Arbeiten mit Auditory HEI-OC1-Zellen

Biology

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Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

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Abstract

Introduction

House Ear Institute-Corti - Organ 1 (HEI-OC1) Zellen werden aus dem Hörorgan einer transgenen Maus 1,2 abgeleitet. Inkubation einer beliebigen Zelle aus dieser transgenen Maus , bei 33 ° C / 10% CO 2 (permissive Bedingungen) induziert die Expression eines Gens , das Immortalisieren Entdifferenzierung und beschleunigter Proliferation auslöst; Bewegen der Zellen auf 39 ° C / 5% CO 2 (nicht-permissive Bedingungen) führen zu einer verminderten Proliferation, Differenzierung und zumindest im Fall von HEI-OC1, Zelltod 2,3.

HEI-OC1-Zellen wurden in unserem Labor vor über einem Jahrzehnt kloniert und charakterisiert, und die anfängliche Studien gezeigt, dass sie spezifische Marker der Cochlea-Haarzellen, wie prestin, Myosin 7a, Atoh1, BDNF, Calbindin und Calmodulin exprimieren, sondern auch Marker der Stütz Zellen wie Connexin 26 und Fibroblasten - Wachstumsfaktor - Rezeptor (FGF-R) 2. Daher wurde vorgeschlagen, dass HEI-OC1 eine commo darstellen könnten Vorläufer für sensorische und Stützzellen des Corti - Organ 2. Parallel Studien lieferten starke Hinweise darauf , dass ototoxic Medikamente wie Cisplatin, Gentamicin und Streptomycin induzierte Caspase-3 - Aktivierung in diesen Zellen archetypischen, während Medikamente als nicht-ototoxische, wie Penicillin, nicht 2,3. Daher wurde diese Zelllinie als ein in vitro - System vorgeschlagen , um die zellulären und molekularen Mechanismen in Ototoxizität beteiligt zu untersuchen , und für das Screening des potentiellen Ototoxizität oder otoprotektiven Eigenschaften neuer pharmakologischer Wirkstoffe. Es wird geschätzt, dass HEI-OC1-Zellen wurden in mehr als einhundertfünfzig Untersuchungen in den letzten zehn Jahren veröffentlicht verwendet.

Während der Suche das Hauptziel der meisten Studien war auf dem Potential pro-apoptotische Wirkung verschiedener Medikamente beteiligt diese Zelllinie, andere wichtige Zellprozesse wie Autophagie und Seneszenz haben gerade erst begonnen 4-7 in HEI-OC1 - Zellen untersucht werden. ichna aktuelle Studie aus unserem Labor 8 verwendeten wir HEI-OC1 - Zellen einen umfassenden Satz von Daten über den Zelltod, Überleben, Proliferation, Seneszenz und durch unterschiedliche pharmakologische Wirkstoffe in der Klinik verwendet häufig induzierten Autophagie zu sammeln. Wir verglichen auch einige der Antworten von HEI-OC1-Zellen mit denen aus HEK-293 (menschliche embryonale Nierenzellen) und HeLa (humane Epithelzellen) Empfangen identische Behandlung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass HEI-OC1 Zellen an die jedes Medikament in einer charakteristischen Art und Weise, mit einem unverwechselbaren dosis- und zeitabhängige Empfindlichkeit auf mindestens einer der Mechanismen zu untersuch reagieren. Wir betonten auch in dieser Studie , dass eine korrekte Interpretation der experimentellen Ergebnisse erfordern parallel Studien mit mehr als eine Technik 8 durchgeführt wird .

In einer anderen Studie untersuchten wir die Verwendung von HEI-OC1 - Zellen die funktionelle Reaktion von Prestin, das Motorprotein von Cochlea äußeren Haarzellen (OHC) 9 zu bewerten + K + ATPase, welche von der Plasmamembran zum Zytoplasma ohne wesentliche Änderungen in Gesamtzellexpressions transloziert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass P-HEI-OC1-Zellen haben eine robuste NLC Motorfunktion prestin verbunden, die abnimmt, wenn die Dichte der prestin Moleküle, die an der Plasmamembran erhöht. Insgesamt stark diese Ergebnisse die Nützlichkeit von HEI-OC unterstützen1-Zellen auditorischen Proteine ​​zu untersuchen.

In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie HEI-OC1-Zellen zu Kultur, warum es bequem ist, Zellen zu verwenden, die an der permissiven Bedingungen (P-HEI-OC1) für Zytotoxizitätsuntersuchungen, wie der Mechanismus / s von arzneimittelinduzierten Zytotoxizität zu bewerten und wie elektro~~POS=TRUNC Untersuchungen (zB Patch-clamp, nicht-lineare Kapazität (NLC)) durchzuführen funktionellen Eigenschaften von prestin, der molekularen Motor Cochlea OHCs zu untersuchen.

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Protocol

1. Zellkultur

Hinweis: Alle Zellkulturprotokolle müssen unter Verwendung geeigneter Zellkulturtechniken durchgeführt werden (als Referenz siehe die ersten drei Kapitel der Zellbiologie: A Laboratory Handbook, Band I 10). HEI-OC1-Zellen benötigen keine zusätzliche Beschichtung oder Behandlung der Zellkulturschalen für eine ordnungsgemäße Anhaftung und Wachstum. Sehr wichtig: Verwenden Sie keine Glaswaren Geschirr für die Zellkultur Zwecke; der Phänotyp und biologische Reaktion der Zellen auf pharmakologische Wirkstoffe ändert (G Kalinec & F Kalinec, nicht veröffentlicht); herkömmlichen Kunststoff-Zellkulturschalen (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung) empfohlen. Achten Sie besonders auf aseptischer Techniken Kontaminationen zu vermeiden, aber niemals Antibiotika (zB Ampicillin oder Streptomycin) mit HEI-OC1 - Zellen verwendet werden . Verwenden Sie bei Bedarf Amphotericin B. Während HeLa und HEK-293 - Zellen wurden als Kontrolle in früheren Studien mit HEI-OC1 8, jede andere Zelllinie könnte verwendet wordenakzeptabel für diesen Zweck.

  1. Resuscitation of Frozen HEI-OC1-Zellen
    Hinweis: Dieses Protokoll kann auch mit anderen Zelllinien aus der gleichen transgenen Maus entwickelte in unserem Labor, wie OC-k3 verwendet werden, von Corti - Organ 11,12 und SV-k1, aus Stria vascularis 13,14.
    1. Entfernen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten HEI-OC1 - Zellen aus flüssigen N 2, und legen Sie es bei 37 ° C in einem Wasserbad. Versenken Sie nur die untere Hälfte des Fläschchens, und lassen Sie es zu tauen, bis nur noch eine geringe Menge an Eis in der Flasche bleibt. Wischen Sie die Außenseite des Fläschchens mit 70% Alkohol.
    2. Pipette , die Zellen aus dem Fläschchen und liefern das gesamte Volumen (~ 1,5 × 10 5 Zellen / ml) langsam, tropfenweise in ein 15 ml konisches Röhrchen von 10 ml einer vorgewärmten Nährmedium enthält, wie Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium ( DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS).
    3. Entfernen DMSO durch das Rohr bei 300-500 xg für 5 min zentrifugiert, t Verwerfener Überstand und Resuspendieren der Zellen in 9 ml frisches Wachstumsmedium (DMEM + 10% FBS). Disaggregieren Klumpen oder Folien aus Zellen durch Fluss- und Rückfluss der suspendierten Zellen, aus der Pipette in das Medium und umgekehrt, drei- bis viermal mit der Spitze der Pipette den Boden des Röhrchens zu berühren.
    4. Platzieren des Gesamtvolumens der in Wachstumsmedium suspendierten Zellen in 100 mm-Durchmesser unbehandeltem, Kunststoff-Zellkulturschalen.
    5. Inkubieren der Zellen bei 33 ° C mit 10% CO 2 (permissive Bedingungen).
  2. Subculture von HEI-OC1-Zellen
    Hinweis: Vor der Konfluenz (~ 80%) sollten die Zellen in Suspension und subkultiviert, um gebracht werden, um die Kultur zu verhindern, zu sterben. Dieses Protokoll kann auch mit anderen Zelllinien entwickelt , in unserem Labor aus der gleichen transgenen Maus, wie OC-k3, von Corti - Organ 11,12 und SV-k1, aus Stria vascularis 13,14 verwendet werden.
    1. Entfernen Sie alte Medium und waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS. </ Li>
    2. Decken die Zellschicht mit einer Lösung von 0,25% Trypsin, unter Verwendung von 1 ml pro 25 cm 2 Oberfläche. So verschieben Sie auf den nächsten Schritt mehr als 40% der Zellen müssen gelöst werden. Untersuchen Sie die Zellen, die ein inverses Mikroskop mit und, falls erforderlich, "schlagen oder tippen Sie auf" die Kulturschalen sanft alle verbleibenden anhaftenden Zellen zu lösen.
      Hinweis: Achten Sie darauf, wie Trypsinisierung für längere Zeit kann zum Zelltod führen; nicht genug, und die übertragenen Zellen werden für die geplanten Studien unzureichend.
    3. Resuspendieren der Zellen, nach dem in 1.1.3 beschriebenen Verfahren, und sie auf einem 15 ml konischen Röhrchen.
    4. Zentrifuge für 5 Minuten bei 300 bis 500 · g, entsorgen Sie das Medium, um die Zellen mit frischem Wachstumsmedium sammeln und Saatgut sie in zumindest vier 100 mm-Durchmesser-Zellkulturschalen. Die Anzahl der Zellen pro Schale wird gewonnen auf der Menge der Zellen ab. Inkubieren der Zellen bei 33 ° C mit 10% CO 2 (P-HEI-OC1) und dividieren wieder so oft wie erforderlich ,die geplanten Experimente oder für ein neues Lager zu erzeugen.
    5. Für die Stoffaufbereitung, ersetzen 100 mm-Schalen mit einem Durchmesser von 250 bis 550 ml Zellkulturflaschen; für Experimente, kleinere Gerichte oder mehreren Vertiefungen Platten können mehr ausreichend sein.
    6. Zur Unterscheidung brüten HEI-OC1-Zellen bei permissiven Bedingungen, bis sie ~ 80% Konfluenz erreichen; bewegen dann die Teller bis 39 ° C mit 5% CO 2 (NP-HEI-OC1) für 2 bis 3 Wochen.
      Hinweis: Die Zellen progressiv stoppt wuchernden und Sterben. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag, um tote Zellen zu entfernen. In Abhängigkeit von der ursprünglichen Anzahl von Zellen, in der Regel nach ca. 4 Wochen keine weiteren Zellen für Experimente zur Verfügung steht. Die Differenzierung beginnt, sobald die Zellen bei NP Bedingungen gestellt werden, aber nicht jede Zelle unterscheiden im gleichen Tempo. Wichtig ist , dass Prestin - Expression und Membranlokalisierung nimmt während des Differenzierungsprozesses (Repräsentative Ergebnisse, siehe Abbildung 4), wird eine qualitative Bereitstellungund quantitative Angabe der Ebene der Differenzierung.

2. Drug Zytotoxizitätsstudien

Hinweis: HEI-OC1 - Zellen bei permissiven Bedingungen gezüchtet (P-HEI-OC1) sind für diese Studien empfohlen (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 1).

  1. Zelllebensfähigkeit (MTT-Assay)
    1. Sammeln P-HEI-OC1-Zellen durch das Verfahren in 1.2 beschrieben nachfolgen und zählen sie entweder mit einem automatischen Zellzähler oder Hämozytometer. Stellen Sie die Konzentration auf 2,0 x 10 5 Zellen / ml.
    2. Seed die Zellen auf 96-Well-klar-Flachbodenplatten (100 ul pro Vertiefung), Inkubation über Nacht zur Befestigung an dem Substrat, und dann behandeln sie mit den Drogen von Interesse. Vergessen Sie nicht, Leerzeichen enthalten und nicht-behandelten Zellen (Kontrolle)!
    3. Nach medikamentöse Behandlung (in der Regel 24 oder 48 Stunden bei 33 ° C), führen Sie den MTT-Test gemäß dem Protokoll des Herstellers. Im AlgemeinenDie Protokolle für diesen Test haben die folgenden Schritte:
      1. Werden 10 ul MTT-Reagenz zu jedem Well.
      2. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 2 bis 4 Stunden, bis lila Farbstoff sichtbar ist, und dann wurden 100 ul der MTT Waschmittel Reagent hinzufügen zu jeder Vertiefung. Sie nicht die Platte schütteln.
      3. Decken Sie die Platte und lassen Sie ihn im Dunkeln für 2 bis 4 Stunden bei 37 ° C.
      4. Verwenden Leser eine Mikrotiterplatten-Absorption bei 570 nm zu messen, in jede Vertiefung, einschließlich der Zuschnitte (Wachstumsmedium allein). Normalisieren Daten die durchschnittliche OD in Kontrollzellen als 100% der Lebensfähigkeit verwendet wird.
  2. Caspase 3/7 Aktivierungs-Assay
    Hinweis: HEI-OC1-Zellen bei permissiven Bedingungen gezüchtet (P-HEI-OC1) sind für diese Studien empfohlen.
    1. Sammeln Sie HEI-OC1-Zellen durch das Verfahren in 1.2 beschrieben nachfolgen und zählen sie entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer. Stellen Sie die Konzentration auf 2,0 x 10 5 Zellen / ml.
    2. Seed die Zellen auf white-walled 96-Well-Platten (100 & mgr; l pro Vertiefung), Inkubation über Nacht zur Befestigung an dem Substrat, und dann behandeln sie mit den Drogen von Interesse. Vergessen Sie nicht, Leerzeichen enthalten und nicht-behandelten Zellen (Kontrolle)!
    3. Nach medikamentöse Behandlung (in der Regel 24 oder 48 Stunden bei 33 ° C), führen Sie die Caspase-Test gemäß dem Protokoll des jeweiligen Herstellers. In der Regel haben die Protokolle für diesen Test die folgenden Schritte:
      1. Bereiten Sie die Reagenzien, mischen sie gut, und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur äquilibrieren.
      2. Entfernen der Zellen aus dem Inkubator und lassen die Platten auf Raumtemperatur äquilibrieren.
      3. Fügen Sie die angegebene Menge an Reagenz in jede Vertiefung, eine Kreuzkontamination zu vermeiden, wobei darauf geachtet, indem sie nicht zu berühren Vertiefungen, die unterschiedliche Proben mit den gleichen Pipettenspitzen.
      4. Decken Sie die Platte und mischen für 30 Sekunden einen Plattenschüttler bei 300-500 UpM.
      5. Inkubieren der Platte bei Raumtemperatur für einen Zeitraum von mindestens 30 min. determine die optimale Inkubationszeit empirisch. Wenn die Raumtemperatur schwankt eine konstante Temperatur Inkubator verwendet werden, da Temperaturschwankungen Lumineszenz Lesen beeinflussen.
      6. Messen Sie Lumineszenz in jeder Vertiefung und normalisieren Werte unter Zugrundelegung eines durchschnittlichen Lumineszenz in Kontrollzellen als 100% der Caspase-Aktivierung.
  3. Zellteilung (Proliferation)
    1. Sammeln Sie HEI-OC1-Zellen durch das Verfahren in 1.2 beschrieben nachfolgen und zählen sie entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer. Stellen Sie die Konzentration auf 2,0 x 10 5 Zellen / ml.
    2. Seed die Zellen auf 96-Well-klar-Flachbodenplatten (100 ul pro Vertiefung), Inkubation über Nacht bei permissiven Bedingungen für die Befestigung an dem Substrat, und dann behandeln sie mit den Drogen von Interesse. Vergessen Sie nicht, Leerzeichen enthalten und nicht-behandelten Zellen (Kontrolle)!
    3. Eine Stunde nach der Behandlung, fügen Sie in jede Vertiefung 1 ul vorbereitet 100x BrdU (5-Brom-2'-deoxyurispeisen) Lösung, und kehren die Platten in den Inkubator bei 33 ° C.
    4. Nach 12, 24 und 48 Stunden, entfernen Sie das vorhandene Medium aus den entsprechenden Platten und waschen jede Vertiefung einmal mit PBS.
    5. Führen Sie die Zellproliferationsassay gemäß dem Protokoll des Herstellers. In der Regel haben die Protokolle für diesen Test die folgenden Schritte:
      1. Bereiten Sie die Reagenzien, einschließlich Befestigungs / Denaturierungslösung, Waschpuffer, primärer Antikörper-Nachweislösung, sekundäre Antikörper-Nachweis-Lösung und BrdU-Lösung wie im Protokoll des Herstellers angegeben.
      2. Fügen Sie die Befestigungs / Denaturierungslösung zu jeder Vertiefung, in den Mengen, in dem Protokoll des Herstellers angegeben ist, und halten Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 min.
      3. Entfernen Sie die Befestigungs / Denaturierungslösung und fügen Sie den primären Antikörper bei der Konzentration in dem Protokoll des Herstellers angegeben. Halten Sie die Platte bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
      4. Entfernen Sie die Lösung mit dem primären antibody, waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschpuffer und dann den sekundären Antikörper bei der Konzentration in dem Protokoll des Herstellers angegeben hinzuzufügen. Halten der Platte mit dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 30 min.
      5. Entfernen Sie die Lösung mit dem sekundären Antikörper, waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschpuffer, und fügen Sie das Substrat. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur, fügen Sie die STOP-Lösung. Seien Sie vorsichtig: Steuern Sie die Änderung in der Farbe; wenn die Lösung sehr dunkel wird, stoppen Sie die Reaktion vor der Standard-Entwicklungszeit von 10 min.
      6. Lesen Sie die Absorption bei 450 nm innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopplösung.
  4. Zytotoxizität
    Hinweis: HEI-OC1-Zellen bei permissiven Bedingungen gezüchtet (P-HEI-OC1) sind für diese Studien empfohlen.
    1. Inkubieren bei permissiven Bedingungen, in der Regel für 24 bis 48 Stunden, HEI-OC1-Zellen in Zellkulturmedium allein (Kontrolle) oder Medium plus die Medikamente von Interesse.
    2. Am Ende der Behandlungs, Wasche die Zellen dreimal mit PBS und pro 25 cm 2 der Oberfläche einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung für 3 min unter Verwendung von 1 ml lösen.
    3. Nach Abtrennen und Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 3000 × g für 5 min pelletieren, entfernen Sie den Überstand und die Zellen mit dem Reagenz für 15 min im Dunkeln Fleck in Zytotoxizitätstest enthalten.
    4. Bestimmung der Anzahl der lebenden HEI-OC1-Zellen durch Flusszytometrie als Zytometer vom Hersteller der Strömung angedeutet ist.
  5. Vergreisung
    1. Inkubieren bei permissiven Bedingungen, in der Regel für 24 bis 48 Stunden, HEI-OC1-Zellen in Zellkulturmedium allein (Kontrolle) oder Medium plus die Medikamente von Interesse.
    2. Bestimmen die Anzahl der Seneszenz-assoziierte beta-Galactosidase - positiven Zellen mit dem Protokoll unter Verwendung von Durchflusszytometrie beschrieben von Debacq-Chainiaux et al. 15 oder ein anderes Verfahren bekannt , um zuverlässige Ergebnisse zu liefern. Ein kurzes Protokoll für die Durchflusszytometrie ist das folgende:
        <li> Am Ende der experimentellen Behandlungen, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und dann für 1 Stunde bei permissiven Bedingungen mit 100 nM Bafilomycin A1 in Zellkulturmedium inkubiert.
      1. Hinzufügen C12FDG bei einer Endkonzentration von ~ 33 & mgr; M, und weiterhin die Zellen für 1-2 h inkubiert.
      2. Wasche die Zellen zweimal mit PBS, ernten sie unter Verwendung von 1 ml pro 25 cm 2 der Oberfläche einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung für 3 min und pelletieren sie durch Zentrifugation bei 3.000 xg für 5 min.
      3. Resuspendieren der Zellen in eiskalter PBS und bestimmen Zytometrie die Anzahl der positiven HEI-OC1-Zellen durch Durchfluss-Zytometer, wie vom Hersteller des Strömungs angegeben.
  6. autophagy
    1. Sammeln Sie HEI-OC1-Zellen steuern und ausgehungert (beraubt Serum für 48 Stunden) nach dem Verfahren in 1.2 beschrieben, und verarbeiten sie für Western-Blot nach Standardprotokollen. In der Regel haben die Protokolle für die Western-Blot die folgende steps:
      1. Seed HEI-OC1 - Zellen in 6-Well - Platten bei einer Konzentration von 1,0 x 10 5 Zellen / ml. Nach 24 und / oder 48 Stunden, waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS.
      2. Lyse mit 200 ul TNESV Puffer (1% NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4) mit Protease - Inhibitor - Cocktail und 1 mM PMSF für 5 min auf Eis.
      3. Sammeln Sie die Zellen (durch den Boden jeder Vertiefung Schaben), Transfer zum Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 16.800 xg für 5 min bei 4 ° C.
      4. Sammeln Sie die Überstände und zu quantifizieren, um die Proteinkonzentration des BCA-Assay verwendet wird.
      5. In 5x Ladepuffer und 1 mM DTT zu jeder Probe und kochen für 5 Minuten um die Proteine ​​zu denaturieren.
      6. Führen Sie die Proben SDS-PAGE auf einem 4-12% Gel und Transfer auf PVDF-Membranen verwendet wird.
      7. Blockieren die Membranen mit 5% fettfreier Trockenmilch in TBS-T mit 0,1% Tween 20 für 60 min bei RT.
      8. Inkubieren der Membranen über Nacht bei 4 ° C mit primären antibodies.
      9. Am nächsten Tag waschen die Membranen ausgiebig mit TBS-T, und Inkubieren mit einem Sekundärantikörper IgG, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP) (1: 1500) für 1 Stunde.
      10. Erkennen Immunreaktivität mit einer verstärkten Chemilumineszenz (ECL) Detektionssystem. Normalisieren Proteinexpressionsniveaus unter Verwendung von GAPDH (1: 2000 in TBS-T mit 10% fettfreie Trockenmilch) als Standard.
    2. In den Western-Blots untersucht, die Expression von zumindest zwei verschiedene Marker der autophagy wie Beclin-1 und LC3B (in der Regel bei 1: 1000-Verdünnung in TBS-T mit 2,5% BSA). Nicht für eine Kontrolle der Proteinexpression wie GAPDH oder Aktin aussehen vergessen.
    3. Bewerten Sie die Expression des Proteins von Interesse durch Densitometrie eines digitalen Blot-Scanner oder Computer-Software wie dem öffentlichen Bereich NIH-Image oder ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) verwenden.

3. Elektrophysiologie Experimente mit HEI-OC1-Zellen

  1. Ernte Zellen
    Hinweis: Verwenden Sie Zellen wachsen in 100 mm Durchmesser Kulturschalen bei 50% -80% Konfluenz. Trypsin, Accutase, enzymfreie Lösung oder p hosphate- b uffered s aline + e Avio d iamine t etra eine cetic Säure (PBS-EDTA) können zum Anheben der Zellen ohne nennenswerte Auswirkungen auf die Anzahl und Qualität der Gigaseals verwendet werden . In einigen Fällen jedoch macht Trypsinbehandlung die Zellen zerbrechlicher. In diesen Fällen lassen sich die Zellen für etwa 30 Minuten zu erholen, bevor die Experimente beginnen.
    1. Wasche die Zellen zweimal mit 10 ml PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+.
    2. 2 ml eines enzymfreien detacher Lösung, wie nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung und inkubieren das Geschirr für 3 min bei 37 ° C mit 5% CO 2.
    3. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop die Ablösung der Zellen zu überprüfen. Falls erforderlich, bewegen Sie den cell Kulturschale zu mehr Zellen lösen, aber tun Sie es sanft.
      Hinweis: Verwenden Sie nicht das Gericht schütteln.
    4. 10 ml DMEM + 10% FBS und die Zellen Pipette vorsichtig auf und ab fünf Mal mit einer 10-ml-Pipette.
    5. Schauen Sie sich die Zellen unter einem Mikroskop. Wenn> 80% der Zellen bereits getrennt sind (single), sind keine weiteren Pipettieren erforderlich. Wenn die Zellen noch in Clustern sind, wiederholen Sie die vorsichtiges Pipettieren, bis mehr als 80% Zellen Single sind.
    6. Legen Sie die ~ 10 ml suspendierten Zellen in eine 15 ml konischen Röhrchen, Zentrifuge für 2 min bei 100 · g, und den Überstand verwerfen.
    7. Verwenden ~ 200 ul externen Aufzeichnungslösung (Leibovitz L-15-Medium auf 305 eingestellt - 310 mOsm mit destilliertem Wasser), um die Zellen zu resuspendieren. Eine optische Kontrolle der Zellen sollten viele einzelne, runde Zellen mit glatten Membrankanten zeigen.
  2. Patch-Clamp und NLC-Messungen
    1. Führen patch-clamp-Messungen und der spannungsabhängigen nichtlinearen Kapazität (NLC) unter Verwendung einesdequate Verstärker und Software, sowie Standard-elektrophysiologischen Techniken. Als interne (intrapipette) -Lösung Einsatz 150 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0,1 mM EGTA, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM GTP-Na und 10 mM HEPES; pH-Wert auf 7,2 mit Tris.
    2. Unter dem Mikroskop, wählen Sie eine einzelne, gesunde Zelle, mit runden und glatten Membrankanten. Bringen Sie die Spitze der Glaspipette an die Zelloberfläche und Membranwiderstand überprüfen. Dies sollte etwa 3-6 Megaohm, entsprechend einem Innendurchmesser (ID) von der Spitze der Pipette von ~ 2 um betragen.
    3. Drücken Sie vorsichtig die Mikropipettenspitze gegen die Zellplasmamembran und dann absaugen. Ein Teil der Zellmembran wird in die Pipette angesaugt werden kann, einen elektrischen Widerstand in der Größenordnung von 10 zu erzeugen - 100 Gigaohm (Giga-Dichtung).
    4. Stellen Sie die Ganzzell-Zustand durch die Plasmamembran mit Saugpulsen zu stören.
    5. Verwenden Sie Zellen , die als Kontrolle 9 nicht Prestin, wie HEK-293 - express.
      Hinweis: Die Stromantworten bei 5 kHz gefiltert werden soll, und Korrekturen für die Auswirkungen der Restserienwiderstand aus. All die Datenerfassung und die meisten Analysen kann mit der Software in der Regel mit den Lock-in-Verstärker eingeschlossen durchgeführt werden. Kapazitätsfunktion kann auf die erste Ableitung eines Zweizustand - Boltzmann - Funktion in Bezug auf nichtlineare Ladungsmembranspannung 16 versehen sein.

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Representative Results

In ein paar jüngsten Veröffentlichungen berichteten wir eine umfassende Reihe von Studien zur Bewertung der Reaktion von dem Ziel HEI-OC1 - Zellen auf mehrere häufig verwendete pharmakologische Wirkstoffe sowie die Untersuchung prestin Funktion 8,9. In diesen Studien haben wir die Verwendung aller Protokolle in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben.

Eines der Ergebnisse dieser früheren Studien war , dass HEI-OC1 - Zellen bei nicht-permissiven Bedingungen kultiviert (39 ° C / 10% CO 2 = NP-HEI-OC1) eine hochsignifikante Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen zeigte, und einen ebenso signifikanten Anstieg in Zelltod Bezug auf Zellen bei permissiven Bedingungen (33 ° C / 10% CO 2 = P-HEI-OC1) (Abbildung 1) kultiviert. Daher erfolgt jede Zytotoxizität Studie über NP-HEI-OC1-Zellen sollten erhebliche Anstrengungen bei der Unterscheidung Arzneimittelwirkungen von den Auswirkungen der Kulturbedingungen widmen. in addition, da Arzneimittelwirkungen auf die Zellen sterben oder bereits mit einer verringerten Lebensfähigkeit könnte unterschiedlich sein, daß die Wirkungen desselben Arzneimittels auf gesunde Zellen, wir P-HEI-OC1-Zellen für Experimente empfehlen, die spezifisch nicht differenzierten Zellen erfordern.

Unsere Untersuchungen über die Wirkung verschiedener pharmakologischer Wirkstoffe produzierte auch interessante Ergebnisse. Beispielsweise Cisplatin, ein chemotherapeutisches Mittel zur Behandlung von verschiedenen menschlichen Tumoren häufig verwendet, und Acetaminophen (APAP = N- eine Cetyl- pa ra-amino p henol), die am häufigsten verkauft over-the-counter Schmerzmittel in den USA, beide toxisch waren für HEI-OC1 - Zellen (Abbildung 2). Doch während APAP die Lebensfähigkeit der Zellen verringert und erhöhte Caspase 3/7 Aktivierung, es hat nicht den Zelltod auslösen. Cisplatin, dagegen deutlich stärker auf die drei Antworten (Abbildung 2). Interessanterweise waren Caspasen 3/7 Möstly aktiviert bei niedrigeren Konzentrationen Cisplatin, was darauf hindeutet, dass der Zelltod durch niedrige Dosen von Cisplatin induziert wahrscheinlich durch Apoptose vermittelt wurde, während hohe Dosen letalen Wirkungen mit Onkose / Nekroptose in Verbindung gebracht werden könnte. Während Onkose hat als Pre-lethal Weg führt zu ungeregelten Zelltod begleitet von zellulären und Organell Schwellung, blebbing und erhöhte Membranpermeabilität 17,18 definiert worden ist , ist eine geregelte Nekroptose nicht-apoptotischen Zelltod - Mechanismus durch die gleichen Stimuli aktiviert , die initiieren Apoptose , jedoch mit morphologischen Eigenschaften ähnlich denen von Onkose 19-22.

Weitere Studien mit der Auswirkungen von APAP Untersuchung und Cisplatin auf P-HEI-OC1 - Zellen zeigten eine deutliche, dosisabhängige Wirkung von APAP auf die Zellproliferation, die die faszinierende Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen ohne den Zelltod im vorhergehenden Absatz beschriebenen erklären konnte (Abbildung 3A). Cisplatin als o verminderte Zellproliferation, und seine Wirkung mit der Zeit der Belichtung verstärkt auch bei kleinen Dosen (3A), aber zusätzlich verringert Seneszenz bei allen Konzentrationen und Zeitpunkte in unserer Studie aufgenommen (3B). Die signifikante Abnahme der Zelle , die durch Cisplatin induzierte Seneszenz durch die Erhöhung der Zelltod erklärt werden könnte, vorausgesetzt , dass seneszenten Zellen wahrscheinlich wäre, anfällig schneller zu sterben , als gesunde Zellen 23.

Wichtig ist, deuten diese Ergebnisse, dass die repräsentativen HEI-OC1-Zellen auf unterschiedliche pharmakologische Wirkstoffe mit ausgeprägtem dosis- und zeitabhängige Empfindlichkeit auf mindestens einer der Mechanismen zu untersuch reagieren. Daher wird eine korrekte Interpretation von jedem experimentellen Ergebnis ein klares Verständnis für die besonderen zellulären Prozesse untersucht erfordern und die durch jede der Techniken zur Verfügung gestellten Informationen verwendet, um sie zu bewerten.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Die konfokale und Durchflusszytometrie Experimente, auf der anderen Seite bestätigt Prestin-Expression in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1-Zellen, mit prestin immunolocalizing meist bei der Zytoplasma von P-HEI-OC1 - Zellen (4A, Pfeile), und konzentrierter an der Plasmamembran in NP-HEI-OC1 - Zellen (4B, Pfeile). die Durchflusszytometrie Studien zeigten einen deutlichen Anstieg der Prestin - Expression in NP-HEI -OC1 Zellen bezüglich P-HEI-OC1 - Zellen (4C und 4D). Die zeitabhängige Erhöhung der Expression und Plasmamembran Lokalisierung von Prestin in NP-HEI-OC1 - Zellen legt nahe , dass die Translokation durch die Synthese von mehr prestin Molekülen begleitet wurde. Allerdings bieten diese Experimente Hinweise nicht zu entscheiden, ob prestin Moleküle ursprünglich im Zytoplasma Bewegung zu der Plasmamembran befindet und neue Moleküle ersetzt sie, wenn sie im Cytoplasma verbleiben und nur der neu synthesized prestin bewegt sich in die Plasmamembran oder eine Kombination beider Verfahren.

Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten eine robuste NLC in P-HEI-OC1 - Zellen (5B), mit einem Spitzenwert, verringert und eine Spannung bei Spitzenkapazität, die zu mehr depolarisierten Werten verschoben, wenn die Zellen auf nicht-permissiven Bedingungen für 1 verschoben wurden , und 2 Wochen (5C und 5D). Aufgrund der fortschreitenden Translokation von prestin aus dem Zytoplasma in die Plasmamembran, die Hypothese aufgestellt ursprünglich dass NLC höher in NP-HEI-OC1 wäre als in P-HEI-OC1-Zellen, und dass es weiter mit der Zeit der Inkubation bei NP erhöhen Bedingungen. Überraschenderweise zeigten die Ergebnisse unserer Studien genau die entgegengesetzte Reaktion. Wir spekulierten, dass die Erhöhung der Dichte von prestin Moleküle in der Plasmamembran ihrer Motorik werden beschränken könnte.

Hin-page = "1"> Hinweis in Abbildung 5 die Depolarisation der Spannung bei Spitzenkapazität in HEI-OC1 - Zellen zu den typischen Werten in OHC und in HEK293 Zellen 24 berichtet , achten; Darüber hinaus beobachten, dass die depolarisierende Verschiebung mit der Zeit zunimmt bei NP Bedingungen. Die progressive depolarisierenden Verschiebung ist ähnlich der in OHCs bei Maus und Ratte Entwicklung 25,26 beschrieben ist , und es war vorgeschlagen worden , dass es mit der OHC der Plasmamembran 25 oder einem Reifungsprozess assoziiert mit der Entwicklung anderer zellulärer Strukturen in Beziehung gesetzt werden könnte intrinsische zu Prestin 24.

Wir hoffen, dass diese kurze Neuauszählung der wenigen Studien mit HEI-OC1-Zellen genügend Beweise für die potentielle Nützlichkeit von HEI-OC1-Zellen bieten ein breites Spektrum von Zell- und Molekularreaktionen zur Untersuchung.

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Abbildung 1: Zelllebensfähigkeit und Zelltod in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1 - Zellen. (A) Die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem MTT - Test bewertet. Die Extinktion wurde mit einem Plattenleser gemessen und die mittlere OD in Kontrollzellen wurde als 100% der Lebensfähigkeit genommen. (B) Der Zelltod mit einem Cytotoxicity Assay ausgewertet. 530 15 nm: Die Anzahl der positiven (toten) Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie mit 488 nm Anregung (blauer Laser) und FL1 bestimmt. Beachten Sie die hochsignifikant (P ≤0.001) Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen (A) und der Erhöhung der Zelltod (B) , induziert durch nicht-permissiven Bedingungen. Die Balken stellen Standardfehler der Mittelwerte (SEM). Geändert von Referenz 8. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2:. Antworten von HEI-OC1 Zellen Exposed APAP und Cisplatin bei Analysiert von MTT, Caspasen 3/7 und Zytotoxizitätstests (A) Lebensfähigkeit Zelle mit dem MTT - Test ausgewertet, und die Absorption mit einem Plattenlesegerät gemessen. (B) Aktivierung von Caspasen Henkers 07.03. (C) Drug - induzierte Zelltod mit einem Zytotoxizitätstest ausgewertet; die Zahl der positiven (toten) Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Daten in jedem Experiment wurde an die jeweiligen Steuerbedingungen normalisiert (Kontrolle = 1) möglich gleichzeitige statistische Analyse zu machen. * = P ≤0.05 Bezug auf Kontrolle. Die Balken stellen Standardfehler der Mittelwerte (SEM). Modifizierte fromreference 8. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Auswirkungen von APAP und Cisplatin auf HEI-OC1 Cells Mitoserate und Seneszenz. (A) Arzneimittelinduzierte Veränderungen auf die Geschwindigkeit der mitotischen Teilung von HEI-OC1 - Zellen nach 24 und 48 h wurde mit einem BrdU - Assay ausgewertet. (B) Arzneimittel-induzierter Seneszenz in HEI-OC1 - Zellen durch Durchfluss - Zytometrie gemessen wurde , und dem senescence- assoziierten β-Galactosidase (SA-bGal) -Technik. Daten in jedem Experiment wurde an die jeweiligen Steuerbedingungen normalisiert (Kontrolle = 1) möglich gleichzeitige statistische Analyse zu machen. * = P ≤0.05 Bezug auf Kontrolle. Die Balken stellen Standardfehler der Mittelwerte (SEM). Modifizierte fromreference 8. Bitte hier klicken , um eine größere Version von t anzuzeigenseine Figur.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Prestin Expression in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1 Zellen - Zellen wurden Beschriftet mit Anti-Prestin Antikörper und Beobachtet von konfokale Mikroskopie und Durchflusszytometrie (A) In P-HEI-OC1 - Zellen Prestin immunolocalized meist an das Zytoplasma (Pfeile). (B) In NP-HEI-OC1 - Zellen wurde im Gegensatz dazu prestin Reaktivität an der Plasmamembran (Pfeile) konzentriert. (C und D) Durchflusszytometrie Studien in HEI-OC1 - Zellen, die für 2 Wochen bei NP Bedingungen (D) zeigte eine deutliche Steigerung der prestin Ausdruck in Bezug auf P-HEI-OC1 - Zellen (C). (C) Inset ist zweitrangig ab allein (negative Kontrolle). Geändert von Referenz 9.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: NLC Studien in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1 - Zellen (A) Patch-geklemmt HEI-OC1 Zelle.. (B - D) NLC in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1 - Zellen. Man beachte die Abnahme in der Spitze der NLC und die schrittweise Verschiebung der Kurven zu mehr depolarisiert Werte in NP-HEI-OC1-Zellen. Geändert von Referenz 9. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In diesem Bericht beschreiben wir, wie sie zur Kultur HEI-OC1-Zellen und verwenden Mechanismen der medikamenteninduzierten Zytotoxizität zu bewerten und funktionellen Eigenschaften von Prestin, der molekulare Motor der Cochlea-OHC zu untersuchen. Die technischen Verfahren sind jedoch allgemein genug, um leicht an verschiedene Studien anzupassen.

Alle Protokolle hier beschrieben sind, erfordern die korrekte Verwendung von gut etablierten Zellkulturtechniken 10. Genau wie bei jedem anderen Zelllinie, die Arbeit mit HEI-OC1-Zellen erfordert einen entsprechend ausgerüsteten Zellkultur-Anlage, mit einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank, einer gekühlten Zentrifuge, ein Wasserbad, und ein inverses Mikroskop zur Untersuchung von Zellkulturen und zum Zählen von Zellen bei Verwendung von hemocytometric Techniken. Eine einzigartige Voraussetzung ist jedoch die Verfügbarkeit von zwei befeuchteten Inkubatoren, ein Satz bei 33 ° C / 10% CO 2 für P-HEI-OC1 - Zellen und anderen bei 39 ° C / 5% CO 2 für NP-HEI-OC1 Zelles. Wenn die geplanten Studien nur P-HEI-OC1 - Zellen beteiligt sind , können die zweite Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 für verschiedene Tests eingestellt werden.

Die Verwendung von Kunststoff-Zellkulturschalen ist eine wichtige zusätzliche Voraussetzung für die mit HEI-OC1-Zellen arbeiten. In der Tat sind HEI-OC1-Zellen sehr robust, und sie werden das Wachstum in verschiedenen Oberflächen und unter sehr unterschiedlichen Bedingungen. Allerdings ist ihr Phänotyp und ihre Reaktion auf Medikamente und andere Stimuli wird stark abhängig von den Kulturparameter (G Kalinec & F Kalinec, nicht veröffentlicht). Wie wir in einer früheren Arbeit 8 diese Plastizität von HEI-OC1 - Zellen argumentiert vorteilhaft neuartige Experimente verwendet werden können , zu entwickeln. Beispielsweise ist es gut bekannt , dass die Sauerstoffspannung in der Cochlea Perilymphe ist viel geringer (~ 2 kPa) als in einem typischen Brutschrank auf Meereshöhe (~ 21,3 kPa) 27. Bebrütung von HEI-OC1 - Zellen bei niedrigeren O 2 -Konzentrationen ihre Antworten ändern, vielleicht um ihnen ein besseres Modell für die Prüfung zu machenory Sinneszellen.

Es sollte betont werden , dass die beschriebenen Protokolle und Subkultur von HEI-OC1 - Zellen können auch mit anderen auditory Zelllinien entwickelt , in unserem Labor aus der gleichen transgenen Maus, wie OC-k3 von Corti - Organ und 11,12 SV verwendet werden -k1 von Stria vascularis 13,14. Darüber hinaus könnten diese Zelllinien als Kontrolle für HEI-OC1-Zellen in ausgewählten Experimenten nützlich sein. Zum Beispiel haben wir SV-K1 - Zellen zeigen , dass die umgekehrt proportional Immunreaktivität prestin und Na + K + ATPase - Antikörper an der Plasmamembran von HEI-OC1 - Zellen war zelltypabhängige Reaktion statt , die mit der transgenen Maus kürzlich verwendet , um aus welche diese Zellen wurden 9 abgeleitet.

Andere wichtige Voraussetzung für das Arbeiten mit HEI-OC1-Zellen ist die Praxis der entsprechenden aseptischen Techniken wie alle Arbeitsflächen innerhalb der Sicherheitswerkbank mit 70% e Reinigungthanol oder Isopropanol und die Dekontamination von Materialien für die Verfahren erforderlich. Während jedoch andere Säugerzelllinien häufig gegen unbeabsichtigtes bakterielle Kontamination geschützt werden unter Verwendung von Penicillin-Streptomycin oder andere ähnliche Kombinationen, Antibiotika darf niemals mit HEI-OC1-Zellen mit Ausnahme verwendet werden, wenn der Zweck der Studie ist, deren Auswirkungen zu untersuchen. HEI-OC1-Zellen wurden in antibiotikafreien Bedingungen erzeugt wird, und sie müssen vermieden werden, um die Entstehung von Antibiotika-resistenten Zellen zu reduzieren.

Schließlich wollen wir einen Punkt nochmals zu betonen, bereits mehrmals in diesem Bericht erwähnt: der Phänotyp und die Antwort von HEI-OC1-Zellen auf Medikamente und andere Reize stark von den Kulturparametern abhängen. Daher ist es sehr wichtig, dass die Laboratorien arbeiten mit HEI-OC1-Zellen verwenden ähnliche Protokolle und Zellkulturbedingungen, um ihre Ergebnisse wirklich mit den von anderen Gruppen zur Verfügung gestellt vergleichbar zu machen. Darüber hinaus ist essehr wichtig, dass der HEI-OC1-Zelllinie ist nur ein Modell, mit allen Einschränkungen zu bedenken, dass ein Modell hat. Erwartung , dass in - vitro - Experimente mit HEI-OC1 - Zellen werden Daten , die die In - vivo - Antworten von realen Gehörsinneszellen genau liefern darstellen unrealistisch ist. Wir glauben jedoch, stark die HEI-OC1-Zelllinie für die Untersuchung von funktionellen Antworten von Gehörsinneszellen und das Screening der potenziellen ototoxicity pharmakologischer Wirkstoffe ein nützliches Modell ist.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

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References

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