour une immunoprécipitation) et rotation de bout en bout sur à la température ambiante pendant au moins 30 min pour conjuguer l'anticorps immunoprécipitation. Utiliser les IgG d'isotype correspondant en tant que témoin négatif d'anticorps convenable.
  9. Placer le tube sur le porte-aimant pour collecter les perles et à enlever le surnageant.
  10. Retirer le tube du porte-aimant et laver les billes d'anticorps conjugués avec des 10 volumes (600 ul) de tampon de lavage 1x et à la rotation pendant 3 min à température ambiante. Répéter deux fois cette étape.
  11. Placer le tube sur le porte-aimant et enlever le tampon de lavage.

2. La récolte de la RNP

NOTE: Préparer les RNP au cours de la période d'incubation après l'étape 1.8.

  1. Éliminer le milieu de culture des cellules par aspiration et laver les cellules deux fois avec 1-5 ml de glace froide 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Utilisez un grattoir cellulaire pour déloger humide,cellules adhérentes avant la collecte par centrifugation à 226 g pendant 4 min à 4 ° C.
  2. Ajouter 375 ul de tampon pauvre en sel glacé (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, MgCl2 3 mM, NaCl 10 mM, DTT 2 mM, 1 x inhibiteur de la protéase cocktail, exempt d' EDTA et 5 pl / ml RNase Inhibitor) au culot de cellules et de permettre le gonflement en le plaçant sur de la glace pendant 5 min.
    REMARQUE: mesure du volume d'un tampon pauvre en sel, selon la taille du culot cellulaire. Pour 1,2 x 10 6 cellules d'une plaque de 10 cm, 375 pi de tampon est suffisante.
  3. Pour recueillir le lysat cellulaire cytoplasmique, ajouter 125 pi de tampon de lyse glacé (0,2 M de saccharose / 1,2% de Triton X-100), puis effectuer 10 coups avec un homogénéisateur Dounce qui était pré-refroidie dans un seau à glace.
    NOTE: Pour recueillir l'extrait total de cellules, tampon standard de lyse RIPA est recommandé pour solubiliser le nucléoplasme / chromatine.
  4. Spin dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale (16.000 xg) pendant 1 min; cela va effacer le surnageant des débris d'unnoyaux nd.
  5. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,7 ml qui a été sur la glace. Déterminer la concentration totale des protéines par une méthode normalisée de laboratoire préféré, tel que le 23 dosage de Bradford. Réserver une fraction aliquote d'au moins 10% pour une analyse par transfert de Western, pour être utilisé comme un contrôle d'entrée. Utilisez le lysat de cellules récoltées immédiatement pour immunoprécipitation ou stocker à -80 ° C pour une analyse ultérieure.
    NOTE: Dans notre expérience, ces échantillons peuvent être conservés et utilisés quelques mois plus tard pour l'analyse d'immunoprécipitation sans compromis de l'intégrité.

3. Immunoprécipitation

  1. Ajouter le volume désiré du lysat cellulaire récoltée, en fonction de la concentration en protéine déterminée à l'étape 2.5, des billes d'anticorps conjugué cible. À l'aide du tampon de lavage 1x, porter le volume total à 600 ul et de rotation de bout en bout pendant 90 min à température ambiante.
    NOTE: Ce laps de temps est suffisant pour produireune isolation solide des complexes de RNP à affinité élevée, tout en minimisant la liaison non spécifique. Diluer sources RNP alternatives, telles que des fractions d'un gradient de saccharose, au moins 1: 1 avec le tampon de lavage 1x, puis les incuber avec des complexes de billes-anticorps précédemment préparés, comme mentionné ci-dessus.
  2. Après 90 min d'incubation, placer le tube IP sur le porte-aimant pour recueillir les perles. Réserver le surnageant comme accréditives.
    NOTE: Ce premier écoulement est important échantillon de contrôle pour mesurer l'efficacité IP. Un immunotransfert fournira une indication de l'efficacité IP, ainsi que la spécificité des interactions étudiées. Il est recommandé de conserver ce surnageant pour l'analyse en aval.
  3. Laver les, des billes d'anticorps conjugué à RNP lié avec 10 volumes (600 pi) de NETN-150 de tampon de lavage glacé (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 3 mM, 0,5% de NP40, et 10% de glycerol) en rotation pendant 3 min à température ambiante. Répétez l'étape 3 fois.
    NOTE: Ce tampon est différent du tampon de lyse et réduit les associations faibles ou non spécifiques, de manière efficace.
  4. Après le dernier lavage, la remise en suspension des complexes RNP immobilisés dans 60 ul de tampon glacé 1x de liaison (HEPES 10 mM, pH 7,6, 40 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 5% de glycerol, et DTT 2 mM) et de la réserve 10% des billes complexes immobilisés pour le Western blot et 20% pour l'isolement de l'ARN.

4. Elution

  1. Ajuster le volume restant à 100 ul avec du tampon de liaison glacé 1x et chauffer le tube à 70 ° C pendant 3 min.
  2. Pour isoler des complexes ARN-protéine apparentée, ajouter un ~ 30 nt oligonucléotide d'ADN qui est complémentaire à la limite 3 'de la séquence de l'ARN d'intérêt et incuber pendant 30 min à température ambiante avec une légère oscillation (100 nM d'oligonucléotide est suffisant).
    NOTE: L'oligonucléotide est antisens par rapport aux résidus de nucléotides adjacents au début de traduction du site de la construction PCE utilisé comme example dans ce protocole. la complémentarité de la séquence appropriée est fournie par le ~ 40% de teneur en GC. Concevoir l'oligonucléotide anti-sens pour une hybridation efficace de la région complémentaire minimale de l'ARN cible.
  3. Ajouter 5-10 unités de RNase H dans le tube et incuber à température ambiante pendant 1 heure pour cliver l'ARN de l'ARN: ADN hybride. Transférer le surnageant dans un tube de 1,7 ml de microcentrifugation stérile; cet échantillon contient les complexes RNP capturés d'intérêt.
    NOTE: En fonction de l'accessibilité de l'ARN apparenté, deux ou plusieurs cycles de traitement RNase H peuvent être utiles pour augmenter l'abondance de l'échantillon pour les analyses en aval.
  4. En utilisant 20% de l'éluat dans un Western blot des protéines associées connus et 20% de l'éluat pour l'isolement de l'ARN, suivie par RT PCR quantitative. Les 60% restants peuvent être utilisés pour la spectrométrie de masse ou d'identifier les composants protéiques.
  5. En parallèle, soumettre une partie aliquote du lysat cellulaire réservé à l'isolement de l'ARN et l'analyse par RT-PCR. Cette assessment fournit une indication de l'enrichissement de l'ARN dans un complexe RNP.
    NOTE: Utiliser la préparation de protéine isolée dans un western blot de contrôle pour vérifier que le clivage RNase H était efficace pour libérer le RNP du complexe immunuoprecipitated.

5. Protein Analyse Electrophorèse et Western Blot

  1. Objet environ 10 à 20% de l'échantillon total à SDS-PAGE et analyse par immunotransfert selon le protocole standard de laboratoire.
    REMARQUE: Cette étape permet de valider l'efficacité et la spécificité IP avant l'analyse de l'ARN en aval. Il peut également être utilisé pour évaluer la composition protéique du complexe RNP isolée.

6. Collection de l'ARN immunoprécipité

REMARQUE: l'isolement d'ARN peut être effectuée par la méthode Trizol ou suivant le protocole décrit.

  1. la moitié Resuspendre de l'échantillon total dans 750 pi d'acide réactif guanidinium thiocyanate et incuber à la salle tEMPÉRATURE pendant 5 minutes avant l'extraction de l'ARN à partir des complexes PCE-RNP capturés.
  2. Ajouter 200 ul de chloroforme dans le tube, agiter vigoureusement pendant 10 sec, et incuber à température ambiante pendant 3 min.
  3. Après centrifugation à 16 000 xg pendant 15 min à 4 ° C, la collecte de la phase aqueuse dans le tube à nouveau et ajouter un volume égal d'isopropanol. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant au moins 10 min. Ajouter 1 pi de bleu de glycol à l'échantillon et le stocker à -20 ° C dans le congélateur pour la précipitation ou un traitement efficace à une date ultérieure.
  4. Centrifuger le tube à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. recueillir soigneusement et jeter le surnageant de manière à ne pas perturber le culot d'ARN; l'utilisation d'une pointe p-200 micropipette est recommandé pour faciliter ce processus.
  5. Ajouter 500 ul d'éthanol à 75% à chaque tube, vortexer et centrifuger les tubes à 16 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Recueillir soigneusement et jeter le surnageant comme dans l'étape 6.4. Air-sécher la pastille pendant 2-3 min et remettre en suspension dans 100 pi d'eau sans RNase.
    REMARQUE: Ne pas prolonger le temps les sèche à l'air à granulés afin d'éviter un problème avec resuspension.
  6. Appliquer 100 pi d'échantillon d'ARN à une colonne de nettoyage d'ARN. Processus en utilisant le protocole du fabricant. Eluer l'ARN dans 30 pi d'eau sans RNase et conserver à -80 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
    NOTE: Cet ARN isolé est adapté à l'analyse en aval par RT-PCR en temps réel (qPCR), microarray, et le séquençage de l'ARN. En fonction de l'abondance du RNP et l'efficacité avec laquelle le RNP d'intérêt est isolée, le même lysat peut être soumis à deux ou plusieurs séries de propriété intellectuelle pour générer suffisamment d'ARN applicable pour l'analyse en aval.

7. ARN transcription inverse et amplification de l'ADNc par PCR

  1. Soumettre l'ARN isolé à une transcription inverse par une amorce aléatoire avec une inversion de haute qualité transcriptase (RT), selon la Manufales instructions cturer.
  2. Pour amplifier l'ARN d'intérêt, de concevoir une amorce anti-sens spécifique du gène dans la séquence de clivage par la RNase H. Utiliser des quantités similaires de l'oligonucléotide anti - sens, une amorce aléatoire ou une amorce oligo-dT (voir le tableau Materials).
    REMARQUE: L'amorce oligo-dT et de l'ARNm polyadénylé de fournir des réactions témoins positifs pour les réactions de RT-PCR.
  3. Reserve 5% de la réaction RT (1 pi) pour une qPCR préparative fait en tandem avec contrôle négatif lysat IP et des échantillons d'ADN positifs de contrôle pour définir la fréquence de coupure et de produire une courbe standard. Si la valeur CT de l'qPCR préparative est hors de portée de la courbe standard, diluer la réaction RT à 1 consécutifs: 5 dilutions et répétez l'étape 7.2.
    NOTE: Pour un séquençage de l'ARN et la technique de spectrométrie de masse, s'il vous plaît voir le fichier de méthode supplémentaire. S'il vous plaît cliquez ici to voir ce fichier Méthode supplémentaire. (Faites un clic droit pour télécharger.)

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Representative Results

Résultats RIP antérieurs identifiés ARNs gag rétrovirales et sélectionnés ARN cellulaires qui co-précipité avec DHX9 / RHA, y compris le VIH-1 6, junD 6 et HUR (Fritz et Boris-Lawrie, non publié). Rétroviral 5 'UTR a été démontré que la co-précipité avec DHX9 / ORS dans le noyau et à co-isoler dans le cytoplasme sur polyribosomes. Elle est définie uniquement comme post-transcriptionnelle élément de commande de cis (PCE) 6. À isoler les complexes de ribonucléoprotéine PCEgag ARN ORS (RNP) formées dans les cellules qui prolifèrent, nous avons effectué FLAG MS2 RNP immunoprécipitation dans des lysats de cellules HEK293 transfectées. Les résultats montrent une précipitation efficace de la protéine FLAG-MS2. Notamment, DHX9 / RHA est identifié au sein de ce complexe RNP et non dans le contrôle isotype IgG, ni dans la cellule lysat témoin négatif HEK293 (figure 2A). La matrice contenant les RNP a été mis en incubation avec un 30 complémentOligonucléotide -nt, puis un clivage RNase H de l'hybride ARN-ADN a été réalisée. Sur RNase H digestion, les éluats ont été analysés par Western blot. La preuve clivage par RNase H de l'ARN PCEgag à la position d'hybride ARN-ADN libéré du complexe RNP spécifiquement liée à l'UTR 5 '. Les RNP DHX9 / RHA-associés ont été déterminés à être enrichi dans les éluants. Fait important, les RNP FLAG MS2 lié est resté avec les billes d'anticorps conjugué (figure 2B). Le co-immunoprécipitation de la tige-boucle contenant MS2 rétroviral PCEgag ARN dans des cellules et des éluants a été validée par RT-PCR et qRTPCR (figure 2C). Les résultats ont confirmé une association de sélection entre DHX9 / RHA et 5 'rétroviral UTR, qui a été mis en évidence comme un RNP unique , important pour le contrôle de la traduction ciblée 6.

Figure 1
Figure 1: RNP isolement et l'enrichissement de RNP spécifiques associés à la 5 'UTR de PCEgag par RNase H clivage. Flux de travail montrant les étapes pour isoler une ribonucléoprotéine sélectionnée formé de novo dans les cellules, sa collection par l' oligonucléotide guidé RNaseH clivage, et l'analyse en aval de l' ARN et de protéines des composants. Résumé de la chromatographie d'affinité en utilisant une interaction de haute affinité entre multimères pour la tige-boucle de l'ARN MS2 et la couche MS2 protéines protéine FLAG fusion pour capturer l'ARN de PCE sur des billes de FLAG. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: A PCEgag ARN contenant 6 sites de liaison ARN MS2 a été capturé par un MS2 protéine d'enveloppe étiquetée FLAG immobilisée et RNP spécifiques associés à la 5 'UTR étaientpublié par oligonucléotide RNase H clivage. les cellules HEK293 ont été co-transfectées avec pAR200 (un plasmide contenant le PCEgag et 6x MS2 boucles dans l'intron du VIH) et un plasmide exprimant l'épitope FLAG-MS2 protéine marquée avec une séquence de localisation nucléaire (NLS). Les cellules ont été recueillies et le cytoplasme a été isolé à 48 heures après la transfection. Les lysats cytoplasmiques ont été soumis à une immunoprécipitation avec soit l'anticorps FLAG ou un contrôle IgG. (A) L'efficacité de la propriété intellectuelle est déterminée par immunotransfert en utilisant un anticorps anti-FLAG. DHX9 / RHA, une protéine de liaison PCE, servi comme témoin positif; ARN contenant PCE-immunoprécipitée avec la protéine MS2. Lanes 1-3: protéines d'entrée utilisées pour IP. Lanes 4-5: IP FLAG de FLAG MS2 surexprimé lysat et HEK293 cellulaire cytoplasmique lysat. Piste 6: IP IgG de FLAG MS2 surexprimé lysat. Lanes 7-9: Flow-through des IPs. (B) RNP 5 'UTR-liés ont été enrichis par RNase H clivage. Lanes 1-3: Éluats de protéines UTR lié 5 'par la RNase H. Lanes 4-6: protéines liées à des billes d'anticorps conjugué. (C) par PCR de la transcriptase inverse et la PCR quantitative en temps réel spécifique de l' ARN lié à des fractions différentes de RNP. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'isolement de RNP et de la stratégie d'identification de l'ARN apparenté décrit ici est un moyen sélectif d'enquêter sur une interaction spécifique ARN-protéine et de la découverte des protéines candidats co-régulation d'un RNP spécifique dans les cellules.

L'avantage d'utiliser oligonucléotide clivage par RNase H d'isoler RNP est la capacité de capturer et analyser plus précisément l'élément d'ARN agissant en cis sur la RNP RNP hétérogènes en aval liés à l'élément d'intérêt ARN agissant en cis. Parce que l'abondance d'un ARN apparenté dans une RNP donnée est une fraction mineure des RNP recueillies isolées sans RNase H clivage, l'inconvénient majeur de ce flux de travail est la rareté de la RNP apparenté. Dans notre expérience, cette limitation a nécessité 5 à 10 fois plus de matériel de départ que IP ARN classique pour la détection dans immunoblot et protéomique analyses sensibles. Un autre avantage fourni par l'immobilisation de la RNP est la commodité de répétition de la RNase H treatment éluat et la collecte supplémentaire. Dans notre expérience, 2-4 séries de traitement RNase H ont conseillé de recueillir des éluat supplémentaires.

Dans ce protocole, les préoccupations techniques clés maintiennent la température optimale et d'assurer le traitement stérile des réactifs. Tous les réactifs doivent être RNase et protease. L'intégrité de l'échantillon d'ARN est un piège potentiel à considérer si une interaction ARN-protéine est non détectable.

Cette technique nécessite la lyse efficace des cellules à accéder aux RNP en une quantité appropriée pour la détection. Bien qu'une importante mise en garde est la lyse cellulaire incomplète, des traitements vigoureux peuvent augmenter les interactions non spécifiques avec l'ARN. Par conséquent, les conditions expérimentales doivent être mesurés afin d'enrichir les interactions spécifiques protéine-ARN. Cependant, l'utilisation de lavages à haute stringence peut éliminer des interactions importantes encore transitoires. Par conséquent, les conditions de lavage sont une autre variable consier dans les exigences spécifiques d'une expérience particulière.

l'efficacité RIP est une technique puissante pour isoler des partenaires parentes ARN-protéine, mais certaines interactions transitoires ou faibles qui sont d'une importance physiologique sont perdus pendant les étapes de liaison ou de lavage. La réticulation du complexe mRNP est une option à considérer dans une analyse. En outre, les conditions de croissance physiologiques doivent être gardés à l'esprit tout en analysant les RNP réglementaires, comme le niveau de l'ARN apparenté d'expression ou RBP peuvent être soumis à des fluctuations physiologiques sous certaines conditions. En outre, le type d'analyse en aval va également jouer un rôle dans le choix des conditions de lyse et de lavage pendant la immunoprécipitation.

En outre, l'immunoprécipitation réussie nécessite que le lysat cellulaire est diluée de manière significative (au moins 1: 1). 1x tampon de lavage (20 mM de Tris-HCl, pH 7,3, 3 mM de MgCl2 et 150 mM de NaCl) est le diluant choisi, comme sa compositionne modifie pas l'intégrité de RNP, une solution de solubilité, ou des interactions anticorps-antigène.

Pour la spectrométrie de masse en aval, les échantillons doivent être exempts de sels, y compris Na +, Cl - et Tris, ainsi que certains détergents. Si nécessaire, les composants de tampons-ioniques des composés du peuvent être réduits par une dialyse ou une filtration d'échange ionique, et dans certains cas, des tampons volatils sont utiles dans les étapes finales. Dans le cas où l'antisérum est utilisé pour isoler une protéine de marquage épitopique exprimé par transfection, la validation par transfert de Western de la protéine recombinante en utilisant un lysat cellulaire initiale doit être exécutée avant une analyse ultérieure. Dans le cas où une étiquette d'épitope est utilisé ( par exemple, FLAG, MYC, GFP, etc.), l'exposition de l'étiquette est cruciale pour le succès de l'étape de liaison d'anticorps. Gel-dégel des échantillons doit être évitée.

La technique de RIP a été largement utilisée pour élucider divers mécanismes de contrôle du gène post-transcriptionnelle10,25. Ceci inclut l'identification d' une nouvelle protéine et de l' ARNm, la protéine de microARN et des interactions protéine-protéine 10,25. Ici, nous fournissons un protocole complet pour la détermination de la composition RNP dans une culture cellulaire. Notre méthode permet l'évaluation ciblée et l'ensemble du génome des interactions protéine-ARN critiques, ainsi que pour la capture des complexes RNP rares et / ou transitoires.

L'application de cette technique a contribué à notre caractérisation des ARN liés par DHX9 / ARN hélicase A et nous ont aidés à définir la régulation post-transcriptionnelle critique de retrovirus et les cellulaires proto-oncogènes junD 6,26 et HUR (Fritz et Boris-Lawrie , données non publiées). Nous nous attendons à l'application de cette technique dans de futures études pour approfondir notre compréhension des mécanismes essentiels pour le contrôle des gènes, y compris ceux médiée par de longues complexes non codantes RNP.

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Acknowledgements

Les auteurs remercient le soutien par le NIH P50GM103297, P30CA100730 et Comprehensive Cancer P01CA16058.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D
Anti-FLAG antibody Sigma F3165
Anti-FLAG antibody Sigma F7425
Anti-RHA antibody Vaxron PA-001
TRizol LS reagent Life technology 10296-028
RNase H Ambion AM2292
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Isopropanol Fisher Scientific BP26184
RNaeasy clean-up column Qiagen 74204
Omniscript reverse transcriptase Qiagen 205113
RNase Out Invitrogen 10777-019
Protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Triton X-100 Sigma X100
NP-40 Sigma 98379
Glycerol Fisher Scientific 17904
Random hexamer primers Invitrogen N8080127
Oligo-dT primers Invitrogen AM5730G
PCR primers IDT Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage IDT Anti-sense primer for target RNA
Trypsin Gibco Life technology 25300-054
DMEM tissue culture medium Gibco Life technology 11965-092
Fetal bovine serum Gibco Life technology 10082-147
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Sodium chloride Fisher Scientific S642-212
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214
DTT Fisher Scientific R0862
Sucrose Fisher Scientific BP220-212
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 1620112
Magnetic stand 1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood For animal tissue culture
CO2 incubator For animal tissue culture
Protein gel apparatus Protein sample separation
Protein transfer apparatus Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%) Protein sample separation
Table top centrifuge Pellet down the sample
Table top rotator Mix the sample end to end
Vortex Mix the samples

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References

  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3, (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, (10), e255 (2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582, (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8, (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13, (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27, (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8, (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309, (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110, (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253, (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10, (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16, (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41, (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73, (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35, (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38, (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289, (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1, (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286, (7), 5328-5337 (2011).

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