Travailler avec des cellules Auditory HEI-OC1

Biology

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Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

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Abstract

Introduction

Maison-oreille Institut organe de Corti 1 (CP1) HEI-cellules sont dérivées de l'organe auditif d'un 1,2 de souris transgéniques. L' incubation d'une cellule à partir de cette souris transgénique à 33 ° C / 10% de CO 2 (conditions permissives) induit l' expression d'un gène immortalisant qui déclenche la dé-différenciation et de la prolifération accélérée; en déplaçant les cellules à 39 ° C / 5% de CO 2 (conditions non permissives) conduisent à une diminution de la prolifération, la différenciation et, au moins dans le cas de HEI-OC1, la mort cellulaire 2,3.

cellules HEI-OC1 ont été clonés et caractérisés dans notre laboratoire il y a plus d'une décennie, et les études initiales ont indiqué qu'ils expriment des marqueurs spécifiques des cellules ciliées de la cochlée, comme prestine, myosine 7a, Atoh1, BDNF, calbindine et calmoduline, mais aussi des marqueurs de soutien des cellules telles que la connexine 26 et le récepteur du facteur de croissance des fibroblastes (FGF-R) 2. Par conséquent, il a été suggéré que HEI-OC1 pourrait représenter un common progénitrices des cellules sensorielles et de soutien de l'organe de Corti 2. Des études parallèles fournis des preuves solides que archétypales médicaments ototoxiques comme le cisplatine, la gentamicine et streptomycine caspase-3 activation induite dans ces cellules, tandis que les médicaments considérés comme non-ototoxiques, comme la pénicilline, ne l' ont pas 2,3. Par conséquent, cette lignée cellulaire a été proposé comme un système in vitro pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l' ototoxicité et pour le dépistage de l'ototoxicité potentiel ou propriétés otoprotective de nouveaux médicaments pharmacologiques. On estime que les cellules HEI-OC1 ont été utilisés dans plus de cent cinquante études publiées au cours des dix dernières années.

Considérant que , en regardant l'effet pro-apoptotique potentiel des différents médicaments a été le principal objectif de la plupart des études portant sur ​​cette lignée cellulaire, d' autres processus cellulaires importants tels que l' autophagie et la sénescence ont tout juste commencé à étudier dans les cellules HEI-OC1 4-7. jena étude récente de notre laboratoire 8, nous avons utilisé des cellules HEI-OC1 pour collecter un ensemble complet de données sur la mort cellulaire, la survie, la prolifération, la sénescence et l' autophagie induite par différents médicaments pharmacologiques fréquemment utilisés dans la clinique. Nous avons également comparé certaines des réponses des cellules HEI-OC1 avec ceux de HEK-293 (cellules rénales embryonnaires humaines) et des cellules HeLa (cellules épithéliales humaines) recevant un traitement identique. Nos résultats indiquent que les cellules HEI-OC1 répondent à la chaque médicament d'une manière typique, avec une dose unique et de la sensibilité en fonction du temps à au moins l'un des mécanismes à l'étude. Nous avons également souligné dans cette étude qu'une interprétation correcte des résultats expérimentaux , il faudra effectuer des études parallèles avec plus d'une technique 8.

Dans une autre étude , nous avons étudié l'utilisation de cellules HEI-OC1 pour évaluer la réponse fonctionnelle de prestine, la protéine motrice de cellules externes cochléaires de cheveux (CCEs) 9 + K + ATPase, qui translocation de la membrane plasmique vers le cytoplasme sans changements significatifs dans l' expression totale des cellules. De plus, nous avons démontré que les cellules P-HEI-OC1 ont un solide CNL associé à Prestin la fonction motrice, ce qui diminue lorsque la densité des molécules de Prestin présentes à la membrane plasmatique augmente. Au total, ces résultats appuient fortement l'utilité de HEI-OC1 cellules pour étudier les protéines auditives.

Dans cet article, vidéo, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1, pourquoi il est commode d'utiliser des cellules de plus en plus dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) pour les études de cytotoxicité, comment évaluer le mécanisme / s de la cytotoxicité induite par le médicament et comment d'effectuer des études électrophysiologiques (par exemple, patch-clamp, la capacité non-linéaire (NLC)) pour étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire CCEs cochléaires.

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Protocol

1. Culture cellulaire

Remarque: Tous les protocoles de culture de cellules doivent être effectuées en utilisant des techniques appropriées de culture cellulaire (pour référence , voir les 3 premiers chapitres de biologie cellulaire: Manuel de laboratoire, volume I 10). les cellules HEI-OC1 ne nécessitent pas de revêtement supplémentaire ou le traitement des boîtes de culture cellulaire pour la croissance et l'adhérence adéquate. Très important: ne pas utiliser de la vaisselle, verrerie à des fins de culture cellulaire; le phénotype et la réponse biologique des cellules aux médicaments pharmacologiques changeront (G Kalinec & F Kalinec, non publié); des boîtes de culture cellulaire en plastique conventionnels sont recommandées (voir le tableau des matériaux / équipement). Portez une attention particulière aux techniques aseptiques pour éviter les contaminations, mais jamais utiliser des antibiotiques (par exemple, l' ampicilline ou la streptomycine) avec des cellules HEI-OC1. Si nécessaire, utilisez amphotéricine B. Alors que les cellules HeLa et HEK-293 ont été utilisées comme témoin dans les études précédentes avec HEI-OC1 8, toute autre lignée cellulaire pourraitacceptable à cette fin.

  1. Réanimation de cellules congelées HEI-OC1
    Remarque: Ce protocole peut également être utilisé avec d' autres lignées cellulaires provenant de la même souris transgénique développé dans notre laboratoire, par exemple OC-k3, à partir de 11,12 organe de Corti et SV-k1, de la strie vasculaire 13,14.
    1. Retirer un flacon de cellules HEI-OC1 cryoconservés de N 2 liquide, et le placer dans un bain d'eau à 37 ° C. Immerger seulement la moitié inférieure du flacon et le laisser décongeler jusqu'à ce qu'une petite quantité de glace reste dans le flacon. Essuyez l'extérieur du flacon avec 70% d'alcool.
    2. Pipeter les cellules du flacon et de livrer la totalité du volume (~ 1,5 x 10 5 cellules / ml) lentement, goutte à goutte, dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml d'un milieu de croissance préchauffé, comme milieu de Eagle modifié par Dulbecco ( DMEM), complété avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS).
    3. Enlever le DMSO en centrifugeant le tube à 300-500 g pendant 5 minutes, en éliminant til surnageant et remettre en suspension les cellules dans 9 ml de milieu de croissance frais (DMEM + 10% de FBS). Désagréger les mottes ou des feuilles de cellules par le flux et le reflux des cellules en suspension, de la pipette sur le support, et vice versa, trois à quatre fois avec la pointe de la pipette touche le fond du tube.
    4. Placer le volume total de cellules en suspension dans un milieu de croissance de 100 mm de diamètre non traitées, des boîtes de culture cellulaire en plastique.
    5. Incuber les cellules à 33 ° C avec 10% de CO 2 (conditions permissives).
  2. Subculture de cellules HEI-OC1
    Remarque: Avant la confluence (~ 80%), les cellules doivent être mises en suspension et repiquées afin d'éviter que la culture de la mort. Ce protocole peut également être utilisé avec d' autres lignées cellulaires développées dans notre laboratoire à partir de la même souris transgénique, comme OC-k3, à partir de 11,12 organe de Corti et SV-k1, de la strie vasculaire 13,14.
    1. Enlever le vieux médium et laver les cellules avec 2 ml de PBS. </ Li>
    2. Couvrir la monocouche cellulaire avec une solution de trypsine à 0,25%, en utilisant 1 ml par 25 cm2 de surface. Pour passer à l'étape suivante de plus de 40% des cellules doit être détaché. Examiner les cellules en utilisant un microscope inversé et, si nécessaire, "gifler ou appuyez sur" les boîtes de culture doucement pour libérer les cellules attachées restantes.
      Remarque: Prenez soin que trypsinisation pendant de longues périodes peuvent causer la mort cellulaire; ne suffit pas et les cellules transférées sera insuffisante pour les études prévues.
    3. Remettre en suspension les cellules, en suivant le mode opératoire décrit dans 1.1.3, et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
    4. Centrifugeuse pendant 5 min à 300-500 xg, jeter le moyen, recueillir les cellules avec un milieu de croissance frais et les semences eux, au moins, quatre de 100 mm de diamètre des boîtes de culture cellulaire. Le nombre de cellules par boîte dépend de la quantité de cellules récupérées. Incuber les cellules à 33 ° C avec 10% de CO 2 (P-HEI-OC1) et diviser à nouveau autant de fois que nécessaireles expériences planifiées ou pour générer un nouveau stock.
    5. Pour la préparation des stocks, remplacer 100 plats mm de diamètre par 250-550 ml des flacons de culture cellulaire; pour des expériences, des plats plus petits ou multi-puits des plaques peut être plus adéquate.
    6. Pour la différenciation, incuber les cellules HEI-OC1 dans des conditions permissives jusqu'à ce qu'ils atteignent ~ 80% de confluence; puis déplacer les plats à 39 ° C avec 5% de CO 2 (NP-HEI-OC1) pendant 2 à 3 semaines.
      Remarque: Les cellules vont arrêter progressivement la prolifération et la mort. Changer le milieu tous les deux jours pour éliminer les cellules mortes. En fonction du nombre initial de cellules, généralement après 4 semaines ~ plus, les cellules seront disponibles pour les expériences. Différenciation commence dès que les cellules sont placées dans des conditions NP, mais pas toutes les cellules différencier au même rythme. Surtout, Prestin expression et de localisation de la membrane augmente pendant le processus de différenciation (voir résultats représentatifs, Figure 4), fournissant une qualitativeet une indication quantitative du niveau de différenciation.

2. Drug cytotoxicité Studies

Remarque: les cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) sont recommandés pour ces études (voir résultats représentatifs, Figure 1).

  1. Viabilité cellulaire (MTT Assay)
    1. Recueillir les cellules P-HEI-OC1 en suivant la procédure décrite au point 1.2, et les compter avec soit un compteur de cellules automatique ou hémocytomètre. Ajuster la concentration à 2,0 x 10 5 cellules / ml.
    2. Ensemencer les cellules sur plaques de 96 puits à fond plat claires (100 pl par puits), incuber pendant la nuit pour la fixation sur le substrat, puis les traiter avec les médicaments d'intérêt. Ne pas oublier d'inclure des blancs et des cellules traitées non (contrôle)!
    3. Après un traitement médicamenteux (habituellement 24 ou 48 heures à 33 ° C), effectuer le test MTT selon le protocole du fabricant. En généralLes protocoles pour cet essai ont les étapes suivantes:
      1. Ajouter 10 pi de réactif de MTT à chaque puits.
      2. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 2 à 4 heures jusqu'à ce que le colorant violet est visible, puis ajouter 100 pi du MTT détergent réactif à chaque puits. Ne pas secouer la plaque.
      3. Couvrir la plaque et le laisser dans l'obscurité pendant 2 à 4 heures à 37 ° C.
      4. Utilisez un lecteur de plaque de microplaques pour mesurer l'absorbance à 570 nm dans chaque puits, y compris les blancs (milieu de croissance à elle seule). Normaliser les données en utilisant la DO moyenne dans les cellules témoins à 100% de la viabilité.
  2. Dosage de la caspase 7/3 d'activation
    Remarque: les cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) sont recommandés pour ces études.
    1. Recueillir les cellules HEI-OC1 en suivant la procédure décrite au point 1.2, et les compter avec soit un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre. Ajuster la concentration à 2,0 x 10 5 cellules / ml.
    2. Ensemencer les cellules sur white paroi plaques à 96 puits (100 pl par puits), incuber pendant la nuit pour la fixation sur le substrat, puis les traiter avec les médicaments d'intérêt. Ne pas oublier d'inclure des blancs et des cellules traitées non (contrôle)!
    3. Après traitement de la toxicomanie (généralement 24 ou 48 heures à 33 ° C), effectuer le dosage de caspase suivant le protocole du fabricant respectif. D'une manière générale, les protocoles pour cet essai ont les étapes suivantes:
      1. Préparer les réactifs, mélangez-les bien, et leur permettre de revenir à température ambiante.
      2. Retirer les cellules de l'incubateur et permettent aux plaques revenir à température ambiante.
      3. Ajouter la quantité de réactif indiqué dans chaque puits, en prenant soin d'éviter la contamination croisée en ne touchant pas les puits contenant des échantillons différents avec les mêmes embouts de pipette.
      4. Couvrir la plaque et mélanger pendant 30 secondes en utilisant un agitateur de plaque à 300-500 rpm.
      5. Incuber la plaque à température ambiante pendant une période d'au moins 30 min. Détermineze la période d'incubation optimale de manière empirique. Si la température ambiante fluctue utiliser un incubateur à température constante, en raison des fluctuations de température affectent la luminescence lecture.
      6. Mesurer la luminescence dans chaque puits, et pour normaliser les valeurs en utilisant la luminescence moyenne dans les cellules témoins à 100% de l'activation des caspases.
  3. Division cellulaire (prolifération)
    1. Recueillir les cellules HEI-OC1 en suivant la procédure décrite au point 1.2, et les compter avec soit un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre. Ajuster la concentration à 2,0 x 10 5 cellules / ml.
    2. Ensemencer les cellules sur plaques de 96 puits à fond plat claires (100 pl par puits), incuber pendant la nuit dans des conditions permissives pour la fixation sur le substrat, puis les traiter avec les médicaments d'intérêt. Ne pas oublier d'inclure des blancs et des cellules traitées non (contrôle)!
    3. Une heure après le traitement, ajouter à chaque puits 1 pi de BrdU 100x préparée (5-bromo-2'-deoxyuridîner) solution, et retourner les plaques dans l'incubateur à 33 ° C.
    4. Après 12, 24 et 48 heures, retirez le support existant dans les plaques correspondantes et laver chaque puits une fois avec PBS.
    5. Effectuer le test de prolifération des cellules selon le protocole du fabricant. D'une manière générale, les protocoles pour cet essai ont les étapes suivantes:
      1. Préparer les réactifs, y compris la fixation / solution dénaturant, tampon de lavage, la solution de détection d'anticorps primaire, la solution de détection d'anticorps secondaire, et une solution de BrdU comme indiqué dans le protocole du fabricant.
      2. Ajouter la solution de fixation / dénaturant à chaque puits, dans les quantités indiquées dans le protocole du fabricant, et de garder la plaque à température ambiante pendant 30 min.
      3. Retirer la / une solution dénaturante de fixation et ajouter l'anticorps primaire à la concentration indiquée dans le protocole du fabricant. Gardez la plaque à température ambiante pendant 1 h.
      4. Retirer la solution avec la fourmi primaireibody, laver la plaque 3 fois avec le tampon de lavage, puis ajoutez l'anticorps secondaire à la concentration indiquée dans le protocole du fabricant. Maintenir la plaque avec l'anticorps secondaire à la température ambiante pendant 30 min.
      5. Retirer la solution avec l'anticorps secondaire, laver la plaque 3 fois avec le tampon de lavage, et ajouter le substrat. Après 10 min d'incubation à température ambiante, on ajoute la solution d'arrêt. Attention: Contrôler le changement de couleur; Si la solution devient très sombre, arrêter la réaction avant que le temps de développement standard de 10 min.
      6. Lire l'absorbance à 450 nm dans les 30 minutes de l'ajout de la solution STOP.
  4. cytotoxicité
    Remarque: les cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) sont recommandés pour ces études.
    1. Incuber à des conditions permissives, généralement pendant 24-48 h, les cellules HEI-OC1 dans un milieu de culture cellulaire seul (témoin) ou du milieu ainsi que les médicaments d'intérêt.
    2. A la fin du traitement,, Laver les cellules à trois reprises avec du PBS, et séparer à l' aide de 1 ml par 25 cm 2 de surface d'une solution non enzymatique dissociation cellulaire pendant 3 min.
    3. Après avoir détaché, de recueillir et sédimenter les cellules par centrifugation à 3000 g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant, et colorer les cellules pendant 15 min à l'obscurité avec le réactif inclus dans le dosage de cytotoxicité.
    4. Déterminer le nombre de cellules vivantes HEI-OC1 par cytométrie en flux, comme indiqué par le fabricant du cytomètre de flux.
  5. sénescence
    1. Incuber à des conditions permissives, généralement pendant 24-48 h, les cellules HEI-OC1 dans un milieu de culture cellulaire seul (témoin) ou du milieu ainsi que les médicaments d'intérêt.
    2. Déterminer le nombre de cellules positives à la sénescence associée à la bêta-galactosidase en utilisant la cytométrie de flux avec le protocole décrit par Debacq-Chainiaux et al. , 15 ou toute autre méthode connue pour obtenir des résultats fiables. Un bref protocole pour cytométrie de flux est le suivant:
        <li> A la fin des traitements expérimentaux, laver les cellules à trois reprises avec du PBS, puis les incuber avec 100 nM bafilomycine A1 dans un milieu de culture cellulaire pendant 1 h dans des conditions permissives.
      1. Ajouter C12FDG à une concentration finale de ~ 33 pM, et continuer à faire incuber les cellules pendant 1-2 heures.
      2. Laver les cellules deux fois avec du PBS, les récolter en utilisant 1 ml par 25 cm 2 de surface d'une solution non-enzymatique de dissociation de cellules pendant 3 minutes, et le culot eux par centrifugation à 3000 g pendant 5 min.
      3. Remettre en suspension les cellules dans du PBS glacé et déterminer le nombre de cellules positives HEI-OC1 par cytométrie en flux, comme indiqué par le fabricant du cytomètre de flux.
  6. autophagie
    1. Collecter les cellules HEI-OC1 contrôlent et affamés (privés de sérum pendant 48 heures) en suivant la procédure décrite au point 1.2, et de les traiter pour Western blot suivant des protocoles standards. En général, les protocoles pour Western blot ont la st suivanteeps:
      1. Semence des cellules HEI-OC1 dans des plaques à 6 puits à une concentration de 1,0 x 10 5 cellules / ml. Après 24 et / ou 48 h, laver les cellules avec du PBS glacé.
      2. Lyse avec 200 ul de tampon TNESV (1% de NP40, du Tris-HCl 50 mM , pH 7,5, 100 mM de NaCl, 2 mM d' EDTA, 1 mM de Na 3 VO 4) avec un cocktail inhibiteur de protease PMSF et 1 mM pendant 5 min sur la glace.
      3. Recueillir les cellules (en raclant le fond de chaque puits), transfert à microtubes et centrifuger à 16800 xg pendant 5 min à 4 ° C.
      4. Recueillir les surnageants et de quantifier la concentration en protéines en utilisant le dosage BCA.
      5. Ajouter un tampon de chargement 5x et du DTT 1 mM à chaque échantillon et faire bouillir pendant 5 minutes pour dénaturer les protéines.
      6. Exécuter les échantillons en utilisant une SDS-PAGE sur un gel à 4-12%, et la transfère sur des membranes de PVDF.
      7. Bloquer les membranes avec 5% de lait écrémé séché dans du TBS-T avec 0,1% de Tween 20 pendant 60 minutes à la température ambiante.
      8. Incuber les membranes pendant une nuit à 4 ° C avec ant primaireibodies.
      9. Le lendemain, se laver les membranes intensivement avec TBS-T, et incuber avec un anticorps IgG secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (1: 1500) pendant 1 h.
      10. Détecter une immunoréactivité avec une chimioluminescence amplifiée (ECL) du système de détection. Normaliser les niveaux d'expression de protéines en utilisant GAPDH (1: 2000 dans du TBS-T dans 10% de lait écrémé séché) en tant que norme.
    2. Dans les Western blots étudier l'expression d'au moins deux marqueurs différents de autophagy tels que Beclin-1 et LC3B (habituellement à 1: 1000 dilution dans du TBS-T avec 2,5% de BSA). Ne pas oublier de regarder pour un contrôle de l'expression des protéines telles que GAPDH ou actine.
    3. Évaluer l'expression de la protéine d'intérêt par densitométrie à l'aide d'un scanner blot numérique ou logiciels informatiques tels que le domaine public NIH image ou ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Expériences d'électrophysiologie avec des cellules HEI-OC1

  1. Les cellules de récolte
    Remarque: les cellules utilisent de plus en plus de 100 mm des boîtes de culture de diamètre à 50% -80% de confluence. Trypsine, Accutase, solution sans enzyme, ou p hosphate- b de aline + e de uffered thylène d iamin t Etra un acide CETIC (PBS-EDTA) peut être utilisé pour soulever les cellules sans effets significatifs sur le nombre et la qualité des gigaseals . Dans certains cas, cependant, le traitement à la trypsine rend les cellules plus fragiles. Dans ces cas, permettre aux cellules de se rétablir pendant environ 30 minutes avant de commencer les expériences.
    1. Laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS sans Ca 2+ et Mg 2+.
    2. Ajouter 2 ml d'une solution de détacheur sans enzyme, comme la non-enzymatique solution de dissociation des cellules, et on incube les boîtes pendant 3 min à 37 ° C avec 5% de CO 2.
    3. Utiliser un microscope inversé pour vérifier le détachement des cellules. Si nécessaire, déplacez le cell de boîte de culture pour détacher davantage de cellules, mais faites-le doucement.
      Note: Ne pas secouer le plat.
    4. Ajouter 10 ml de DMEM + 10% de FBS et les cellules pipeter doucement vers le haut et vers le bas cinq fois avec une pipette de 10 ml.
    5. Regardez les cellules sous un microscope. Si> 80% des cellules sont déjà séparées (simple), aucune autre pipetage est nécessaire. Si les cellules sont encore en grappes, répétez le pipetage doucement jusqu'à ce que plus de 80% des cellules sont célibataires.
    6. Placer les ~ 10 ml de cellules en suspension dans un tube conique de 15 ml, centrifuger 2 min à 100 xg, et jeter le surnageant.
    7. Utiliser ~ 200 ul d'une solution d'enregistrement externe (L-15 du milieu de Leibovitz ajustée à 305-310 mOsm avec de l'eau distillée) pour remettre en suspension les cellules. Un contrôle optique des cellules doit montrer beaucoup, cellules rondes individuelles avec des bords de la membrane lisse.
  2. Patch-clamp et mesures NLC
    1. Effectuer patch-clamp et des mesures de tension dépendant non linéaire capacité (NLC) en utilisant unamplificateurs dequate et logiciels, ainsi que des techniques électrophysiologiques standard. En tant que (intrapipette) solution interne utilisation mM de KCl, 150 1 mM de MgCl2, 0,1 mM d' EGTA, 2 mM d' ATP-Mg, 0,1 mM de GTP-Na, et de 10 mM de HEPES; ajuster le pH à 7,2 avec du Tris.
    2. Sous le microscope, sélectionnez une seule cellule saine, avec rond et bords de la membrane lisse. Fixer la pointe de la pipette en verre à la surface cellulaire et vérifier la résistance de la membrane. Cela devrait être autour de 3-6 mégohms, correspondant à un diamètre interne (ID) de la pointe de la pipette de ~ 2 um.
    3. Appuyez doucement sur la pointe de micropipette contre la membrane plasmique de la cellule, puis appliquer le vide. Une partie de la membrane cellulaire est aspiré dans la pipette, la génération d'une résistance électrique de l'ordre de 10 - 100 gigaohms (gigaseal).
    4. Déterminer l'état de cellules entières en perturbant la membrane plasmique, avec des impulsions d'aspiration.
    5. Utiliser des cellules qui ne se manifestent pas Prestin, telles que des cellules HEK-293, en tant que témoin 9.
      Remarque: Les réponses actuelles doivent être filtrés à 5 kHz, et les corrections faites pour les effets de la résistance série résiduelle. Toutes les collectes de données et la plupart des analyses peuvent être effectuées en utilisant le logiciel habituellement inclus dans les amplificateurs de verrouillage. Fonction capacitance peut être monté sur la première dérivée d'une fonction de Boltzmann deux Etats concernant la charge non linéaire à la tension de la membrane 16.

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Representative Results

Dans quelques publications récentes , nous avons signalé un ensemble complet d'études visant à évaluer la réponse des cellules HEI-OC1 à plusieurs médicaments pharmacologiques couramment utilisés, ainsi que l' enquête de la fonction prestine 8,9. Dans ces études, nous avons fait usage de tous les protocoles décrits dans les sections précédentes.

L' un des résultats de ces études antérieures est que les cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions non permissives (39 ° C / 10% CO 2 = NP-HEI-CP1) a montré une diminution très significative de la viabilité cellulaire et une augmentation aussi importante dans la mort cellulaire, ce qui concerne les cellules cultivées dans des conditions permissives (33 ° C / 10% CO 2 = P-HEI-OC1) (Figure 1). Par conséquent, toute étude de cytotoxicité réalisée sur des cellules NP-HEI-OC1 devrait consacrer des efforts considérables dans les effets des médicaments discriminatoires contre les effets des conditions de culture. Dans supplén, étant donné que les effets des médicaments sur les cellules meurent déjà ou avec une diminution de la viabilité pourrait être différente que les effets du même médicament sur les cellules saines, nous vous recommandons d'utiliser des cellules P-HEI-OC1 pour des expériences qui ne nécessitent pas spécifiquement des cellules différenciées.

Nos études sur l'effet de différents médicaments pharmacologiques ont également produit des résultats intéressants. Par exemple, le cisplatine, un agent chimiothérapeutique fréquemment utilisé pour le traitement de plusieurs tumeurs malignes humaines, et l' acétaminophène (APAP = N- un cétyl- pa ra-amino p henol), l'over-the-counter antidouleur le plus vendu aux Etats - Unis, étaient tous deux toxiques pour les cellules HEI-OC1 (Figure 2). Cependant, alors que l'APAP diminution de la viabilité cellulaire et une augmentation de la caspase 3/7 activation, elle n'a pas induit la mort cellulaire. Cisplatin, au contraire, a augmenté de manière significative les trois réponses (figure 2). Fait intéressant, les caspases 3/7 étaient Möstly activé à des concentrations plus faibles de cisplatine, suggérant que la mort cellulaire induite par de faibles doses de cisplatine était probablement médiée par l'apoptose, tandis que des doses élevées des effets létaux pourraient être associés à oncosis / nécroptose. Alors que oncosis a été définie comme une voie de pré-létale entraînant la mort cellulaire non régulée accompagnée d' un gonflement cellulaire et organite, bourgeonnement et l' augmentation de la perméabilité membranaire 17,18, nécroptose est un mécanisme de mort cellulaire non-apoptotique régulée activés par les mêmes stimuli qui déclenchent l' apoptose mais avec des caractéristiques morphologiques similaires à celles des oncosis 19-22.

Des études supplémentaires visant à étudier les effets de l' APAP et le cisplatine sur les cellules P-HEI-OC1 ont montré un effet clair, dose-dépendante de l' APAP sur la prolifération cellulaire qui pourrait expliquer la diminution intéressante de la viabilité cellulaire sans mort cellulaire décrit dans le paragraphe précédent (Figure 3A). als cisplatine o diminution de la prolifération cellulaire, et son effet augmenté avec le temps d'exposition , même pour de petites doses (figure 3A), mais en plus diminué sénescence à toutes les concentrations et points de temps inclus dans notre étude (figure 3B). La diminution significative de la sénescence cellulaire induite par le cisplatine pourrait être expliquée par l'augmentation de la mort cellulaire, en supposant que les cellules sénescentes seraient probablement enclins à mourir plus rapidement que les cellules saines 23.

Surtout, ces résultats suggèrent que les cellules représentatives HEI-OC1 répondent à différents médicaments pharmacologiques avec une dose unique et de la sensibilité en fonction du temps à au moins l'un des mécanismes à l'étude. Par conséquent, une interprétation correcte de tout résultat expérimental exigera une compréhension claire des processus cellulaires particuliers étudiés et les informations fournies par chacune des techniques utilisées pour les évaluer.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> confocale et cytométrie de flux d'expériences, d'autre part, a confirmé l'expression prestine dans les cellules P-HEI-OC1 et NP-HEI-OC1, avec prestine immunolocalizing principalement au cytoplasme des cellules P-HEI-OC1 (figure 4A, des flèches), et plus concentré à la membrane plasmique dans les cellules NP-HEI-OC1 (figure 4B, des flèches). cytométrie de flux études ont montré une nette augmentation de l' expression prestine dans NP-HEI -OC1 cellules qui concerne les cellules P-HEI-OC1 (figures 4C et 4D). L'augmentation dépendante du temps dans l' expression et la membrane plasmique localisation de Prestin dans les cellules NP-HEI-OC1 suggère que le transfert a été accompagnée par une synthèse de plusieurs molécules d'Prestin. Toutefois, ces expériences ne fournissent des indices pour décider si les molécules de Prestin initialement situées dans le cytoplasme passage à la membrane plasmique et de nouvelles molécules les remplacer, si elles restent au cytoplasme et seul le nouveau synthéesized se déplace Prestin à la membrane plasmique, ou une combinaison des deux procédés.

Des études électrophysiologiques ont montré une forte NLC dans les cellules P-HEI-OC1 (figure 5B), avec une valeur de crête qui diminue et une tension de crête capacitance décalée vers des valeurs plus dépolarisés, lorsque les cellules ont été transférées à des conditions non permissives pour 1 et 2 semaines (figures 5C et 5D). En raison de la translocation progressive Prestin du cytoplasme vers la membrane plasmique, nous avons initialement supposé que NLC serait plus élevé NP-HEI-OC1 que dans les cellules P-HEI-OC1, et qu'il serait encore augmenter avec le temps d'incubation à NP conditions. De manière surprenante, les résultats de nos études ont montré exactement la réaction inverse. Nous avons émis l'hypothèse que l'augmentation de la densité des molécules Prestin dans la membrane plasmatique pourrait restreindre leur fonction motrice.

hin-page = "1"> Note à la figure 5 , la dépolarisation de la tension à pic capacité dans les cellules HEI-OC1 respecte les valeurs typiques rapportés dans CCEs et dans les cellules HEK293 transfectées 24; en outre, observer que le décalage de dépolarisation augmente avec le temps dans des conditions NP. Le passage de dépolarisation progressive est semblable à celle décrite dans CCEs pendant la souris et le rat développement 25,26, et il a été suggéré que cela pourrait être lié au développement d'autres structures cellulaires associées à la membrane de l'OHC plasma 25, ou d' un processus de maturation intrinsèque à Prestin 24.

Nous espérons que ce bref recomptage des quelques études avec des cellules HEI-OC1 fournir suffisamment de preuves de l'utilité potentielle de cellules HEI-OC1 pour enquêter sur un large éventail de réponses cellulaires et moléculaires.

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Figure 1: Viabilité cellulaire et la mort cellulaire dans P-HEI-OC1 et NP-HEI-OC1 cellules. (A) La viabilité cellulaire évaluée par le test MTT. L'absorbance a été mesurée avec un lecteur de plaques et la DO moyenne des cellules témoins a été prise comme 100% de la viabilité. (B) La mort cellulaire évaluée avec un Essai de cytotoxicité. Le nombre de morts (cellules positives) a été déterminée par cytométrie de flux avec excitation à 488 nm (laser bleu) et FL1: 530 15 nm. Noter la très significative (P ≤0.001) diminution de la viabilité des cellules (A) et une augmentation de la mort cellulaire (B) induite par des conditions non permissives. Les barres représentent l'erreur standard des moyens (SEM). Modifié à partir de la référence 8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2:. Les réponses des cellules HEI-OC1 exposés à APAP et cisplatine lorsqu'il est analysé par MTT, caspases 3/7 et cytotoxicité (A) La viabilité cellulaire évaluée par le test MTT, et l' absorbance mesurée avec un lecteur de plaque. (B) L' activation de caspases bourreau 3/7. (C) Médicaments - la mort cellulaire induite évaluée par un dosage de cytotoxicité; le nombre de morts) (cellules positives a été déterminé par cytométrie de flux. Les données de chaque expérience a été normalisée aux conditions de contrôle respectives (contrôle = 1) pour rendre possible l'analyse statistique simultanée. * = P respect pour le contrôle. Les barres représentent l'erreur standard des moyens (SEM). Fromreference 8 modifié. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Effets de APAP et cisplatine sur mitotique Taux de cellules HEI-OC1 et sénescence. (A) Les changements induits par la drogue sur le taux de division mitotique des cellules HEI-OC1, à 24 et 48 heures, a été évaluée avec un BrdU Assay. (B) sénescence induite par les médicaments dans les cellules HEI-OC1 a été mesurée par cytométrie en flux et la sénescence β-galactosidase associé (SA-bGAL) technique. Les données de chaque expérience a été normalisée aux conditions de contrôle respectives (contrôle = 1) pour rendre possible l'analyse statistique simultanée. * = P respect pour le contrôle. Les barres représentent l'erreur standard des moyens (SEM). Fromreference Modifié 8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de tsa figure.

Figure 4
Figure 4:. Prestin Expression dans P-HEI-OC1 et NP-HEI-OC1 cellules - cellules ont été marquées avec Anti-Prestin Anticorps et observé par microscopie confocale et cytométrie de flux (A) Dans les cellules P-HEI-OC1 Prestin immunolocalized principalement au le cytoplasme (flèches). (B) Dans les cellules NP-HEI-OC1, en ​​revanche, la réactivité Prestin a été concentrée sur la membrane du plasma (flèches). (C et D) par cytométrie de flux des études dans les cellules HEI-OC1 cultivées pendant 2 semaines dans les conditions NP (D) a montré une nette augmentation de prestine expression concernant les cellules P-HEI-OC1 (C). (C) Inset est secondaire ab seulement (contrôle négatif). Modifié de référence 9.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Etudes NLC dans P-HEI-OC1 et NP-HEI-OC1 cellules (A) cellules HEI-OC1 Patch-serré.. (B - D) NLC dans P-HEI-OC1 et NP-HEI-OC1 cellules. Notez la diminution du pic de NLC et le passage progressif des courbes aux valeurs dans les cellules NP-HEI-OC1 plus dépolarisées. Modifié de référence 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dans ce rapport, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1 et les utiliser pour évaluer les mécanismes de la cytotoxicité induite par le médicament et d'étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire cochléaire CCEs. Les procédures techniques, cependant, sont suffisamment généraux pour être facilement adapté à différentes études.

Tous les protocoles décrits ici nécessitent l'utilisation correcte des techniques de culture cellulaire bien établies 10. Tout comme avec toute autre lignée cellulaire, en travaillant avec des cellules HEI-OC1 nécessite une installation de culture de cellules correctement équipé, avec un cabinet certifié biologique de sécurité, une centrifugeuse réfrigérée, un bain d'eau, et d'un microscope inversé pour l'examen des cultures de cellules et des cellules de comptage si l'on utilise des techniques hemocytometric. Une exigence unique, cependant, est la disponibilité de deux incubateurs humidifiés, un ensemble à 33 ° C / 10% de CO 2 pour les cellules P-HEI-OC1 et d' autres à 39 ° C / 5% de CO 2 pour la cellule NP-HEI-OC1s. Si les études envisagées concernent uniquement les cellules P-HEI-OC1, le second incubateur peut être réglé à 37 ° C / 5% de CO 2 pour les différents dosages.

L'utilisation de boîtes de culture cellulaire en plastique est une condition supplémentaire importante pour travailler avec des cellules HEI-OC1. En fait, les cellules HEI-OC1 sont très robustes et ils seront la croissance dans différentes surfaces et dans des conditions très différentes. Cependant, leur phénotype et leur réponse aux médicaments et autres stimuli vont fortement dépendre des paramètres de culture (G & F Kalinec Kalinec, non publié). Comme nous l' avons soutenu dans un article précédent 8, cette plasticité des cellules HEI-OC1 peut être avantageusement utilisée pour concevoir des expériences de nouvelles. Par exemple, il est bien connu que la tension d'oxygène dans la périlymphe cochléaire est beaucoup plus faible (~ 2 kPa) que dans un incubateur typique au niveau (~ 21,3 kPa) 27 de la mer. Incubation cellules HEI-OC1 à O inférieure 2 concentrations changeront leurs réponses, peut - être en faire un meilleur modèle pour vérificationcellules sensorielles ory.

Il convient de souligner que les protocoles décrits pour la culture et la sous - culture de cellules HEI-OC1 peuvent également être utilisés avec d' autres lignées de cellules auditives développées dans notre laboratoire à partir de la même souris transgénique, comme OC-k3 à partir organe de Corti et 11,12 SV -k1 de strie vasculaire 13,14. En outre, ces lignées cellulaires peuvent être utiles en tant que témoin pour les cellules HEI-OC1 dans des expériences sélectionnées. Par exemple, on a récemment utilisé des cellules de SV-k1 pour démontrer que l'immunoréactivité inversement proportionnelle à Prestin et des anticorps Na + K + ATPase dans la membrane plasmique des cellules HEI-OC1 était dépendant du type cellulaire réponse plutôt que associée à la souris transgénique à partir de dont ces cellules sont dérivées 9.

Autre exigence essentielle pour travailler avec des cellules HEI-OC1 est la pratique des techniques aseptiques appropriées, telles que le nettoyage de toutes les surfaces de travail au sein du cabinet de sécurité avec 70% ethanol ou de l'isopropanol et la décontamination de tout le matériel nécessaire pour les procédures. Cependant, alors que d'autres lignées cellulaires de mammifères sont souvent protégés contre la contamination bactérienne accidentelle à l'aide de pénicilline-streptomycine ou d'autres combinaisons similaires, les antibiotiques ne doivent jamais être utilisés avec des cellules HEI-OC1, sauf si le but de l'étude est d'étudier leurs effets. cellules HEI-OC1 ont été générés dans des conditions sans antibiotiques, et ils doivent être évités pour réduire l'apparition de cellules résistantes aux antibiotiques.

Enfin, nous voulons souligner à nouveau un point déjà mentionné à plusieurs reprises dans le présent rapport: le phénotype et la réponse des cellules HEI-OC1 aux médicaments et autres stimuli vont fortement dépendre des paramètres de culture. Par conséquent, il est très important que les laboratoires travaillant avec des cellules HEI-OC1 utilisent des protocoles similaires et des conditions de culture cellulaire afin de rendre leurs résultats véritablement comparables à ceux fournis par d'autres groupes. En outre, il esttrès important de se rappeler que la lignée cellulaire HEI-OC1 est seulement un modèle, avec toutes les limites que le modèle a. Attendre que les expériences in vitro avec des cellules HEI-OC1 fournira des données représentant avec précision les réponses in vivo de cellules sensorielles auditives réelles est irréaliste. Cependant, nous croyons fermement la lignée cellulaire HEI-OC1 est un modèle utile pour étudier les réponses fonctionnelles des cellules sensorielles auditives et la projection du ototoxicité potentiel de médicaments pharmacologiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

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References

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