質量サイトメトリー分析のための試料調製

Biology

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McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

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Abstract

質量サイトメトリーは、重金属標識とコンジュゲートした抗体、大幅に良く従来の蛍光ベースのフローサイトメトリーを用いて可能であるものを超えて深い分析のためのパラメータと機会の数を増加させたアプローチを利用します。すべての新しい技術と同様に、高品質、信頼性の高いデータの生成を確保するための重要なステップがあります。ここに提示質量サイトメトリー分析のための細胞試料を処理するための複数の技術を組み込んで最適化されたプロトコルです。ここで説明する方法は、ユーザーが一般的な落とし穴を回避し、不正確なデータにつながる可能性の変動を、最小限に抑えることにより、一貫性のある結果を達成するのに役立ちます。実験計画を通知するために、プロトコルと調査されているシステムの生物学に新たな知見を暴くにおけるそれらの効果でオプションまたは代替の手順の理論的根拠が覆われています。最後に、代表的なデータは、技術のpresenteから予想される結果を説明するために提示されていますここでdは。

Introduction

フローサイトメトリーは、細胞の大集団を横切る単一細胞レベルでの複数の標的抗体の同時測定を可能にします。従来の蛍光ベースのフローサイトメトリーでは、定量化可能なパラメータの数は、パラメータの数が増加するにつれてますます複雑補償計算を必要とする複数のフルオロフォアの発光スペクトルとの間のスペクトルの重なりによって制限されます。これらの制限は、重金属標識抗体が検出され、大幅に同時に収集するパラメータの数を拡張し、個々のセルのために高次元のタンパク質存在量プロファイルを生成するフライト(TOF)質量分析の時間によって定量化されているマスサイトメトリーによって対処されます。

器具サイトメトリー質量の仕組みの基本的な理解は、ユーザーにとって有益であり、トラブルシューティングのために不可欠であり得ます。より徹底したチューニングの説明とマスサイトメトリーのマシンを実行するために、関連の原稿1を参照してください。簡潔には、細胞試料は、細胞表面マーカー、細胞質タンパク質、核タンパク質、クロマチン結合タンパク質または目的の他のエピトープ( 図1I)を標的と金属結合した抗体のパネルで標識されます。標識された細胞は、手動注射によって一度に一つまたはその96ウェルプレートからサンプルをオートサンプラーを使用してのいずれかで、機械にロードされています。ロードされた細胞は、細胞( 図1II)を封入液滴のスプレーを生成する噴霧器を介して注入されます。細胞は、アルゴンプラズマトーチによってイオン化されるように、このスプレーは配置されています。このイオン化は、各セルを構成する全原子からなる粒子雲( 図1iii)を生成します。この粒子雲が検出器に移動するように、低原子質量の原子は四重極質量フィルタによって高質量のイオンから分離されます。残りの高質量イオンは検出器、abundに進み各同位体のANCEは( 図1iv)定量化されます。検出器によって収集された生データは、細胞イベントを識別するために、マスサイトメトリー機器ソフトウェアによって分析されます。識別された各セルのイベントのために、各チャネルで検出された信号を定量化して出力.fcsファイルに保存します。重金属結合した抗体を検出するための質量チャネルは1%以下、最も貢献して0から4パーセントの範囲で最小のスペクトルオーバーラップを示します。そのため、チャネル間のこの低クロストークのために、それは分析2の前に補償行列にデータを変換するために、一般的に不要です。しかし、注意は、この可能性があるため、高存在量のエピトープを有する抗体は、低存在量の抗体に割り当てられたチャネルに信号を寄与質量チャネルに割り当てられていないことを保証するために、抗体の実験パネルの設計時に注意すべきです信号寄与を受信チャンネルに人為的に高い人口を作成します。

3,4で発生することが知られているように、いくつかの固定は、細胞表面抗体と適切な染色を防止することができます。生細胞上の細胞表面抗体染色を実行するいくつかの抗体のために必要であるが、これは抗体ベースのバーコード6、7例外であるが、ほとんどのバーコード法は固定5の後に実行される抗体標識の前にバーコード化のオプションを排除することができます。

分析のために調製される細胞の数を決定するとき、マシンにロードされた細胞の画分のみが検出され、データを生成することを知ることが重要です。ネブライザーは、トーチでサンプルを噴霧するとき、この損失は、非効率性が主な要因です。正確なパーセント損失は50から85パーセントの範囲であることができる機械のセットアップおよび細胞型が、フローサイトメトリー質量に依存しなければなりません実験を設計する際に考慮しました。このプロトコルは、サンプルあたり2×10 6個の細胞のために最適化されているが、より小さいまたはより大きいサンプルサイズを処理するために適合させることができます。このプロトコルは、しかし、サンプルサイズが実験内一貫性が保たれることが重要であり、4×10 6、1×10 6からのサンプルサイズに対して最小の変更を加えて使用することができます。細胞数の変化は、バーコードおよび抗体染色の強度に影響を与えることができると直接比較されるべきサンプルを横切って概ね一貫性が保たれるべきです。

すべての実験デザインされていない場合、このような死んだ細胞標識およびDNA標識のようないくつかの手順は、、大多数で行われるべきです。唯一の表面マーカーを分析する実験における死細胞の標識はRh103を用いて達成することができるが、Rh103は、それは染色損失をもたらすよう透過が必要とされる実験のために避けるべきです。透過性を含む実験のために、シスプラチンを利用することをお勧めします

バーコードのサンプルは、サンプル間の変動性を、抗体の消費を減らす取得時間を減少させ、除去することができる9。バーコードのプロセスは、その起源のサンプルに各セルを割り当てるために使用されている全ての細胞に固有のサンプル固有のコードを適用することを含みます。サンプルをバーコード化した後、抗体染色、すべてのサンプルを均等に染色されることを保証する工程の前にプールされてもよいです。実験誤差を最小にするために、それはバーコードに慎重であり、互いに直接比較される任意の試料をプールします。現在(下記参照)、ここで提示されているそのうちの2つ質量サイトメトリー分析5、6、7、のためのバーコードサンプルのいくつかの方法が存在します。

現在入手可能なreagen付きTSは、38個の抗体の標的の存在量を定量S期10で細胞を同定、生細胞と死細胞8を区別し、複数のサンプルの多重化実験における低酸素11の細胞レベルを測定することが可能です。大きな細胞集団のための高パラメーター単一細胞データを収集するこの能力は、非常に不均一な細胞集団の改善されたプロファイリングを可能にし、既に新規な生物学的洞察12、13、14、15、16の数を生産しています。解釈情報に得られた複素データを蒸留すると、スパニングツリー密度正規化イベントの進行(SPADE)17とviSNE 18を含む計算アルゴリズムの使用を必要としています。

この記事では、アクセスを提供します設計・マスサイトメトリー実験を実施する方法の概要とマスサイトメトリーデータの基本的な分析を紹介します。

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Protocol

1.細胞の回収

  1. 一次組織から採取した細胞
    注:一次組織から採取細胞について記載された方法は、マウス乳房腫瘍組織に特異的に適用可能であり、他の供給源からの一次組織にそのまま適用できないかもしれません。
    1. 処理されるべき組織のグラムあたり10mLのDMEM / F12培地中で5 mgのヒアルロニダーゼおよび30mgコラゲナーゼを溶解することによって消化緩衝液を調製します。消化緩衝液を滅菌フィルター。
    2. マウスとレコード腫瘍重量から主乳腺腫瘍を分離します。
    3. 少なくとも5分間#10メスで組織をミンチ。
    4. 消化緩衝液(組織のグラムあたり10mlの緩衝液)の適切な容積に細分化した組織を加えます。
    5. 37℃で1-3時間、100rpmで消化緩衝液中に細かく切り刻まれた組織を振ります。
    6. 50mlのチューブに0.4μmのフィルターを通して細胞を通過させることによって、単一細胞懸濁液を得ます。
    7. 4℃で10分間、300×gで遠心分離細胞; C。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
    8. 再懸濁4mLのDMEM / F12でペレットと5 mL丸底チューブに移します。
  2. 組織培養から収穫の細胞
    1. 洗濯板又は室温でカルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて接着細胞のフラスコ。
      注:収穫細胞について記載された技術は、接着性ヒト胚性幹細胞(hESCの)培養細胞に特異的に適用可能です。しかしながら、記載されたプロトコルの残りは、他の培養細胞株、非付着株および初代細胞に広く適用可能です。
    2. 温めた(37℃)トリプシンまたは接着細胞からの単一細胞懸濁液を得るために最適化された他の酵素消化試薬を加えます。製造者のプロトコルに従ってください。
      注:トリプシンおよび他の酵素的解離試薬は、細胞マーカーに影響を及ぼす可能性があります。
    3. 37℃でプレートをインキュベート細胞を分離するために2-5分間C°。高コンフルエント培養のために、優しく細胞を剥離を助けるためにプレートをタップします。
    4. 5mLの丸底チューブにプレートから完全に剥離した細胞を移し、穏やかに細胞を解離するために1 mLのピペットを使用してピペット。
      注:多数のサンプルを処理するためのすべての手順は、代替的に96ウェル丸底プレート中で行うことができます。 96ウェルフォーマットでサンプルを処理するための全ての洗浄は、250μLの容量で行うことができます。総容積は300μLを超えないように、他の工程に記載のボリュームを調整することができます。
    5. (PBS中0.5%BSAおよび0.02%アジ化ナトリウム)等体積の洗浄緩衝液で酵素消化試薬をクエンチしました。
      注:アジ化ナトリウムは、危険な化学物質です。適切な安全措置は、その調製および取り扱いのために観察する必要があります。
    6. 37℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
    7. 再懸濁1 mLの無血清培地中の細胞。
    8. 1.5mLのマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液10μLを移すことによって、細胞をカウント。トリパンブルーで既知の比率にアリコートを希釈し、血球計又は自動細胞計数システムに転送します。
  3. S-相人口の標識
    注:S-相標識は行うことがされていない場合は1.4を幹に進みます。
    1. 各2×10 6個の細胞を分析するための無血清DMEM F12または他の適切な培地中で10μMの5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IDU)を1mLを調製。
    2. 各2×10 6細胞用無血清培地で10のμMIDUの500μLを追加します。
      注:IDUの標識は、血清を含む培地で行うことができますが、自由なタンパク質は、死んだ細胞に関する表示の適正化を防止し、シスプラチンと反応します。血清を含む培地は、追加の洗浄ステップを標識IDU中に使用されている場合は無血清培地は、シスプラチン生/死STA前血清タンパク質を除去する必要があるさining。
    3. 穏やか1mLのピペットでペレットを再懸濁します。
    4. 穏やかに揺り動かしながら37℃で10分間インキュベートします。
  4. ライブ/デッドラベル
    1. 各サンプルについて、無血清DMEM-F12または細胞型の適切な培地中で50μMシスプラチンの500μLを準備します。
      注:IDUによってS期集団の標識ではない実行される場合、4×10 6細胞/ mLの濃度で再懸濁サンプル。シスプラチンを追加する前に細胞を再懸濁して均一な生/死標識のためのソリューションの迅速な混合を可能にします。
    2. サンプルに2×10 6個の細胞あたり50μMシスプラチンの500μLを加えます。
    3. 一定に混合しながら、オービタルシェーカー上で1分間室温(RT)でインキュベートします。
    4. 洗浄緩衝液の等量シスプラチンを急冷。
    5. RTで5分間300×gで遠心分離した細胞。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
    6. 二回洗浄サンプル500μL洗浄緩衝液で過剰シスプラチンを削除します。
    7. 余分なタンパク質を除去するために500μLPBSで2回洗浄サンプル。
  5. サンプルの固定
    1. 500μLのPBSに再懸濁サンプル。
    2. 2%の最終濃度のためにPBS中4%PFAの等量を加えます。混合するピペット。
      注:6.9にpHを調整し、0.44μmのフィルターを通過し、粉末から4%PFAの新鮮を準備します。 PBS中の4%PFAは、2週間まで4℃で保存することができます。それは、多くの場合、測定質量チャネルと干渉する可能性金属汚染物質を含有するように、具体的に試験しない限り、アンプルで供給既成ホルマリンを避けます。 PFAの低濃度で十分と結合する抗体の固定化の影響を最小限にするために助けることが経験的にテストする必要があります。
    3. 一定に混合しながら、オービタルシェーカー上でRTで15分間インキュベートします。
    4. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。デカントまたは慎重に上清のwiを吸引ペレットを乱さthout。
    5. PFA溶液を除去するためにPBSで洗浄サンプル。
      注:このステップでは、サンプルは4°Cで簡単に保存することができます。 4℃での長期保管は、試料の劣化をもたらし、染色を減少させてもよいです。

2.バーコーディング

注:モノアイソトピックシスプラチンのバーコードとパラジウムバーコードを利用するための方法論が同時に提示されている間、どちらかが独立して使用することができるか、実験が必要としない場合は完全に回避。

  1. モノアイソシスプラチンとバーコード
    注:シスプラチンのバーコード及びシスプラチンライブ/デッド染色するので、重複チャンネルのケアに依存しているが、これは、シスプラチンバーコードの精度を妨げる可能性として生きた細胞内でその背景シスプラチンライブ/デッド染色が最小化されているように注意しなければなりません。
    1. PBS中の200μMに1mMのモノアイソトピックシスプラチン原液を希釈します。
    2. EのACHユニークシスプラチンバーコードは、バーコードを受信し各2×10 6個の細胞を500μlのPBSで1.5mlチューブを準備します。
    3. それぞれ固有のバーコードが200nmの最終濃度まで各該当モノシスプラチンを追加作製しました。
    4. 2×10 6細胞当たり500μlのPBSに再懸濁細胞。
    5. 各サンプルに対応するバーコード溶液の等量を加えます。
    6. 一定に混合しながら、オービタルシェーカー上で5分間RTでサンプルをインキュベートします。
    7. 洗浄緩衝液の等量シスプラチンを急冷。
    8. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
    9. 二回500μLの洗浄緩衝液で洗浄サンプルは、過剰シスプラチンを削除します。
  2. パラジウムバーコーディング
    注:パラジウムバーコード試薬はいずれかの準備5または商業的に購入することができます。
    1. 部分的な過渡透過19
      注:パラジウムキレートバーコードは、試薬は、細胞膜を通過し、確実に細胞を標識するための部分的な透過性を必要とします。
      1. 500μLPBSで洗浄サンプル。
      2. 500μLのPBSプラス0.02%サポニンで洗浄サンプル。
      3. 残留ボリュームに再懸濁ペレット。
    2. パラジウムバーコードを適用します。
      1. 1 mLの氷冷PBSプラス0.02%サポニンでパラジウムバーコード試薬の100Xストックを希釈します。
      2. 急速に再懸濁したサンプルに希釈したバーコード試薬を加えます。
      3. 一定に混合しながらでオービタルシェーカー上でRTで15分間インキュベートします。
      4. 洗浄サンプルは二回500μLでバッファを洗います。

3.細胞表面染色

注:細胞表面染色は、固定前に生きた細胞で実施することができます。これはtheiのための親和性を失う抗体について必要があるかもしれません固定後のRエピトープ。いくつかの細胞試料は、バックグラウンドを減少させる前に抗体標識への白血球に対するFcブロッキングなど、追加のブロックから利益を得ることができます。最適なブロッキングは、特定のサンプルタイプのために、経験的に決定されるべきです。

  1. 細胞表面抗体染色パネルを準備します。
    1. 1.5mLのチューブにサンプルあたりそれぞれ0.5 mg / mlと細胞表面抗体の0.5μL、または経験的に決定された量を組み合わせます。サンプルあたり10μLにボリュームを起動するには、必要に応じて洗浄バッファーを追加します。ピペッティングにより混和します。
      注:滴定実験によって経験的に実験の前に、各抗体の作業希釈を決定します。
    2. 分裂細胞表面抗体プール等しく染色される各サンプルに対して1本の1.5mlチューブに。
    3. 各サンプルの1.5mlチューブに洗浄緩衝液500μlを調製します。
  2. 全ての試料についての正規化体積で試料に細胞表面染色を適用します。
    注:ENSへ複数のサンプル間で一貫性のあるURE抗体標識には、慎重にサンプル量と抗体の濃度を制御することが重要です。次の手順では、抗体が追加された後、最終的なサンプル量が均一であることを確実にすることによって、この一貫性を達成することを目指しています。
    1. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
    2. 50μLの200μLピペットセットを、アリコートの細胞表面抗体プールのチューブに試料ペレット及び転送から残りの溶液を除去します。
    3. ピペットチップ内に空気を引き込むことなく、アリコート管中のすべての液体をピペット。
    4. 空気が500μLの調製管に先端を移動描画避けるためにピペットプランジャを保持しながらプランジャをバッファと解放洗います。
    5. サンプルにピペットチップの内容を再度追加し、穏やかにピペッティングして、液体中に試料を懸濁します。
    6. 1のためのサンプルをインキュベート一定に混合しながら、オービタルシェーカー上でRTでH。
    7. 二回500μLの洗浄緩衝液で洗浄サンプルは、すべての遊離抗体が洗い流されていることを確認します。
    8. 500μLPBSで洗浄サンプル。
    9. 500μlのPBS中に細胞ペレットを再懸濁します。
    10. PBS中4%PFAの等量を加えます。混合するピペット。
    11. オービタルシェーカー上で10分間インキュベートします。

4.細胞透過および細胞内染色

  1. 細胞透過
    1. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
    2. ペレットが解離されるまで穏やかにボルテックスにより残留量に細胞を再懸濁。
      注:MeOHを一緒に接着している細胞をもたらす追加および部分的試料の損失につながるであろう薄膜の製造に先立って細胞を解離するために失敗しました。
    3. 直ちに<2×10 6個あたり100%のMeOH 1 mLを加え/ SUP>細胞と混合する優しくピペット。
      注:他の透過化方法をMeOHの代わりに使用することができ、いくつかの細胞型のための最適な透過性を達成するために必要であってもよいです。依然として一貫透過性を提供しながら、いくつかの細胞ソースの透過のためにPBS溶液中の0.1%トリトンX-100、0.2%のTween-20または0.1%サポニンは、より良好な細胞の完全性を維持することができます。
    4. 少なくとも1時間または透過4℃で24時間の最大値までのサンプルをインキュベートします。
      注:このステップでMeOH中のサンプルを-80℃で1ヶ月まで保存することができます。
    5. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
    6. 各mlのMeOH中の洗浄緩衝液1 mLを加え、試料を透過するために使用されます。静かに細胞ペレットを再懸濁します。
    7. 500μLの洗浄緩衝液で二回サンプルを洗ってください。
  2. 細胞内抗体染色パネルを準備します。
    1. 1.5mLのチューブにサンプルあたりそれぞれ0.5 mg / mlと細胞内抗体の0.5μL、または経験的に決定された量を組み合わせます。サンプルあたり10μLにボリュームを起動するには、必要に応じて洗浄バッファーを追加します。ピペッティングにより混和します。
    2. 均等各サンプルに対して1本の1.5mlチューブに細胞内抗体プールを分割します。
    3. 各サンプルの1.5mlチューブに洗浄緩衝液500μLを準備します。
  3. すべてのサンプルについて正規化されたボリューム内のサンプルに細胞内染色を適用します。
    注:慎重にサンプル量と抗体の濃度を制御することが不可欠である複数のサンプル間で一貫性の抗体標識を確保するため。
    1. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
    2. 200μLピペット50μLに設定して等分細胞表面抗体プールの管に試料ペレット及び転送から残りの溶液を除去します。
    3. ピペットアップアリコートチューブ内の液体のすべてのピペットチップ内に空気を引き込むことはありません。
    4. 空気が500μLの調製管に先端を移動描画避けるためにピペットプランジャを保持しながら、50μLの総サンプル体積のための洗浄緩衝液を描く、プランジャバッファと解放洗います。
    5. サンプルにピペットチップの内容を再度追加し、穏やかにピペッティングして、液体中に試料を懸濁します。
    6. 一定に混合しながら、オービタルシェーカー上で室温で1時間試料をインキュベートします。
    7. 洗浄サンプルは二回500μLでバッファを洗います。
    8. 500μLPBSで洗浄サンプル。

5.イリジウムラベリング

  1. サンプルを修正
    1. PBS 500μLで再懸濁サンプル。
    2. PBS中の4%PFAの500μLを追加します。
    3. 一定に混合しながら、オービタルシェーカー上でRTで15分間の最小インキュベートします。
  2. DNAのイリジウムラベルを適用します。
    1. サンプルに500μL62.5 nMのイリジウムPFAのソリューションを追加します。
      注:overstainingを回避するために、2000:透過処理した細胞を用いた実験のために、1の最終希釈のために500倍Ir191 / 193株を希釈。
    2. 一定に混合しながら、オービタルシェーカー上でRTで15分間インキュベートします。
      注:強いIr193信号は、Pt194質量チャネルに寄与し、負バーコードの品質に影響を与えることができるので、モノアイソトピックシスプラチンバーコードを実行する場合、15分よりも長いため、イリジウムを有する試料をインキュベートしていません。
    3. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
    4. 濾過し、脱イオン水で500μLの0.1%BSAで二回洗浄試料。
      注:一度私たちは可能な場合は24時間以内にサンプルを実行することはお勧め用意しました。調製した試料は、4℃で短期間を格納することができますしかし、注意が劣化を避けるように注意する必要があります。可能な場合、最終洗浄は、このようBSAなしろ過、脱イオン水で行うべき洗浄器具を減少するマシンのスプレーチャンバーとサンプラコーン上への堆積を減少させます。ヒトES細胞のためには、管表面に付着するサンプルの損失を避けるためにBSAを含めて、これらの洗浄を行う必要があります。

6.取得のためのサンプルを準備します

  1. 細胞を数えます
    1. 35μmのセルストレーナーキャップを介して新しいチューブに濾過し、脱イオン水及びフィルタ500μL、0.1%BSAに再懸濁細胞。
      注:最終的な洗浄のためのBSAのレベルを下げるには、マスサイトメトリーネブライザーに残された残渣を減少させます。非接着細胞を洗浄し、濾過し、脱イオン水に再懸濁することができます。
    2. マイクロ遠心チューブに細胞懸濁液10μLを移すことによって、細胞をカウント。で知られている比率に一定量を希釈トリパンブルー(細胞の可視化を補助するため)および血球計又は自動細胞計数システムへの転送。
    3. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。デカントまたは慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
  2. 準備と負荷サンプル
    1. キャリブレーションビーズを準備するには、冷蔵庫から削除し、再懸濁するために積極的に振ります。
    2. 質量サイトメトリーオートサンプラーを用いて、サンプルを実行した場合、その後、分析されるべき細胞の所望の数を追加するサンプルプレートの各ウェルに、キャリブレーションビーズの50μLを加えます。手動注入により、サンプルを実行した場合はマスサイトメトリー試料注入ポートに、サンプルろ過、脱イオン水でサンプルを希釈し、よく混合し、負荷サンプルにキャリブレーションビーズの50μLを加えます。適切な試料希釈は、分析される細胞型に依存して変化し得るが、10 6の希釈は1概して適切です。

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Representative Results

ここで提示されたプロトコルは、広くわずかな修正を加えて培養し、一次細胞サンプルの広範囲に適用することができます。このようなバーコード又は細胞表面染色などの特定の要素は、必要でない場合、実験の要件に応じて、それはモジュール方式で行うことができます。その全体で利用このプロトコルは、死細胞の排除、S期集団同定のために標識し、最大38個の抗体標的の定量化のために染色されたサンプルサイトメトリー多重塊の製造を可能にします。

図2)は、このプロトコルで概説した方法によって製造さ期待した結果を図3に示されています。データの収集時に、キャリブレーションビーズの強度に基づいて、信号強度の正規化は、質量サイトメトリーソフトウェア内で行うことができます。正規化の後に、初期データproce単一細胞上のキャリブレーションビーズ、ゲートを除去し、死んだ細胞を除去するssingは、フローサイトメトリーデータを分析することが可能な任意のソフトウェアを使用して手動で行うことができます。キャリブレーションビーズの除去はIr191 + Ce140-集団( 図3A)またはMATLABベースのアルゴリズム20を用いてゲーティングすることによって手動で行うことができます。 Ir193とイベントの長さ( 図3B)の二軸プロットでゲーティングすることによって、破片および細胞多重を除去しながら、単セルのイベントは(黒のアウトライン、 図3B)ゲーティングすることができます。死細胞のシスプラチン標識が細胞死の量を定量化するために利用することができます。低い( 図3D)および死細胞のより高い( 図3E)の量を有する試料の例が示されます。死細胞は、Pt198 +集団( 図3E)をゲートオフすることによって、データから除去することができます。サンプルのバーコード、モノアイソトピックシスプラチン又はパラジウム試薬、SAの明確な分離をもたらすかどうかと細胞は、元のサンプルIDに割り当てることができるバーコードのパラメータ( 図3C)、内mples。そのようなIDU標識などの追加の任意の方法は、特定の集団、 例えば 、S期細胞( 図3F)の検出を可能にします。初期の正規化、debarcoding及びゲーティング以下、高次元データはSPADE 17とマスサイトメトリーデータ分析および視覚化18のために設計されたいくつかの他のものを含む様々なアルゴリズムを利用して分析することができます。例えばSPADEようなアルゴリズムは、直接、その高次元の状態で可視化することができないので、解釈が困難である可能性が高い次元のデータを取り、目視判読( 図3G)に、より適しているデータの低次元表現を生成します。

図1 図1: マスサイトメトリー測定の基本原理。質量サイトメトリー分析のための細胞試料の調製は、主要素のランタニド系列からの金属同位体で標識された抗体で細胞を染色することを含みます。この方式では、特定のエピトープに対して惹起された各抗体は、表面、細胞質、核又はクロマチンが局在しているエピトープに対する154抗体は、潜在的に使用することができるようサマリウムなどの固有の原子質量を有する同位体で標識されています。標識された細胞を注入し、それらがアルゴンプラズマトーチによってイオン化された単一の細胞小滴として噴霧サイトメトリー質量を通して噴霧されます。より大きな原子質量のイオンの存在量を検出器で測定しながら、得られた粒子雲は、四重極質量フィルタによって低質量原子が取り除かれています。各固有質量のイオンの測定された量は、関連抗体の標的エピトープの細胞豊富に対応します。理論リットルながら100以上のパラメータのimitは、この方法を利用して定量化することができ、現在の市販の試薬は、細胞あたり40を超えるパラメータの検出を可能にします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: 実験手順とオプションのステップのワークフロー図。質量サイトメトリー用の細胞を調製プロトコルに関与する主要なステップの描写。オプションのステップは、オレンジ色のボックスで表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:M サイトメトリー分析 から生成されるデータ の例 (A)細胞(高いIr191、低Ce140)、ビーズ(低Ir191、高Ce140)及びビーズ細胞ダブレット(高Ir191、高Ce140)の分離を示す二軸プロット。イベントの長さ対Ir193の予想される外観を示す(B)二軸プロット。細胞破片および細胞多重を除去する単一細胞のゲーティングが示されています。 (C)シスプラチンバーコードから2つの質量チャネルの例図を示す二軸プロット。 (D - E)低いパーセンテージ(D)および死細胞の高い割合(E)とのサンプルについてのシスプラチンのライブ/デッド染色からのデータ例。 S相、さらに細胞周期を区別するサイクリンB1に対する抗体で細胞を区別するために、IDUで標識したH9 hESCの細胞の(F)二軸プロット。 (G この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで提示されたプロトコルが正常に様々な培養細胞株(H1及びH9 hESCを、たmESC、MCF7、HEK 293、KBM5、HMEC、MCF10A)および原発組織サンプル(マウス骨髄、マウス胎児肝臓、マウス成体の処理のために使用されています肝臓、マウス腫瘍)。関わらず、ソースの、細胞の状態を維持しながら、単一の細胞に解離させることができる任意の組織は、質量サイトメトリーにより解析に従順であるべきであるが、いくつかのプロトコルの最適化を必要とするかもしれません。いくつかのエピトープを利用し、特定の解離、固定および透過処理によって影響を受ける可能性があり、これらの方法は、サンプル固有の最適化を受ける必要があるかもしれないことに注意することが重要です。低信号が、抗体について観察された場合には、生細胞上の細胞表面標識を行う透過処理方法を変更すること、又は固定時間を減少させることによって向上させることができます。

可能な場合は、実験計画の中、目でバーコードを含みますE試料処理ワークフローは、細胞と抗体濃度のレベルで試料間の一貫性を保証します。バーコードなしで、細心の注意を試料処理を制御するために取られた場合でも、抗体濃度と細胞濃度のわずかな変化はサンプル間に導入される可能性があります。さらに、特定のエピトープに対して陽性の細胞の割合は、おそらくサンプル間で変化するであろうように、有効な抗体のエピトープ比は必ずしも総抗体濃度は、潜在的に抗体染色の不整合につながる、一貫性が保たれている場合でも、サンプル間で異なることができます。これらの変化は、単一のチャネルを観察する場合、一般的に、マイナーながら高パラメータ実験を行う際に、大きくなる配合することができ、ケアは、データ解析中に取り込まれていない場合、生物学的に意味のあると誤解されてもよいです。

質量サイトメトリー実験から得られたデータの分析は、多くの形態をとり、そしてcomputaの数ができTIONALアプローチは、このアプリケーションのために特別に適応されています。質量のために有用なアルゴリズムの徹底的な調査を提供しながら、データ分析サイトメトリー本稿の範囲を超えて、うまく利用されているアプローチは、強調表示され、関心のある読者は、このトピック21、22、23覆う複数のリソースに向けられています。データフローサイトメトリー質量分析のために最も広く用いられ、現在利用可能なアプローチの二つが密度のツリーの進行をスパニングしているがイベント(SPADE)とviSNEを正規化します。 SPADEは、同様のマーカー発現を有する細胞のグループからクラスタを形成し、ノードと各クラスタを表しています。これらのノードは、同様のノードがライン( 図3G)によって接続されているSPADEツリーに配置されています。 viSNEは二次元表現を生成するためのアルゴリズム24を埋め込みT-分散確率ネイバーを利用します高次元データ全体のデータ構造を維持しながら。 SPADEとviSNE両方をMATLABで記述され、ソースコードは自由に利用可能であり、MATLABを持つユーザーによって実行することができます。また、SPADEのスタンドアロンバージョンが利用可能です。

質量サイトメトリーは、現在のパラメータの最大数の収集を可能にしながら、蛍光タグベースのサイトメトリーは、いくつかの用途のためのより良いアプローチであってもよいです。蛍光フローサイトメトリーは、フローサイトメトリー質量ため500-1,000に比べて5×10 4まで毎秒より多くの細胞を分析し、より多くの利用可能な検証の抗体25を有することができます。蛍光の更なる進歩は、このようなハイパースペクトルのすべてが、非常に高いパラメータの実験のための実行可能な代替サイトメトリーフローサイトメトリー26と新しい蛍光団27メイク蛍光フローとして、フローサイトメトリー。このような以前にのみ可能RNA 28の測定などの追加の技術蛍光に基づくフローサイトメトリーによって最近タンパク質とRNA 29の同時検出を可能にするサイトメトリー質量に適応されています。利用可能な同位体および試薬の将来の拡張をより完全に測定可能な同位体の質量ウィンドウを利用し、フローサイトメトリー質量可能プロファイリングの深さを拡大する測定可能な細胞特性のレパートリーを拡大します。

質量サイトメトリーで同時に分析することができる多数のパラメータを大幅に調査することができる実験的な質問を拡張します。私たちは、この記事とビデオプロトコルを伴うが、より効果的に自分の研究を進めるためにマスサイトメトリーを利用するために興味を持って研究を可能にすることを願っています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

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References

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