Работа с Слуховой HEI-OC1 клеток

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Дом Ухо институт-кортиева органа 1 (HEI-OC1) клетки получают из слухового органа трансгенной мыши 1,2. Инкубационный любой клетки от этой трансгенной мыши при 33 ° C / 10% CO 2 (разрешающих условиях) индуцирует экспрессию гена увековечивающему, запускающего де-дифференциацию и пролиферацию ускоренную; перемещение клеток до 39 ° C / 5% CO 2 (не разрешающие условия) приводят к снижению пролиферации, дифференцировки и, по крайней мере , в случае Hei-OC1, гибели клеток 2,3.

Вуз-OC1 клетки были клонированы и охарактеризованы в нашей лаборатории более десяти лет назад, и первоначальные исследования показали, что они выражают специфические маркеры волосковых клеток улитки, такие как Prestin, миозина 7а, Atoh1, BDNF, кальбиндин и кальмодулин, но и маркеры поддержки клетки , такие как коннексина 26 и рецептора фактора роста фибробластов (FGF-R) 2. Поэтому было высказано предположение о том, что HEI-OC1 может представлять собой Коммоп прародителем для сенсорных и опорных клеток органа Корти 2. Параллельные исследования убедительно показали , что архетипическом ототоксичен препараты , как цисплатин, гентамицин и стрептомицин индуцированной активации каспазы-3 в этих клетках, в то время как препараты считаются не ототоксичен, как пенициллин, не сделал 2,3. Таким образом, эта клеточная линия была предложена в качестве системы в пробирке для исследования клеточных и молекулярных механизмов , участвующих в ототоксичность и для скрининга потенциальных ототоксичность или otoprotective свойств новых фармакологических препаратов. Предполагается, что HEI-OC1 клетки были использованы в более чем ста пятидесяти исследований, опубликованных за последние десять лет.

Принимая во внимание , глядя на потенциального проапоптотического влияния различных препаратов была основной целью большинства исследований , связанных с этой клеточной линии, другие важные клеточные процессы , такие как аутофагии и старении только начали исследовать в клетках HEI-OC1 4-7. яна недавнем исследовании нашей лаборатории 8, мы использовали клетки HEI-OC1 собрать полный набор данных о гибели клеток, выживание, пролиферацию, старении и аутофагии , вызванных различными фармакологическими препаратами , часто используемых в клинике. Мы также сравнили некоторые из ответов HEI-OC1 клеток с теми из НЕК-293 (эмбриональные клетки почки человека) и HeLa (эпителиальные клетки человека), получающих идентичную обработку. Наши результаты показали, что Hei-OC1 клетки реагируют на каждого лекарственного средства характерным образом, с характерным дозы и времени зависит чувствительность, по крайней мере, один из механизмов, на стадии изучения. Мы также подчеркнули , в этом исследовании , что правильная интерпретация экспериментальных результатов потребует проведения параллельных исследований с более чем одной техники 8.

В другом исследовании мы изучали использование клеток HEI-OC1 оценить функциональную характеристику Prestin, двигатель белок кохлеарных наружных волосковых клеток (OHCs) 9 + K + АТФазы, которая транслокации из плазматической мембраны в цитоплазму без существенных изменений в общей экспрессии в клетках. Кроме того, мы показали, что Р-Вуз-OC1 клетки имеют надежный НЖК, связанный с Prestin двигательной функции, которая уменьшается, когда плотность молекул Prestin, присутствующих на мембране увеличена. В целом, эти результаты убедительно подтверждают полезность Hei-OC1 клетки для исследования слуховых белков.

В этом видео статье мы опишем, как культура клеток HEI-OC1, почему удобно использовать клетки растут в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) для исследований цитотоксичности, как оценить механизм / с лекарственно-индуцированной цитотоксичности и как для выполнения электрофизиологических исследований (например, патч-зажим, нелинейную емкость (НЖК)) для исследования функциональных свойств Prestin, молекулярного двигателя кохлеарного OHCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток

Примечание: Все протоколы культивирования клеток должны быть выполнены с использованием надлежащих методов культивирования клеток (для справки см первые 3 главы клеточной биологии: A Laboratory Handbook, том I 10). Вуз-OC1 клетки не требуют какого-либо дополнительного покрытия или обработка посуды клеточных культур для надлежащего соблюдения и роста. Очень важно: не используйте стеклянную посуду посуду для целей культивирования клеток; фенотип и биологическая реакция клеток на фармакологических препаратов изменится (G & F Kalinec Kalinec, неопубликованный); Рекомендуется использовать традиционные блюда из пластика для культивирования клеток (см Таблицу материалов / оборудования). Обратите особое внимание на асептики , чтобы избежать загрязнения, но никогда не используют антибиотики (например, ампициллин или стрептомицин) с клетками HEI-OC1. При необходимости использовать амфотерицина В. В то время как HeLa и НЕК-293 клеток, были использованы в качестве контроля в предыдущих исследованиях с Hei-OC1 8, любая другая линия клеток можетбыть приемлемыми для этой цели.

  1. Реанимация Замороженный HEI-OC1 клеток
    Примечание: Этот протокол также может быть использован с другими клеточными линиями из той же трансгенной мыши , разработанной в нашей лаборатории, такие как OC-K3, из органа Корти 11,12 и SV-k1, с полоской vascularis 13,14.
    1. Удалить флакон криоконсервированных клеток Hei-OC1 из жидкого N 2, и поместить его на водяной бане при 37 ° С. Погрузите только нижнюю половину флакона, и дайте ему оттаять, пока лишь небольшое количество льда остается во флаконе. Протрите наружную поверхность флакона с 70% -ным спиртом.
    2. Пипетировать клетки из флакона и доставить весь объем (~ 1,5 × 10 5 клеток / мл) медленно, по капле, в 15 мл коническую пробирку , содержащую 10 мл подогретого среды для роста, как модифицированной среде Игла Дульбекко ( DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
    3. Удалить ДМСО при центрифугировании трубки при температуре 300-500 мкг в течение 5 мин, отбрасывая тон супернатант и ресуспендирования клеток в 9 мл свежей среды для роста (DMEM + 10% FBS). Дезагрегации комки или листы клеток флюса и флегмы взвешенных клеток, из пипетки в среде, и наоборот, в три-четыре раза с кончиком пипетки касаясь дна трубки.
    4. Поместите общий объем клеток, суспендированных в среде роста в мм диаметра 100 необработанных, пластиковые чашки для культивирования клеток.
    5. Инкубируйте клетки при 33 ° C с 10% CO 2 (разрешающих условиях).
  2. Субкультура HEI-OC1 клеток
    Примечание: До слияния (~ 80%), клетки должны быть приведены в подвеске и субкультивироваться для того, чтобы предотвратить культуру смерти. Этот протокол также может быть использован с другими клеточными линиями , разработанных в нашей лаборатории из той же трансгенной мыши, например, OC-K3, из органа Корти 11,12 и SV-k1, с полоской vascularis 13,14.
    1. Удалите старую среду и промыть клетки с 2 мл PBS. </ Li>
    2. Накройте клеточный монослой с раствором 0,25% трипсина, с использованием 1 мл на 25 см 2 поверхности. Для того, чтобы перейти к следующему шагу более чем 40% клеток должна быть отсоединена. Исследуют клетки с использованием инвертированного микроскопа, и, при необходимости, "шлепать или нажмите" культуральных чашек осторожно, чтобы освободить все оставшиеся прикрепленные клетки.
      Примечание: Будьте осторожны, как трипсином в течение длительного времени может привести к гибели клеток; не достаточно, а переданные клетки будут недостаточными для планируемых исследований.
    3. Ресуспендируют клеток, следуя процедуре, описанной в разделе 1.1.3, и передавать их в коническую пробирку на 15 мл.
    4. Центрифуга в течение 5 мин при 300-500 XG, выбросьте среду, собирают клетки со свежей средой роста и семя их в, по меньшей мере, четыре 100 мм диаметра блюда клеточной культуры. Число клеток на чашку, будет зависеть от количества клеток, выделенных. Инкубируйте клетки при 33 ° C с 10% CO 2 (С-Hei-OC1) и разделить снова столько раз , сколько необходимо длязапланированные эксперименты или для создания нового запаса.
    5. Для подготовки запасов, заменить блюда мм диаметром 100 от 250-550 мл колбах для культивирования клеток; для экспериментов, небольшие блюда или мульти-луночные планшеты могут быть более адекватными.
    6. Для дифференцировки, клетки инкубировать HEI-OC1 в разрешающих условиях, пока они не достигают ~ 80% слияния; затем переместите посуду до 39 ° C с 5% CO 2 (NP-Вуз-OC1) в течение 2 -х до 3 -х недель.
      Примечание: Клетки будут постепенно остановить пролиферирующих и умирает. Изменение среды через день, чтобы удалить мертвые клетки. В зависимости от исходного количества клеток, как правило, после ~ 4 недели не больше ячеек не будут доступны для экспериментов. Дифференциация начинается, как только клетки помещают в условиях NP, но не каждая клетка дифференцируются в том же темпе. Важно отметить, что Prestin экспрессии и локализации мембраны возрастает в процессе дифференцировки (см Представитель Результаты, рисунок 4), обеспечивая качественноеи количественный показатель уровня дифференциации.

2. Drug Исследования цитотоксичности

Примечание: Вуз-OC1 клетки , выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований (см Представитель Результаты, Рисунок 1).

  1. Жизнеспособность клеток (МТТ)
    1. Собирают клетки Р-Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
    2. Семенной клетки на 96-луночный прозрачных плоскодонных планшетах (100 мкл на лунку), инкубировать в течение ночи для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
    3. После того, как медикаментозное лечение (как правило, 24 или 48 ч при температуре 33 ° С), выполняют МТТ анализ в соответствии с протоколом производителя. В целом, Протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
      1. Добавьте 10 мкл реагента МТТ в каждую лунку.
      2. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение от 2 до 4 ч до тех пор, фиолетовый краситель не виден, а затем добавить 100 мкл МТТ Моющая реактива в каждую лунку. Не встряхивайте пластину.
      3. Закройте планшет и оставить его в темноте в течение 2 до 4 ч при температуре 37 ° С.
      4. Используйте устройство для чтения микропланшетов пластины для измерения оптической плотности при длине волны 570 нм в каждую лунку, включая пробелы (рост среднего в одиночку). Нормализация данных с использованием среднего OD в контрольных клетках, как 100% от жизнеспособности.
  2. Каспазы 3/7 Активация Анализ
    Примечание: Вуз-OC1 клетки, выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований.
    1. Собирают клетки Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
    2. Семенной клеток на КНИТО-стеной 96-луночные планшеты (100 мкл на лунку), инкубировать в течение ночи для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
    3. После медикаментозного лечения (как правило, 24 или 48 ч при температуре 33 ° С), выполнить анализ каспазы следующий протокол соответствующего производителя. В целом, протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
      1. Подготовка реагентов, хорошо перемешать, и дать им возможность уравновешивания до комнатной температуры.
      2. Удалить клетки из инкубатора и позволяют пластины уравновешиваться до комнатной температуры.
      3. Добавьте указанное количество реагента в каждую лунку, соблюдая осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения, не касаясь лунки, содержащие различные образцы с одинаковыми наконечниками пипеток.
      4. Закройте планшет и перемешивают в течение 30 секунд с помощью шейкере при температуре 300-500 оборотов в минуту.
      5. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение периода, по крайней мере, 30 мин. Determinе оптимальный период инкубации эмпирически. Если температура в помещении колеблется использовать постоянной температуры инкубатора, так как колебания температуры будут влиять на чтение люминесценции.
      6. Измеряют люминесценцию в каждую лунку, и нормализовать значения с использованием среднего люминесценцию в контрольных клетках, как 100% от активации каспазы.
  3. Деление клеток (пролиферации)
    1. Собирают клетки Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
    2. Семенной клетки на 96-луночный прозрачных плоскодонных планшетах (100 мкл на лунку), инкубируют в течение ночи при разрешающих условиях для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
    3. Через час после обработки, добавляют в каждую лунку по 1 мкл приготовленной 100x BrdU (5-Бром-2'-deoxyuriобед) решение, и вернуть пластины в инкубатор при 33 ° С.
    4. После того, как 12, 24 и 48 ч, удалить существующую среду из соответствующих пластин и промыть каждую лунку один раз PBS.
    5. Провести анализ пролиферации клеток в соответствии с протоколом производителя. В целом, протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
      1. Подготовка реагентов, в том числе фиксации / денатурирующих раствор, моющий буфер, раствор первичного обнаружения антител, вторичное решение для обнаружения антител и BrdU раствора, как указано в протоколе изготовителя.
      2. Добавьте решение фиксирующее / денатурации в каждую лунку в количествах, указанных в протоколе изготовителя, и держать планшет при комнатной температуре в течение 30 мин.
      3. Удалите / денатурирующих фиксирующим раствором и добавляют первичное антитело в концентрации, указанной в протоколе изготовителя. Хранить планшет при комнатной температуре в течение 1 часа.
      4. Удалите раствор с первичным муравейibody, мыть пластины 3 раза промывочным буфером, а затем добавить вторичные антитела в концентрации, указанной в протоколе изготовителя. Держите пластину с вторичным антителом, при комнатной температуре в течение 30 мин.
      5. Удалите раствор с вторичным антителом, мыть пластины 3 раза промывочным буфером, и добавьте субстрат. Через 10 мин инкубации при комнатной температуре, добавляют раствор STOP. Будьте осторожны: контролировать изменение в цвете; если решение становится очень темно, остановить реакцию до начала стандартного времени разработки 10 мин.
      6. Измерить оптическую плотность при 450 нм в течение 30 мин после добавления стоп-раствора.
  4. Цитотоксичность
    Примечание: Вуз-OC1 клетки, выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований.
    1. Инкубируют при разрешающих услови х, как правило, в течение 24-48 ч, клетки Hei-OC1 только в клеточной культуральной среде (контроль) или среда плюс интересующих лекарственных средств.
    2. В конце лечения, Промыть клетки три раза PBS, и отделяться с использованием 1 мл на 25 см 2 площади поверхности неферментативного раствора для диссоциации клеток в течение 3 мин.
    3. После стягивания, сбора и осаждения клеток центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин, удалить супернатант, и окрашивать клетки в течение 15 мин в темноте с реагентом, включенного в цитотоксичности.
    4. Определить количество живых клеток Hei-OC1 с помощью проточной цитометрии, как указано изготовителем проточного цитометра.
  5. физиологическое старение
    1. Инкубируют при разрешающих услови х, как правило, в течение 24-48 ч, клетки Hei-OC1 только в клеточной культуральной среде (контроль) или среда плюс интересующих лекарственных средств.
    2. Определить количество Старение-ассоциированные бета-галактозидазы - положительных клеток с помощью проточной цитометрии с протоколом , описанным Debacq-Chainiaux и др. 15 или другим способом , известным , чтобы обеспечить надежные результаты. Краткий протокол для проточной цитометрии является следующее:
        <Li> В конце эксперимента обработок, промыть клетки три раза PBS, а затем инкубировать их с 100 нМ Bafilomycin A1 в культуральной среде клеток в течение 1 ч при разрешающих условиях.
      1. Добавить C12FDG в конечной концентрации ~ 33 мкМ, и продолжают инкубацию клеток в течение 1-2 ч.
      2. Вымойте клетки дважды с PBS, собирают их с использованием 1 мл на 25 см 2 площади поверхности неферментативного раствора диссоциации клеток в течение 3 мин, и гранул их центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин.
      3. Ресуспендируют клеток в охлажденном льдом PBS и определяют количество положительных клеток Hei-OC1 с помощью проточной цитометрии, как указано изготовителем проточном цитометре.
  6. аутофагия
    1. Собирают Hei-OC1 контрольные клетки и голодали (лишенные сыворотки в течение 48 ч) с помощью следующей процедуры, описанной в разделе 1.2, и обрабатывать их для Вестерн-блоттинга в соответствии со стандартными протоколами. В целом, протоколы для вестерн-блоттинга имеют следующую стEPS:
      1. Семенной Hei-OC1 клеток в 6-луночные планшеты при концентрации 1,0 х 10 5 клеток / мл. После того, как 24 и / или 48 ч, промыть клетки с охлажденным льдом PBS.
      2. Лизируйте с 200 мкл буфера TNESV (1% NP40, 50 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na 3 VO 4) с ингибитором протеаз и 1 мМ PMSF в течение 5 мин на льду.
      3. Собирают клетки (путем соскоба в нижней части каждой лунки), трансфер в микроцентрифужных пробирках и центрифугируют при 16800 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
      4. Собирают супернатанты и количественного определения концентрации белка с помощью ВСА анализа.
      5. Добавить 5х буфера для загрузки и 1 мМ DTT, к каждому образцу и кипятят в течение 5 мин для денатурации белков.
      6. Запуск образцов с помощью SDS-PAGE на 4-12% геле и переносят на мембраны ПВДФ.
      7. Блок мембраны с 5% обезжиренным сухим молоком в TBS-T с 0,1% твина 20 в течение 60 мин при комнатной температуре.
      8. Инкубацию мембраны в течение ночи при 4 ° С с первичным муравейibodies.
      9. На следующий день, промывка мембран экстенсивно с TBS-T, и инкубировать с вторичным антителом IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (1: 1500) в течение 1 часа.
      10. Обнаружение иммунореактивности с системой обнаружения усиливается хемилюминесценции (ECL). Нормализация уровней экспрессии белка с использованием GAPDH (1: 2000 в TBS-T с в 10% обезжиренного сухого молока) в качестве стандарта.
    2. В Вестерн-блоттинга исследовать экспрессию, по крайней мере, два различных маркеров аутофагией, такие как Beclin-1 и LC3B (как правило, в соотношении 1: 1000 разбавления в TBS-T, с 2,5% БСА). Не забудьте взглянуть на контроль экспрессии белка, такие как GAPDH или актина.
    3. Оценка экспрессии интересующего белка с помощью денситометрии с помощью цифрового сканера блот или компьютерного программного обеспечения, таких как публичного домена NIH Image или ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Электрофизиологические Эксперименты с вузом-OC1 клеток

  1. Сбор клеток
    Примечание: Используйте клетки растут в чашки для культивирования диаметром 100 мм на 50% -80% сплошности. Трипсин, Accutase, фермент-бесплатное решение, или р hosphate- б uffered сек Алины + е thylene d iamine т ETRA в cetic кислоту (PBS-EDTA) могут быть использованы для подъема клеток без значительного воздействия на количество и качество gigaseals , В некоторых случаях, однако, обработка трипсином делает клетки более хрупкими. В этих случаях, позволяют клеткам восстановиться в течение примерно 30 минут, перед началом экспериментов.
    1. Вымойте клетки дважды с 10 мл PBS без Са 2+ и Mg 2+.
    2. Добавляют 2 мл фермента раствора без съемника, например неферментативного раствора клеточной диссоциации, и инкубировать блюда в течение 3 мин при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
    3. С помощью инвертированного микроскопа, чтобы проверить отряд клеток. При необходимости, переместите CELл культуры блюдо, чтобы отделить больше клеток, но сделать это мягко.
      Примечание: Не трясите блюдо.
    4. Добавьте 10 мл DMEM + 10% FBS и пипеткой клетки нежно вверх и вниз в пять раз с 10-мл пипетки.
    5. Посмотрите на клетки под микроскопом. Если> 80% клеток уже разделены (один), не далее пипеткой не требуется. Если клетки все еще находятся в кластерах, повторите осторожно пипеткой до более чем 80% клеток не одиноки.
    6. Поместите ~ 10 мл взвешенных клеток в коническую пробирку на 15 мл, центрифуга в течение 2 мин при 100 мкг, и отбросить супернатант.
    7. Используйте ~ 200 мкл внешнего раствора записи (Лейбовиц L-15 средней доводят до 305 - 310 мОсм с дистиллированной водой) для ресуспендирования клеток. Оптический контроль ячеек должны показать много одиночных, круглые клетки с гладкими краями мембраны.
  2. Патч-зажим и НЖК Измерения
    1. Выполните патч-зажим и измерения напряжения зависящих от нелинейной емкости (НЖК) с использованиемdequate усилители и программного обеспечения, а также стандартные электрофизиологические методы. Как использование внутреннего раствора (intrapipette) 150 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 0,1 мМ EGTA, 2 мМ АТФ-Mg, 0,1 мМ ГТФ-Na, и 10 мМ HEPES; доведения рН до 7,2 с помощью Триса.
    2. Под микроскопом, выбрать одну, здоровую клетку, с круглыми и гладкими краями мембраны. Прикрепите кончик стеклянной пипетки на клеточной поверхности и проверить сопротивление мембраны. Это должно быть около 3-6 МОм, что соответствует внутреннему диаметру (ID) наконечника пипетки из ~ 2 мкм.
    3. Слегка нажмите на кончик микропипетки против плазматической мембраны клетки, а затем применить всасывание. Часть клеточной мембраны будет отсасывается в пипетку, генерируя электрическое сопротивление в порядка 10 - 100 gigaOhms (gigaseal).
    4. Установить состояние целой клетки путем разрушения плазматической мембраны с всасывающим импульсами.
    5. Использование клеток , которые не экспрессируют Prestin, такие как НЕК-293, в качестве контроля 9,
      Примечание: Текущие ответы должны быть отфильтрованы на 5 кГц, а также исправления, сделанные для эффектов остаточного сопротивления серии. Все сбора данных и большинство анализов могут быть выполнены с использованием программного обеспечения, как правило, включены с замком усилителями. Функция емкостного сопротивления может быть установлен на первой производной двух государственной функции Больцмана , связанной нелинейной заряд мембраны напряжения 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В нескольких недавних публикациях мы сообщали , полный набор исследований , направленных на оценку реакции клеток HEI-OC1 к нескольким наиболее часто используемых фармакологических препаратов, а также исследовать функцию Prestin 8,9. В этих исследованиях мы использовали всех протоколов, описанных в предыдущих разделах.

Одним из результатов этих предыдущих исследований было то , что Hei-OC1 клетки культивировали при непермиссивные условиях (39 ° С / 10% СО 2 = NP-Hei-OC1) показали весьма значительное снижение жизнеспособности клеток, и столь же значительное увеличение в клеточной гибели, по отношению к клеткам культивировали при разрешающих условиях (33 ° C / 10% CO 2 = P-вуз-OC1) (Рисунок 1). Поэтому любое цитотоксичность исследование, проведенное на клетках NP-Вуз-OC1 должны выделять значительные усилия в дискриминирующих эффектов препарата от воздействия условий культивирования. В сложения иN, так как лекарственные эффекты на клетки уже умирают или с уменьшением жизнеспособности может быть различным, что воздействие одного и того же препарата на здоровых клетках, рекомендуется использовать клетки Р-Hei-OC1 для экспериментов, которые не требуют специально дифференцированных клеток.

Проведенные нами исследования по изучению влияния различных фармакологических препаратов также интересные результаты. Например, цисплатин, химиотерапевтическое средство , часто используется для лечения некоторых злокачественных опухолей человека, и ацетаминофена (APAP = N- cetyl- ра ра-амино- р henol), наиболее широко продаются более чем в розницу болеутоляющее в США, оба были токсичны для клеток HEI-OC1 (Рисунок 2). Тем не менее, в то время как АПАФ снижение жизнеспособности клеток и увеличение активации каспазы 3/7, он не вызывал гибели клеток. Цисплатин, напротив, значительно возросло три отклика (Рисунок 2). Интересно отметить, что каспазы 3/7 были mostlY активируется при более низких концентрациях, цисплатин, предполагая, что гибель клеток индуцируется низкими дозами цисплатина, вероятно, опосредовано апоптоза, в то время как высокие дозы летальные эффекты могут быть связаны с oncosis / necroptosis. В то время как oncosis была определена как предварительно летальным путь , ведущий к нерегулируемому гибели клеток в сопровождении клеточного и органелл отек, блеббинга и повышенной проницаемости мембран 17,18, necroptosis является регулируемым , не механизм апоптоза гибель клеток активируются те же раздражители , которые инициируют апоптоз , но с морфологическими признаками , аналогичными oncosis 19-22.

Дополнительные исследования , направленные на изучение влияния APAP и цисплатином на клетки Р-Hei-OC1 показали четкую, дозозависимый эффект АРАР на пролиферацию клеток , которые могли бы объяснить интригующим снижение жизнеспособности клеток без гибели клеток , описанной в предыдущем параграфе (рис 3A). цисплатин ALS O уменьшилась на пролиферацию клеток, и его эффект дополняется временем экспозиции даже при малых дозах (рис 3 , а ), но дополнительно уменьшились старении при всех концентрациях и временных точках , включенных в наше исследование (фиг.3В). Значительное уменьшение клеточного старения , индуцированный цисплатином , можно объяснить увеличением гибели клеток, при условии , что стареющие клетки будет, вероятно, склонны умирать быстрее , чем здоровые клетки 23.

Важно, что эти репрезентативные результаты свидетельствуют о том, что Hei-OC1 клетки реагируют на различные фармакологические препараты с отличительным дозы и времени зависит чувствительность к по меньшей мере, одного из механизмов исследуемых. Таким образом, правильная интерпретация любого экспериментального результата потребует четкого понимания конкретных клеточных процессов, исследованных и информацию, представленную каждым из методов, используемых для их оценки.

jove_content "ВОК: Keep-together.within-страницу =" 1 "> конфокальной и проточной цитометрии экспериментов, с другой стороны, подтвердил Prestin выражение в P-Вуз-OC1 и NP-Вуз-OC1 клеток, с Prestin immunolocalizing главным образом на цитоплазма клеток P-вуз-OC1 (рис 4A, стрелки), и более концентрированным на плазматической мембране в клетках NP-вуз-OC1 (рис 4В, стрелки). Проточная цитометрия исследования показали явное увеличение Prestin экспрессии в NP-ХЕИ -OC1 клетки по отношению к клеткам P-вуз-OC1 (Рисунки 4C и 4D). Нестационарная увеличение экспрессии и локализации плазмы мембраны Prestin в клетках NP-вуз-OC1 позволяет предположить , что транслокация сопровождался синтезом более молекул Prestin. Однако эти эксперименты не дают ключ, чтобы решить, является ли молекулы Prestin первоначально расположенные в цитоплазме перехода к плазматической мембране и новых молекул заменить их, если они остаются в цитоплазме и только недавно синтesized Prestin перемещается к плазматической мембране, или сочетание обоих процессов.

Электрофизиологические исследования показали надежную НЖК в клетках Р-Hei-OC1 (рис 5б) с пиковым значением , которое уменьшается , и напряжение при пиковой емкости , которые переходили на более деполяризованы значений, когда клетки были перенесены в непермиссивные условий для 1 и 2 недели (Рисунки 5C и 5D). Из-за прогрессирующего транслокации Prestin из цитоплазмы в плазматическую мембрану, мы первоначально выдвинули гипотезу, что НЖК бы в NP-Hei-OC1 выше, чем в клетках Р-Hei-OC1, и что он будет в дальнейшем возрастать со временем инкубации при NP условия. Удивительно, но результаты наших исследований показали точно противоположный ответ. Мы предположили, что увеличение плотности Prestin молекул в плазматической мембране может быть ограничение их двигательной функции.

хин-страница = "1"> Обратите внимание на рисунке 5 деполяризации напряжения при пиковой емкости в клетках HEI-OC1 по отношению к типичным значениям , зарегистрированных в OHCs и в трансфицированных клетках НЕК293 24; Кроме того, заметим, что деполяризующее сдвиг увеличивается со временем в условиях NP. Прогрессирующее Деполяризующее сдвиг аналогичен тому , который описан в OHCs во время мыши и крысы развития 25,26, и было высказано мнение , что это может быть связано с развитием других клеточных структур , связанных с плазматической мембраной НВК № 25 или процесса созревания внутренней к Prestin 24.

Мы надеемся, что этот краткий пересчет голосов нескольких исследований с клетками HEI-OC1 обеспечивают достаточно доказательств потенциальной полезности клеток HEI-OC1 для исследования широкого спектра клеточных молекулярных реакций.

Объявление / 54425 / 54425fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Жизнеспособность клеток и гибель клеток в P-Вуз-OC1 и NP-Вуз-OC1 клеток. Жизнеспособность (А) Cell оценивали с помощью МТТ - анализе. Оптическую плотность измеряли с помощью планшет-ридер, а средняя ОП в контрольных клеток принимают за 100% жизнеспособности. (В) некрозу клеток оценивали с помощью анализа цитотоксичности. Число положительных (умерших) клеток определяли с помощью проточной цитометрии с 488 нм возбуждения (синий лазер) и FL1: 530 15 нм. Обратите внимание , статистически значимы (P ≤0.001) снижение жизнеспособности клеток (А) и гибель клеток (В) , индуцированного непермиссивные условий. Столбики показывают стандартную ошибку средних (SEM). Измененный ссылки 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

</ Html"Рисунок 2" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg" />
Рис . 2: Ответы HEI-OC1 клетках , подвергнутых APAP и цисплатин при анализе МТТ, каспазы 3/7 и цитотоксичность (A) Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ - анализе, и оптическую плотность измеряли с помощью планшет - ридер. (B) Активация палача каспазы 3/7. (С) Drug - индуцированной гибели клеток оценивали с помощью анализа цитотоксичности; число положительных (умерших) клеток определяли с помощью проточной цитометрии. Данные в каждом эксперименте нормализовали к соответствующим условиям управления (управления) = 1, чтобы сделать возможным одновременный статистический анализ. * = P ≤0.05 отношению к контролю. Столбики показывают стандартную ошибку средних (SEM). Модифицированный fromreference 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Влияние APAP и цисплатин на митотических Rate и старении HEI-OC1 клеток. (А) Изменения наркотиков индуцированных на скорость митотического деления клеток HEI-OC1, 24 и 48 ч, оценивали с BrdU Количественное определение. (В) лекарственно-индуцированной старении в клетках HEI-OC1 измеряли с помощью проточной цитометрии а senescence- связаны β-галактозидазы (SA-Bgal) метод. Данные в каждом эксперименте нормализовали к соответствующим условиям управления (управления) = 1, чтобы сделать возможным одновременный статистический анализ. * = P ≤0.05 отношению к контролю. Столбики показывают стандартную ошибку средних (SEM). Модифицированный fromreference 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию тего фигура.

Рисунок 4
Рис . 4: Prestin Экспрессия в P-Вуз-OC1 и NP-Вуз-OC1 клетки - клетки метили с анти-Prestin антител и наблюдаемых с помощью конфокальной микроскопии и проточной цитометрии (А) В клетках Р-Вуз-OC1 Prestin immunolocalized главным образом на цитоплазма (стрелки). (В) В клетках NP-Hei-OC1, в противоположность этому , Prestin реактивность была сосредоточена на плазматической мембране (стрелки). и D) , методом проточной цитометрии исследований в Hei-OC1 клеток , культивированных в течение 2 -х недель при условиях Np (D) показал явное увеличение Prestin экспрессии по отношению к клеткам Р-Hei-OC1 (C). (C) Врезка является вторичным AB только (отрицательный контроль). Измененный ссылки 9.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: НЖК исследования в P-Hei-OC1 и NP-Hei-OC1 клетки (А) патч-зажаты HEI-OC1 ячейки.. (B - D) НЖК в P-Hei-OC1 и NP-Вуз-OC1 клетки. Обратите внимание на снижение пика НЖК и прогрессивный сдвиг кривых более деполяризованных значения в ячейках NP-Вуз-OC1. Измененный ссылки 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом докладе мы опишем, как культура клеток HEI-OC1 и использовать их для оценки механизмов цитотоксичности медикаментозного и исследовать функциональные свойства Prestin, молекулярного двигателя кохлеарной OHCs. Технические процедуры, однако, являются достаточно общими, чтобы быть легко адаптирована к различным исследованиям.

Все протоколы , описанные здесь , требуют правильного использования хорошо зарекомендовавших себя методов клеточной культуры 10. Так же, как с любой другой клеточной линии, работая с клетками HEI-OC1 требует правильно оборудованной клеточной культуры объекта, заверенный бокс биологической безопасности, охлаждаемой центрифуге, водяной бане, и один инвертированный микроскоп для исследования клеточных культур и для подсчета клеток при использовании hemocytometric техники. Уникальное требование, однако, является наличие двух увлажненных инкубаторах один набор при 33 ° C / 10% СО 2 для клеток P-Вуз-OC1 и другие при 39 ° C / 5% CO 2 для NP-Вуз-OC1 клеткиs. Если запланированные исследования включают только Р-Hei-OC1 клетки, второй инкубатор может быть установлена ​​на уровне 37 ° C / 5% CO 2 для различных анализов.

Использование пластиковой посуды для культивирования клеток является важным дополнительным условием для работы с клетками HEI-OC1. На самом деле, Вуз-OC1 клетки являются очень прочными, и они будут рост в различных поверхностях и в очень разных условиях. Тем не менее, их фенотип и их реакция на лекарства и другие раздражители будут сильно зависеть от параметров культуры (G & F Kalinec Kalinec, неопубликованный). Как мы утверждали в предыдущей работе 8, эта Пластичность клеток Hei-OC1 могут быть с успехом использованы для разработки новых опыта. Например, хорошо известно , что парциальное давление кислорода в кохлеарного перилимфой значительно ниже (~ 2 кПа) , чем в обычном инкубаторе на уровне моря (~ 21,3 кПа) 27. Инкубация клеток HEI-OC1 при более низкой концентрации O 2 будет изменять свои ответы, возможно , делает их лучшую модель для аудитаORY сенсорные клетки.

Следует подчеркнуть , что описанные протоколы для культуры и субкультуры клеток Hei-OC1 также могут быть использованы с другими слуховыми клеточных линий , разработанных в нашей лаборатории из той же трансгенной мыши, например, OC-K3 от органа Корти 11,12 и С.В. -k1 из полоской vascularis 13,14. Более того, эти клеточные линии могут быть полезны в качестве контроля для клеток Hei-OC1 в отдельных экспериментах. Например, недавно мы использовали SV-К1 , чтобы продемонстрировать , что обратно пропорционально иммунореактивности к Prestin и Na + , K + АТФазы антител в плазматической мембране клеток Hei-OC1 был типа клеток зависимый ответ , а не связан с трансгенной мыши из которой эти клетки были получены 9.

Другое важное требование для работы с клетками HEI-OC1 является практика соответствующих асептических методов, таких как очистка всех рабочих поверхностей внутри шкафа безопасности с 70% еthanol или изопропиловый спирт и обезвреживание любых материалов, необходимых для проведения процедур. Тем не менее, в то время как другие клеточные линии млекопитающих часто защищены от случайного бактериального загрязнения с помощью пенициллина-стрептомицина или других подобных комбинаций, антибиотики никогда не должны быть использованы с клетками HEI-OC1, за исключением, если цель исследования состоит в том, чтобы исследовать их эффекты. Клетки HEI-OC1 были получены в антибиотических свободных условиях, и они должны избегать, чтобы уменьшить появление устойчивых к антибиотикам клеток.

И, наконец, мы хотим еще раз подчеркнуть точку уже несколько раз упоминается в этом докладе: фенотип и реакция клеток HEI-OC1 к лекарственным препаратам и других раздражителей будет сильно зависеть от параметров культуры. Поэтому очень важно, чтобы лаборатории, работающие с клетками HEI-OC1 используют аналогичные протоколы и условия культивирования клеток для того, чтобы сделать их результаты действительно сопоставимы с представленными другими группами. Кроме того, онаОчень важно помнить, что клеточная линия Hei-OC1 только модель, со всеми ограничениями, что модель. Ожидая , что в пробирке эксперименты с клетками HEI-OC1 будет предоставлять данные точно представляющие ответы в естественных условиях реальных слуховых сенсорных клеток нереально. Тем не менее, мы твердо убеждены, клеточная линия Hei-OC1 является полезной моделью для исследования функциональных ответов слуховых сенсорных клеток и скрининг потенциальных ототоксичность фармакологических препаратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics