Arbejde med Auditiv HEI-OC1 Cells

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) celler er afledt fra det auditive organ i en transgen mus 1,2. Inkubation af enhver celle fra denne transgene mus ved 33 ° C / 10% CO2 (tolerante betingelser) inducerer ekspression af et immortaliserende gen, der udløser de-differentiering og accelereret proliferation; flytte cellerne til 39 ° C / 5% CO 2 (ikke-tolerante betingelser) føre til nedsat proliferation, differentiering og, i det mindste i tilfælde af HEI-OC1, celledød 2,3.

HEI-OC1 celler blev klonet og karakteriseret i vores laboratorium over ti år siden, og de første undersøgelser viste, at de udtrykker specifikke markører for cochleare hårceller, såsom Prestin, myosin 7a, Atoh1, BDNF, calbindin og calmodulin, men også markører for støtte celler som connexin 26 og fibroblastvækstfaktorreceptor (FGF-R) 2. Derfor blev det foreslået, at HEI-OC1 kunne udgøre en common stamfader til sensoriske og understøttende celler i organ Corti 2. Parallelle undersøgelser forudsat stærke beviser for, at arketypiske ototoksiske stoffer som cisplatin, gentamicin og streptomycin induceret caspase-3 aktivering i disse celler, mens lægemidler anses ikke-ototoksisk, ligesom penicillin, ikke gjorde 2,3. Derfor blev denne cellelinje foreslået som et in vitro-system til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer involveret i ototoksicitet og til screening af potentielle ototoksicitet eller otoprotective egenskaber af nye farmakologiske stoffer. Det anslås, at HEI-OC1-celler er blevet anvendt i mere end et hundrede og halvtreds undersøgelser offentliggjort i de sidste ti år.

Ud fra følgende betragtninger ser på potentielle pro-apoptotiske effekt af forskellige stoffer var den største mål af de fleste af de undersøgelser med denne cellelinie, har andre vigtige celle processer som autofagi og ældning lige begyndt at blive undersøgt i HEI-OC1 celler 4-7. jegna nylig undersøgelse fra vores laboratorium 8, vi brugte HEI-OC1 celler til at indsamle et omfattende sæt af data om celledød, overlevelse, spredning, ældning og autofagi fremkaldt af forskellige farmakologiske stoffer, der ofte anvendes klinikken. Vi sammenlignede også nogle af svarene fra HEI-OC1 celler med dem fra HEK-293 (humane embryonale nyreceller) og HeLa (humane epitelceller) modtager samme behandling. Vores resultater indikerede, at HEI-OC1-celler reagerer på hvert lægemiddel i en karakteristisk måde, med en karakteristisk dosis- og tidsafhængig følsomhed over for mindst en af ​​de mekanismer, der undersøges. Vi understregede også i denne undersøgelse, at en korrekt fortolkning af de eksperimentelle resultater vil kræve at udføre parallelle undersøgelser med mere end én teknik 8.

I en anden undersøgelse undersøgte vi brug af HEI-OC1-celler til at vurdere den funktionelle reaktion Prestin, motoren proteinet af cochleare ydre hårceller (OHCs) 9 + K + ATPase, der omplantes fra plasmamembranen til cytoplasmaet uden væsentlige ændringer i den totale celleekspression. Derudover demonstrerede vi, at P-HEI-OC1 celler har en robust CNT tilknyttet Prestin motorisk funktion, der faldt når densiteten af ​​Prestin molekyler til stede på plasmamembranen forøget. Tilsammen understøtter disse resultater kraftigt anvendeligheden af ​​HEI-OC1-celler for at undersøge auditive proteiner.

I denne video artiklen beskriver vi, hvordan kultur HEI-OC1-celler, hvorfor det er hensigtsmæssigt at anvende celler vokser med permissive betingelser (P-HEI-OC1) for cytotoksicitet undersøgelser, hvordan man vurderer mekanismen / s af lægemiddel-induceret cytotoksicitet og hvordan at udføre elektrofysiologiske undersøgelser (f.eks, patch-clamp, ikke-lineær kapacitans (NLC)) for at undersøge funktionelle egenskaber Prestin, den molekylære motor af cochleære OHCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur

Bemærk: Alle celle dyrkning protokoller skal udføres ved hjælp af ordentlig celledyrkningsteknikker (for reference se de første 3 kapitler i Cellebiologi: A Laboratory Handbook, bind I 10). HEI-OC1 celler kræver ikke nogen yderligere belægning eller behandling af cellekultur retter til ordentlig vedhæftning og vækst. Meget vigtigt: Brug ikke glas retter til cellekultur formål; fænotypen og biologiske respons af cellerne til farmakologiske lægemidler vil ændre (G Kalinec & F Kalinec, ikke publiceret); konventionelle plast cellekultur retter anbefales (se tabel Materialer / udstyr). Vær særlig opmærksom på aseptiske teknikker til at undgå forureninger, men aldrig bruge antibiotika (f.eks ampicillin eller streptomycin) med HEI-OC1 celler. Brug om nødvendigt amphotericin B. Mens HeLa og HEK-293-celler er blevet anvendt som kontrol i tidligere undersøgelser med HEI-OC1 8, enhver anden cellelinie kunnevære acceptabelt til dette formål.

  1. Genoplivning af Frozen HEI-OC1 Cells
    Bemærk: Denne protokol kan også anvendes med andre cellelinjer fra samme transgene mus udviklet i vores laboratorium, såsom OC-k3, fra organ Corti 11,12, og SV-k1, fra stria vascularis 13,14.
    1. Fjern et hætteglas med kryopræserverede HEI-OC1 celler fra væske N2, og læg den i et vandbad ved 37 ° C. Sænk kun den nederste halvdel af hætteglasset, og lad det tø indtil kun en lille mængde is forbliver i hætteglasset. Tør hætteglasset med 70% alkohol.
    2. Pipettere cellerne fra hætteglasset og levere hele mængden (~ 1,5 x 10 5 celler / ml) langsomt, dråbevis til en 15 ml konisk rør indeholdende 10 ml af en forvarmet vækstmedium, ligesom Dulbeccos modificerede Eagles Medium ( DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS).
    3. Fjern DMSO ved centrifugering af røret ved 300-500 x g i 5 minutter, kassere than supernatanten og resuspendere cellerne i 9 ml frisk vækstmedium (DMEM + 10% FBS). Disaggregere klumper eller plader af celler ved flux og tilbagesvaling af de suspenderede celler, fra pipetten til mediet og vice-versa, tre til fire gange med spidsen af ​​pipetten rører bunden af ​​glasset.
    4. Placer det totale volumen af ​​celler suspenderet i vækstmedium i 100 mm-diameter ubehandlede, plast celle dyrkningsskåle.
    5. Inkuber cellerne ved 33 ° C med 10% CO2 (tolerante betingelser).
  2. Subkultur af HEI-OC1 Cells
    Bemærk: Før konfluens (~ 80%) cellerne bør bringes i suspension og sub-dyrket med henblik på at forhindre, at kulturen døende. Denne protokol kan også anvendes med andre cellelinjer udviklet i vores laboratorium fra den samme transgene mus, såsom OC-k3, fra organ Corti 11,12, og SV-k1, fra stria vascularis 13,14.
    1. Fjern gammelt medium og vask af cellerne med 2 ml PBS. </ Li>
    2. Dæk cellemonolaget med en opløsning af 0,25% trypsin, anvendelse af 1 ml pr 25 cm2 overfladeareal. At komme videre til næste trin mere end 40% af cellerne skal afmonteres. Undersøg cellerne ved hjælp af et omvendt mikroskop og om nødvendigt, "smække eller tryk" dyrkningsskålene forsigtigt for at frigive de resterende vedhæftede celler.
      Bemærk: Pas som trypsinisering i lange perioder kan forårsage celledød; ikke nok, og de overførte celler vil utilstrækkelig til de planlagte undersøgelser.
    3. Resuspender cellerne, efter den under 1.1.3 procedure, og overføre dem til et 15 ml konisk rør.
    4. Centrifuger i 5 minutter ved 300-500 xg, kasseres mediet, indsamle cellerne med frisk vækstmedium og frø dem i, i det mindste, fire 100 mm diameter cellekultur retter. Antallet af celler pr skål vil afhænge af mængden af ​​udvundne celler. Inkuber cellerne ved 33 ° C med 10% CO2 (P-HEI-OC1) og deler sig igen så mange gange som nødvendigt forde planlagte forsøg eller til at generere en ny bestand.
    5. For lager forberedelse, udskifte 100 mm diameter retter med 250-550 ml cellekultur kolber; til forsøg, kan mindre retter eller multi-brønde plader være mere fyldestgørende.
    6. For differentiering, inkuberes HEI-OC1 celler ved tolerante betingelser, indtil de når ~ 80% sammenløb; derefter flytte retterne til 39 ° C med 5% CO2 (NP-HEI-OC1) i 2 til 3 uger.
      Bemærk: Celler vil gradvist stoppe prolifererende og døende. Skift medium hver anden dag for at fjerne døde celler. Afhængigt af det oprindelige antal celler, sædvanligvis efter ~ 4 uger ikke flere celler er tilgængelige til eksperimenter. Differentiering starter, så snart cellerne placeret ved NP betingelser, men ikke hver celle differentierer i samme tempo. Vigtigere, Prestin ekspressions- og membranlokalisering stiger under differentiering (se Repræsentative resultater, figur 4), hvilket giver et kvalitativtog kvantitativ angivelse af niveauet for differentiering.

2. Drug Cytotoksicitetsstudier

Bemærk: HEI-OC1 celler dyrket på tolerante betingelser (P-HEI-OC1) anbefales til disse studier (se Repræsentative resultater, figur 1).

  1. Cellelevedygtighed (MTT assay)
    1. Indsamle P-HEI-OC1-celler ved at følge fremgangsmåden beskrevet i 1.2, og tælle dem med enten en automatisk celletæller eller hæmocytometer. Indstille koncentrationen til 2,0 x 10 5 celler / ml.
    2. Frø cellerne på 96-brønds klare fladbundede plader (100 pi per brønd), inkuberes natten over til fastgørelse til underlaget, og derefter behandle dem med lægemidlerne af interesse. Glem ikke at inkludere emner og ikke-behandlede celler (kontrol)!
    3. Efter lægemiddelbehandling (normalt 24 eller 48 timer ved 33 ° C), udføre MTT-assayet ved at følge fabrikantens protokol. Generelt, Protokollerne for dette assay har de følgende trin:
      1. Tilsæt 10 pi MTT-reagens til hver brønd.
      2. Inkubér pladen ved 37 ° C i 2 til 4 timer indtil lilla farvestof er synligt, og derefter tilsættes 100 pi af MTT Detergent Reagens til hver brønd. Ryst ikke pladen.
      3. Dæk pladen og lad det i mørke i 2 til 4 timer ved 37 ° C.
      4. Brug en mikroplade pladelæser at måle absorbansen ved 570 nm i hver brønd, herunder de tomme felter (vækstmedium alene). Normalisér data ved hjælp af gennemsnitlige OD i kontrol celler som 100% af levedygtighed.
  2. Caspase 3/7 Aktivering Assay
    Bemærk: HEI-OC1 celler dyrket på tolerante betingelser (P-HEI-OC1) anbefales til disse undersøgelser.
    1. Indsamle HEI-OC1-celler ved at følge fremgangsmåden beskrevet i 1.2, og tælle dem med enten en automatisk celletæller eller et hæmocytometer. Indstille koncentrationen til 2,0 x 10 5 celler / ml.
    2. Frø cellerne på white-walled 96-brønds plader (100 pi per brønd), inkuberes natten over til fastgørelse til underlaget, og derefter behandle dem med lægemidlerne af interesse. Glem ikke at inkludere emner og ikke-behandlede celler (kontrol)!
    3. Efter lægemiddelbehandling (normalt 24 eller 48 timer ved 33 ° C), udføre caspase-assayet efter den respektive fabrikantens protokol. Generelt protokollerne for dette assay har de følgende trin:
      1. Forbered reagenserne, bland dem godt, og tillade dem at ækvilibrere til stuetemperatur.
      2. Fjerne cellerne fra inkubatoren og tillade pladerne at ækvilibrere til stuetemperatur.
      3. Tilføj den angivne mængde reagens til hver brønd, være omhyggelig med at undgå krydskontaminering ved ikke at røre ved brønde, der indeholder forskellige prøver med de samme pipettespidser.
      4. Dæk pladen og bland i 30 sekunder under anvendelse af en pladeryster ved 300-500 rpm.
      5. Inkubér pladen ved stuetemperatur i et tidsrum på mindst 30 min. determine den optimale inkubationstid empirisk. Hvis rumtemperaturen svinger bruge en konstant temperatur inkubator, fordi temperatursvingninger vil påvirke luminescens læsning.
      6. Mål luminescens i hver brønd, og normalisere værdier under anvendelse gennemsnitlige luminescens i kontrolceller som 100% af caspaseaktivering.
  3. Celledeling (Proliferation)
    1. Indsamle HEI-OC1-celler ved at følge fremgangsmåden beskrevet i 1.2, og tælle dem med enten en automatisk celletæller eller et hæmocytometer. Indstille koncentrationen til 2,0 x 10 5 celler / ml.
    2. Frø cellerne på 96-brønds klare fladbundede plader (100 pi per brønd), inkuberes natten over ved tolerante betingelser for fastgørelse til underlaget, og derefter behandle dem med lægemidlerne af interesse. Glem ikke at inkludere emner og ikke-behandlede celler (kontrol)!
    3. En time efter behandling, tilsættes til hver brønd 1 pi af tilberedt 100x BrdU (5-brom-2'-deoxyurispise) opløsning, og pladerne tilbage til inkubatoren ved 33 ° C.
    4. Efter 12, 24 og 48 timer, fjerne den eksisterende medium fra de tilsvarende plader og vask hver brønd gang med PBS.
    5. Udfør celleproliferationsassay efter fabrikantens protokol. Generelt protokollerne for dette assay har de følgende trin:
      1. Forbered reagenserne, herunder fastsættelse / denaturerende opløsning, vaskebuffer, primære antistof detektion opløsning, sekundært antistof detektion opløsning, og BrdU opløsning som angivet i fabrikantens protokol.
      2. Tilføj fastsættelse / denaturerende opløsning til hver brønd, i de mængder, der er angivet i fabrikantens protokol, og holde pladen ved stuetemperatur i 30 min.
      3. Fjern fastsættelse / denaturerende opløsning og tilsæt det primære antistof ved den koncentration, der er anført i producentens protokol. Hold pladen ved stuetemperatur i 1 time.
      4. Fjern opløsningen med det primære antiBody, vask pladen 3 gange med vaskebuffer, og derefter tilføje det sekundære antistof ved den koncentration, der er anført i producentens protokol. Hold pladen med det sekundære antistof ved stuetemperatur i 30 min.
      5. Fjern opløsningen med det sekundære antistof, vask pladen 3 gange med vaskebuffer, og tilføj substratet. Efter 10 minutters inkubering ved stuetemperatur, tilsæt STOP opløsning. Vær forsigtig: Styr ændringen i farve; hvis opløsningen bliver meget mørk, standse reaktionen før standard udviklingstid på 10 min.
      6. Læs absorbans ved 450 nm inden for 30 minutter for at tilføje STOP Solution.
  4. cytotoksicitet
    Bemærk: HEI-OC1 celler dyrket på tolerante betingelser (P-HEI-OC1) anbefales til disse undersøgelser.
    1. Inkuber ved tolerante betingelser, sædvanligvis i 24-48 timer, HEI-OC1-celler i cellekultur medium alene (kontrol) eller medium plus lægemidlerne af interesse.
    2. Ved afslutningen af ​​behandlingenVaskes cellerne tre gange med PBS, og frigøre anvendelse af 1 ml pr 25 cm2 overfladeareal af en ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning i 3 min.
    3. Efter afmontering, indsamle og pelletere cellerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 5 min, supernatanten fjernes, og plette cellerne i 15 minutter i mørke med reagenset indeholdt i cytotoksicitet assay.
    4. Bestemme antallet af levende HEI-OC1-celler ved flowcytometri som angivet af producenten af ​​flowcytometeret.
  5. ældning
    1. Inkuber ved tolerante betingelser, sædvanligvis i 24-48 timer, HEI-OC1-celler i cellekultur medium alene (kontrol) eller medium plus lægemidlerne af interesse.
    2. Bestem antallet af alderdom-associeret beta-galactosidase positive celler ved hjælp af flowcytometri med protokollen beskrevet af Debacq-Chainiaux et al. 15 eller anden metode er kendt for at give pålidelige resultater. En kort protokol for flowcytometri er følgende:
        <li> I slutningen af ​​de eksperimentelle behandlinger, vaske cellerne tre gange med PBS og derefter inkubere dem med 100 nM bafilomycin A1 i cellekulturmedium i 1 time ved permissive betingelser.
      1. Tilføj C12FDG ved en endelig koncentration på ~ 33 pM, og fortsætte inkubation af cellerne i 1-2 timer.
      2. Vask cellerne to gange med PBS, høste dem anvendelse af 1 ml pr 25 cm2 overfladeareal af en ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning i 3 min, og pellet dem ved centrifugering ved 3.000 x g i 5 min.
      3. Resuspender cellerne i iskold PBS og bestemme antallet af positive HEI-OC1-celler ved flowcytometri som angivet af producenten af ​​flowcytometeret.
  6. autophagy
    1. Indsamle HEI-OC1-celler kontrollere og udsultet (frataget serum i 48 timer) ved at følge fremgangsmåden beskrevet i 1.2, og behandle dem for Western blot ifølge standardprotokoller. Generelt protokollerne for Western blot have følgende steps:
      1. Seed HEI-OC1-celler i 6-brønds plader ved en koncentration på 1,0 x 10 5 celler / ml. Efter 24 og / eller 48 timer, vaskes cellerne med iskold PBS.
      2. Lyse med 200 pi TNESV puffer (1% NP40, 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4) med blanding af proteaseinhibitor og 1 mM PMSF i 5 minutter på is.
      3. Opsamle cellerne (ved skrabning bunden af ​​hver brønd), overførsel til mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 16.800 xg i 5 min ved 4 ° C.
      4. Saml supernatanterne og kvantificere proteinkoncentrationen ved hjælp af BCA-analysen.
      5. Tilføj 5x påsætningsbuffer og 1 mM DTT til hver prøve og koges i 5 min for at denaturere proteinerne.
      6. Kør prøver ved anvendelse af SDS-PAGE på en 4-12% gel, og overførsel til PVDF-membraner.
      7. Blokere membranerne med 5% fedtfri tørmælk i TBS-T med 0,1% Tween 20 i 60 minutter ved stuetemperatur.
      8. Inkuber membranerne natten over ved 4 ° C med primær antibodies.
      9. Den næste dag, vaske membranerne grundigt med TBS-T, og inkuberes med et sekundært IgG-antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP) (1: 1.500) i 1 time.
      10. Detect immunreaktivitet med et forøget kemiluminescens (ECL) detektionssystem. Normalisere protein ekspressionsniveauer under anvendelse GAPDH (1: 2.000 i TBS-T med i 10% fedtfri tørmælk) som standard.
    2. I Western blots undersøge ekspressionen af ​​mindst to forskellige markører for autofagi såsom Beclin-1 og LC3B (sædvanligvis ved 1: 1.000 fortynding i TBS-T med 2,5% BSA). Glem ikke at kigge efter en kontrol af protein udtryk såsom GAPDH eller actin.
    3. Evaluere udtrykket af proteinet af interesse ved densitometri hjælp af en digital Blot scanner eller computer software som det offentlige domæne NIH Image eller ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Elektrofysiologiske Eksperimenter med HEI-OC1 Cells

  1. Høst Celler
    Bemærk: Brug celler vokser i 100 mm kultur diameter retter på 50% -80% sammenflydning. Trypsin, Accutase, enzym-fri løsning, eller p hosphate- b uffered s aline + e thylene d iamine t ETRA en cetic syre (PBS-EDTA) kan anvendes til at løfte celler uden væsentlig indvirkning på antallet og kvaliteten af de gigaseals . I nogle tilfælde er der imidlertid trypsinbehandling gør cellerne mere skrøbelig. I disse tilfælde lade cellerne restituere i ca. 30 minutter før start af eksperimenterne.
    1. Vask cellerne to gange med 10 ml PBS uden Ca2 + og Mg2 +.
    2. Tilsæt 2 ml af en enzym-fri detacher opløsning, såsom ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning, og inkuber retterne i 3 min ved 37 ° C med 5% CO2.
    3. Brug et inverteret mikroskop for at kontrollere frigørelsen af ​​cellerne. Hvis det er nødvendigt, skal du flytte cell dyrkningsskål at frigøre flere celler, men gør det forsigtigt.
      Bemærk: Du må ikke ryste fadet.
    4. Der tilsættes 10 ml DMEM + 10% FBS og pipette cellerne forsigtigt op og ned fem gange med en 10-ml pipette.
    5. Kig på celler under et mikroskop. Hvis> 80% af cellerne allerede er adskilt (single), kræves ikke yderligere pipettering. Hvis cellerne er stadig i klynger, gentag forsigtigt pipettering indtil mere end 80% celler er single.
    6. Placer ~ 10 ml suspenderede celler ind i en 15 ml konisk rør, centrifugeres i 2 minutter ved 100 xg, og kassér supernatanten.
    7. Brug ~ 200 pi ekstern optagelse løsning (Leibovitz L-15 medium justeret til 305-310 mOsm med destilleret vand) til at opblande cellerne. En optisk kontrol af cellerne skal vise mange enlige, runde celler med glatte membran kanter.
  2. Patch-clamp og NLC Målinger
    1. Udfør patch-clamp og målinger af spændingsafhængige lineær kapacitans (NAR) ved hjælp af enkeligt forstærkere og software, samt standard elektrofysiologiske teknikker. Som interne (intrapipette) opløsning anvendelse 150 mM KCI, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM GTP-Na og 10 mM HEPES; justering af pH til 7,2 med Tris.
    2. Under mikroskopet, skal du vælge en enkelt, sund celle, med rund og glat membran kanter. Fastgør spidsen af ​​glaspipette til celleoverfladen og kontroller membran modstand. Dette bør være omkring 3-6 MQ, svarende til en indre diameter (ID) af spidsen af ​​pipetten på ~ 2 um.
    3. Tryk forsigtigt mikropipettespidsen mod cellens plasmamembran og derefter anvende sugning. En portion af cellemembranen vil blive suget ind i pipetten, genererer en elektrisk modstand i størrelsesordenen 10 - 100 gigaohm (gigaseal).
    4. Etablere helcelle-tilstand ved at forstyrre plasmamembranen ved sugning pulser.
    5. Anvende celler, som ikke udtrykker Prestin, såsom HEK-293, som kontrol 9.
      Bemærk: De nuværende reaktioner skal filtreres ved 5 kHz, og korrektioner for virkningen af ​​resterende serie modstand. Alle dataindsamlingen og de fleste analyser kan udføres ved hjælp af softwaren normalt følger med lock-forstærkere. Kapacitans funktion kan monteres på den første afledede af en to state Boltzmann funktion vedrørende ulineære ladning til membran spænding 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I et par af de seneste publikationer rapporterede vi et omfattende sæt af undersøgelser med henblik på at vurdere svaret fra HEI-OC1 celler til flere almindeligt anvendte farmakologiske narkotika samt undersøge Prestin funktion 8,9. I disse undersøgelser vi gjort brug af alle de protokoller, der er beskrevet i de foregående afsnit.

Et af resultaterne af disse tidligere undersøgelser var, at HEI-OC1-celler dyrket ved ikke-permissive betingelser (39 ° C / 10% CO2 = NP-HEI-OC1) viste en meget signifikant fald i cellelevedygtighed, og en lige så væsentlig forøgelse i celledød, angår celler dyrket ved permissive betingelser (33 ° C / 10% CO2 = P-HEI-OC1) (figur 1). Derfor vil enhver cytotoksicitet undersøgelse udført på NP-HEI-OC1 celler bør afsætte en betydelig indsats i kræsne lægemiddelvirkninger fra virkningerne af dyrkningsbetingelser. I Addition, da narkotika effekter på celler, der allerede døende eller med en nedsat levedygtighed kunne være anderledes, at virkningerne af det samme lægemiddel på sunde celler, anbefaler vi at bruge P-HEI-OC1 celler til eksperimenter, der ikke specifikt kræver differentierede celler.

Vore undersøgelser af virkningen af ​​forskellige farmakologiske stoffer også produceret interessante resultater. For eksempel cisplatin, et kemoterapeutisk middel, der ofte anvendes til behandling af flere humane maligniteter, og acetaminophen (APAP = N- et cetyl- pa ra-amino p henol), den mest solgte over-the-counter smertestillende i USA, var begge toksiske for HEI-OC1-celler (figur 2). Men mens APAP faldt cellernes levedygtighed og øget caspase 3/7 aktivering, det ikke inducerede celledød. Cisplatin derimod signifikant øget de tre responser (figur 2). Interessant caspaser 3/7 var mostly aktiveres ved lavere koncentrationer cisplatin, tyder på, at celledød fremkaldt af lave doser af cisplatin blev sandsynligvis medieret af apoptose, mens høje doser dødelige virkninger kan være forbundet med oncosis / necroptosis. Mens oncosis er blevet defineret som en pre-dødbringende, der fører til ureguleret celledød ledsaget af cellulære og organel hævelse, blæredannelse, og forøget membranpermeabilitet 17,18, necroptosis er et reguleret ikke-apoptotisk celledød mekanisme aktiveret af de samme stimuli, som initierer apoptose men med morfologiske træk svarende til dem af oncosis 19-22.

Yderligere undersøgelser med henblik på at undersøge effekten af APAP og cisplatin på P-HEI-OC1 celler viste en klar, dosisafhængig effekt af APAP på celledeling, der kunne forklare den spændende fald i celle levedygtighed uden celledød beskrevet i det foregående afsnit (figur 3A). cisplatin als o nedsat celleproliferation, og dens virkning udvidet med eksponeringstid selv for små doser (figur 3A), men derudover faldt ældning ved alle koncentrationer og tidspunkter inkluderet i vores undersøgelse (figur 3B). Det betydelige fald i celleældning induceret af cisplatin kunne forklares ved stigningen i celledød, forudsat at senescentceller ville være, sandsynligvis, tilbøjelige til at dø hurtigere end raske celler 23.

Vigtigere er, disse repræsentative resultater antyder, at HEI-OC1-celler reagerer på forskellige farmakologiske stoffer med en karakteristisk dosis- og tidsafhængig følsomhed over for mindst en af ​​de mekanismer, der undersøges. Derfor vil en korrekt fortolkning af enhver eksperimentelle resultat kræver en klar forståelse af de undersøgte særlige cellulære processer og de oplysninger, som hver enkelt af de teknikker, der anvendes til at evaluere dem.

jove_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Konfokal og flowcytometri eksperimenter, på den anden side, bekræftede Prestin udtryk i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 celler, med Prestin immunolocalizing hovedsagelig på cytoplasma af P-HEI-OC1-celler (figur 4A, pile), og mere koncentreret på plasmamembranen i NP-HEI-OC1-celler (figur 4B, pile). Flowcytometri undersøgelser viste en klar stigning i Prestin ekspression i NP-HEI -OC1 celler respekterer til P-HEI-OC1-celler (figur 4C og 4D). Den tidsafhængige forøgelse af ekspression og plasmamembran lokalisering af Prestin i NP-HEI-OC1-celler antyder, at translokation blev ledsaget af syntese af flere Prestin molekyler. Men disse eksperimenter ikke give et fingerpeg at afgøre, om Prestin molekyler oprindeligt placeret i cytoplasmaet flytte til plasmamembranen og nye molekyler erstatte dem, hvis de forbliver på cytoplasmaet og kun den nyligt synthesized Prestin flytter til plasmamembranen, eller en kombination af begge processer.

Elektrofysiologiske undersøgelser viste en robust NLC i P-HEI-OC1-celler (figur 5B), med en maksimal værdi, der faldt og en spænding på top kapacitans, der skiftede til mere depolariserede værdier, når cellerne blev flyttet til ikke-tolerante betingelser i 1 og 2 uger (fig 5C og 5D). På grund af den gradvise translokation af Prestin fra cytoplasmaet til plasmamembranen, vi oprindeligt antaget, at NLC ville være højere i NP-HEI-OC1 end i P-HEI-OC1-celler, og at den ville stige med tiden inkubation ved NP betingelser. Overraskende viste resultaterne af vores undersøgelser præcis det modsatte reaktion. Vi spekuleret, at stigningen i tætheden af ​​Prestin molekyler i plasmamembranen kunne begrænse deres motorik.

hin-side = "1"> Bemærk i figur 5 på depolarisering af spændingen på højeste kapacitans i HEI-OC1 celler respekt til de typiske værdier rapporteret i OHCs og i transfekterede HEK293 celler 24; desuden konstatere, at den depolariserende skift stiger med tid på NP betingelser. Den progressive depolariserende skift er svarende til den beskrevet i OHCs under mus og rotte udvikling 25,26, og det var blevet antydet, at det kan være relateret til udviklingen af andre cellulære strukturer forbundet med OHC plasmamembran 25, eller en modningsproces iboende at Prestin 24.

Vi håber, at denne korte optælling af nogle få studier med HEI-OC1 celler giver nok beviser for den potentielle nytte af HEI-OC1 celler til at undersøge et bredt spektrum af cellen og molekylære reaktioner.

annonce / 54.425 / 54425fig1.jpg "/>
Figur 1: Cell Levedygtighed og celledød i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 Cells. (A) Cellelevedygtighed vurderes med MTT-assayet. Absorbans blev målt med en pladelæser, og gennemsnitlige OD i kontrolceller blev taget som 100% af levedygtighed. (B) Celledød evalueret med en cytotoksicitetsanalyse. Antallet af positive (døde) celler blev bestemt ved flowcytometri med 488 nm excitation (blå laser) og FL1: 530 15 nm. Bemærk den meget signifikant (P ≤0.001) fald i cellelevedygtighed (A) og forøgelse i celledød (B) induceret af ikke-tolerante betingelser. Søjler repræsenterer standardafvigelse midlerne (SEM). Modificeret fra henvisning 8. Klik her for at se en større version af dette tal.

</ Html"Figur 2" src = "/ files / ftp_upload / 54.425 / 54425fig2.jpg" />
Figur 2:. Responser af HEI-OC1 celler udsat for APAP og cisplatin ved analyse ved MTT, Caspaser 3/7 og cytotoksicitet assays (A) Cellelevedygtighed vurderes med MTT-assayet, og absorbansen måles med en pladelæser. (B) Aktivering af bøddel caspaser 3/7. (C) Drug - induceret celledød evalueres med cytotoksicitetsanalyse; antallet af positive (døde) celler blev bestemt ved flowcytometri. Data i hvert eksperiment blev normaliseret til de respektive kontrol- betingelser (kontrol = 1) at gøre det muligt samtidig statistisk analyse. * = P ≤0.05 forhold til kontrol. Søjler repræsenterer standardafvigelse midlerne (SEM). Modificeret fromreference 8. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Effekter af APAP og cisplatin på HEI-OC1 Cells 'Mitotisk Vurder og Ældning. (A) Lægemiddelinducerede ændringer på hastigheden af mitotiske deling af HEI-OC1-celler, ved 24 og 48 timer blev evalueret med en BrdU-analysen. (B) Drug-induceret senescens i HEI-OC1-celler blev målt ved flowcytometri og senescence- associeret β-galactosidase (SA-Bgal) -teknik. Data i hvert eksperiment blev normaliseret til de respektive kontrol- betingelser (kontrol = 1) at gøre det muligt samtidig statistisk analyse. * = P ≤0.05 forhold til kontrol. Søjler repræsenterer standardafvigelse midlerne (SEM). Modificeret fromreference 8. Klik her for at se en større udgave af thans figur.

Figur 4
Figur 4:. Prestin Expression i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 Cells - Cellerne blev mærket med Anti-Prestin antistof og observeret af konfokalmikroskopi og flowcytometri (A) I P-HEI-OC1 celler Prestin immunolocalized meste på cytoplasmaet (pile). (B) I NP-HEI-OC1-celler, i modsætning hertil blev Prestin reaktivitet koncentreret ved plasmamembranen (pile). (C og D) Flowcytometri studier i HEI-OC1 celler dyrket i 2 uger ved NP betingelser (D) viste en klar stigning i Prestin ekspression hensyn til P-HEI-OC1-celler (C). (C) Indsat er sekundær ab eneste (negativ kontrol). Modificeret fra henvisning 9.Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: NLC studier i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 Cells (A) Patch-fastspændt HEI-OC1 celle.. (B - D) NAR i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 celler. Bemærk faldet i toppen af ​​NLC og gradvis forskydning af kurverne til mere depolariserede værdier i NP-HEI-OC1-celler. Modificeret fra henvisning 9. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne rapport beskriver vi, hvordan kultur HEI-OC1 celler og bruge dem til at evaluere mekanismer lægemiddelinduceret cytotoksicitet og undersøge funktionelle egenskaber Prestin, den molekylære motor af cochlear OHCs. De tekniske procedurer er imidlertid generelt nok til nemt at kunne tilpasses til forskellige undersøgelser.

Alle her beskrevne protokoller kræver den korrekte brug af veletablerede cellekulturteknikker 10. Ligesom med enhver anden cellelinje, der arbejder med HEI-OC1 celler kræver en korrekt udstyret cellekultur facilitet, med en certificeret biologisk sikkerhedsskab, en nedkølet centrifuge, et vandbad, og en inverteret mikroskop til undersøgelse af cellekulturer og tælle celler hvis bruger hemocytometric teknikker. En unik krav er imidlertid tilgængeligheden af to inkubatorer med fugtig luft, et sæt ved 33 ° C / 10% CO2 i P-HEI-OC1-celler og andre ved 39 ° C / 5% CO2 i NP-HEI-OC1 celles. Hvis de planlagte undersøgelser involverer kun P-HEI-OC1-celler, kan den anden inkubator fastsættes til 37 ° C / 5% CO2 i forskellige assays.

Anvendelsen af ​​plast celle dyrkningsskåle er et vigtigt yderligere forudsætning for at arbejde med HEI-OC1-celler. Faktisk HEI-OC1 celler er meget robust og de vil væksten i forskellige overflader og under meget forskellige forhold. Dog vil deres fænotype og deres reaktion på lægemidler og andre stimuli stærkt afhænge af kultur parametre (G Kalinec & F Kalinec, upubliceret). Som vi fremførte i et tidligere papir 8, kan denne plasticitet HEI-OC1-celler med fordel anvendes til at designe hidtil ukendte eksperimenter. For eksempel er det velkendt, at oxygenspændingen i cochlear perilymfe er meget lavere (~ 2 kPa) end i en typisk inkubator ved havoverfladen (~ 21,3 kPa) 27. Inkubering HEI-OC1 celler ved lavere O 2 koncentrationer vil ændre deres svar, måske gøre dem en bedre model for revisionORY sensoriske celler.

Det skal understreges, at de beskrevne protokoller for kultur og subkultur af HEI-OC1-celler også kan anvendes med andre auditive cellelinjer udviklet i vores laboratorium fra den samme transgene mus, såsom OC-k3 fra cortiske organ 11,12 og SV -K1 fra stria vascularis 13,14. Desuden kunne disse cellelinier være anvendelige som kontrol for HEI-OC1-celler i udvalgte forsøg. For eksempel har vi for nylig brugt SV-k1 celler til at vise, at den omvendt proportional immunoreaktivitet at Prestin og Na + K + ATPase-antistoffer på plasmamembranen af HEI-OC1 celler var celletype-afhængig reaktion i stedet forbundet med den transgene mus fra som disse celler blev afledt 9.

Andre kritiske krav for at arbejde med HEI-OC1 celler er den praksis passende aseptiske teknikker såsom rengøring af alle overflader i sikkerhed kabinet med 70% ethanol eller isopropanol og dekontaminering af materialer, der er nødvendige for procedurerne. Men mens andre mammale cellelinier ofte beskyttet mod utilsigtet bakteriel kontaminering under anvendelse penicillin-streptomycin eller andre lignende kombinationer, antibiotika må aldrig anvendes med HEI-OC1-celler undtagen hvis formålet med undersøgelsen er at undersøge deres virkninger. HEI-OC1-celler blev frembragt i antibiotiske-fri betingelser, og de skal undgås for at reducere forekomsten af ​​antibiotikaresistente celler.

Endelig ønsker vi at understrege et punkt allerede nævnt flere gange i denne rapport: fænotype og svaret fra HEI-OC1 celler til narkotika og andre stimuli vil kraftigt afhænge af kultur parametre. Derfor er det meget vigtigt, at de laboratorier, der arbejder med HEI-OC1 celler bruger lignende protokoller og celle dyrkningsbetingelser for at gøre deres resultater virkelig kan sammenlignes med dem, som andre grupper. Desuden er detmeget vigtigt at huske, at HEI-OC1-cellelinien er kun en model, med alle de begrænsninger, at en model har. Forventer at in vitro eksperimenter med HEI-OC1 celler vil levere data præcist repræsenterer in vivo respons af rigtige auditive sensoriske celler urealistisk. Men vi er overbevist, at HEI-OC1 cellelinie er en nyttig model til undersøgelse funktionelle reaktioner af auditive sensoriske celler og screening af de potentielle ototoksicitet af farmakologiske stoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics