Подготовка проб для анализа Масс-цитометрии

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Масс-цитометрии используют антитела, конъюгированные с тяжелыми металлами этикетки, подход, который значительно увеличилось число параметров и возможностей для глубокого анализа далеко за пределы того, что возможно с обычной флуоресценции на основе проточной цитометрии. Как и с любой новой технологией, есть важные шаги, которые помогают обеспечить надежное получение данных высокого качества. Представленные здесь является оптимизированным протокол, который включает в себя несколько методов для обработки образцов клеток для анализа масс цитометрии. Методы, описанные здесь, помогут пользователю избежать распространенных ошибок и добиться согласованных результатов путем минимизации изменчивости, что может привести к неточным данным. Сообщать экспериментальный дизайн, обоснование дополнительных или альтернативных шагов в протоколе и их эффективности в выявлении новых открытий в биологии исследуемой системы покрыто. Наконец, представительные данные представлены для иллюстрации ожидаемых результатов от Presente техникиd здесь.

Introduction

Цитометрии позволяет одновременное измерение нескольких целей антител на уровне одной клетки в больших популяциях клеток. В традиционной флуоресценции на основе проточной цитометрии, число параметров, которые могут быть определены количественно ограниченно спектральным перекрытием между спектром излучения нескольких флуорофоров, что требует все более и более сложных вычислений компенсации, как число параметров увеличиваются. Эти ограничения рассматриваются по массе цитометрии, где тяжелые металлы, конъюгированным антитела обнаружены и количественно по времени пролета (TOF) масс-спектрометрии, чтобы значительно расширить число параметров, собранных одновременно и дают высокую размерную профиль белка изобилие для каждой отдельной клетки.

Базовое понимание выработок массы цитометрии инструмента является полезным для пользователя и может иметь важное значение для поиска неисправностей. Для более подробного описания настройки и запуска массовой цитометрии машины,видеть связанные рукописи 1. Если коротко, то образец клеток метят панелью конъюгированных антител металла , ориентированных на маркеры клеточной поверхности, цитоплазматические белки, ядерные белки, хроматин-связанные белки или другие эпитопы , представляющие интерес (рис 1i). Меченые клетки загружаются на машину, либо по одному времени с помощью ручной или инъекции с помощью пипетки, что образцы из 96-луночного планшета. Загруженные клетки инъецируют через распылитель, который генерирует струю капель жидкости , заключающей клетку (рис 1II). Этот спрей расположен таким образом, что клетки ионизируется аргоновой плазменной горелки. Эта ионизация создает облако частиц , состоящий из всех составляющих атомов каждого элемента (рис 1iii). Как это облако частиц движется к детектору, низкие атомные массовые атомы отделяются от высоких масс ионов с помощью масс-квадрупольного фильтра. Остальные высокие массовые ионы продолжают в детектор, где abundANCE каждого изотопа количественно (рис 1IV). Исходные данные, собранные с помощью детектора, анализирует с помощью цитометрии инструмента программного обеспечения для идентификации массового события клеток. Для каждого идентифицированного события клеток, сигнал обнаружен в каждом канале количественно и сохраняется в выходном файле .fcs. Массовые каналы, используемые для обнаружения тяжелого металла, конъюгированных антител обнаруживают минимальное спектральное перекрытие, которое колеблется от 0-4% с большинством взносов ниже 1%. Из - за этого низкие перекрестные помехи между каналами, то , как правило , нет необходимости , чтобы преобразовать данные с матрицей компенсации перед анализом 2. Тем не менее, следует соблюдать осторожность при проектировании экспериментальной панели антител, чтобы гарантировать, что антитело с высокой численностью эпитопом не назначено массовым каналом, который вносит свой вклад сигнала канала, назначенный на низкую численность антитела, так как это может создать искусственно завышенные населения в канале, получающего вклад сигнала.

3, 4. Выполнение окрашивания антител на клеточной поверхности на живые клетки могут быть необходимы для некоторых антител, но это исключает возможность Barcoding до маркировки антител , как большинство методов Barcoding выполняются после фиксации 5 , хотя штриховое кодирование антитела на основе 6, 7 является исключением.

При определении числа клеток, который должен быть подготовлен для анализа, важно знать, что только часть из клеток, нагруженных на машину будут обнаружены и выдавать данные. Эта потеря в первую очередь из-за неэффективности, когда распылитель разбрызгивает образец на факел. Точная потери процентов зависит от массы цитометрии установки машины и типа клеток, но может варьироваться от 50-85% и должна бытьучитывать при проектировании эксперимента. Этот протокол был оптимизирован для 2x10 6 клеток на образец , но может быть приспособлен для обработки меньших или больших размеров выборки. Этот протокол может быть использован с минимальными изменениями для образцов размеров от 1 × 10 6 до 4 × 10 6, однако очень важно , чтобы размер выборки быть последовательным в течение эксперимента. Изменения числа клеток могут влиять на интенсивность Barcoding и антител окрашивания и должны храниться примерно последовательно через образцы непосредственно сравнивать.

Некоторые процедуры, такие как мертвое мечение клеток и маркировка ДНК, следует проводить в подавляющем большинстве, если не во всех экспериментальных конструкциях. Маркировка мертвых клеток в экспериментах анализируя только поверхностные маркер может быть достигнута при использовании Rh103, но Rh103 следует избегать для экспериментов, где требуются пермеабилизации как это приводит к потере окрашивания. Для экспериментов с пермеабилизацией, рекомендуется использовать цисплатины

Barcoding образцы могут уменьшить потребление антител, сократить время сбора и ликвидации выборки к выборке вариабельность 9. Процесс штрихкодирования включает в себя применение уникального образца конкретного кода для всех ячеек, который используется, чтобы назначить каждую клетку его образец происхождения. После того, как Barcoding образцы могут быть объединены перед использованием меченых антител, процесс, который обеспечивает все образцы окрашивали в равной степени. Чтобы свести к минимуму ошибки эксперимента, благоразумно штрихкода и объединять любые образцы, которые должны быть непосредственно сопоставлены друг с другом. В настоящее время существует несколько способов Barcoding образцов для анализа массы цитометрии 5, 6, 7, две из которых представлены здесь (см ниже).

С имеющимся в настоящее время ReageNт.с. можно количественно оценить обилие 38 мишеней антител, идентификации клеток в S-фазе 10, различают живой и мертвые клетки 8 и измеряют клеточные уровни гипоксии 11 в мультиплексном эксперименте нескольких образцов. Эта способность собирать данные одной ячейки высокого показателя для крупных клеточных популяций позволяет улучшить профилирование популяций сильно неоднородных клеточных и уже подготовила ряд новых биологических идей 12, 13, 14, 15, 16. Перегонка в результате сложных данных в интерпретируемой информации требуется использование вычислительных алгоритмов , включая Spanning Tree Прогрессирование плотности нормированных событий (лопату) 17 и 18 viSNE.

В данной статье представлена ​​доступнаяОбзор того, как проектировать и проводить массу цитометрии эксперимента и представляет основной анализ массы цитометрии данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Сбор клеток

  1. Сбора клеток из первичной ткани
    Примечание: Процесс, описанный для уборки клеток из первичной ткани специфический применимо к ткани опухоли молочной железы мыши и не может быть применимы как к первичным тканям из других источников.
    1. Приготовьте пищеварение буфер растворением 5 мг гиалуронидазы и 30 мг коллагеназы в 10 мл DMEM / F12 сред на грамм ткани, подлежащей обработке. Фильтр стерилизовать пищеварения буфера.
    2. Изолировать первичной опухоли молочной железы у мышей и записи опухоли весом.
    3. Фарш ткани с # 10 скальпелем в течение по крайней мере 5 мин.
    4. Добавить измельченные ткани соответствующего объема буфера пищеварения (10 мл буфера на грамм ткани).
    5. Взболтать измельченной ткани в пищеварении буфере при 100 оборотах в минуту в течение 1-3 ч при 37 ° С.
    6. Получение суспензии отдельных клеток, пропуская клетки через фильтр 0,4 мкм в 50 мл пробирку.
    7. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин при 4 °; С. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
    8. Ресуспендируют осадок в 4 мл DMEM / F12 и передачи до 5 мл с круглым дном трубки.
  2. Сбора клеток из культуры ткани
    1. пластины Промыть или колбу из адгезивных клеток с кальцием и магнием свободного фосфатный буферный солевой раствор (PBS) при комнатной температуре.
      Примечание: метод, описанный для уборки клеток специфически применимо к приверженец эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) культуры клеток человека. Тем не менее, остальная часть описанного протокола широко применим к другим культивируемым клеточным линиям, неприлипающим линиям и первичным клеткам.
    2. Добавить нагретом (37 ° С) трипсин или другой реагент ферментативного расщепления, оптимизированную для достижения суспензии отдельных клеток от прилипших клеток. Следуйте протоколу производителя.
      Примечание: трипсин и другие ферментные реагенты диссоциации имеют возможность влиять на клеточные маркеры.
    3. Инкубируйте планшет при 37° С в течение 2-5 мин, чтобы отделить клетки. Для высоких культур слитности, осторожно нажмите на тарелку, чтобы помочь отделить клетки.
    4. Передача полностью обособленные клетки от пластины в нижней круглой трубку 5 мл и осторожно пипетка с использованием 1 мл пипетки для диссоциации клеток.
      Примечание: Для обработки большого количества проб все этапы могут альтернативно быть выполнены в 96-луночный круглой пластины нижней. Для обработки образцов в 96-луночном формате все смывает могут быть выполнены в объеме 250 мкл. Объемы, описанные в других стадиях могут быть отрегулированы таким образом, общий объем не превышает 300 мкл.
    5. Гасят ферментативным расщеплением реагента с равным объемом буфера для промывки (0,5% BSA и 0,02% азида натрия в PBS).
      Примечание: Азид натрия является опасным химическим веществом. Надлежащие меры предосторожности должны быть соблюдены для его подготовки и обработки.
    6. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 37 ° С. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
    7. Ресуспендируютклеток в 1 мл бессывороточной среды.
    8. Граф клеток путем переноса 10 мкл клеточной суспензии в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Развести аликвоту к известному соотношению в трипановых синий и передачах в гемоцитометр или автоматизированной системе подсчета клеток.
  3. Маркировка S-фаза населения
    Примечание: Если S-фаза маркировка не должны быть выполнены, чтобы перейти шток 1.4.
    1. Подготовить 1 мл 10 мкМ 5-иод-2'-дезоксиуридина (ПИН) в бессывороточной DMEM F12 или другого соответствующего материала для каждого 2 х 10 6 клеток для анализа.
    2. Добавить 500 мкл 10 мкМ ПИН в свободной от сыворотки среды для каждых 2 × 10 6 клеток.
      Примечание: В то время как Idu маркировка может быть выполнена в среде, содержащей сыворотку, свободный белок будет вступать в реакцию с цисплатином, предотвращая надлежащей маркировки мертвых клеток. Если носитель, содержащий сыворотку используется во время Idu маркировки дополнительный этап стирки бессывороточной среды необходимо удалить белки сыворотки, прежде чем цисплатин живой / мертвой STAining.
    3. Аккуратно ресуспендирование гранулы с 1 мл пипетки.
    4. Инкубирую в течение 10 мин при 37 ° С при осторожном покачивании.
  4. Live / Dead этикетирование
    1. Для каждого образца готовят 500 мкл 50 мкМ цисплатина в бессывороточной DMEM-F12 или типа клеток соответствующие средства массовой информации.
      Примечание: Если маркировка S-фаза населения по Idu не должны быть выполнена, образцы ресуспендируют при концентрации 4 × 10 6 клеток / мл. Ресуспендировании клеток перед добавлением цисплатины обеспечивает быстрое смешивание растворов для равномерной живой / мертвой маркировки.
    2. Добавьте 500 мкл 50 мкМ цисплатина на 2 × 10 6 клеток в образцах.
    3. Инкубируют при комнатной температуре (RT) в течение 1 мин на орбитальном шейкере при постоянном перемешивании.
    4. Гасят цисплатины с равным объемом буфера для промывки.
    5. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
    6. Образцы Wash дваждыс 500 мкл буфера для промывки для удаления избытка цисплатин.
    7. Wash образцы дважды 500 мкл PBS, чтобы удалить избыток белка.
  5. Пример фиксации
    1. Ресуспендируют образца в 500 мкл PBS.
    2. Добавить равный объем 4% PFA в PBS до конечной концентрации 2%; пипетка перемешать.
      Примечание: Подготовка 4% PFA свежий из порошка, доведения рН до 6,9 и пропускают через фильтр с размером 0,44 мкм. 4% PFA в PBS можно хранить при температуре 4 ° С в течение двух недель. Избегайте Premade формалин, поставляемый в ампулах, если специально не проверена, так как она часто содержит примесь металлов, которые могут помешать измеренным массовым каналам. Нижняя концентрация PFA может быть достаточным и помочь свести к минимуму эффект фиксации на связывания антитела, но должны быть проверены эмпирически.
    3. Инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере при постоянном перемешивании.
    4. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантируйте или тщательно аспирата надосадочной Without нарушая гранул.
    5. Wash образцы с PBS для удаления раствора PFA.
      Примечание: На этом этапе образцы могут быть кратко хранили при 4 ° С. Длительное хранение при 4 ° С, может привести к деградации образца и снижение окрашивания.

2. Barcoding

Примечание: В то время как методика использования моноизотопной цисплатин Barcoding и палладий Barcoding представлена ​​одновременно, либо можно использовать независимо друг от друга или полностью избежать, если не требуется эксперимент.

  1. Моноизотопная Цисплатин Barcoding
    Примечание: Так как цисплатины штрихкодирование и цисплатины Live / Dead Окрашивания полагается на накладывающихся уходы каналов должны быть приняты для обеспечения того, чтобы фон цисплатины Live / Dead окрашивания в живых клетках минимизируются, так как это может повлиять на точности цисплатин штрихкода.
    1. Развести 1 мМ моноизотопной цисплатин растворы до 200 мкМ в PBS.
    2. При еACH уникальный штрих - код цисплатин подготовить 1,5 мл пробирку с 500 мкл PBS в течение каждых 2 × 10 6 клеток , получающих , что штрих - код.
    3. Чтобы подготовить каждый уникальный штрих-код добавления каждого применимого моноизотопная цисплатин до конечной концентрации 200 нМ.
    4. Ресуспендируют клеток в 500 мкл PBS в 2 × 10 6 клеток.
    5. Добавить равный объем соответствующего решения штрих-кода для каждого образца.
    6. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 мин на орбитальном шейкере при постоянном перемешивании.
    7. Quench цисплатин с равным объемом буфера для промывки.
    8. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
    9. Wash пробы в два раза с 500 мкл промывочного буфера, чтобы удалить избыток цисплатин.
  2. Палладий Barcoding
    Примечание: Палладий Barcoding реагенты могут быть либо подготовлены 5 или куплены на коммерческой основе .
    1. Переходная частичнаяпермеабилизации 19
      Примечание: Палладий комплексообразования штрихкодирования требует частичной пермеабилизации для реагентов, чтобы пройти через клеточную мембрану и энергично маркировать клетки.
      1. Образцы промыть с 500 мкл PBS.
      2. Образцы промыть с помощью 500 мкл PBS плюс 0,02% сапонина.
      3. Ресуспендирует осадок в остаточном объеме.
    2. Применение палладия Barcoding.
      1. Развести 100x запас реагента Barcoding палладия в 1 мл охлажденного льдом PBS плюс 0,02% сапонина.
      2. Быстро добавляют разбавленный Barcoding реагент для ресуспендировали образца.
      3. Инкубирую в течение 15 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере при постоянном перемешивании с.
      4. Wash образцы дважды 500 мкл промывочным буфером.

3. Окрашивание поверхности клеток

Примечание: Поверхность окрашивание клеток может быть выполнено на живые клетки до фиксации. Это может быть необходимо для антител, которые теряют сродство к theiг эпитоп после фиксации. Некоторые образцы клеток могут извлечь выгоду из дополнительной блокировки, такие, как блокирование Fc для лейкоцитов, до маркировки антител, чтобы уменьшить фон. Оптимальная блокировка должна быть определена эмпирически для конкретного типа образца.

  1. Подготовка поверхности клетки окрашивания антител панель.
    1. Смешайте 0,5 мкл, или эмпирически определенное количество, каждого 0,5 мг / мл клеточной поверхности антитела на образце в 1,5 мл трубки. Добавить промывочный буфер, если это необходимо, чтобы довести объем до 10 мкл на пробу. Смешать с помощью пипетки.
      Примечание: Определение работы разбавления для каждого антитела до эксперимента эмпирически путем титрования эксперимента.
    2. Разделение на клеточной поверхности бассейна антитела в равной мере в одну пробирку 1,5 мл для каждого образца, чтобы быть окрашены.
    3. Подготовьте 500 мкл промывочного буфера в 1,5 мл трубки для каждого образца.
  2. Нанесите поверхностное окрашивание клеток в образцах в нормализованном объеме для всех образцов.
    Примечание: Для епзаЮр маркировки в соответствии антитела по нескольким образцам важно тщательно контролировать объем образца и концентрацию антитела. Следующие шаги направлены на достижение этой последовательности, гарантируя, что окончательные объемы проб после того, как антитело было добавлено равномерны.
    1. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
    2. С 200 мкл пипетки набора до 50 мкл, удалить остатки раствора из образца гранул и переноса в трубке аликвоты клеточной поверхности бассейна антител.
    3. Пипетировать всю жидкость в трубке аликвоты без втягивания воздуха в наконечник пипетки.
    4. Удерживая поршень пипетки, чтобы избежать втягивания воздуха переместить наконечник в подготовленную пробирку 500 мкл буфером для промывки и отпустить поршень.
    5. Добавить обратно содержимое наконечника пипетки к образцу и ресуспендирует образец в жидкости с нежной пипеткой.
    6. Инкубируйте образцы для 1ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере при постоянном перемешивании.
    7. Wash пробы в два раза с 500 мкл промывочного буфера, чтобы гарантировать, что все свободное антитело вымывают.
    8. Образцы промыть с 500 мкл PBS.
    9. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл PBS.
    10. Добавить равный объем 4% PFA в PBS; пипетка перемешать.
    11. Инкубируют в течение 10 мин на орбитальном шейкере.

4. проницаемости клеточной мембраны и внутриклеточных Окрашивание

  1. проницаемости клеточной мембраны
    1. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
    2. Ресуспендируют клетки в остаточном объеме, осторожно встряхивая, пока осадок не диссоциируют.
      Примечание: Если не диссоциирует клетку перед добавлением МеОН приведет клетки, прилипшие вместе и производить тонкую пленку, которая приведет к частичной потере образца.
    3. Сразу же добавить 1 мл 100% MeOH в 2 × 10 6 </ SUP> клетки и осторожно пипеткой перемешать.
      Примечание: Другие способы пермеабилизирующих может быть заменены МеОН и может быть необходимо для достижения оптимального пермеабилизации для некоторых типов клеток. Для некоторых клеточных источников 0,1% Тритон Х-100, 0,2% твин-20 или 0,1% сапонина в растворе PBS для пермеабилизации может поддерживать целостность клеток лучше, обеспечивая при этом последовательное пермеабилизации.
    4. Инкубируйте образцы в течение по крайней мере 1 ч или до максимума 24 ч при 4 ° С в течение пермеабилизации.
      Примечание: На этом этапе образцы в MeOH могут храниться в течение 1 месяца при температуре -80 ° С.
    5. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
    6. Добавить 1 мл промывочного буфера для каждых мл МеОН используется для проницаемого образца. Аккуратно ресуспендируют осадок клеток.
    7. Промыть образец дважды 500 мкл промывочный буфер.
  2. Подготовьте внутриклеточное окрашивание панель антител.
    1. Смешайте 0,5 мкл, или эмпирически определенное количество, каждого 0,5 мг / мл внутриклеточного антитела на образце в 1,5 мл трубки. Добавить промывочный буфер, если это необходимо, чтобы довести объем до 10 мкл на пробу. Смешать с помощью пипетки.
    2. Разделить внутриклеточный пул антител в равной мере в одну пробирку 1,5 мл для каждого образца.
    3. Подготовьте 500 мкл промывочного буфера в 1,5 мл трубки для каждого образца.
  3. Применение внутриклеточного окрашивания для образцов в нормализованном объеме для всех образцов.
    Примечание: Для того, чтобы обеспечить последовательное мечение антител на несколько образцов, важно тщательно контролировать объем пробы и концентрацию антител.
    1. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
    2. С 200 мкл пипеткой, установленной на 50 мкл удалить остатки раствора из образца гранул и переноса в трубке аликвоты клеточной поверхности бассейна антител.
    3. пипеткався жидкость в трубке аликвота без втягивания воздуха в наконечник пипетки.
    4. Удерживая поршень пипетки, чтобы избежать втягивания воздуха переместить наконечник в подготовленную пробирку 500 мкл буфера для промывки и отпустить поршень, составление промывочного буфера для общего объема образца 50 мкл.
    5. Добавить обратно содержимое наконечника пипетки к образцу и ресуспендирует образец в жидкости с нежной пипеткой.
    6. Инкубируйте образцы в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере при постоянном перемешивании.
    7. Wash образцы дважды 500 мкл промывочным буфером.
    8. Образцы промыть с 500 мкл PBS.

5. Иридий Этикетировочное

  1. образцы Fix
    1. Образцы Ресуспендируют в 500 мкл PBS.
    2. Добавить 500 мкл 4% PFA в PBS.
    3. Инкубировать в течение как минимум 15 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере при постоянном перемешивании.
  2. Нанести Iridium мечения ДНК
    1. Добавить 500 мкл 62,5 нМ иридий раствора PFA к образцам.
      Примечание: Для экспериментов с использованием клеток проницаемыми, разбавить 500x Ir191 / 193 запас для окончательного разведения 1: 2000, чтобы избежать overstaining.
    2. Инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере при постоянном перемешивании.
      Примечание: При выполнении моноизотопной цисплатин Barcoding не инкубировать образцы с иридием в течение более 15 мин, так как сильные Ir193 сигналы могут внести свой вклад в массе-канал Pt194 и отрицательно влияют на качество Barcoding.
    3. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
    4. Образцы Wash два раза с 500 мкл 0,1% БСА в фильтрованной деионизованной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После подготовки мы рекомендуем запускать образцы в течение 24 часов, если это возможно. Приготовленные образцы могут быть сохранены в краткосрочной перспективе при 4 ° С,но следует соблюдать осторожность, чтобы избежать деградации. Если возможно конечные промывки должны быть выполнены в фильтрованной деионизованной воде без БСА, так как это приведет к снижению отложений на распылительной камере и сэмплера конусов машины, которая будет уменьшаться очистки прибора. Для получения ЭСКА необходимо выполнить эти промывки, а в том числе БСА, чтобы избежать потерь образца от прилипания к поверхности трубы.

6. Подготовка образцов для приобретения

  1. Количество ячеек
    1. Ресуспендируют клетки в 500 мкл 0,1% БСА в фильтрованной деионизированной воде и фильтруют в свежую пробирку через колпачок фильтра 35 мкм клеток.
      Примечание: Понижение уровня BSA для конечных промывок уменьшает остаток оставил на цитометрию небулайзере Mass. Неприлипающие клетки могут быть промыты и повторно суспендируют в деионизированной воде фильтруют.
    2. Граф клеток путем переноса 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужных трубки. Развести аликвоту к известному соотношению втрипановые синий (чтобы помочь с визуализацией клеток) и передать гемоцитометр или автоматизированной системе подсчета клеток.
    3. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Декантируйте или тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
  2. Подготовка и образцы нагрузки
    1. Для приготовления калибровочных бусин удалить из холодильника и энергично встряхивают для ресуспендирования.
    2. При работе с использованием образцов массой цитометрии пробоотборником, добавить 50 мкл калибровочных шариков в каждую лунку для образца пластины затем добавить нужное число ячеек, которые будут проанализированы. При работе образцы с помощью ручной инъекции добавляют 50 мкл калибровочных шариков к образцу, развести образец в фильтрованной деионизованной воды, хорошо перемешать и образец нагрузки в массу цитометрии образца инъекционного порта. Соответствующее разведение образца может варьироваться в зависимости от типа клеток анализируемого, но разбавление 10 6 , как правило , целесообразно 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол, представленные здесь, могут найти широкое применение в самых различных культурных и первичных клеточных образцов с только незначительными изменениями. В зависимости от требований эксперимента, она может быть выполнена по модульному принципу, когда некоторые элементы, такие как Barcoding или поверхности клетки окрашивание, не являются необходимыми. Использовано в полном объеме этого протокол обеспечивает получение мультиплексированной массы цитометрии образцов, меченные для идентификации популяции клеток исключения мертвого, S-фазы и окрашивали для количественного определения до 38 целевых антител.

Ожидаемые результаты , полученные с помощью методов , описанных в данном протоколе (рисунок 2) изображены на фиг.3. После сбора данных, нормализация интенсивности сигнала на основе интенсивности борта калибровки может быть выполнена в программном обеспечении массовой цитометрии. После нормализации, начальный проц данныеssing удалить калибровочные шарики, ворота на отдельные клетки и удалить мертвые клетки может быть выполнено вручную с помощью любого программного обеспечения, способного анализа проточной цитометрии данных. Удаление калибровочных шариков может быть выполнено вручную , путем стробирования на популяции Ir191 + Ce140- (фиг.3А) или с основанным MATLAB алгоритма 20. Одноклеточные события (черный контур, фигура 3В) может быть закрытого типа при удалении мусора и клеточных мультиплеты, путем стробирования на двухосной участке Ir193 и длина события (рис 3B). Цисплатины маркировка мертвых клеток может быть использована для определения количества клеточной смерти; показаны примеры образцов с низким (рис 3D) и выше (рис 3М) количеством мертвых клеток. Мертвые клетки могут быть удалены из данных путем стробирования от населения Pt198 + (рис 3E). Штриховой код образцов, то ли с моноизотопными цисплатинами или палладиевыми реагентами, приводит к отчетливому разделению саmples в пределах параметров Barcoding (рис 3C), который позволяет клеткам быть отнесены к их первоначальной идентичности образца. Дополнительные необязательные методы, такие как маркировка ПИН, разрешить обнаружение конкретных групп населения, например, S-фазные клетки (рис 3F). После первоначального нормализации, debarcoding и стробирования, высокие размерные данные могут быть проанализированы с использованием различных алгоритмов , в том числе ЛОПАТУ 17 и несколько других , предназначенных для масс цитометрии анализа и визуализации данных 18. Алгоритмы , такие как лопата принимают высокие пространственные данные, которые могут быть трудно интерпретировать , поскольку он не может быть непосредственно визуализировать в своем высоком размерном состоянии, и генерировать более низкое мерное представление данных, которое является более пригодным для визуальной интерпретации (рис 3G).

Рисунок 1 Рисунок 1: Основные принципы массы цитометрии измерения. Подготовка образцов для клеточных масс цитометрии включает окрашивание клетки с антителами меченных изотопами металлов, в основном из лантаноидов элементов. В этой схеме каждое антитело, индуцированное против конкретного эпитопа помечено изотоп, обладающим уникальной атомной массой, таких как самарий 154. антител против эпитопов, которые являются поверхностными, цитоплазматическим, ядерным или хроматин локализуется потенциально может быть использован. Меченые клетки инъецируют и распыляется через массу цитометрии небулайзера в виде капель одиночных клеток, где они ионизируются аргоновой плазменной горелки. Облака Полученные частицы удаляют из атомов низких масс с помощью квадрупольного масс-фильтра в то время как обилие больших ионов атомной массы измеряются с помощью детектора. Отмеренное количество каждого уникального массового иона соответствует клеточному изобилию целевого эпитопа связанного с ним антителом. В то время как теоретический лIMIT из более чем 100 параметров может быть определена количественно с использованием этой методики, существующие коммерчески доступные реагенты позволяют обнаруживать более 40 параметров на клетку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Процедура схема экспериментальной процедуры и дополнительных шагов. Живописание из основных этапов в протоколе получения клеток для массовой цитометрии. Дополнительные шаги обозначены оранжевыми коробки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3Пример данных , полученных от м задницы цитометрии. (А) двухосный график , показывающий разделение клеток (высокая Ir191, низкая Се140), бусы (низкая Ir191, высокая Се140) и шарик-клеточные дублеты (высокая Ir191, высокая Се140). (B) двухосный график , показывающий ожидаемый внешний вид Ir193 против длины событий. Стробирование отдельных клеток, который удаляет продукты распада клеток и клеточных мультиплеты показано. (С) двухосный график , показывающий пример вид двух массовых каналов из цисплатина штрихкодирования. - Е) Пример данные из цисплатина Live / Dead окрашивания для образцов с низким процентом (D) и высоким процентом (Е) мертвых клеток. (F) , двухосный участок клеток Н9 чЭСКа , меченных Idu различать клетки в S-фазе , и антитело против циклина В1 для того чтобы отличать клеточный цикл. (G Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, представленные здесь, были успешно использованы для обработки различных культивируемых клеточных линий (H1 и H9 ЭСК, mESCs, MCF7, НЕК 293, KBM5, HMEC, MCF10A) и образцов первичных тканей (костного мозга мыши, мыши эмбриональной печени, мыши взрослых печени, опухоль мыши). Независимо от источника, любой ткани, которые могут быть диссоциированы на отдельные клетки при сохранении клеточного состояния должны быть пригодны для анализа по массе цитометрии, но может потребовать некоторой оптимизации протокола. Важно отметить, что некоторые эпитопы могут быть затронуты специфические диссоциации, фиксации и проницаемости процедур, используемых и эти методы, возможно, потребуется пройти образец конкретной оптимизации. Если низкий уровень сигнала наблюдается для антитела может быть возможным, чтобы улучшить путем выполнения клеточной поверхности маркировки на живых клетках, изменение методов проницаемости, или уменьшения времени фиксации.

Когда это возможно в рамках эксперимента, в том числе штрихкодирования в тысРабочий процесс электронной обработки образцов обеспечивает согласованность между образцами на уровне клеток и антител концентрации. Без штрихкодирования, даже когда большая осторожность, чтобы управлять обработкой образца, вполне вероятно, что небольшие вариации в концентрации антител и концентрации клеток будут введены между образцами. Кроме того, как процентное содержание клеток, положительных для конкретных эпитопов, вероятно, различаются между образцами, эффективное отношение антитела к эпитопу обязательно могут отличаться между образцами, даже если общая концентрация антител сохраняется последовательно, что потенциально ведет к несоответствиям в меченых антител. Эти вариации, в то время как правило, незначительные при наблюдении одного канала, могут стать значительно усугубляются при выполнении эксперимента высокого параметра и могут быть неверно истолкован как биологически значимыми, если не соблюдать осторожность при анализе данных.

Анализ полученных данных от массы цитометрии эксперимента может принимать различные формы, а также ряд computaнальные подходы были адаптированы специально для этого приложения. Предоставляя исчерпывающий обзор полезных алгоритмов для масс цитометрии анализа данных выходят за рамки этой рукописи, подходы , которые были успешно использованы, выделены и заинтересованные читатели направлены на несколько ресурсов , охватывающих эту тему 21, 22, 23. Два из наиболее широко используемой, имеющейся в настоящее время подходы к анализу массовых цитометрии данных Spanning Tree прогрессии плотности нормализует события (лопата) и viSNE. ЛОПАТА образует кластеры из групп клеток с аналогичной экспрессией маркеров и представляет каждый кластер в качестве узла. Эти узлы расположены в лопату дерева , где аналогичные узлы соединены линией (рис 3G). viSNE использует Т-Распределенная Стохастический алгоритм Neighbor Встраивание 24 , чтобы генерировать двумерное представлениеданные высокой размерности, сохраняя при этом общую структуру данных. Оба лопаты и viSNE записываются в MATLAB, исходный код находится в свободном доступе и может быть запущен пользователями с MATLAB. Кроме того, автономная версия лопаты доступна.

В то время как масса цитометрия в настоящее время допускает сбор наибольшего количества параметров, флуоресцентная метка на основе цитометрия может быть лучше подходит для некоторых приложений. Флуоресцентные цитометрии потока могут анализировать больше клеток в секунду, до 5 × 10 4 по сравнению с 500-1000 для массы цитометрии, и более доступными подтверждены антитела 25. Дополнительные достижения в области потока флуоресцентной цитометрии, такие как гиперспектральная цитометрии 26 и 27 новых флуорофоры делают флуоресценции проточной цитометрией жизнеспособной альтернативы для всех , кроме очень высоких экспериментов параметров. Дополнительные методы , такие как измерение РНК 28 возможно ранее толькос помощью проточной цитометрии на основе флуоресценции были недавно адаптированы к массе цитометрии позволяет одновременное обнаружение белка и РНК 29. Будущее расширение доступных изотопов и реагентов, чтобы более полно использовать массовое окно измеримых изотопов и расширить репертуар измеримых клеточных характеристик позволит расширить глубину профилирования можно по массе цитометрии.

Большое число параметров, которые могут быть проанализированы одновременно с помощью масс-цитометрии значительно расширяет экспериментальные вопросы, которые могут быть исследованы. Мы надеемся, что эта статья и сопровождающие видео протокол позволят заинтересованным исследователям более эффективно использовать массу цитометрии для продвижения своих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. e4398 (2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics