Oligonucleotide निर्देशित क्षालन का उपयोग कोशिकाओं से आत्मीय आरएनए प्रोटीन परिसरों का अलगाव

1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University
* These authors contributed equally
Biochemistry

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Singh, G., Fritz, S. M., Ranji, A., Singh, D., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution. J. Vis. Exp. (119), e54391, doi:10.3791/54391 (2017).

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Abstract

Introduction

पोस्ट-transcriptional जीन अभिव्यक्ति ठीक नियंत्रित किया जाता है, नाभिक में डीएनए प्रतिलेखन के साथ शुरुआत की। आरएनए बंधनकारी प्रोटीन (RBPs) द्वारा नियंत्रित, mRNA जीवजनन और चयापचय को अत्यधिक गतिशील ribonucleoprotein कणों (RNPs) है, जो सहयोगी और एक सब्सट्रेट अग्रदूत mRNA के साथ शाही सेना चयापचय 1-3 की प्रगति के दौरान अलग कर देना में होते हैं। RNP घटकों में गतिशील परिवर्तन एक mRNA के बाद ट्रांसक्रिप्शनल भाग्य को प्रभावित और प्राथमिक टेप, अपने परमाणु तस्करी और स्थानीयकरण, अनुवाद के लिए mRNA टेम्पलेट्स के रूप में उनकी गतिविधियों, और परिपक्व mRNAs के अंतिम कारोबार के प्रसंस्करण के दौरान गुणवत्ता आश्वासन प्रदान करते हैं।

कई प्रोटीन आरएनए मान्यता मूल भाव (RRM) सहित उनके संरक्षित एमिनो एसिड डोमेन के आधार पर RBPs के रूप में नामित कर रहे हैं, डबल असहाय शाही सेना बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी), और बुनियादी अवशेषों के हिस्सों (जैसे, arginine, लाइसिन, और ग्लाइसिन) 4। RBPs नियमित तौर पर कर रहे हैंimmunoprecipitation रणनीतियों से अलग है और उनके आत्मीय RNAs की पहचान के लिए जांच कर रहे हैं। कुछ RBPs सह विनियमित पूर्व mRNAs कि कार्यात्मक-से संबंधित हैं, आरएनए regulons 5-8 के रूप में नामित। ये RBPs, उनके आत्मीय mRNAs, और कभी कभी गैर-कोडिंग आरएनए, उत्प्रेरक RNPs कि संरचना में भिन्नता फार्म; अपनी विशिष्टता की वजह से संबद्ध कारकों के विभिन्न संयोजनों के लिए, साथ ही अस्थायी अनुक्रम, स्थान, और उनकी बातचीत 9 की अवधि के लिए है।

आरएनए immunoprecipitation (आरआईपी) कोशिकाओं से RNPs अलग-थलग करने और अनुक्रम विश्लेषण 10-13 का उपयोग कर संबंधित टेप की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। उम्मीदवार से आगे बढ़ते जीनोम चौड़ा करने के लिए स्क्रीनिंग एक माइक्रोएरे विश्लेषण 14 या उच्च throughput अनुक्रमण (RNAseq) 15 के साथ संयुक्त चीर के माध्यम से संभव है। इसी तरह, सह precipitating प्रोटीन, मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहचाना जा सकता है अगर वे पर्याप्त प्रचुर मात्रा में और सह precipitating एंटीबॉडी 16 से वियोज्य हैं,17। यहाँ, हम सभ्य मानव कोशिकाओं से एक विशिष्ट आत्मीय शाही सेना के RNP घटकों को अलग-थलग करने की पद्धति को संबोधित है, हालांकि दृष्टिकोण संयंत्र कोशिकाओं, कवक, वायरस और बैक्टीरिया के घुलनशील lysates के लिए परिवर्तनीय है। चित्रा 1 में संक्षेप के रूप में सामग्री के बहाव के विश्लेषण के उम्मीदवार की पहचान और मान्यता immunoblot द्वारा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, जैव रासायनिक एंजाइमी परख, आर टी-qPCR, माइक्रोएरे, और RNAseq शामिल हैं।

पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में RNPs की मौलिक भूमिका को देखते हुए, घटक RBPs या उनकी पहुंच की अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए आत्मीय RNAs सेल के लिए हानिकारक हो सकता है और तंत्रिका संबंधी रोग 18 सहित विकारों के कई प्रकार, के साथ जुड़े रहे हैं। DHX9 / आरएनए helicase एक (RHA) सेलुलर और रेट्रोवायरल मूल 6 के चयनित mRNAs के अनुवाद के लिए आवश्यक है। ये आत्मीय RNAs भीतर संरचनात्मक रूप से संबंधित सीआईएस से अभिनय तत्वों का प्रदर्शन उनकी5 'UTR, जो बाद के transcriptional नियंत्रण तत्व (PCE) 19 के रूप में नामित किया गया है। RHA-PCE गतिविधि एचआईवी -1 सहित कई रेट्रोवायरस, के कुशल टोपी पर निर्भर अनुवाद के लिए आवश्यक है, और Jund 6,20,21 सहित विकास नियामक जीन, के। एक आवश्यक जीन (dhx9) द्वारा इनकोडिंग, RHA सेल प्रसार और इसके नीचे विनियमन के लिए आवश्यक है सेल व्यवहार्यता 22 को समाप्त। RHA-PCE RNPs की आणविक विश्लेषण समझ क्यों RHA-PCE गतिविधि सेल प्रसार को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है के लिए एक आवश्यक कदम है।

स्थिर अवस्था में या सेल के शारीरिक गड़बड़ी पर RHA-PCE RNP घटकों के सटीक लक्षण वर्णन नीचे की ओर विश्लेषण के लिए पर्याप्त बहुतायत में चयनात्मक संवर्धन और RHA-PCE RNPs का कब्जा की आवश्यकता है। इधर, रेट्रोवायरल PCEgag आरएनए MS2 कोट प्रोटीन (सीपी) खुला पढ़ने के लिए सीमा के भीतर सीआईएस से अभिनय आरएनए बाध्यकारी साइट के 6 प्रतियों के साथ टैग किया गया। MS2 कोट प्रोटीन exo थाgenously सह व्यक्त प्लाज्मिड अभिकर्मक द्वारा PCEgag शाही सेना के साथ बढ़ कोशिकाओं में RNP विधानसभा की सुविधा के लिए। आत्मीय MS2 टैग PCEgag शाही सेना के साथ MS2 कोट प्रोटीन युक्त RNPs सेल निकालने से immunoprecipitated और चुंबकीय मोती (चित्रा 2A) पर कब्जा कर लिया गया। चुनिंदा RNP घटकों PCE के लिए बाध्य कब्जा करने के लिए, स्थिर RNP एक oligonucleotide PCE के लिए बाहर के दृश्यों के पूरक के साथ incubated किया गया था, एक शाही सेना डीएनए संकर RNase एच गतिविधि के लिए सब्सट्रेट है कि बनाने। चूंकि PCE untranslated क्षेत्र 5 '5 के टर्मिनल' में तैनात है, oligonucleotide रेट्रोवायरल अनुवाद शुरू साइट (झूठ शुरुआत कोडोन) से सटे आरएनए दृश्यों के लिए पूरक था। RNase एच स्थिर RNP, जो eluent के रूप में एकत्र किया गया था से रिहा 5 'UTR जटिल कोडोन झूठ शुरुआत के पास दरार। इसके बाद, नमूना आरटी पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया गया था captu पुष्टि करने के लिए PCEgag की और एसडीएस पृष्ठ और immunoblot द्वारा कब्जा पुष्टि करने के लिएलक्ष्य MS2 कोट प्रोटीन की पुन। PCE जुड़े आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन की एक मान्यता, DHX9 / आरएनए helicase ए, तो प्रदर्शन किया गया था।

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Protocol

बफर रचनाएं
धो बफर:
50 मिमी Tris एचसीएल, 7.4 पीएच
150 मिमी NaCl
3 मिमी MgCl2
कम नमक बफर:
20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5
10 मिमी NaCl
3 मिमी MgCl2
2 मिमी डीटीटी
1x protease अवरोध कॉकटेल EDTA मुक्त
RNase से 5 μl / एमएल (RNase अवरोध)
Cytoplasmic बफर:
0.2 एम सुक्रोज
1.2% ट्राइटन X-100
NETN-150 धो बफर:
20 मिमी Tris एचसीएल, 7.4 पीएच
150 मिमीNaCl
0.5% एनपी 40
3 मिमी MgCl2
10% ग्लिसरॉल
बाध्यकारी बफर:
10 मिमी HEPES पीएच 7.6
40 मिमी KCl
3 मिमी MgCl2
2 मिमी डीटीटी
5% ग्लिसरॉल

तालिका 2: बफर रचनाओं।

1. कोशिकाओं और आत्मीयता मैट्रिक्स की तैयारी

  1. संस्कृति एक 10 सेमी डिश में उप-संगम (80%) के लिए ब्याज की एक सेल लाइन। एक झंडा टैग एनएलएस-MS2 कोट प्रोटीन की स्वतंत्र immunoprecipitations (आईपी) के लिए 10 सेमी प्लेटों का प्रयोग करें। आईपी ​​झंडा मिलान टैग के लिए antisera का उपयोग कर प्रदर्शन करना। जब झंडा टैग MS2 कोट प्रोटीन प्लाज्मिड व्यक्त कोशिकाओं फसल 20 के अग्रिम में 24-48 घंटा transfect।
    नोट: एक विशेष RNP परमाणु या कोशिका द्रव्य से समृद्ध बनाया जा सकता हैइस तरह के एक सूक्रोज ढाल के अंश के रूप में आईसी lysates या एक biochemically-fractionated तैयारी,। यह गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से lysate फसल के लिए समानांतर में एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण संस्थान के लिए सिफारिश की है।
  2. स्थानांतरण एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब प्रोटीन जी चुंबकीय मनका घोल के आईपी प्रति 60 μl।
  3. एक चुंबक रैक पर ट्यूब रखें microcentrifuge ट्यूबों भंडारण समाधान से मोती को अलग करने के लिए।
  4. इसे ध्यान ड्राइंग को एक micropipette के साथ द्वारा भंडारण समाधान निकालें।
  5. चुंबक रैक से ट्यूब निकालें।
  6. धो और 1x धो बफर के 600 μl के साथ मोती (मोतियों की 10 बार इस्तेमाल किया मात्रा) संतुलित करना (20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.4, 3 मिमी 2 MgCl, और 150 मिमी NaCl) और अंत ओवर के अंत में 3 के लिए रोटेशन कमरे के तापमान पर मिनट।
  7. चुंबक रैक पर ट्यूब प्लेस और धोने बफर हटा दें।
  8. 1x धो बफर और immunoprecipitating झंडा एंटीबॉडी के 10 संस्करणों (600 μl) equilibrated जनसंपर्क में जोड़ेotein जी चुंबकीय मोती immunoprecipitating एंटीबॉडी एकत्रित करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए और कमरे के तापमान पर बारी बारी से अंत से अधिक अंत (राशि एक immunoprecipitation के लिए निर्माता से सिफारिश के अनुसार)। एक उपयुक्त एंटीबॉडी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इसी निर्धारण आईजीजी का प्रयोग करें।
  9. चुंबक रैक पर ट्यूब रखें मोती को इकट्ठा करने के लिए और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  10. चुंबक रैक से ट्यूब निकालें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 1x धो बफर और रोटेशन के 10 संस्करणों (600 μl) के साथ एंटीबॉडी संयुग्मित मोती धो लें। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  11. चुंबक रैक पर ट्यूब प्लेस और धोने बफर हटा दें।

2. फसल काटने RNPs

ध्यान दें: कदम 1.8 के बाद ऊष्मायन समय के दौरान RNPs तैयार करें।

  1. आकांक्षा से कोशिकाओं से संस्कृति के माध्यम से निकालें और (पीबीएस) ठंडा 1x फॉस्फेट बफर खारा 1-5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें। गीला को बेदखल करने के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग करें,4 मिनट के लिए 226 XG पर centrifugation द्वारा संग्रह करने से पहले पक्षपाती कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. 3 मिमी 2 MgCl; 10 मिमी NaCl, 2 मिमी डीटीटी; 1x प्रोटीज-अवरोध कॉकटेल, EDTA मुक्त, और 5 μl / मिलीलीटर ठंडा, कम नमक बफर (20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5 से 375 μl जोड़े RNase अवरोध करनेवाला) सेल गोली और 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखकर सूजन अनुमति देते हैं।
    नोट: सेल गोली के आकार के हिसाब से कम नमक की मात्रा बफर दर्जी। एक 10 सेमी की थाली से 1.2 x 10 6 कोशिकाओं के लिए, बफर के 375 μl के लिए पर्याप्त है।
  3. cytoplasmic सेल lysate इकट्ठा करने के लिए, ठंडा lysis बफर के 125 μl जोड़ने (0.2 एम सुक्रोज / 1.2% ट्राइटन X-100), और फिर एक Dounce homogenizer कि एक बर्फ बाल्टी में पूर्व ठंडा था के साथ 10 स्ट्रोक प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: कुल सेल निकालने के लिए इकट्ठा करने के लिए, मानक RIPA lysis बफर nucleoplasm / क्रोमेटिन solubilizing के लिए सिफारिश की है।
  4. 1 मिनट के लिए शीर्ष गति (16,000 XG) पर एक microfuge में स्पिन; इस मलबे की सतह पर तैरनेवाला एक साफ हो जाएगाएन डी नाभिक।
  5. एक नया 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब है कि बर्फ पर किया गया स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। इस तरह के ब्रैडफोर्ड परख 23 के रूप में एक मानक, प्रयोगशाला-वरीय विधि द्वारा कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण। एक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए कम से कम 10% की एक विभाज्य रिजर्व, एक इनपुट नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। काटा सेल lysate immunoprecipitation के लिए तुरंत प्रयोग करें या भविष्य के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
    नोट: हमारे अनुभव में, इन नमूनों संग्रहीत और अखंडता के लिए एक समझौता किए बिना immunoprecipitation विश्लेषण के लिए कई महीनों बाद में इस्तेमाल किया जा सकता है।

3. Immunoprecipitation

  1. काटा सेल lysate के वांछित मात्रा 2.5 कदम में निर्धारित प्रोटीन एकाग्रता पर आधारित लक्ष्य एंटीबॉडी संयुग्मित मोती के लिए, जोड़ें। 1x धो बफर का प्रयोग, 600 μl अप करने के लिए कुल मात्रा लाने के लिए और कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए अंत से अधिक अंत घुमाएगी।
    नोट: इस समय अवधि उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हैउच्च आत्मीयता RNP परिसरों की एक मजबूत अलगाव जबकि गैर विशिष्ट बंधन कम से कम। इस तरह के एक सूक्रोज ढाल के भागों, कम से कम 1 के रूप में वैकल्पिक स्रोतों RNP, पतला: 1 1x धो बफर के साथ, और फिर जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, पहले से तैयार मनका एंटीबॉडी परिसरों के साथ उन्हें सेते हैं।
  2. ऊष्मायन के 90 मिनट के बाद, मोती को इकट्ठा करने के लिए चुंबक रैक पर आईपी ट्यूब जगह। प्रवाह के माध्यम के रूप में सतह पर तैरनेवाला सुरक्षित रखते हैं।
    नोट: यह पहली प्रवाह के माध्यम से आईपी क्षमता को मापने के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण नमूना है। एक immunoblot परख आईपी दक्षता का एक संकेत है, साथ ही जांच की बातचीत की विशिष्टता प्रदान करेगा। यह नीचे की ओर विश्लेषण के लिए इस सतह पर तैरनेवाला रखने के लिए सिफारिश की है।
  3. 150 मिमी NaCl; 3 मिमी 2 MgCl, 0.5% NP40; ठंडा NETN-150 धो बफर (20 मिमी Tris एचसीएल, 7.4 पीएच के 10 संस्करणों (600 μl) के साथ RNP बाध्य, एंटीबॉडी संयुग्मित मोती धो और 10% ग्लिसरॉल) कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए रोटेशन के तहत। चरण को दोहराएँ 3 बार।
    नोट: इस बफर lysis बफर से अलग है और प्रभावी रूप से कमजोर या गैर विशिष्ट संघों कम कर देता है।
  4. और रिजर्व 10% अंतिम धोने के बाद, ठंडा 1x बाध्यकारी बफर (; 40 मिमी KCl, 3 मिमी 2 MgCl; 5% ग्लिसरॉल और 2 मिमी डीटीटी 10 मिमी HEPES, पीएच 7.6) के 60 μl में स्थिर RNP परिसरों resuspend पश्चिमी धब्बा और आरएनए अलगाव के लिए 20% के लिए स्थिर जटिल मोतियों की।

4. क्षालन

  1. ठंडा 1x बाध्यकारी बफर के साथ 100 μl करने के लिए शेष मात्रा समायोजित करें और 3 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब गर्मी।
  2. आत्मीय आरएनए प्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए, एक ~ 30 NT डीएनए oligonucleotide है कि ब्याज की शाही सेना के 3 'अनुक्रम सीमा के लिए पूरक है जोड़ सकते हैं और कमाल की कोमल के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते (oligonucleotide के 100 एनएम के लिए पर्याप्त है)।
    नोट: oligonucleotide शुरू साइट PCE एक exampl के रूप में इस्तेमाल निर्माण का अनुवाद करने के लिए आसन्न न्यूक्लियोटाइड अवशेषों को antisense हैइस प्रोटोकॉल में ई। उचित अनुक्रम पूरकता ~ 40% जीसी सामग्री द्वारा प्रदान की जाती है। डिजाइन लक्ष्य शाही सेना के कम से कम पूरक क्षेत्र के लिए कुशल संकरण के लिए antisense oligonucleotide।
  3. RNase एच के 5-10 इकाइयों ट्यूब को जोड़ने और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते आरएनए की शाही सेना फोड़ना करने के लिए: डीएनए संकर। एक बाँझ 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला; इस नमूने के हित के लिए कब्जा कर लिया RNP परिसरों में शामिल है।
    नोट: आत्मीय शाही सेना की पहुंच के आधार पर, RNase एच उपचार के दो या अधिक राउंड बहाव के विश्लेषण के लिए नमूना बहुतायत में वृद्धि करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
  4. नाम से जाना जाता जुड़े प्रोटीन और आरटी qPCR द्वारा पीछा किया आरएनए अलगाव के लिए eluate के 20% के लिए एक पश्चिमी धब्बा में eluate के 20% का प्रयोग करें। शेष 60% मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या प्रोटीन घटकों की पहचान करने के लिए।
  5. समानांतर में, आरएनए अलगाव और आरटी पीसीआर विश्लेषण के लिए आरक्षित सेल lysate के एक विभाज्य का विषय है। इस assessment एक RNP परिसर के भीतर शाही सेना के संवर्धन का एक संकेत है।
    नोट: पता लगाने के लिए कि RNase एच दरार immunuoprecipitated परिसर से RNP जारी करने में प्रभावी था एक नियंत्रण पश्चिमी धब्बा में पृथक प्रोटीन तैयारी का प्रयोग करें।

5. प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

  1. विषय लगभग 10-20 मानक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुसार एसडीएस पृष्ठ और immunoblot विश्लेषण के लिए कुल नमूने के%।
    नोट: यह कदम नीचे की ओर आरएनए विश्लेषण करने से पहले आईपी दक्षता और विशिष्टता को मान्य करने के लिए कार्य करता है। यह भी पृथक RNP परिसर के प्रोटीन संरचना का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

6. immunoprecipitated आरएनए का संग्रह

नोट: शाही सेना अलगाव Trizol विधि या वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके किया जा सकता है।

  1. कमरे टी में एसिड guanidinium thiocyanate अभिकर्मक के 750 μl में कुल नमूने के Resuspend आधा और सेते5 मिनट के लिए कब्जा कर लिया PCE-RNP परिसरों से शाही सेना को निकालने के लिए पहले emperature।
  2. ट्यूब को क्लोरोफॉर्म की के 200 μl जोड़ें, 10 सेकंड के लिए सख्ती से हिला है, और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 XG पर centrifugation के बाद नए सिरे से ट्यूब में जलीय चरण को इकट्ठा करने और isopropanol के एक बराबर मात्रा में जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और कम से कम 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। नमूने के लिए ग्लाइकोल नीले रंग की 1 μl जोड़ें और एक भविष्य की तारीख में कुशल वर्षा या प्रसंस्करण के लिए ठंडे बस्ते में -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। ध्यान से इकट्ठा करने और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के रूप में तो शाही सेना गोली को परेशान नहीं करने के लिए; एक पी 200 micropipette टिप का उपयोग इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए सिफारिश की है।
  5. 75% इथेनॉल के 500 μl प्रत्येक ट्यूब, भंवर, और सेंट्रीफ्यूज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर नलियों जोड़ें। ध्यान से इकट्ठा करने और कदम 6.4 में के रूप में सतह पर तैरनेवाला त्यागें। वायु-2-3 मिनट और RNase मुक्त पानी के 100 μl में resuspend के लिए गोली सूखी।
    नोट: आदेश में मेजबान के साथ एक समस्या से बचने के लिए समय को लम्बा खींच न गोली एयर सूख जाता है।
  6. एक शाही सेना को साफ-अप स्तंभ के लिए आरएनए नमूने के 100 μl लागू करें। निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए यह प्रक्रिया। अप करने के लिए 3 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर RNase मुक्त पानी और दुकान के 30 μl में शाही सेना Elute।
    नोट: इस पृथक शाही सेना RT-realtime पीसीआर (qPCR), माइक्रोएरे, और आरएनए अनुक्रमण द्वारा बहाव के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। RNP और दक्षता के साथ जो ब्याज की RNP अलग है की बहुतायत पर निर्भर करता है, एक ही lysate पर्याप्त आरएनए बहाव के विश्लेषण के लिए लागू उत्पन्न करने के लिए आईपी के दो या अधिक राउंड के अधीन किया जा सकता है।

7. आरएनए रिवर्स प्रतिलेखन और पीसीआर द्वारा सीडीएनए के प्रवर्धन

  1. एक उच्च गुणवत्ता वाले रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) के साथ एक यादृच्छिक प्राइमर द्वारा प्रतिलेखन रिवर्स करने के लिए पृथक शाही सेना विषय है, manufa के अनुसारcturer के निर्देशों।
  2. ब्याज की शाही सेना बढ़ाना करने के लिए, RNase एच दरार अनुक्रम में एक जीन विशिष्ट antisense प्राइमर डिजाइन। Antisense oligonucleotide, एक यादृच्छिक प्राइमर, या एक oligo-dt प्राइमर की समान मात्रा में प्रयोग करें (सामग्री तालिका देखें)।
    नोट: oligo-dt प्राइमर और पाली adenylated mRNA आरटी पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं प्रदान करते हैं।
  3. रिजर्व एक प्रारंभिक qPCR के लिए आरटी प्रतिक्रिया (1 μl) नकारात्मक नियंत्रण lysate आईपी और सकारात्मक नियंत्रण डीएनए नमूनों के साथ मिलकर किया कटऑफ को परिभाषित करने और एक मानक वक्र का उत्पादन करने के 5%। अगर प्रारंभिक qPCR की सीटी मूल्य मानक वक्र की सीमा से परे है, लगातार 1 में आरटी प्रतिक्रिया पतला: 5 dilutions और कदम 7.2 दोहराएँ।
    नोट: एक शाही सेना अनुक्रमण और मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक के लिए, कृपया पूरक विधि फ़ाइल देखें। कृपया यहाँ क्लिक करें टीओ इस पूरक विधि फ़ाइल देख सकते हैं। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

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Representative Results

पहले चीर परिणाम रेट्रोवायरल झूठ RNAs पहचान और सह वेग सेलुलर RNAs कि एचआईवी -1 6, 6 Jund हूर (फ्रिट्ज और बोरिस-लॉरी, अप्रकाशित) सहित DHX9 / RHA के साथ, का चयन किया। रेट्रोवायरल 5 'UTR करने के नाभिक में DHX9 / RHA के साथ सह-वेग और polyribosomes पर कोशिका द्रव्य में सह-अलग करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। यह विशिष्ट सीआईएस -acting के बाद transcriptional नियंत्रण तत्व (PCE) 6 के रूप में परिभाषित किया जाता है। PCEgag शाही सेना RHA ribonucleoprotein परिसरों (RNPs) proliferating कोशिकाओं में गठन को अलग-थलग करने के लिए, हम ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 सेल lysates में झंडा-MS2 RNP immunoprecipitation प्रदर्शन किया। परिणाम-MS2 प्रोटीन के कुशल वर्षा दिखा। विशेष रूप से, DHX9 / RHA इस RNP परिसर के भीतर और आईजीजी निर्धारण नियंत्रण के भीतर नहीं पहचाना जाता है, और न ही नकारात्मक नियंत्रण HEK293 सेल lysate के भीतर (2A चित्रा)। RNPs युक्त मैट्रिक्स एक पूरक 30 के साथ incubated था-nt oligonucleotide, और फिर शाही सेना डीएनए संकर की एक RNase एच दरार प्रदर्शन किया गया था। RNase एच पाचन पर, eluates पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया। शाही सेना डीएनए संकर स्थिति पर PCEgag शाही सेना के प्रदर्शन RNase एच दरार RNP जटिल विशेष रूप से 5 'UTR के लिए बाध्य जारी किया। DHX9 / RHA जुड़े RNPs eluents में समृद्ध होने के लिए निर्धारित किए गए थे। महत्वपूर्ण बात है, झंडा-MS2 बाध्य RNPs एंटीबॉडी संयुग्मित मोती (चित्रा 2 बी) के साथ बने रहे। MS2 स्टेम पाश कोशिकाओं में और eluents में युक्त रेट्रोवायरल PCEgag शाही सेना के सह immunoprecipitation आरटी पीसीआर और qRTPCR (चित्रा -2) द्वारा मान्य किया गया था। परिणाम DHX9 / RHA और रेट्रोवायरल 5 'UTR, जो एक अद्वितीय लक्षित अनुवाद नियंत्रण 6 के लिए महत्वपूर्ण RNP के रूप में प्रकाश डाला गया है के बीच एक का चयन एसोसिएशन की पुष्टि की।

आकृति 1
चित्रा 1: आरएनपी अलगाव और RNase एच दरार द्वारा PCEgag के 5 'UTR के साथ जुड़े विशिष्ट RNPs के संवर्धन। कदम दिखा कार्यप्रवाह एक चयनित ribonucleoprotein गठन कोशिकाओं में नए सिरे से अलग करने के लिए, oligonucleotide निर्देशित RNaseH दरार द्वारा अपने संग्रह है, और शाही सेना और प्रोटीन घटकों के बहाव के विश्लेषण। MS2 आरएनए स्टेम पाश और MS2 कोट प्रोटीन झंडा संलयन प्रोटीन झंडा मनकों पर PCE आरएनए पर कब्जा करने के लिए multimers के बीच एक उच्च आत्मीयता बातचीत का उपयोग आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का सारांश। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एक PCEgag आरएनए 6 MS2 आरएनए बाध्यकारी साइटों से युक्त एक स्थिर झंडा टैग MS2 कोट प्रोटीन द्वारा कब्जा कर लिया गया था, और 5 'UTR के साथ जुड़े विशिष्ट RNPs थेoligonucleotide निर्देशित RNase एच दरार द्वारा जारी की। HEK293 कोशिकाओं pAR200 (एक प्लाज्मिड PCEgag और 6x MS2 युक्त एचआईवी intron में छोरों) और एक प्लाज्मिड एक परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम (एनएलएस) के साथ ध्वज मिलान टैग MS2 प्रोटीन व्यक्त के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट थे। प्रकोष्ठों एकत्र किए गए थे और कोशिका द्रव्य 48 घंटा बाद अभिकर्मक पर पृथक किया गया। cytoplasmic lysates या तो झंडा एंटीबॉडी या एक आईजीजी नियंत्रण के साथ immunoprecipitation के अधीन थे। (ए) आईपी क्षमता एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot द्वारा निर्धारित किया गया था। DHX9 / RHA, एक PCE बाध्यकारी प्रोटीन, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया; PCE युक्त आरएनए MS2 प्रोटीन के साथ immunoprecipitated। लेन 1-3: इनपुट आईपी के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन। लेन 4-5: ध्वज MS2 का झंडा आईपी overexpressed lysate और HEK293 cytoplasmic सेल lysate। 6 लेन: ध्वज MS2 के आईजीजी आईपी overexpressed lysate। लेन 7-9: आईपी के प्रवाह के माध्यम से। (बी) के 5 'UTR बाध्य RNPs RNase एच दरार से समृद्ध कर रहे थे। लेन 1-3: RNase एच लेन 4-6 से 5 'UTR बाध्य प्रोटीन की eluates: एंटीबॉडी संयुग्मित मोतियों के लिए बाध्य प्रोटीन। (सी) रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर और विशिष्ट शाही सेना के वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर RNPs के विभिन्न भागों के लिए बाध्य। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

RNP अलगाव और आत्मीय आरएनए पहचान रणनीति यहाँ वर्णित एक विशिष्ट आरएनए प्रोटीन बातचीत की जांच की और सह-विनियमन के उम्मीदवार प्रोटीन की खोज की कोशिकाओं में एक विशिष्ट RNP के एक चयनात्मक साधन है।

oligonucleotide निर्देशित RNase एच दरार का उपयोग कर RNPs को अलग करने का लाभ पर कब्जा करने और विशेष रूप से ब्याज की सीआईएस से अभिनय आरएनए तत्व करने के लिए नीचे की ओर बंधे हुए विषम RNPs खत्म RNP सीआईएस से अभिनय आरएनए तत्व विश्लेषण करने की क्षमता है। क्योंकि एक दिया RNP में एक आत्मीय शाही सेना की बहुतायत RNase एच दरार के बिना पृथक एकत्र RNPs की एक नाबालिग अंश है, इस कार्यप्रवाह करने के लिए बड़ा नुकसान आत्मीय RNP की कमी नहीं है। हमारे अनुभव में, इस सीमा के संवेदनशील immunoblot और प्रोटिओमिक्स विश्लेषण में पता लगाने के लिए 10 गुना पारंपरिक आरएनए आईपी से अधिक मूल्य उस सामग्री के लिए 5 जरूरी हो। RNP immobilizing द्वारा प्रदान की एक और लाभ यह RNase एच Tre दोहराने की सुविधा हैatment और अतिरिक्त eluate का संग्रह। हमारे अनुभव में, RNase एच उपचार के 2-4 दौर अतिरिक्त eluate इकट्ठा करने के लिए सलाह दी जाती थीं।

इस प्रोटोकॉल में, कुंजी तकनीकी चिंताओं अधिकतम तापमान बनाए रखने और अभिकर्मकों की बाँझ हैंडलिंग सुनिश्चित कर रहे हैं। सभी अभिकर्मकों RNase- और प्रोटीज-मुक्त किया जाना चाहिए। शाही सेना के नमूने की अखंडता के लिए एक संभावित ख़तरा यदि एक शाही सेना, प्रोटीन बातचीत detectable नहीं है पर विचार करने के लिए है।

इस तकनीक का पता लगाने के लिए एक उपयुक्त मात्रा में RNPs का उपयोग करने की कोशिकाओं के कुशल सेल की आवश्यकता है। जबकि एक महत्वपूर्ण चेतावनी अधूरा सेल है, जोरदार उपचार शाही सेना के साथ गैर विशिष्ट बातचीत वृद्धि हो सकती है। इसलिए, प्रयोगात्मक शर्तों के क्रम में विशिष्ट प्रोटीन शाही सेना बातचीत को समृद्ध करने में मापा जाना चाहिए। हालांकि, उच्च तंगी washes के उपयोग महत्वपूर्ण अभी तक क्षणिक बातचीत समाप्त कर सकते हैं। इसलिए, कपड़े धोने की स्थिति एक और चर माना कर रहे हैंएक विशेष रूप से प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं में इंजी।

RIP दक्षता आत्मीय आरएनए प्रोटीन के भागीदारों को अलग करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन कुछ क्षणिक या कमजोर बातचीत है कि शारीरिक महत्व के हैं बंधन या वाशिंग चरणों के दौरान खो रहे हैं। mRNP परिसर के पार से जोड़ने की एक विश्लेषण में विचार करने के लिए एक विकल्प है। इसके अलावा, शारीरिक विकास की स्थिति आत्मीय शाही सेना की अभिव्यक्ति के स्तर के रूप में ध्यान में रखा जाना चाहिए, जबकि नियामक RNPs का विश्लेषण, या RBP कुछ शर्तों के तहत शारीरिक उतार चढ़ाव के अधीन हो सकता है। इसके अलावा, नीचे की ओर विश्लेषण के प्रकार भी immunoprecipitation दौरान सेल और कपड़े धोने की स्थिति के चयन में एक भूमिका निभानी होगी।

इसके अलावा, सफल immunoprecipitation कि सेल lysate काफी पतला किया जा आवश्यकता है (कम से कम 1: 1)। 1x धो बफर (20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.3, 3 मिमी 2 MgCl, और 150 मिमी NaCl) चयनित मंदक है, इसकी संरचना के रूप मेंRNP अखंडता, समाधान घुलनशीलता, या एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत प्रभावित नहीं करता।

और Tris, साथ ही कुछ डिटर्जेंट - नीचे की ओर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए, नमूने सहित ना +, सीएल लवण, से मुक्त होना चाहिए। यदि आवश्यक हो, buffers ईओण के घटकों डायलिसिस या आयनिक विनिमय निस्पंदन द्वारा कम किया जा यौगिकों-सकता है, और कुछ मामलों में, अस्थिर बफ़र्स अंतिम चरणों में उपयोगी होते हैं। मामलों में जब सीरमरोधी एक मिलान टैग प्रोटीन अभिकर्मक द्वारा व्यक्त अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, पुनः संयोजक प्रोटीन प्रारंभिक सेल lysate का उपयोग कर के पश्चिमी धब्बा सत्यापन आगे के विश्लेषण से पहले निष्पादित किया जाना चाहिए। मामले में एक मिलान टैग प्रयोग किया जाता है (यानी, झंडा, MYC, GFP, आदि), टैग के जोखिम एंटीबॉडी बाध्यकारी कदम की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। नमूनों की फ्रीज पिघलना बचा जाना चाहिए।

RIP तकनीक का व्यापक रूप के बाद transcriptional जीन नियंत्रण के विविध तंत्र को स्पष्ट करने के लिए नियोजित किया गया है10,25। इस उपन्यास प्रोटीन mRNA, प्रोटीन-microRNA, और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 10,25 की पहचान भी शामिल है। यहाँ, हम एक सेल संस्कृति के भीतर RNP संरचना के निर्धारण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हमारे विधि के साथ ही दुर्लभ और / या क्षणिक RNP परिसरों के कब्जा करने के लिए, महत्वपूर्ण प्रोटीन आरएनए बातचीत के लक्षित और जीनोम चौड़ा मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

इस तकनीक के आवेदन DHX9 / आरएनए helicase एक से बंधे RNAs के हमारे लक्षण वर्णन करने के लिए योगदान दिया है और रेट्रोवायरस की आलोचना के बाद ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन और सेलुलर आद्य-ओंकोजीन Jund 6,26 और हूर (फ्रिट्ज और बोरिस-लॉरी को परिभाषित करने के लिए हमें मदद मिली है , अप्रकाशित डेटा)। हम जीन नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण तंत्र है, लंबे समय से गैर-कोडिंग RNP परिसरों द्वारा मध्यस्थता सहित उन के बारे में हमारी समझ को आगे करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस तकनीक के आवेदन की उम्मीद है।

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Acknowledgements

लेखकों कृतज्ञता एनआईएच P50GM103297, P30CA100730 और व्यापक कैंसर P01CA16058 द्वारा समर्थन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D
Anti-FLAG antibody Sigma F3165
Anti-FLAG antibody Sigma F7425
Anti-RHA antibody Vaxron PA-001
TRizol LS reagent Life technology 10296-028
RNase H Ambion AM2292
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Isopropanol Fisher Scientific BP26184
RNaeasy clean-up column Qiagen 74204
Omniscript reverse transcriptase Qiagen 205113
RNase Out Invitrogen 10777-019
Protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Triton X-100 Sigma X100
NP-40 Sigma 98379
Glycerol Fisher Scientific 17904
Random hexamer primers Invitrogen N8080127
Oligo-dT primers Invitrogen AM5730G
PCR primers IDT Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage IDT Anti-sense primer for target RNA
Trypsin Gibco Life technology 25300-054
DMEM tissue culture medium Gibco Life technology 11965-092
Fetal bovine serum Gibco Life technology 10082-147
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Sodium chloride Fisher Scientific S642-212
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214
DTT Fisher Scientific R0862
Sucrose Fisher Scientific BP220-212
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 1620112
Magnetic stand 1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood For animal tissue culture
CO2 incubator For animal tissue culture
Protein gel apparatus Protein sample separation
Protein transfer apparatus Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%) Protein sample separation
Table top centrifuge Pellet down the sample
Table top rotator Mix the sample end to end
Vortex Mix the samples

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References

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