İşitsel HEI-OC1 Hücreleri ile Çalışma

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Corti 1 Ev Kulak Enstitüsü Organ (HEI-OC1) hücreler transgenik fare 1,2 işitsel organdan türetilmiştir. 33 ° C /% 10 CO2 (permisif koşullar) bu transjenik fareden bir hücre inkübasyonu de-farklılaşma ve hızlandırılmış çoğalmasını tetikler bir immortalize genin ekspresyonuna neden olur; 39 ° C /% 5 CO2 en az Hei-OC1, hücre ölümü 2,3 halinde, çoğalma, farklılaşma azalma ve (non-permisif koşullar) talebi hücreleri ediyor.

HEI-OC1 hücreleri klonlanmış ve on yıl önce laboratuvarımızda karakterize ve ilk çalışmalar spesifik gibi lüks mah, miyozin 7a, Atoh1, BDNF, calbindinden ve kalmodulin olarak koklear saç hücrelerinin, belirteçleri, aynı zamanda destekleyici işaretleri ifade belirtti edildi Connexin 26 ve fibroblast büyüme faktörü reseptörü (FGF-R) 2 gibi bir hücre. Bu nedenle, HEI-OC1 bir Commo temsil kanısına varıldıCorti 2 organı duyusal ve destekleyici hücreler n progenitör. Penisilin gibi, olmayan ototoksik kabul ilaçlar, 2,3 vermedi iken Paralel çalışmalar bu hücrelerde kaspaz-3 aktivasyonu kaynaklı sisplatin, gentamisin ve streptomisin gibi ototoksik ilaçlar arketipsel güçlü deliller sağladı. Bu nedenle, bu hücre çizgisi ototoksisitenin potansiyel ototoksiklikleri veya farmakolojik ilaçların otoprotective özellikleri taranması için dahil hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için in vitro bir sistem önerilmiştir. HEI-OC1 hücreleri son on yıl içinde yayınlanan birden fazla yüz elli çalışmalarında kullanılmıştır tahmin edilmektedir.

Farklı ilaçların potansiyel pro-apoptotik etkisi bakarak bu hücre hattını kapsayan çalışmaların çoğunda temel amacı iken, otofaji ve yaşlanma gibi diğer önemli hücre işlemleri sadece HEI-OC1 hücrelerinde 4-7 araştırılması başlamıştır. benna Laboratuvarımızda 8'den yeni bir çalışmada, sık sık klinikte kullanılan farklı farmakolojik ilaçların yol açtığı hücre ölümü, hayatta kalma, proliferasyon, yaşlanma ve otofaji ilgili verilerin kapsamlı bir dizi toplamak için HEI-OC1 hücreler kullanılmaktadır. Ayrıca aynı tedavi HEK-293 (insan embriyonik böbrek hücreleri) ve HeLa gelenler (insan epitel hücre) Hei-OC1 hücre yanıtları bazıları karşılaştırıldığında. Sonuçlarımız, Hei-OC1 hücreleri üzerinde çalışılan mekanizmaların en az birine farklı bir doza ve zamana bağımlı bir hassasiyetle, karakteristik bir şekilde, The her ilacın yanıt göstermiştir. Biz de deney sonuçlarını doğru bir yorumu birden fazla teknikle 8 ile paralel çalışmalar yapmak gerektirdiğini Bu çalışmada vurgulanmıştır.

Farklı çalışmada lüks mah fonksiyonel yanıtı, koklear dış saç hücreleri motor protein (OHCs) 9 değerlendirmek için Hei-OC1 hücrelerin kullanımı araştırılmıştır + K + ATPaz bir azalma ile ilişkili NP-Hei-OC1 hücrelerin plazma membranında Prestin lokalizasyonu artış. Ayrıca, p-Hei-OC1 hücreleri sağlam olarak kendisine plazma membranında bulunan Prestin moleküllerin yoğunluğu arttıkça azalmıştır motor fonksiyonları, Prestin ilişkili olduğunu göstermiştir. Toplamda, bu sonuçlar şiddetle HEI-OC yararlılığını destek1 hücreleri işitsel proteinleri araştırmak.

Bu video makalede, nasıl ilaca bağlı sitotoksisite ve nasıl mekanizması / sn değerlendirmek için nasıl sitotoksisite çalışmaları için (P-HEI-OC1) izin veren koşullar büyüyen hücreleri kullanmak daha uygun olur neden kültür HEI-OC1 hücrelerini, açıklamak elektrofizyolojik çalışmalar yapmak (örneğin, patch-kelepçe, doğrusal olmayan kapasitans (NLC)) lüks mah, koklear OHCs moleküler motor fonksiyonel özelliklerini araştırmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre Kültürü

Not: Tüm hücre kültürü protokolleri uygun hücre kültür teknikleri kullanılarak yapılmalıdır (: Bir Laboratuar El Kitabı, Cilt I 10 başvuru için Hücre Biyolojisi ilk 3 Bölümler bakınız). Hei-OC1 hücreleri uygun bir yapışma ve bir büyüme hücre kültür kaplarına ilave kaplama ya da işlem gerektirmez. Çok önemli: Hücre kültürü amaçlı cam yemekleri kullanmayın; fenotip ve farmakolojik ilaçların, hücrelerin biyolojik yanıt (yayınlanmamış G Kalinec & F Kalinec) değişecektir; geleneksel plastik hücre kültürü yemekleri (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) tavsiye edilir. Bulaşmayı önlemek için aseptik teknikler özellikle dikkat edin, ancak HEI-OC1 hücreleri ile antibiyotik (örneğin, ampisilin veya streptomisin) asla kullanmayın. Gerekirse HeLa ve HEK-293 hücreleri Hei-OC1 8, başka bir hücre soyu olabilir önceki çalışmalarda bir kontrol olarak kullanılmış olsa da, amfoterisin B kullanımıBu amaç için kabul edilebilir.

  1. Dondurulmuş HEI-OC1 Hücrelerinin Resüsitasyon
    Not: stria 13,14 vaskularis gelen bu protokol, aynı transjenik Corti 11,12 organdan, örneğin OC-K3 olarak, laboratuarda geliştirilmiş fare ve SV-K1 diğer hücre çizgileri de kullanılabilir.
    1. Sıvı N 2 dondurulan Hei-OC1 hücrelerinin bir şişe çıkarın ve 37 ° C'de bir su banyosu içine koyun. Şişenin sadece alt yarısı daldırın ve buz sadece küçük bir miktar şişede kalmaktadır kadar çözülme sağlar. % 70 alkol ile flakon dışını silin.
    2. (Dulbecco değiştirilmiş Eagle aracı maddesi gibi önceden ısıtılmış büyüme ortamında 10 ml içeren 15 ml'lik konik bir tüp içine yavaşça bütün hacmi (-1.5 x 10 5 hücre / mi), damla damla, şişeden hücreler pipet ve teslim DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir.
    3. t atarak, 5 dakika boyunca 300-500 xg tüp santrifüjle DMSO kaldırO süpernatan ve yeniden süspansiyon, taze büyüme ortamına (DMEM +% 10 FBS) 9 ml hücreleri. orta ve tersi, tüpün alt dokunmadan pipet ucu ile üç dört kez pipetle dan, asma hücrelerinin akı ve reflü kümeleri veya hücre yaprak parçalara ayırma.
    4. 100 mm çapında işlenmemiş plastik hücre kültürü tabakları büyüme ortamı içinde süspansiyon haline hücrelerin toplam hacmi yerleştirin.
    5. % 10 CO2 (izin veren koşullar) ile 33 ° C'de inkübe hücreleri.
  2. HEI-OC1 Hücrelerinin Altkültür
    Not: izdiham önce (~% 80) hücre boyama kültür önlemek için süspansiyon ve alt-kültür haline getirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, aynı zamanda stria gelen 13,14 vaskularis, çorti 11,12 ve SV-K1 organdan Bu OC-K3 aynı transgenik fare laboratuvarda geliştirilen diğer hücre çizgileri, kullanılabilir.
    1. 2 ml PBS ile hücreleri eski orta alın ve yıkama. </ Li>
    2. Yüzey alanı 25 cm2 başına 1 mi kullanılarak,% 0.25 tripsin solüsyonu ile hücre mono tabakasının örtün. hücrelerin% 40'ından fazlası çıkartılması gerekmektedir sonraki adıma hareket ettirin. Gerekirse, ters bir mikroskop kullanılarak hücrelerin inceleyin ve "tokat veya dokunun" kalan bağlı hücreleri serbest bırakmak için hafifçe kültür yemekleri.
      Not: hücre ölümüne neden olabilir uzun süre trypsinization olarak özen gösterin; Yeterince ve transfer hücreleri olacak planlanan çalışmalar için yetersiz. değil
    3. 1.1.3 tarif edilen prosedür izlenerek, hücrelerin tekrar ve 15 ml konik bir tüp aktarın.
    4. 300-500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje, orta atmak, taze büyüme ortamına hücreleri toplamak ve, en az dört, 100 mm çapında, hücre kültür kaplarına bunları tohum. çanak başına hücre sayısı, geri kazanılan hücre miktarına bağlıdır. % 10 CO2 (P-Hei-OC1) ile 33 ° C'de inkübe hücreleri ve için gerekli daha birçok kez bölmekPlanlanan deneyler ya da yeni bir stok oluşturmak için.
    5. stok hazırlanması için, 250-550 ml hücre kültürü şişeleri ile 100 mm çaplı yemekler yerine; Deneyler için, daha küçük bir yemekler veya çok-kuyucuklu plak daha uygun olabilir.
    6. Onlar gelinceye kadar farklılaşma, ~ hoşgörülü koşullarda% 80 izdiham HEI-OC1 hücreleri inkübe; daha sonra 2 ila 3 hafta içinde,% 5 CO2 (NP-Hei-OC1) 39 ° C'ye kadar yemekler hareket eder.
      Not: Hücreler giderek çoğalan ve ölen duracaktır. Ölü hücreleri çıkarmak için her gün orta değiştirin. daha fazla hücre deneyleri için uygun olacak, genellikle yaklaşık 4 hafta sonra, orijinal hücre sayısına bağlı olarak. Hücreler NP koşullarında yerleştirilir olarak farklılaşma en kısa sürede başlar, ancak her hücre aynı hızda ayırt. Önemlisi, nitel sağlayan (Şekil 4 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) farklılaşma sürecinde ifade ve membran yerelleştirme artar Prestinve farklılaşma düzeyi kantitatif bir gösterge.

2. İlaç Sitotoksisite çalışmaları

Not: izin veren koşullar (P-HEI-OC1) yetiştirilen HEI-OC1 hücreleri bu çalışmalarda (Şekil 1 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) için tavsiye edilir.

  1. Hücre Canlılık (MTT testi)
    1. 1.2 anlatılan prosedürü izleyerek P-HEI-OC1 hücreleri toplamak ve otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ya onları saymak. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın.
    2. 96 oyuklu şeffaf yassı tabanlı plakalar (oyuk başına 100 ul) ile ilgili hücrelerin Tohum substrata eklenmesi için bir gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın!
    3. ilaç tedavisinden sonra (genellikle 24 veya 48 saat 33 ° C'de), imalatçının protokolü izlenerek MTT gerçekleştirin. Genel olarakBu deney için protokol, aşağıdaki adımları vardır:
      1. Her bir oyuğa, MTT ayıracı 10 ul ekle.
      2. mor boya görünene kadar 2 ila 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası ve daha sonra her bir MTT Deterjan reaktifi 100 ul ilave edin. plaka sallamayın.
      3. plaka Kapak ve 37 ° C'de 2 saat 4 için karanlıkta bırakın.
      4. boşlukları (tek başına büyüme ortamı) de dahil olmak üzere, her bir 570 nm'de absorbansı ölçmek için bir mikro-plaka plaka okuyucusu kullanarak. canlılığı% 100 olarak kontrol hücreleri ortalama OD kullanarak veri normalize.
  2. Kaspaz 3/7 aktivasyon deneyi
    Not: izin veren koşullar (P-Hei-OC1) yetiştirilen Hei-OC1 hücreleri bu çalışmalar için tavsiye edilir.
    1. 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek Hei-OC1 hücreleri toplamak ve bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ile ya say. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın.
    2. wh üzerinde hücreleri Tohum(100 ul oyuk başına), 96 gözlü levhalar ite duvarlı, alt-tabakaya bağlanması için bir gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın!
    3. ilaç tedavisinden sonra (genellikle 24 veya 48 saat 33 ° C'de), ilgili üreticinin protokolü takip kaspaz deneyi yapar. Genel olarak, bu deneme için olan protokole şu adımları vardır:
      1. , Reaktifler hazırlayın iyice karıştırın ve onları oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
      2. inkübatör hücreleri çıkarın ve plakalar oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın.
      3. Aynı pipet uçları ile farklı örnekleri içeren kuyu dokunmadan değil tarafından çapraz bulaşmayı önlemek için dikkatli olmak, iyi her reaktif belirtilen miktarda ekleyin.
      4. plaka Kapak ve 300-500 rpm'de bir plaka çalkalayıcı kullanarak 30 saniye boyunca karıştırın.
      5. en az 30 dakika, bir süre için, oda sıcaklığında inkübe plakası. determinampirik optimum kuluçka dönemi e. Oda sıcaklığı sıcaklık dalgalanmaları lüminesans okuma etkileyecektir, çünkü sabit sıcaklık kuluçka kullanın dalgalanmalar durumunda.
      6. her bir lüminesans ölçümü ve kaspaz aktivasyonunun% 100 olarak kontrol hücreleri ortalama ışıldama kullanarak değerleri normalize.
  3. Hücre Bölünmesi (Proliferation)
    1. 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek Hei-OC1 hücreleri toplamak ve bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ile ya say. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın.
    2. 96 oyuklu şeffaf yassı tabanlı plakalar (oyuk başına 100 ul) ile ilgili hücrelerin Tohum alt-tabaka bağlanma izin veren koşullar gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın!
    3. muameleden sonra bir saat, her çukuruna hazırlanan 100x BrdU 1 ul (5-Bromo-2'-deoxyuri) Çözeltisi yemek ve 33 ° C'de inkübatör plakaları döndürür.
    4. 12, 24 ve 48 saat sonra, ilgili plakalar mevcut orta kaldırmak ve PBS ile de bir kez, her yıkama.
    5. Üreticinin protokolü takip hücre proliferasyon tahlili gerçekleştirmek. Genel olarak, bu deneme için olan protokole şu adımları vardır:
      1. / Sabitleme de dahil olmak üzere, üreticinin protokolüne belirtildiği gibi denatüre edici çözelti, yıkama tamponu birincil antikor algılama çözeltisi, ikincil antikor algılama çözeltisi ve BrdU çözelti belirteçlerinin hazırlayın.
      2. üreticinin protokolü gösterilen miktarlarda, her bir kuyucuğa sabitleme / denatüre solüsyonu ekleyin ve 30 dakika için oda sıcaklığında plaka tutun.
      3. Kurma / denatürasyon çözeltisi çıkarın ve üreticinin protokolüne belirtilen konsantrasyonda primer antikor ilave edin. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında plaka tutun.
      4. Primer ant ile çözüm çıkarıniBody, plaka, yıkama tamponuyla 3 kez yıkayın ve daha sonra imalatçının protokolüne belirtilen konsantrasyonda sekonder antikoru ilave edin. 30 dakika için oda sıcaklığında, ikincil antikor ile plaka tutun.
      5. , Ikincil antikor ile çözüm çıkarın plaka, yıkama tamponuyla 3 kez yıkanır ve substrat ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyondan sonra, durdurma çözeltisi ilave edin. Dikkatli olun: renk değişimi kontrol; çözüm çok karanlık olursa, 10 dakika standart geliştirme zamanı öncesinde reaksiyonu durdurmak.
      6. Durdurma çözeltisi ekleyerek 30 dakika içinde 450 nm'de absorbansı okumak.
  4. sitotoksisite
    Not: izin veren koşullar (P-Hei-OC1) yetiştirilen Hei-OC1 hücreleri bu çalışmalar için tavsiye edilir.
    1. tek başına hücre kültürü ortamı (kontrol) ya da orta artı faiz uyuşturucu, 24-48 saat süreyle genellikle hoşgörülü koşullarda HEI-OC1 inkübe hücreleri.
    2. Tedavi sonundaHücreleri, PBS ile üç kez yıkanır, ve 3 dakika için bir enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi yüzey alanının 25 cm2 başına 1 ml ile çıkarınız.
    3. çıkardıktan sonra toplamak ve 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri Süpernatantı ve sitotoksisite analizi dahil reaktif ile karanlıkta 15 dakika için hücrelerin lekelenmesi.
    4. akış sitometresinin üreticisi tarafından belirtilen sitometri olarak akış canlı HEI-OC1 hücrelerinin sayısını belirler.
  5. yaşlılık
    1. tek başına hücre kültürü ortamı (kontrol) ya da orta artı faiz uyuşturucu, 24-48 saat süreyle genellikle hoşgörülü koşullarda HEI-OC1 inkübe hücreleri.
    2. Güvenilir sonuçlar sağlamak için bilinen Debacq-Chainiaux ve ark., 15 ya da başka bir yöntemle tanımlanan protokol ile akış sitometrisi kullanılarak yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz pozitif hücrelerin sayısını belirler. flow sitometri için kısa bir protokol şudur:
        <li> deneysel tedavi sonunda, hücrelerin PBS ile üç kez yıkanır ve daha sonra izin veren koşullar da 1 saat süre ile hücre kültür ortamı içinde, 100 nM bafilomisin A1 ile inkübe edin.
      1. ~ 33 uM'lik bir son konsantrasyonda C12FDG ekleyin ve 1-2 saat boyunca hücrelerin inkübe edilmesi devam edin.
      2. 3 dakika için bir enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi yüzey alanının 25 cm2 başına 1 ml kullanarak hasat, PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile bunları pelet.
      3. buz soğukluğunda PBS hücrelerin yeniden süspanse edin ve akış sitometresi üreticisi tarafından gösterildiği gibi akış sitometrisi ile pozitif Hei-OC1 hücrelerinin sayısını belirler.
  6. otofaji
    1. Hei-OC1 hücreleri kontrol etmek ve aç 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek (48 saat boyunca serumdan yoksun) ve standart protokoller izlenerek, batı lekesi üzere işlemden toplayın. Genel olarak, Western blot protokolleri, aşağıda st bilgisieps:
      1. 1.0 x 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda, 6 oyuklu tabaklar Tohum Hei-OC1 hücreleri. 24 ve / veya 48 saat sonra, buz gibi soğuk PBS ile yıkayın hücreleri.
      2. Lyse ile TNESV tamponu (% 1 NP40, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4), buz üzerinde 5 dakika süre ile proteaz inhibitör kokteyli ile ve 1 mM PMSF 200 ul.
      3. (Her bir alt kazıma) hücreler toplama 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,800 x g'de mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj aktarın.
      4. süpernatantlar toplamak ve BCA Testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek.
      5. proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 5x yükleme tamponu ve her bir örnek için, 1 mM DTT ve kaynatılır.
      6. % 4-12 jel üzerinde SDS-PAGE kullanılarak örnekleri çalıştırın ve PVDF zarlarına transfer.
      7. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca Tween 20% 0.1 TBS-T içinde% 5 yağsız kuru süt ile bloke membranlar.
      8. Birincil ant ile 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe membranlaribodies.
      9. Sonraki gün, TBS-T ile iyice membranları yıkamak ve yaban turpu peroksidazı (HRP) (1: 1500) konjüge edilmiş bir sekonder IgG ile inkübe 1 saat karıştırıldı.
      10. bir chemiluminescence (ECL) algılama sistemi ile immünoreaktivite algılar. standart olarak (% 10 yağsız kuru süt ile TBS-T içinde 2.000 1) GAPDH kullanılarak protein ekspresyon seviyelerini normalize.
    2. Western blotlar olarak ekspresyonunu incelemek en azından bu Beclin-1 ve LC3B olarak Otofaji iki farklı işaretleri (genellikle 1 için:% 2.5 BSA ile TBS-T içinde 1000 seyrelti). GAPDH veya aktin gibi protein ifade bir denetim bakmak için unutma.
    3. Böyle kamu malı NIH Image veya ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) gibi dijital Blot tarayıcı veya bilgisayar yazılımı kullanılarak dansitometrisi tarafından ilgilenilen proteinin ifadesini değerlendirir.

HEI-OC1 Hücreleri ile 3. Elektrofizyoloji Deneyler

  1. Hasat Hücreler
    Not: kullanımlar hücreleri 50% -80% birbirine karıştığında 100 mm çaplı kültür tabaklarında büyüyen. Tripsin, Accutase bir asetik asit (PBS-EDTA) etra meti! D iamine t uffered s aline + e B enzim içermeyen bir çözelti ya da p hosphate- gigaseals sayısı ve kalitesi üzerinde önemli bir etkisi olmaksızın hücreleri kaldırma için kullanılabilmektedir . Bazı durumlarda ise, tripsin tedavisi hücreleri daha kırılgan hale getirmektedir. Bu gibi durumlarda, hücreler, bir deney başlamadan önce, yaklaşık 30 dakika boyunca geri sağlar.
    1. 10 ml Ca olmadan PBS 2+ ve Mg 2+ ile iki kez hücreleri yıkayın.
    2. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de 3 dakika boyunca yemekler gibi enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi gibi bir enzim içermeyen detacher çözeltisi 2 mi, ekleme ve inkübe edilir.
    3. Hücrelerin dekolmanı kontrol etmek için ters bir mikroskop kullanın. Gerekirse, cel hareketl kültür çanak fazla hücreleri ayırmak için, ama nazikçe yapın.
      Not: çanak sallamayın.
    4. DMEM +% 10 FBS, 10 ml ilave edilir ve yavaşça yukarı ve 10 ml bir pipet ile beş defa hücreleri pipetle.
    5. Mikroskop altında hücrelerin bak. Hücrelerin>% 80 zaten (tek) ayrılmış ise, başka pipet gereklidir. Hücreler kümeler hala varsa% 80'den fazla hücreleri tek olana kadar yavaşça pipetleme tekrarlayın.
    6. 100 x g'de 2 dakika süre ile, 15 ml konik bir tüp içine santrifüj süspansiyon hücrelerinin ~ 10 mi yerleştirin ve süpernatant atılır.
    7. hücreler tekrar süspansiyon - harici kayıt solüsyonu ~ 200 ul kullanarak (damıtılmış su ile 310 mOsm Leibovitz L-15 ortamı 305 ayarlanmıştır). hücrelerin optik kontrol pürüzsüz zar kenarlara sahip çok sayıda tek, yuvarlak hücreler göstermesi gerekir.
  2. Patch-kelepçe ve NLC Ölçümler
    1. yama-kelepçe ve bir kullanarak voltaj bağımlı doğrusal olmayan kapasitans ölçümü (NLC) gerçekleştirindequate yükselticiler ve yazılım, yanı sıra standart elektrofizyolojik teknikler. İç (intrapipette) çözeltisi kullanımı, 150 mM KCI, 1 mM MgCI2, 0.1 mM EGTA, 2 mM ATP, Mg gibi, 0.1 mM GTP-Na ve 10 mM HEPES; Tris ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
    2. Mikroskop altında, yuvarlak ve pürüzsüz zar kenarlara sahip tek, sağlıklı hücreyi seçin. hücre yüzeyine cam pipet ucu takın ve membran direnci kontrol edin. Bu ~ 2 um pipet ucu, iç çapı (ID) tekabül eden, yaklaşık 3-6 megohm olmalıdır.
    3. Yavaşça hücre plazma zarı karşı mikropipet ucu basın ve sonra emme uygulanır. 100 gigaOhms (gigaseal) - hücre zarının bir kısmı 10 için bir elektriksel direnç üreten pipet içine emilen olacaktır.
    4. Emme darbeleri ile plazma zarı bozarak tüm hücre durumunu kurmak.
    5. Kontrol 9 gibi, bu HEK-293 olarak Prestin eksprese etmeyen hücreler, kullanma.
      Not: Şu tepkiler 5 kHz filtre edilmelidir ve düzeltmeler artık seri direnç etkileri için yapılmış. Tüm veri toplama ve çoğu analizler genellikle kilitli amplifikatörler birlikte gelen yazılımı kullanılarak yapılabilir. Kapasitans fonksiyonu membran gerilimine 16 doğrusal olmayan ücret ile ilgili bir iki devlet Boltzmann fonksiyonunun birinci türevi takılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Son yayınlar bir çift biz birkaç sık kullanılan farmakolojik ilaçlara HEI-OC1 hücrelerinin tepkisini değerlendirirken yanı sıra Prestin fonksiyonunu 8,9 araştırılması amaçlanmıştır çalışmaların kapsamlı bir dizi bildirdi. Bu çalışmalarda önceki bölümlerde açıklanan tüm protokollerin kullanımını yaptı.

Bu önceki çalışmaların sonuçlarından biri HEI-OC1 hücreleri non-permisif koşullarda kültüre oldu (39 ° C /% 10 CO 2 = NP-HEI-OC1) hücre canlılığı çok önemli bir azalma ve eşit derecede önemli bir artış gösterdi hücre ölümü, izin veren koşullar kültürlenmiş hücreler olmuştur (33 ° C /% 10 CO2 = p-Hei-OC1) (Şekil 1). Bu nedenle, herhangi bir sitotoksisite çalışma kültür koşulları etkilerinden ayırt ilaç etkileri önemli çabalar adamak gerekir NP-HEI-OC1 hücreleri üzerinde yapıldı. additiohücreler üzerindeki ilaç etkileri zaten ölüyor veya beri n, bir azalma canlılığı sağlıklı hücreler üzerinde aynı ilacın etkileri, biz farklılaşmış hücreler özellikle gerekmez deneyler için P-HEI-OC1 hücreleri kullanılarak tavsiye farklı olabilir.

Farklı farmakolojik ilaçların etkisi üzerine çalışmalarımız da ilginç sonuçlar üretti. Örneğin, sisplatin, bir kemoterapötik ajan genellikle çeşitli insan kanserleri tedavisinde ve asetaminofen (APAP = N-, bir setil-PA RA-amino p henol) için kullanılır, ABD'de en yaygın olarak satılan reçetesiz bir ağrı kesici, (Şekil 2) HEI-OC1 hücreleri için toksik hem de vardı. APAP hücre canlılığı azalmış ve Kaspaz 3/7 aktivasyonunu artarken, ancak, hücre ölümünü indüklememiştir. Sisplatin, aksine, önemli ölçüde üç tepkileri (Şekil 2) artmıştır. İlginç bir şekilde, kaspazlar 3/7 MÖSTL edildiy yüksek dozlarda öldürücü etkileri onkoz / necroptosis ile ilişkili olabilir iken sisplatin düşük dozlarda tarafından uyarılan hücre ölümü muhtemelen apoptosis aracılık edildi düşündüren, düşük sisplatin konsantrasyonlarda aktif. Onkoz hücre ve organel şişme, kabarmasıyla, ve artan membran geçirgenliği 17,18 ile birlikte kontrolsüz hücre ölümüne yol açan bir ön öldürücü yol olarak tarif edilmiş olmakla beraber, necroptosis başlatma aynı stimuli ile aktif hale düzenlenmiş olmayan apoptotik hücre ölüm mekanizması apoptoz, ancak onkoz 19-22 benzer morfolojik özelliklere sahip.

APAP ve P-HEI-OC1 hücreleri üzerinde sisplatin etkilerini araştıran yönelik ek çalışmalar önceki paragrafta açıklanan hücre ölümü olmadan hücre canlılığı ilginç azalma açıklayabilir hücre çoğalması üzerine APAP açık, doza bağımlı etki göstermiştir (Şekil Şekil 3A). cisplatin als O hücre çoğalmasını azalma ve etkisi daha küçük dozlarda (Şekil 3A) maruz kalma süresi ile artar, ancak ek olarak çalışmamızda (Şekil 3B) yer alan tüm konsantrasyonu ve zaman noktalarında yaşlanmayı azalmıştır. Sisplatin tarafından uyarılan hücre yaşlanması anlamlı azalma yaşlanmış hücreler olacağını varsayarak, hücre ölümü artış ile açıklanabilir, belki de, eğilimli sağlıklı hücreler 23 daha hızlı ölmek.

Daha da önemlisi, bu sonuçlar Örnek Hei-OC1 hücreleri üzerinde çalışılan mekanizmaların en az birine farklı bir doza ve zamana bağımlı bir hassasiyetle farklı farmakolojik ilaçlara yanıt olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, herhangi bir deneysel sonucun doğru yorumlanması araştırıldı özellikle hücresel süreçlerin net bir anlayış ve bunları değerlendirmek için kullanılan tekniklerin her biri tarafından sağlanan bilgileri gerektirir.

"Fo: =-together.within-PAGE tutma" jove_content 1 "> konfokal ve diğer taraftan, deney akış sitometrisi, Prestin çoğunlukla immunolocalizing ile P-Hei-OC1 ve NP-Hei-OC1 hücrelerinde Prestin ifade teyit P-Hei-OC1 hücreleri (Şekil 4A, oklar) sitoplazma ve NP-Hei-OC1 hücreleri (Şekil 4B, oklar) plazma membranında daha konsantre. Akış sitometrisi çalışmaları NP-Hei bölgesindeki Prestin ifadede açık bir artış gösterdi -OC1 hücreler P-Hei-OC1 hücreleri (Şekil 4C ve 4D) 'e göre. NP-Hei-OC1 hücrelerinde lüks mah ekspresyonu ve plazma membran lokalizasyonuna zamanla bağlı bir artışın translokasyon fazla Prestin moleküllerin sentezi ile birlikte olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu deneyler yalnızca yeni synth sitoplazma kalır ve orijinal olarak, plazma membranı ve yeni moleküllere sitoplazma hareket bulunan Prestin molekülleri, bunların yerine karar vermek için ipuçları vermediplazma membranı veya her iki yöntemin bir kombinasyonu esized Prestin hareket eder.

Elektrofizyolojik çalışmalar, hücre 1 ve non-permisif koşullar taşınan azalmış bir zirve değeri ve daha fazla depolarize değerlere kaydırılmış tepe kapasitans bir gerilim, P-Hei-OC1 hücrelerinde güçlü bir NLC (Şekil 5B) gösterdi 2 hafta (Şekiller 5C ve 5D). Çünkü, plazma zarına sitoplazmadan lüks mah ilerleyici translokasyon, başlangıçta olarak kendisine P-Hei-OC1 hücrelerinde daha NP-Hei-OC1 daha yüksek olacağı ve daha da NP inkübasyon verilen zaman ile artacaktır hipotezi koşullar. Şaşırtıcı bir şekilde, bizim çalışmaların sonuçları tam tersi tepki gösterdi. Plazma membranında Prestin moleküllerinin yoğunluğunda artış kendi motor fonksiyon kısıtlayarak vurgulandı.

hin-page = "1"> Şekil 5 OHCs ve transfekte HEK293 hücrelerinde 24 bildirilen tipik değerlere saygı HEI-OC1 hücrelerinde zirve kapasite de gerilim depolarizasyon içinde Not; dahası, depolarizan vardiya NP koşullarında zamanla artar görüyoruz. Progresif depolarize edici kayma fare ve sıçan gelişim 25,26 sırasında OHCs de tarif edilene benzer, ve bu OHC plazma membranı 25 veya içsel bir olgunlaşma işlemi ile bağlantılı diğer hücresel yapılarının gelişimi ile ilişkili olabileceğini öne sürülmekteydi 24 Prestin için.

Biz HEI-OC1 hücreleri ile bir kaç çalışmalar bu kısa anlattıklarında hücre ve moleküler yanıtların çok geniş bir yelpaze araştırmak için HEI-OC1 hücrelerinin potansiyel yararlarının yeterince kanıt umuyoruz.

reklam / 54425 / 54425fig1.jpg "/>
Şekil 1: P-HEI-OC1 ve NP-HEI-OC1 hücrelerinde Hücre Canlılığı ve Hücre Ölümü. (A) Hücre canlılığı MTT testi ile değerlendirildi. Absorbans bir plaka okuyucu ile ölçüldü, ve kontrol hücrelerinden ortalama OD canlılığının% 100 olarak alındı. Bir sitotoksiklik tahlilinin oluşturulması ile değerlendirildi (b) hücre ölümü. 530 15 nm: pozitif (ölü) hücre sayısı sitometri 488 nm eksitasyon (mavi lazer) ve FL1 ile akış ile belirlenmiştir. Non-permisif koşullar neden olduğu hücre ölümlere (B) 'de çok önemli (p ≤0.001) hücre canlılığı azalma (A) ve bir artış not edin. Çubuklar (SEM) olarak standart hatasını temsil eder. Referans 8 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

</ Html"Şekil 2" src = "/ files / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg" />
Şekil 2:. MTT kaspazlar 3/7 ve sitotoksisite tahlillerini ile analiz edildiği zaman APAP ve Sisplatin Maruz Hei-OC1 Hücreler Yanıtlar MTT testi ile değerlendirildi (A) Hücre canlılığı, ve absorbans bir plaka okuyucu ile ölçüldü. Cellat kaspaz 3/7 (B) aktivasyonu. (C) İlaç - Bir sitotoksiklik tahlilinin oluşturulması ile değerlendirildi indüklenen hücre ölümü; pozitif (ölü) hücre sayısı akış sitometrisi ile tespit edilmiştir. Her deneyde veriler olası eşzamanlı istatistiksel analiz yapmak için ilgili kontrol koşullarında (kontrol = 1) normalize edildi. * = Kontrole P ≤0.05 saygı. Çubuklar (SEM) olarak standart hatasını temsil eder. Fromreference 8 Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: HEI-OC1 Hücrelerin Mitotik Oranı ve yaşlanmayı üzerinde APAP ve Cisplatin Etkileri. (A) 24 ve 48 saat sonra Hei-OC1 hücrelerin mitoz bölünme, oranı üzerinde ilaca bağlı değişiklikler, bir BRDU testi ile değerlendirildi. Hei-OC1 hücreleri (B) İlaç kaynaklı yaşlanmayı akış sitometrisi ve senescence- ölçüldü ilişkili β-galaktosidaz (SA-Bgal) tekniği. Her deneyde veriler olası eşzamanlı istatistiksel analiz yapmak için ilgili kontrol koşullarında (kontrol = 1) normalize edildi. * = Kontrole P ≤0.05 saygı. Çubuklar (SEM) olarak standart hatasını temsil eder. Modifiye fromreference 8. T büyük halini görmek için tıklayınızOnun rakam.

Şekil 4,
Şekil 4:. P-HEI-OC1 ve NP-HEI-OC1 hücrelerinde Prestin İfade - Hücreler Anti-Prestin Antikor ile Etiketli ve Konfokal Mikroskop ve Akış Sitometri tarafından gözlenen (A) P-HEI-OC1 hücreleri çoğunlukla immünolokalize Prestin sitoplazma (oklar). NP-Hei-OC1 hücreleri (B), bunun aksine, Prestin reaktivite plazma zarı (oklar) konsantre edildi. (C ve D) NP koşulları (D) 2 hafta kültüre Hei-OC1 hücrelerinde çalışmalar Akış sitometri, P-Hei-OC1 hücrelerine Prestin sentezleme göre (C) belirgin bir artış göstermiştir. (C) Ankastre ikincil ab Yalnızca (negatif kontrol). Referans 9 modifiye.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5:. P-HEI-OC1 ve NP-HEI-OC1 Hücreler (A) Patch-kenetli HEI-OC1 hücrede NLC çalışmalar. P-HEI-OC1 in - (B D) NLC ve NP-HEI-OC1 hücreleri. NLC zirve azalma ve daha NP-HEI-OC1 hücrelerdeki değerleri depolarize için eğrilerin ilerici kayması unutmayın. Referans 9 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda nasıl kültür HEI-OC1 hücrelerini açıklamak ve ilaca bağlı sitotoksisite mekanizmaları değerlendirmek için bunları kullanmak ve lüks mah, koklear OHCs moleküler motor fonksiyonel özelliklerini araştırmak için. teknik prosedürler, ancak kolayca farklı çalışmalara adapte edilebilecek kadar geneldir.

Burada tarif edilen tüm protokoller, köklü hücre kültürü teknikleri 10 doğru kullanımını gerektirir. Sadece herhangi bir başka hücre hattı olduğu gibi, Hei-OC1 hücreleri ile çalışan bir onaylı biyolojik güvenlik kabini, bir soğutmalı santrifüj, bir su banyosu ve hücre kültürlerinin incelenmesi için, bir inverted mikroskop ile ve sayma hücreler için uygun bir şekilde donatılmış hücre kültür odası gerektirir hemositometrik teknikleri kullanarak eğer. Benzersiz bir gereklilik, ancak, NP-HEI-OC1 hücre için 39 ° C /% 5 CO 2 P-HEI-OC1 hücreleri için 33 ° C /% 10 CO 2 iki nemlendirilmiş kuluçka merkezleri, bir set durumu ve diğeris. Planlanan çalışmalar sadece P-HEI-OC1 hücreleri içeriyorsa, ikinci kuluçka 37 ° C / 5 farklı deneyleri için% CO 2 ayarlanabilir.

plastik hücre kültürü yemekleri kullanımı HEI-OC1 hücreleri ile çalışmak için önemli bir ek koşuldur. Aslında, HEI-OC1 hücreleri çok sağlam ve farklı yüzeylerde ve çok farklı koşullarda büyüme onlar olacaktır. Ancak, bunların fenotip ve ilaçlar ve diğer uyaranlara tepki şiddetle kültür parametreleri (G Kalinec & F Kalinec, yayınlanmamış) bağlıdır. Daha önceki yazıda 8 açıklandığı gibi, HEI-OC1 hücrelerinin bu plastisite avantajlı yeni deneyler tasarlamak için kullanılan olabilir. Örneğin, koklear perilenf oksijen gerilimi deniz seviyesi (~ 21.3 kPa) 27 tipik bir kuluçka makinesi içinde daha (~ 2 kPa) daha düşük olduğu bilinmektedir. Belki 2 konsantrasyonları yanıtlarını değişecek alt O'da HEI-OC1 hücreleri kuluçka onlara denetim için daha iyi bir modeli yapmaory duyu hücreleri.

Kültür ve Hei-OC1 hücrelerin alt-kültür için tarif edilen protokoller aynı zamanda Corti'den 11,12 ve SV organı OC-K3 aynı transgenik fare laboratuvarımızda geliştirilen diğer işitsel hücre çizgileri ile de kullanılabilir vurgulanmalıdır -k1 stria dan 13,14 vaskularis. Ayrıca, bu hücre hatları seçilmiştir deneylerde Hei-OC1 hücreleri için kontrol olarak yararlı olabilir. Örneğin, yakın zamanda ters orantılıdır immünoreaktivite Prestin ve Hei-OC1 hücrelerin plazma membranında, Na + K + ATPase antikorlar hücre tipine bağlı olarak müdahale yerine transjenik fare ile ilişkili olduğunu göstermek için SV-K1 hücreleri kullandık bu, bu hücrelerin 9 elde edilmiştir.

HEI-OC1 hücreleri ile çalışmak için diğer kritik gereklilik gibi% 70 e güvenlik kabini içinde tüm iş yüzeylerin temizlenmesi gibi uygun aseptik tekniklerin uygulama-metanol veya izopropanol ve prosedürler için gerekli her türlü malzeme dekontaminasyon. diğer memeli hücre hatları sık sık penisilin-streptomisin veya başka benzer kombinasyonları kullanarak yanlışlıkla bakteriyel kontaminasyon karşı korunur Ancak, antibiyotikler çalışmanın amacı, etkilerini araştırmak için ise dışında HEI-OC1 hücreleri ile asla kullanılmamalıdır. Hei-OC1 hücreleri antibiyotik içermeyen koşullarda üretilmiştir ve antibiyotik dirençli hücrelerin ortaya çıkmasını azaltmak için kaçınılmalıdır.

Son olarak, biz zaten bir noktaya yeniden vurgulamak bu raporda birkaç kez söz etmek istiyorum: fenotip ve uyuşturucu ve diğer uyaranlara HEI-OC1 hücrelerinin tepki şiddetle kültür parametrelerine bağlıdır. Nedenle, HEI-OC1 hücreleri ile çalışan laboratuvarlar diğer gruplar tarafından sağlanan ile bunların sonuçları gerçekten karşılaştırılabilir hale getirmek için benzer protokoller ve hücre kültürü koşulları kullanmak çok önemlidir. Buna ek olarak, birçok önemli HEI-OC1 hücre hattı sadece bir model sahip olduğu tüm sınırlamalar bir model olduğunu hatırlamak. HEI-OC1 hücreleri ile in vitro deneyler bekliyor doğru gerçek işitme duyu hücrelerinin in vivo yanıtları gerçekçi bir temsil veri sağlayacaktır. Ancak, biz güçlü HEI-OC1 hücre hattı fonksiyonel işitme duyu hücrelerinin tepkilerini ve farmakolojik ilaçların potansiyel ototoksisite tarama araştırmak için uygun bir modeldir olduğuna inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics