Metoder til bestemmelse af priser for glucose og fedtsyreoxidation i Isolated Working Rat Heart

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart. J. Vis. Exp. (115), e54497, doi:10.3791/54497 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den pattedyr hjerte er storforbruger af ATP og kræver en konstant tilførsel af energi substrater til sammentrækning. Ikke overraskende har ændringer af myocardial metabolisme været knyttet til udviklingen af ​​kontraktil dysfunktion og hjertesvigt. Derfor optrevling sammenhængen mellem metabolisme og sammentrækning skal kaste lys over nogle af de mekanismer, der styrer hjerte-tilpasning eller dårlig tilpasning i sygdomstilstande. Det isolerede rotte hjerte præparat arbejder kan bruges til at følge, samtidig og i realtid, hjerte- kontraktile funktion og flux af energi leverer substrater til oxidative metaboliske veje. Den nuværende protokol til formål at give en detaljeret beskrivelse af de metoder, der anvendes til fremstilling og anvendelse af buffere til kvantitativ måling af satserne for oxidation for glucose og fedtsyrer, den vigtigste energi leverer substrater af hjertet. De til prøveanalyse og datafortolkning metoder er også diskuteret.Kort fortalt er teknikken baseret på levering af 14 C- radiomærket glucose og en 3H-radiomærket langkædet fedtsyre til en ex vivo bankende hjerte via normotermisk krystalloid perfusion. 14 CO 2 og 3 H2O, endelige biprodukter af de enzymatiske reaktioner, der er involveret i udnyttelsen af ​​disse energi leverer substrater, derefter kvantitativt genvindes fra koronar spildevand. Med kendskab til den specifikke aktivitet af de radiomærkede anvendte substrater, er det så muligt at individuelt kvantificere fluxen af ​​glucose og fedtsyre ved oxidationen veje. Kontraktile funktion af det isolerede hjerte kan bestemmes parallelt med den passende kontrolapparatet og direkte korreleret til metaboliske flux værdier. Teknikken er yderst nyttig til at studere metabolismen / sammentrækning forhold som reaktion på forskellige stressbetingelser såsom ændringer i før og efter belastning og iskæmi, et lægemiddel eller et omløbTing faktor, eller efter ændring i ekspressionen af ​​et gen produkt.

Introduction

Klinisk relevans

I pattedyrs hjerte, er der en stærk positiv sammenhæng mellem fluxen af substrater gennem oxidative metaboliske veje, ATP generation og hjertets arbejde 1. I de seneste to årtier, har undersøgelsen af den indviklede sammenhæng mellem hjerte-stofskifte og funktion førte til at erkende, at ændringer i hjertets stofskifte er en årsag til kontraktile dysfunktion og eventuelt patologisk strukturelle remodeling i fastsættelsen af forskellige typer af hjertesygdomme 2-4. derfor forventes det, at vores forståelse af de mekanismer, der styrer metaboliske ombygning af stressede hjerte vil føre til identifikation af terapeutiske mål for forebyggelse eller behandling af hjertesvigt 5-7. Den nylige offentliggørelse af en videnskabelig redegørelse fra American Heart Association på "Vurdering Cardiac Metabolisme" understreger den voksende interesse for det videnskabelige samfund for thans forskningsfelt 8. Men mens de teknologiske fremskridt i cardiac imaging nu mulighed for en hurtig og præcis vurdering af hjertefunktionen morfologi og funktion, in vivo-undersøgelse af hjertets stofskifte fortsat begrænset og byrdefuld: kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og Positron Emission Tomography (PET) scanning kan anvendes til at følge cardiac høj energi phosphatmetabolisme og Krebs cyklus aktivitet, men disse teknikker er plaget af høje driftsomkostninger og ved deres manglende evne til at bestemme bidraget fra forskellige substrater for oxidativ metabolisme i ligevægtsforhold 9 .For denne dato ex vivo arbejder hjerte forberedelse repræsenterer den eneste og unikke teknik til rådighed til at studere, samtidigt og i realtid, kontraktil funktion og flux af substrater til oxidative metaboliske veje 7,9. Følgende protokol til formål at give retningslinjer i forberedelsen og udnyttelsen af ​​reagenser bruges til at bestemme rottenes af substrater udnyttelse i den isolerede arbejdsmiljø rotte hjerte.

De isolerede Working gnaver Heart Apparatur

Selvom teknikken er næsten et halvt århundrede gamle, det isolerede rottehjerte præparat arbejder stadig et foretrukne metode til kardiovaskulær forskning. Som med Langendorff hjerte forberedelse, arbejdsmiljøet gnaver hjertet tilbyder en relativt simpel, pålidelig og billig måde at måle en bred vifte af hjerteparametre uafhængigt af de forstyrrende virkninger af andre organer, neurohormonale og andre cirkulerende faktorer. Men i modsætning til Langendorff-perfunderet hjerte, arbejdsmiljøet hjertet fortsætter med at udføre næsten fysiologisk hjertets arbejde, en forudsætning for dannelsen af oxidative metaboliske flux til niveauer, der er relevante for in vivo betingelser. Dette opnås ved at levere perfusionen buffer til den venstre ventrikel (LV) via en kanyle forbundet til det venstre atrium, og som LV fylder og udbud, enbuffer udstødes gennem aorta linje mod et bestemt afterload hydrostatisk tryk. Udformningen af perfusion apparat oprindeligt beskrevet af Neely og kolleger 10 blev efterfølgende forbedret ved Taegtmeyer, Hems og Krebs 11, men har ændret sig meget lidt siden da. Som beskrevet i den oprindelige apparat, kan kontraktile funktion vurderes ved bestemmelse af minutvolumen, hjælp ikke flere end graduerede cylindre og et stopur til at måle aorta og koronar strømme 10,11. Flere leverandører nu tilbyde komplette arbejdsmiljø gnaver hjerte perfusion systemer. Disse kommercielt tilgængelige apparater kan erhverves med flowprobes, tryktransducere, et tryk-volumen kateter og alt det nødvendige udstyr til hjerte-funktionel indsamling og analyse af data. Sælgerne giver omfattende dokumentation og kurser til at sætte den nye bruger med deres udstyr. Adskillige oversigtsartikler også detaljer protokoller om arbejdsmiljøet hjerte instrumentation og om brugen af katetre til måling hjertefunktion hos gnavere 12-15. Derfor vil vi kun kort nævne det set-up af perfusion apparater og kontrolapparatet. Den nuværende protokol snarere har til formål at supplere de allerede tilgængelige oplysninger med en beskrivelse af de metoder, der kan gennemføres til samtidig satserne for glucose og langkædede fedtsyrer oxidation, de to store energi leverer substrater i normal hjerte. Vi beskriver her alle de trin, der er involveret i brugen af ​​radioaktivt mærkede energi substrater til vurdering af myokardie oxidativ metabolisme, fra udarbejdelse af reagenser og buffere til genopretning og behandling af prøver, til dataanalyse.

Principper for metoden

Cardiomyocytter generere hovedparten af ​​deres energi til kontraktion fra den oxidative phosphorylering af fedtsyrer (hovedsageligt langkædede fedtsyrer) og carbohydrater (glucose og lactat). Hjertet har meget begrænset energiske reserver og er afhængig af en konstant tilførsel af disse energi leverer substrater fra cirkulationen. Katabolismen af ​​glucose gennem den glycolytiske pathway giver pyruvat, som derefter decarboxyleres ved pyruvatdehydrogenase-kompleks af den indre mitokondrielle membran. Langkædede fedtsyrer, udvundet af cirkulerende albumin eller lipoprotein triglycerider, først aktiveres til acyl-CoA-molekyler i cytosolen og derefter transporteres inde i mitochondriematricen gennem carnitin shuttle at indtaste beta-oxidation pathway. Acetyl-CoA molekyler fremstillet ved katabolismen af glucose og fedtsyrer brændstof Krebs cyklus til at generere de reducerende ækvivalenter (NADH og FADH 2), der anvendes af elektrontransportkæden at bygge proton-motorkraft tværs den indre mitokondrielle membran og generere ATP gennem aktiviteten af ​​ATP syntase. Vand og kuldioxid er de endelige biprodukter afde enzymatiske reaktioner, der finder sted inde i Krebs cyklus. Levering af 14 C- og 3H-radioaktivt mærkede substrater (såsom 14C-radiomærket glucose og 3H-radiomærket oliesyre) til isolerede arbejder hjerte vil følgelig føre til produktion af 14 CO 2 og 3 H2O, som kan kvantitativt udvindes fra koronar spildevand. Indsamlingen af 14 CO 2 udføres ved at holde den isoleret perfunderet hjerte i en forseglet kammer og ved straks udvinding af koronar spildevand, idet den forlader hjertet. En lille anionbyttersøjle bruges til at adskille og genvinde 3 H2O fra koronar spildevand. Radioaktiviteten af ​​de behandlede prøver måles med en væskescintillationstæller, og med kendskab til den specifikke aktivitet af radioaktivt mærkede substrater anvendes, er det så muligt at individuelt kvantificere fluxen af ​​glucose og fedtsyre ioxidation veje 16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med NIH Public Health Service Politik på Human Care og anvendelse af dyr og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Mississippi Medical Center. Alle procedurer, der involverer brugen af ​​radioaktive isotoper blev godkendt og udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af stråling sikkerhed kontor på University of Mississippi Medical Center.

1. Udarbejdelse af Stock Buffer Solutions og reagenser

  1. Krebs-Henseleit (KH) stødpudelagerets Solutions
    1. Forbered 2 I af en 20x koncentreret salt stamopløsning indeholdende (i mol / l) 2,37 NaCl, 0,0948 KCI, 0,0236 KH 2 PO 4, og 0,0236 MgSO4 * 7H 2 O. Filter på et 0,45 um porestørrelse filtreringsenheden og opbevares ved stuetemperatur i op til 1 måned.
    2. Forbered 2 I af en 20x koncentreret (0,5 mol / l) opløsning af NaHCO3. Løsningen kan væreopbevares ved stuetemperatur på ubestemt tid.
    3. Forbered 250 ml af en 1 mol / l stamopløsning af CaCl2. Filter på et 0,45 um porestørrelse filtreringsenheden og opbevares ved stuetemperatur i op til 1 måned.
  2. Omdannelse af anionbytterharpiks fra chloridform til hydroxidformen
    1. Vask anionbytterharpiksen ved resuspendering det i 1 L ultrarent vand. Lad harpiksen at bosætte sig og hæld det overskydende vand. Gentag dette trin 4 gange mere.
    2. Hæld harpiksen i et glas mikroanalyse vakuum filterholder monteret på en filtrering kolbe.
    3. Konverter harpiksen til hydroxidformen ved langsomt at passere gennem 22 volumener 1 N NaOH. Bland opslæmningen intermitterende med en rustfri stål spatel.
    4. Vask af harpiksen med ultrarent vand, indtil pH falder til under 9,0. PH kontrolleres regelmæssigt ved at dyppe en pH teststrimmel nær overfladen af ​​harpiksen opslæmning. Dæk og opbevar harpiksen med ultrarent vand i et borosilicate glasflaske og beskytte mod lys. Lad ikke harpiksen at tørre før brug.
      BEMÆRK: Når opbevares korrekt, vil harpiksen vare mindst 3 måneder.
  3. Oliesyre-albumin 8x koncentreret stamopløsning
    1. I en 4 L Erlenmeyer-kolbe, blandes 200 ml af 20x koncentreret salt stamopløsning og 200 ml af 20x koncentreret NaHCO3-opløsning med 3,6 l ultrarent vand.
    2. Ved hjælp af en gasdispergeringsrør med en frittet cylinder, gas opløsningen i 15 minutter med en blanding af carbondioxid 5% og oxygen 95% for at stabilisere pH.
    3. Hæld 470 ml buffer i en 1 L bægerglas. Tilsættes 8,75 ml af 1 mol / l CaCl2-stamopløsning til 3530 ml puffer tilbage i 4 L Erlenmeyer kolbe og afsat.
    4. Tilsæt 40 ​​g fedtstof syrefri BSA til 1 L bægerglas og omrøres med en omrører indtil opløsning.
    5. I en 15 ml konisk rør, forberede 4 ml af en 50% (vol: vol) ethanol opløsning i ultrarent vand. Tilføj 487 mg sodium oleat og vortex indtil pulveret er fuldstændigt opløst.
      BEMÆRK: Nogle forskere anvender palmitinsyre i stedet for oliesyre i perfusion buffer. En palmitinsyre-albumin stamopløsning kan fremstilles efter samme procedure. Det anbefales dog, at varme løsningen ved 70 ºC for at opnå fuldstændig opløsning af natrium palmitat.
    6. Tilsæt oleat opløsningen dråbevis til fedtsyrefrit BSA opløsning under konstant omrøring og vent 10 mere min i oliesyre-BSA-komplekset til at danne.
      BEMÆRK: Opløsningen skal have en lys gul farve og være blottet for synlige partikler. Tilstedeværelse af et bundfald eller uopløselige partikler kan indikere ufuldstændig konjugation af fedtsyren til BSA. Hvis dette sker, skal opløsningen kasseres og processen startes forfra.
      BEMÆRK: palmitat vil udfælde om det er tilladt at sidde i en pipette og kan ikke tilføjes dråbevis. Den omrørte opløsning af BSA kan opvarmes ved 37 ºC at lette binding eng palmitinsyre. Må ikke overophedes, da det kan forårsage denaturering og aggregering af BSA.
      ADVARSEL: De næste trin i denne protokol involverer manipulation af radioaktivt materiale. Bær passende værnemidler og følge reglerne for sikkerhed og affald bortskaffelse er fastsat af institutionens stråling sikkerhed kontor.
    7. Tilføj 160 pi (0,8 mCi) [9,10- 3H] oliesyre til den omrørte opløsning af oliesyre-BSA og omrør i yderligere 10 minutter.
    8. Tilsættes 2,5 ml af 1 mol / l CaCl2-stamopløsning til den omrørte opløsning af oliesyre-BSA.
    9. Skær ca. 1,2 m dialysemembran slangen og skylles både indenfor og udenfor med postevand. Skrubbe dialyserøret kraftigt under ledningsvand i 10 til 15 min for at fjerne glycerol coating af membranen. Alternativt fjernes belægningen ved neddypning dialyserøret i varmt vand i 1 time før brug. Afslut ved at skylle dialyse slangen med ultrarent water.
    10. Sikker hæfte ene ende af dialyserøret. Fyld med oliesyre-BSA-opløsning og binde off den anden ende af dialyserøret.
    11. Det fyldte dialyserør i 4 L Erlenmeyer kolbe af KH-buffer og tillade dialysere natten over ved 4 * C under forsigtig omrøring med en omrører.
    12. Den næste dag, fjern 8x koncentreret oliesyre-BSA-opløsning fra dialyserøret. Brug oliesyre-BSA opløsning umiddelbart til perfusion eller alikvot og opbevares ved -20 ºC. Frosne alikvoter er stabile i mindst 2 måneder. Undgå flere fryse-tø-cykler da dette reducerer opløseligheden af ​​oliesyre-BSA-kompleks.
      BEMÆRK: Brug kun ultrarent vand (resistivitet på 18,2 MΩ.cm ved 25 ºC, total organisk kulstof <10 ppb, mikroorganismer ≤ 1 CFU / ml, partikler med størrelse over 0,22 um ≤1 / ml) for at forberede reagenser og buffere anvendes til hjerte perfusion. Omdannelse af anionbytterharpiksen fra dens chlorid form til hydroxidformen kan undgås ved direkte køb af hydroxidformen på en ekstra omkostning (se Materialer tabel). Udover oleat eller palmitat, kan også anvendes enhver anden type af naturligt forekommende fedtsyre, så længe en tritieret version af fedtsyren er tilgængelig til at følge dens oxidation.

2. Fremstilling af Perfusion Buffer

  1. I en 4 L Erlenmeyer-kolbe, blandes 200 ml af 20x koncentreret salt stamopløsning og 200 ml af 20x koncentreret NaHCO3-opløsning med 3,6 l ultrarent vand. Gas opløsningen i 15 minutter med en blanding af carbondioxid 5% og oxygen 95%, og derefter tilsættes 10 ml af 1 mol / l CaCl2-stamopløsning for at indstille koncentrationen af frit Ca2 + ved 2,5 mmol / l.
    ADVARSEL: Følgende trin involverer manipulation af radioaktivt materiale. Bær passende værnemidler og følg sikkerheds- og affaldsbortskaffelse regler fastsat af institutionens rastrålingsdosis sikkerhed kontor.
  2. Overfør 1.750 L KH-buffer til en 2 L borsilikatflaske. Tilsættes 250 ml af 8x koncentreret oliesyre-BSA-opløsning, 1,802 g D-glucose, 400 pi insulin ved 0,4 U / ml, og 200 pi (0,2 mCi) [U- 14 C] glucose. Invert flasken for at blande. Dette vil give 2 L af fuldstændig perfusion buffer indeholdende oliesyre (0,4 mmol / l), D-glucose (5 mmol / l), og insulin (40 g enhed / ml).
    BEMÆRK: Et volumen på 2 L er tilstrækkelig til at perfundere en arbejder voksen rotte hjerte i ikke-recirkulerende betingelser i mindst 60 min.
  3. Brug nogle af de ikke-radioaktiv KH buffer til at fylde to dissektion retter og placere på is til afkøling.

3. Fremstilling af perfusionsapparatet

BEMÆRK: Investigator kan vælge at bruge en specialbygget perfusion apparat som den beskrevet af Taegtmeyer, Hems og Krebs 11, eller en af de kommercielt tilgængelige systemer. Perfusion systemer er typisk sammensat afbeskrevne elementer i figur 1 herunder. Udover slanger og glasvarer, resten af ​​kontrolapparatet er valgfri og dets udnyttelse vil afhænge af investigators behov for at løse den eksperimentelle spørgsmål bliver stillet. Ikke desto mindre, anbefaler vi brug af ilt mikroelektroder til at bestemme koncentrationen O 2 i bufferen indgåelse og udtrædelse af koronare cirkulation (figur 1). Dette vil hjælpe investigator kontrol, at hjertet er forsynet med en passende mængde af oxygen, og at iltforsyningen ikke varierer mellem eksperimenter. Desuden kan bestemmelse af "arteriovenøse" oxygen forskel anvendes til at beregne myocardial oxygen forbrug og hjerteeffektivitet 16,18.

  1. Tænd for cirkulerende vandbad og indstillet til 37 ºC at varme op perfusionsapparatet.
  2. Tænd for computeren og data erhvervelse system, der vilanvendes til at måle hjertefunktionen.
  3. Tilslut optageudstyr (tryk kateter, tryk-volumen kateter, ilt mikroelektroder, flowmålere osv) til dataindsamlingssystemet og udføre kalibrering af instrumenterne efter producentens anvisninger.
  4. Fyld bufferreservoiret med ultrarent vand. Tænd den peristaltiske pumpe og skylle vandet ud gennem alle slanger og glasvarer at skylle systemet. Sluk den peristaltiske pumpe og sørg for ingen vand ophold i slangen og / eller glas, da dette kan påvirke koncentrationen af ​​perfusionen buffer og forberedelse hjerte.
  5. Tilslut en ny 1,0 um glasfiberfilter til systemet. Tilslut gas tank indeholdende en blanding af carbondioxid 5% og oxygen 95% til oxygenating kammeret.
    ADVARSEL: Følgende trin involverer manipulation af radioaktivt materiale. Bær passende værnemidler og følg sikkerheds- og affaldsbortskaffelse regler fastsat af institutionen'S stråling sikkerhed kontor.
  6. Fyld bufferreservoiret med perfusion buffer. Tænd for pumpen og sikre fyldning af alle rør og glasvarer med perfusionspufferen. Kør perfusionsbuffer gennem perfusionsapparatet i det recirkulerende mode og oxygenat i mindst 30 min før anvendelse.
  7. Stramt fastgøre røret af en 20 ml sprøjte under hjertekammeret at genvinde den koronare spildevand. Forbind spidsen af ​​sprøjten til toppen af ​​en tre-vejs stophane. Slut sidearm til en 3 ml sprøjte. Forbind den nederste arm via en slange til en beholder til flydende radioaktivt affald.
    BEMÆRK: Ved brug af fedtsyre-BSA kompleks, kan iltning af perfusion bufferen ikke udføres gennem direkte boblende med en gasdispergeringsrør da dette vil forårsage overdreven skumning af løsningen. Brug en membranoxygenatoren (figur 1) eller et ark flow oxygenating kammer til dette formål. Det anbefales at kontrollere, at et passende niveau of oxygenering nås ved at placere et oxygen mikroelektrode i perfusionskredsløbet (figur 1).

4. Rat Heart Isolering og Kanylering

  1. Afvejes rotte på en skala.
  2. Forbered en sprøjte med bedøvelse dosis på 150 mg / kg thiobutabarbital natriumsalt hydrat og en tuberkulin sprøjte med 200 USP enheder heparin.
  3. Sprøjt thiobutabarbital IP og vente på, at dyret mister bevidstheden. Andre induktion midler kan anvendes, så længe dette ikke griber forstyrrende ind i formålet med forsøget (Se Valg af bedøvelsesmidlet i diskussionen nedenfor).
  4. Check for passende anæstesi ved at bekræfte manglende tå knivspids refleks. Sørg for at opretholde korrekt dybde af bedøvelse for at sikre, at dyret ikke føler smerte under proceduren.
  5. Når rotten er fuldt bevidstløs og ikke reagerer på tå knibe, placere den på ryggen på operationsbordet og secUre lemmer med tape eller stifter.
  6. Clip maven fri af hår og udføre en midtlinjeincision af maven. Åbn ikke brysthulen på dette tidspunkt endnu. Flyt maven og tarmen til side for at afsløre den nedre vena cava. Injicere heparin direkte i vena cava inferior og vent 5 til 10 sekunder, før der fortsættes.
  7. Brug af saks klippe mellemgulvet og siderne af brystkassen at eksponere indholdet af brysthulen.
  8. Fint fat hjertet mellem tommel-, pege- og langfinger og punktafgifter både hjerte og lunger sammen. Skåret ved niveauet af aorta descendens, pas på ikke at beskadige aortabuen og aorta ascendens i processen. overdrage hjerte og lunger til en af ​​dissektion petriskåle fyldt med iskold KH-buffer.
  9. Efter hjertet stopper slå, overførsel til den anden dissektion skålen og afskære store stykker af lungevæv fastgjort samtidig holde hjertet nedsænket i iskold KH-buffer. Skær nedstigningening aorta lige over aortabuen.
    ADVARSEL: Følgende trin involverer manipulation af radioaktivt materiale. Bær passende værnemidler og følge reglerne for sikkerhed og affald bortskaffelse er fastsat af institutionens stråling sikkerhed kontor.
  10. Skyl aorta linje i perfusionsapparatet at fylde aorta kanyle med varm puffer og for at fjerne eventuelt vand eller luft, der stadig kan være til stede i slangen. Tillad perfusionsbuffer at dryppe fra aorta kanyle for at minimere risikoen for luft emboli på tidspunktet hjertet er fastgjort til kanylen.
  11. Brug to mikro Dissecting pincet forsigtigt åbne aorta og skub hjerte op på aorta kanyle. Fastgør aorta på kanylen med en mikro klip og initiere Langendorff-perfusion af hjertet. Observere hjerte start slå igen og uddrive blodet tilbage i den koronare vaskulatur i sekunder efter begyndelsen af ​​perfusion.
    BEMÆRK: Det er meget vigtigt at udføre fire trin.6 til 4.10 så hurtigt som muligt for at forhindre irreversibel iskæmisk beskadigelse af hjertet. Med erfaring, bør hele proceduren tager mellem 1 og 2 minutter. Når glidende aorta op på kanylen, skal du passe på ikke at passere aortaroden da dette kan resultere i myokardie hypoperfusion og skader på aortaklappen.
  12. Bind aorta til aorta kanyle med en 3-0 silke sutur og fjern mikro klip. Find lungevenen. Det kan være nødvendigt at trimme ikke-hjertevæv at finde det, men ikke skære for meget af de ikke-hjertevæv, da de vil tjene til at binde det venstre atrium til kanylen.
  13. Skyl venstre forkammer linje i perfusionsapparatet at fylde atriumkanyle med varm puffer og for at fjerne eventuelt vand eller luft, der stadig kan være til stede i slangen. Være særlig omhyggelig med at fjerne eventuel luft bobler fra apparatet for at minimere chancen for luft emboli på tidspunktet hjertet er fastgjort til kanylen.
  14. Brug to micro dissekere kræfeps fint fat åbningen af ​​lungevenen og skub hjerte op på atrial kanyle. Det kan være nødvendigt at flytte hjertet ved forsigtigt at dreje atrial og / eller aorta kanyle til at udføre dette trin. Under alle omstændigheder sikre, at proceduren ikke pålægger stor belastning af hjertet og forårsage bøjning af aorta. Bind venstre atrium til atrial kanyle med en 3-0 silke sutur.
  15. Åbn atrial linje og samtidig koble den aortiske linje fra Langendorff tilstand til arbejdstilstand. Hvis buffer siver ud fra venstre atrium, lukke atrial linje, skifte tilbage aorta linje til Langendorff perfusion, og bruge en anden 3-0 silke sutur at binde venstre atrium mere sikkert til kanylen.

5. Måling af hjertefunktion og Prøvetagning

BEMÆRK: Bestemmelsen af ​​metaboliske flux vil kræve viden om koronar flow (CF). Som beskrevet nedenfor kan koronare flowværdier væreopnået med den simple anvendelse af et stopur. Derudover vil målingen af ​​aorta flow (AF) med den samme fremgangsmåde tillader bestemmelse af minutvolumen (CO = CF + AF), som derefter kan anvendes til at beregne kardiel effekt (CP) som et generelt mål for hjertefunktionen ved anvendelse formlen CP = CO (m 3 / s) * afterload (Pa). En anden metode til rådighed til vurdering af hjertefunktionen er afhængig af tidstro måling af pulstryk med en tryktransducer (figur 3 og 4). Selvom valgfri, de mest nøjagtige og detaljerede undersøgelser af hjertefunktionen kontraktile funktion og hæmodynamik, herunder fastlæggelse af venstre ventrikel systolisk og diastolisk funktioner, vil blive opnået ved brug af et tryk-volumen (PV) ledningsevne kateter. Dette afsnit beskriver kort den kateterisation af det isolerede hjerte. Yderligere oplysninger om kalibrering af PV katetre og dataanalyse med statistisk software kan værefindes i referencer 14,15.
ADVARSEL: Følgende trin involverer manipulation af radioaktivt materiale. Bær passende værnemidler og følge reglerne for sikkerhed og affald bortskaffelse er fastsat af institutionens stråling sikkerhed kontor.

  1. Hvis forsøget direkte måling af LV-funktion med et kateter, punktere LV apex med en 26 G nål og indføre kateteret via punktur.
  2. Ved brug af en tryk-volumen kateter, omhyggeligt positionere kateteret således, at dens aksel er på linje med LV længdeakse, med den distale elektrode lige under aortaklappen og støder op til den endokardiale grænse, og den proximale elektrode lige inden den ventrikulære væg.
  3. Seal hjertet i vandet-kappe hjertekammer og overvåge hjerte-funktionelle parametre med datafangst software. Start optagelse efter baseline kardielle parametre har været stabil i mere end 5 min.
  4. Bestem koronar flow ved measuring den nødvendige tid til at fylde 20 ml sprøjte rør fastgjort under hjertekammeret. Efter målingen åbne trevejs stophane at tømme koronar spildevand til det radioaktive beholder flydende affald.
    BEMÆRK: Flow målinger kan også udføres under anvendelse af et flowmeter og flowprobes.
  5. Brug 3 ml sprøjte fastgjort til siden arm af tre-vejs stophane til at inddrive ~ 2 ml koronar spildevand, idet den forlader hjertet. Overfør 0,5 ml af koronar spildevand i et 2 ml capless mikrocentrifugerør og straks gå videre med fastsættelsen af ​​satserne for glukose oxidation (afsnit 6 nedenfor).
  6. Overfør resten af ​​koronar effluentprøve (~ 1,5 ml) i en hensigtsmæssigt mærket mikrocentrifugerør og opbevares på is.
  7. Gentag trin 5.4 til 5.6 regelmæssige mellemrum (f.eks hver 5 eller 10 min) indtil udgangen af perfusion eksperiment.
  8. Hvis der anvendes et tryk-volumen kateter, injiceres en 10 pi bolus af hypertonisk saltvand (15%)ind i atrial linje og lige før atriumkanyle før indgåelsen eksperimentet. Brug denne bolusinjektion at beregne parallelkonduktansen (V p), hvilket er kritisk for nøjagtig bestemmelse af hjertets volumen 15.
  9. Bryde forseglingen hjertekammeret og fjerne kateteret fra LV, hvis en blev anvendt i forsøget. Gendan hjertet ved hjælp af en af ​​følgende muligheder:
    1. Hvis der ikke er behov for at isolere specifikke områder af hjertet for downstream analyser og hvis perfusionsapparatet tillader det, nære både atrielle og aorta linjer og straks fryse-klemme hjerte på sine kanyler under anvendelse Wollenberger tænger for-kølet i flydende nitrogen.
    2. Alternativt, skar hjertet ud for kanyler og slippe den i iskold KH buffer. Hurtigt tørre hjerte på et stykke køkkenrulle og måle dens vådvægt. Hjertet kan derefter dissekeret og vævsprøver indsamlet til specifikke målinger. Frys resterende væv under anvendelse Wollenberger tongs forafkølet i flydende nitrogen.
  10. Opbevar frosne hjerte væv ved -80 ºC indtil bestemmelse af tør vægt (Se afsnit 8. Beregninger).

6. Bestemmelse af Myokardie Glucose Oxidation priser

BEMÆRK: Metoden består i den kvantitative genvinding af 14 CO 2 fra koronar spildevand med en fælde løsning af hydroxid af Hyamine. Den 14 CO 2 opløst som H 14 CO3- genvindes efter forsuring af bufferen med perchlorsyre. Prøverne skal behandles umiddelbart efter nyttiggørelse som passiv diffusion af gas mellem luft og prøve vil resultere i et tab på 14 CO 2 over tid. De scintillationshætteglas bør tæt forseglet med gummi ærmer propper for at forhindre tab af 14 CO 2 efter tilsætning perchlorsyre. Om nødvendigt kan parafilm bruges til at sikre gummibøsningen propper tilhætteglas (figur 2).

  1. Tilsæt 1 ml 10x koncentreret hydroxid af Hyamine til glas scintillationsglas (ét hætteglas pr prøve + to ekstra hætteglas til bestemmelse af baggrunden aktivitet).
    ADVARSEL: Hydroxid af Hyamine er meget giftigt og forårsager alvorlige forbrændinger. Rådfør produktet MSDS for hensigtsmæssig håndtering og opbevaring.
  2. Med en pincet forsigtigt overføre 2 ml capless mikrocentrifugeglas indeholdende 0,5 ml koronar effluentprøve til et hætteglas fyldt med hydroxid af Hyamine. Brug 0,5 ml perfusionsbuffer til bestemmelse af baggrunden aktivitet.
  3. Luk hætteglasset med en gummi bøsning prop. Parafilm kan anvendes til at sikre forsegling af hætteglasset. Anvendelse af en 1 ml sprøjte og en 23 G lang nål injiceres 200 pi perchlorsyre (60% vægt: vægt%) gennem gummibøsningen prop og direkte ind i 2 ml capless rør.
    BEMÆRK: koronar spildevand skal blive hvid på grund af udfældning af BSA.
  4. Lad hætteglas sdet natten over.
    ADVARSEL: Perchlorsyre er stærkt ætsende, kan fungere som en oxidant, og / eller forårsage eksplosionsfare. Rådfør produktet MSDS for hensigtsmæssig håndtering og opbevaring.
  5. Den næste dag, fjerne gummi ærme propper. hente omhyggeligt hver 2 ml capless rør med en pincet og vask bunden af ​​røret på toppen af ​​den åbne hætteglas med 1 ml scintillationscocktail at hente hele hydroxid af Hyamine. Kassér capless røret i en passende mærket beholder radioaktivt affald.
  6. Tilføj yderligere 9 ml scintillationscocktail per hætteglas. Tilsæt 0,5 ml perfusionsbuffer direkte til to hætteglas fyldt med 10 ml flydende scintillationscocktail til bestemmelse af den specifikke aktivitet. Ryst glassene kraftigt i hånden og vente mindst 6 timer for at tillade luftbobler at sprede før måling i en væskescintillationstæller passende sat op til dobbelt label eksperimenter.
    BEMÆRK: Brug klare hætteglas til at visualisere neEdle når piercing gummi ærme propper. Tab ikke perchlorsyre i hydroxid af Hyamine da dette vil ødelægge reaktionen. Tilføjelse af perchlorsyre frigiver 14 CO 2 fra koronar spildevand i luften. Selv hætteglassene bør tæt lukket og alle 14 CO 2 bør fanget i Hyamine af hydroxid, anbefales det at udføre dette assay under stinkskab.

7. Bestemmelse af Myokardie oleate Oxidation priser

BEMÆRK: Metoden er baseret på kvantitativ adskillelse og genvinding af 3H 2 O fra koronar spildevand anvendelse af en stærk anionbytterresin. I modsætning til udvinding af 14 CO 2, der er ingen prøve stabilitet spørgsmålet og koronar spildevand kan holdes på is eller opbevares i fryseren før udførelse af analysen.

  1. Forbered anionbytterharpiks søjler (én kolonne per prøve + two ekstra kolonner til bestemmelse af baggrunden aktivitet) ved at fylde spidsen af ​​3 ml sprøjte rør med glasuld. Tilsæt harpiks / vand-opslæmning med en overførsel pipette indtil harpiksen når 2 ml mærket på sprøjten røret.
  2. Vask harpiksen ved at lede 2 ml ultrarent vand gennem søjlen. Gentag dette trin to gange mere.
  3. Placere åbne scintillationshætteglas I kolonnerne og indlæse 0,5 ml koronar spildevand pr kolonne. Indlæse 0,5 ml perfusion buffer for bestemmelse af baggrunden aktivitet.
  4. Vask søjlerne successivt med 0,5, 1 og 2 ml ultrarent vand. Når eluering er gjort, kassere søjlerne i en passende mærket beholder radioaktivt affald.
  5. Tilsæt 13 ml væskescintillationscocktail pr scintillationshætteglas. Tilsæt 0,5 ml perfusionsbuffer direkte til to hætteglas fyldt med 13 ml flydende scintillationscocktail til bestemmelse af den specifikke aktivitet. Ryst glassene kraftigt og vente mindst 6 timer før måling i en flydende scintillation tæller passende sat op til dobbelt label eksperimenter.

8. Beregninger

  1. Hvis det ikke allerede gjort, fastlægge våd vægt af hele perfunderet hjerte.
    BEMÆRK: Lad ikke frosne væv til at tø, hvis molekylære og biokemiske analyser skal efterfølgende udføres på det resterende væv.
  2. Bestemme den våde vægt af en vævsprøve fra hele perfundere-hjerte (bruge cirka 15 til 30% af hele hjertet). Placer vævsprøven i en ovn indstillet til 50 ° C natten over og måle dens tørvægt. Brug vådvægt / tørvægt forholdet af vævsprøven for at bestemme tørvægten af ​​hele hjertet i gram (g tørvægt.).
  3. For hvert tidspunkt X udtrykke værdien af koronar flow CF x i ml / min.
  4. Beregning af satsen af ​​glukose oxidation
    1. Gennemsnit to disintegration / min (dpm) værdier målt for baggrunden aktivitet på 14 C til determine korrektionsfaktoren 14C dpm ba.
    2. Bestem 14C gennemsnittet for specifik aktivitet 14C dpm sa.
    3. Bestem den specifikke radioaktivitet af glukose i dpm / pmol (F Glu) ved anvendelse af formlen
      ligning 1
      BEMÆRK: Når n Glu (pmol) = C Glu (pmol / L) * prøvevolumen (L) = 2,5, når der anvendes glucose ved 5 mmol / l og en 0,5 ml prøve.
    4. Bestemme for hvert tidspunkt x hastigheden for produktion af 14 CO 2 i dpm / min (A) ved anvendelse af formlen
      ligning 1
      BEMÆRK: Hvor Vol x (ml) = 0,5
    5. Divide A ved den bestemte værdi af tør hjertevægt at opnå den normaliserede produktionshastighed af 14 CO 2 (A Norm
    6. Påfør formlen GO = En Norm / F Glu at opnå hastigheden af glukose oxidation (GO) i pmol af glukose / min pr g tør vægt.
  5. Bestemmelse af Rate af oleate Oxidation
    1. Gennemsnittet af to desintegration / min (dpm) værdier målt for baggrunden aktivitet på 3 H til at bestemme korrektionsfaktoren 3H dpm ba.
    2. Bestem 3 H gennemsnittet for specifik aktivitet 3H dpm sa.
    3. Bestem den specifikke radioaktivitet af oleat i dpm / pmol (F Ol e) ved anvendelse af formlen
      ligning 1
      BEMÆRK: Når n Ole (pmol) = C Ole (pmol / L) * prøvevolumen (L) = 0,2, når der anvendes oleat ved 0,4 mmol / L og en 0,5 ml prøve.
    4. Bestem for hver time punkt x hastigheden af produktionen af 3 H 2 O i dpm / min (B) ved at anvende den formel
      ligning 1
      BEMÆRK: Hvor Vol x (ml) = 0,5
    5. Divide B ved den bestemte værdi af tør hjertevægt til opnåelse af normaliserede-produktionshastigheden af 3 H2O (B Norm) i dpm / min per g tør vægt.
    6. Påfør formlen OO = B Norm / F Ole for at få hastigheden af oleat oxidation (OO) i pmol oleat / min pr g tør vægt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To repræsentative eksperimenter er beskrevet i nedenstående figurer. I begge tilfælde blev hjertet af en 16 uger gamle Sprague Dawley rotte isoleret og perfunderet i arbejds- tilstand med KH-buffer fremstillet ifølge det foregående protokol. I hvert forsøg blev hjertet udsat for en stresstilstand påvirker hjertes arbejde. Cardiac kontraktile funktion blev bedømt ved kontinuerlig registrering af puls tryk gennem indsættelse af en tryktransducer i aorta linje og ved bestemmelse af hjertets magt. Konsekvenserne af hver stresstilstand om udnyttelsen af ​​energi leverer substrater blev samtidig bestemt ved måling af satserne for glucose og oleat oxidation.

I det første eksperiment blev en akut stigning i arbejdsbyrden simuleret efter 20 min perfusion ved nær-fysiologisk arbejdsbyrde ved at øge afterload med 40% (opnået ved manuelthæve aorta overløbskammeret) og ved tilsætning af adrenalin (1 pmol / L) til perfusion buffer (figur 3A). Puls, som kan bestemmes ved måling af intervallet mellem den maksimale systoliske trykværdier på pulsen tryk spor, steg straks med mere end 50% ved workjump induktion (figur 3B). Cardiac magt steget med mere end 40% ved workjump, som blev ledsaget af en stigning i både satserne for glucose og oleat oxidation (figur 3C). Resultaterne viser, at under stress af en akut stigning i arbejdsbyrden, hjertet hurtigt tilpasser sig øge energiproduktionen for sammentrækning fra både glucose og fedtsyrer oxidation. Men den relative stigning i hastigheden af ​​oxidation var vigtigere for glucose (~ 2.8-fold) end den var for oleat (~ 1,3 gange). Øget afhængighed af kulhydrater oxidation til at klare den ekstra arbejdsbyrde er et typisk træk ved tryk overbelastet pattedyr hjerte 18

I det andet eksperiment blev hjertet perfunderet under grundlinjebetingelser i 20 minutter efterfulgt af 15 min total, global, normotermisk iskæmi (induceret ved at lukke både den atriale og aorta linjer) og 30 min reperfusion (figur 4A). Under disse eksperimentelle betingelser blev en næsten normal pulstryk genoprettet mellem 2 og 3 min efter begyndelsen af reperfusion (figur 4B). Cardiac magt steg hurtigt over pre-iskæmi værdier i den første 10 min af reperfusion før det faldt til nær-baseline værdier (Figur 4C). I forhold til baseline, satsen for oleat oxidation steg i reperfusion hvorimod glukose oxidation hurtigt vendte tilbage til før-iskæmiske niveauer. Ved samtidig måling kontraktile funktion og begge satser substratoxidering kan man klart forstå, at de foreliggende eksperimentelle betingelser, variationen i satserne for fedtsyre oxidation er den vigtigste faktor for ændringer i mængden af ​​arbejde genereres ved reperfusion. Den højere kontakten mod fedtsyre udnyttelse efter iskæmi er et godt estalished træk ved den reperfunderede hjerte 19.

figur 1
Figur 1:. Forenklet skema af det isolerede Working Rat Heart Apparatur Krebs-Henseleit-puffer suppleret med fedtsyre-BSA-opløsning iltes ved passage gennem en membran oxygenator. Typiske preload og afterload værdier for en rotte hjerte perfuseret i nær-fysiologiske betingelser er angivet. Indstillingerne kan ændres ved at justere højden af ​​den atriale reservoiret og aorta overløbskammer. Rørene i graduerede sprøjter er blevet placeret under hjertekammeret og den aortiske overløbskammeret for at måle koronar flow og aorta flow hhv. Strømmen afbuffer kan stoppes (ved måling af aorta og koronar flows) eller omdirigeret (når der skiftes fra Langendorff til arbejdsmiljøet tilstand) ved brug af trevejsspærreventiler. Røde pile angiver den optimale positionering for in-line ilt microlelectrodes at bestemme "arteriovenøse" ilt forskel. In-line flow prober og tryktransducere kan placeres i preload og afterload linjer til at måle både atrial og aorta strømningshastigheder og tryk (grønne pile). Venstre ventrikel tryk og volumen kan også registreres med PV kateter indsat gennem spidsen af ​​den venstre ventrikel. Ikke vist på figuren er vandkappen omkring alle de glasvarer elementer og perfusionsslange i mørkeblå farve. Disse vand med kappe elementer er alle forbundet serielt via slange til en cirkulerende vandbad indstillet på 37 ºC. Klik her for at se en større udgave af thans figur.

Figur 2
Figur 2:. Repræsentation af de forskellige trin i opsætning af CO 2 Trap (A) Tilsæt 1 ml 10x koncentreret hydroxid af Hyamine. (B) Tilføj et 0,5 ml prøve indeholdt i en uden hætte rør. (C) Forsegl hætteglasset. (D) indsprøjtes 200 pi perchlorsyre (60% vægt: vægt%). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Repræsentative resultater af en Workjump Experiment (A) Kontinuerlig registrering af puls pres.. (B) Short iinterval optagelse afbilder ændringen i pulstryk på tidspunktet for workjump initiering. (C) Hjerte satser glucose oxidation (rød spor med cirkler) og oleat oxidation (blå spor med firkanter) blev bestemt ved analyse af koronar spildevand ved en 5 min interval. Cardiac effekt (sort trace med trekanter) blev bestemt ved måling af minutvolumen samtidig de koronare spildevand prøver blev genvundet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Repræsentative resultater af en Iskæmi-reperfusion Experiment (A) kontinuerlig registrering af puls pres.. (B) Kort interval optagelse skildrer inddrivelse af kontraktile funktion during første 5 min af reperfusion. (C) Hjerte satser af glucose oxidation (rød spor med cirkler) og oleat oxidation (blå spor med firkanter) blev bestemt ved analyse af koronar spildevand ved en 5 min interval, undtagen under de første 5 minutter af reperfusion hvor analyser blev udført ved en 1 min interval. Cardiac effekt (sort trace med trekanter) blev bestemt ved måling af minutvolumen samtidig de koronare spildevand prøver blev genvundet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den foregående protokol beskriver de metoder til samtidig kvantificering fluxen af ​​substratet gennem glucose oxidation og fedtsyreoxidation i det isolerede arbejdsdag rotte hjerte. Målingerne kan derefter oven på de optagne cardiac funktionelle parametre for at bestemme forholdet mellem substrater stofskifte og hjerte arbejde under baseline og stress betingelser (ændring i arbejdsbyrden, iskæmi-reperfusion, etc ...). Det er også muligt at vurdere, hvordan stofskiftet / sammentrækning forhold påvirkes af allerede eksisterende tilstande, såsom hjertesvigt og diabetes. Desuden kan hjertet af genetisk modificerede gnavere anvendes til at forespørge virkningen af ​​et specifikt protein på hjertets metabolisme og funktion. Endelig kan effekten af ​​narkotika og andre cirkulerende faktorer på disse parametre individuelt afprøvet. Fordi fluxen af ​​glucose via glycolyse ikke altid hænger sammen med den mængde glucose, oxidation, kan det være informative at følge satserne for glukose flux gennem begge veje i en enkelt eksperimentel indstilling.

Hastighederne for glycolyse kan bestemmes ved at tilsætte [5- 3H] glucose til perfusion buffer, fordi frigivelsen af 3 H2O er bestemt af aktiviteten af enolase trin af glycolyse 20. Alternativt [2- 3H] glucose, som fører til produktionen af 3 H2O ved phosphoglukoseisomerase trin i den glycolytiske vej, kan anvendes til at forespørge hastighederne for glukoseoptagelse ved hjertemusklen 16,17,21. Muligheden for at vælge mellem flere radiomærkede sporstoffer at undersøge, hvilken skæbne glucose ved forskellige niveauer af dets katabolisme er et andet eksempel på alsidigheden af ​​teknikken. Men fordi alle de flux målinger stole på kvantitativ genvinding af enten 3 H2O eller 14 CO 2 fra koronar spildevand, kun to radiomærkeed sporstoffer (én 3H-mærkede og den anden er mærket med 14C) kan anvendes i perfusionsbuffer ad gangen.

Metodologiske overvejelser

Der er nogle iboende begrænsninger for måling af cardiac metaboliske flux og funktion ved hjælp af denne protokol. Selv om anvendelsen af ​​KH-buffer giver mulighed for en total kontrol over sammensætningen af ​​perfusatet, kan den fysiologiske relevans af denne forsøgsopstilling være tvivlsom. For det første er anvendelsen af en krystalloid opløsning over blod vides at have en negativ indvirkning cardiac hæmodynamik og modstand mod iskæmi 22,23. Andet den perfusionsbuffer vi beskriver her mangler en række hormoner og næringsstoffer, der direkte kan modulere cardiac metabolisme og dermed påvirke hjertets reaktion på en simuleret stresstilstand. Faktisk den mammale hjerte er en metabolisk omnivore og kan, foruden glucose og fedtsyrer, anvende andre substrater til fulfill sit energibehov (lactat, pyruvat, ketonstoffer, forgrenet aminosyre). Der er stadig flere tegn, at nogle af disse substrater spiller en vigtig rolle i den metaboliske omdannelse af det syge hjerte 24,25. Det er fuldt ud muligt for undersøgeren at tilføje disse substrater til perfusion buffer, for at modulere deres koncentration for at efterligne tættere forskellige fysiologiske forhold (f.eks fodret tilstand versus fastende tilstand) eller sygdomstilstande, og følge deres satser for oxidation ved hjælp af passende radioaktivt mærkede sporstoffer 26,27. Metabolismen af ​​triglycerider kan også spores, og det anbefales i dette tilfælde at undgå brug af heparin før udskæring af hjertet, da dette vil inducere frigivelse af lipoproteinlipase fra endotelet og væsentlig forringelse af den udvinding af triglycerid fra bufferen 28. Med omhyggelig udvælgelse af de radioaktivt mærkede sporstoffer, inkorporering af radioaktivitet i varskellige væv metabolitter kan også måles efter perfusion at bestemme parametre som de novo triglycerid syntese, glycogen omsætning, eller satser af proteinsyntese 18,29,30. Med andre ord kan investigator arbejde med en bred vifte af substrater / hormoner kombinationer og koncentrationer. Valget af buffer sammensætning vil primært afhænge af formålene med forsøget. Fordi disse kontrollerede pufferbetingelser skabe en "forenklet" fysiologisk model, skyldes ex vivo bør fortolkes arbejder hjerte perfusion eksperimenter med forsigtighed og om muligt bør yderligere valideres dataene in vivo.

Valget af anæstetikum

Den bedøvelsesmiddel bruges på rotter før excision af hjertet skal nøje udvalgt på grundlag af kendte effekt på hjerte-lunge funktion og stofskifte til at sikre, at dette ikke vil forstyrre forsøget skal udføreed. Både injicerbare og inhalationsanæstetika hurtigt fremkalde hyperglykæmi og variable grader af glukose intolerance, som kan påvirke hjertets stofskifte under perfusion 31,32. Sammenlignet med andre agenter, de kortsigtede effekter af barbiturater (pentobarbital og thiobutabarbital) på glukose homøostase er relativt ubetydelige 31. Men intraperitoneal pentobarbital anæstesi før hjertet excision er blevet vist, at formindske hjertets minutvolumen, forringe venstre ventrikelfunktion og øge myocardial lactat-frigivelse i en ex vivo protokol af iskæmi-reperfusion 33. Den negative inotrope virkning, som pentobarbital har på den isolerede rottehjerte foreslås at være forårsaget af væv akkumulering af lægemidlet 34. Omvendt brug af inhalationsanæstetika, som er hurtigere udvasket fra hjertevævet, er forbundet med bedre kontraktionsfunktion ex vivo 33. Flygtige anæstetika kan faktisk give cardioprotection under iskæmi-reperfusion gennem en mekanisme, der involverer åbning af de mitokondrie K ATP-kanaler og øget binding af hexokinase at mitokondrier 32. Sammenfattende typen af ​​bedøvelsesmiddel, der anvendes i en isoleret arbejder hjerte perfusionsprotokollen er en væsentlig variabel i vurderingen af ​​både funktionelle og metaboliske parametre, der direkte kan påvirke resultaterne af eksperimentet. Derfor bør altid rapporteres typen og dosen af ​​bedøvelsesmiddel i den del af et eksperiment metoder, og disse parametre bør ikke ændres mellem eksperimenter, der er beregnet til at blive sammenlignet.

Radioisotoper i hjerte perfusion

Alle flux målinger udført med den foregående protokol udføres i den ikke-recirkulerende tilstand, hvilket betyder, at det koronare spildevand kasseres i stedet for at blive returneret til bufferreservoiret (figur 1). Investigator kan snarerevælger at bruge perfusionsapparat i recirkulerende tilstand, hvilket har den fordel at den kræver et meget mindre volumen buffer og dermed radioaktivitet at betjene. Imidlertid genanvendelse af koronar spildevand kompromitterer steady state sammensætningen af perfusionsbuffer gennem genvinding af biprodukter, der stammer fra den metaboliske aktivitet i hjertet (herunder lactat, men også 3 H2O og H 14 CO3-), hvilket komplicerer bestemmelsen af metaboliske flusmidler og kan endda ændre hjertefunktion over tid 35. Disse spørgsmål er forhindret i den ikke-recirkulerende tilstand. På grund af mængden af ​​radioaktivitet og den store mængde af perfusion buffer anvendes i et enkelt forsøg, bør investigator være særlig forsigtig ved brug af arbejdstiden rotte hjerte i metabolisk flux analyser. Når du bruger en perfusion apparat for første gang, anbefales det at udføre flere mock eksperimenter med ikke-radioaktivt buffer til at blive fortrolig medforskellige trin i protokollen og med procedurerne for sikkerhed. Monteringen af ​​hjerte på kanylerne er et særligt følsomt trin, fordi det kræver at etablere en tæt kontakt med apparatet, og fordi puffer kan lække eller skyde ud fra en af ​​hjertets overskårne blodkar. Den perfusionsapparat beskrevet af Taegtmeyer og kolleger 11 har den fordel, herunder en Langendorff reservoir, der er helt uafhængig af resten af perfusionsapparatet, og kan derfor fyldes med ikke-radioaktivt KH-buffer for at forhindre udslip af radioaktivt materiale under hjertets kanylering . Uanset hvilket system der benyttes, skal udføres forsøgene i et dedikeret område med begrænset adgang. Rummet bør omfatte en vask og en forsyning af ultrarent vand til at udføre buffer behandling og rensning af kontamineret udstyr i samme område. Efterforskere bør arbejde tæt sammen med deres institutions strålingssikkerhed kontor for at etablere sPECIFIKKE inddæmning, kontrol og rensningsprocesser.

Rengøring af perfusionsapparatet

Stillingen eksperimenterende rengøring af perfusion apparat er et afgørende skridt, der er alt for ofte overset, og hvis ikke omhyggeligt udført, er ansvarlig for de fleste af de spørgsmål i forbindelse med dårlig eksperimentelle reproducerbarhed. Den næringsrige perfusion buffer og den høje temperatur perfusionssystemet giver ideelle betingelser for bakterie- og svampevækst. Anvendelsen af ​​proteiner (insulin, BSA) og fedtsyrer i perfusionsbuffer tilføjer en anden grad af kompleksitet til rengøring procedure, fordi disse forbindelser vil klæbe til overfladen af ​​slangen og glasvarer, hvilket gør dem svære at skylle ud af apparatet. Brugen af ​​radioaktive isotoper vil også pålægge yderligere begrænsninger såsom oprettelsen af ​​et dedikeret inddæmning område i laboratoriet for manipulation af kontamineret udstyr og bortskaffelse af fast end flydende radioaktivt affald. Derfor vil den passende procedure rengøring hovedsagelig afhænge af både sammensætningen af ​​perfusion buffer og af typen af ​​perfusion anvendte apparatur. Hvis du bruger et kommercielt apparat, skal du kontrollere producentens websted eller kontakt kundeservice for at få oplysninger om, hvordan du udfører rengøring uden at beskadige nogen af ​​komponenterne i apparatet. Generelt kan alle glasvarer og plastdele vaskes med en lang række af sæbe. Enzym-aktive drevne detergenter er særligt anvendelige til fjernelse fedtsyre-BSA-rest. De fleste forureninger bliver også fjernet ved at køre 0,1 M HCl eller 0,1 M HNO3 gennem apparatet i flere timer. Vi opnå tilfredsstillende rengøringsresultater ved at skylle systemet først med 0,1 M HCI, derefter med en frisk 1% (w: v) opløsning af enzym-aktive drevne detergent fremstillet i varmt vand, og endelig ved at skylle systemet med ultrarent vand. Når du bruger en specialbygget perfusion apparat som den oprindeligt described af Taegtmeyer og kolleger 11, kan det være lettere og mere effektiv til helt apparatet adskilles ved slutningen af hver forsøgsdag. Den glasvarer er renset af en 15 min nedsænkning i en koncentreret bad af en chromsyre og svovlsyre blandingen. De plastikdele og PVC slanger kan vaskes med en rest-fri vaskemiddel. Vi fandt det faktisk hurtigere og mere pålidelig for helt at erstatte PVC slange hver dag, fordi den begrænser manipulation af materiale kontamineret med radiokemikalier og fordi det forhindrer forlader rester af rengøringsmidler bag. Under alle omstændigheder bør investigator gælder følgende regler: 1 Rengør perfusion apparater og alt snavset udstyr umiddelbart efter endt perfusion eksperimentet. Waiting vil kun gøre rengøringen mere vanskeligt og tidskrævende. 2 Kontroller cirkulerende bad af vand jakke systemet regelmæssigt for forureninger. Anvendelse af en vand balsam vil øge intervallet mellem clænet af vandbadet. 3 Efter rengøring grundigt skyl alle glasvarer og slanger med vand fra hanen flere gange og slut skylning med ultrarent vand for at fjerne rester fra rengøringsmidler. 4- To hjerte præparater fortløbende ikke når dissektion blev omhyggeligt udført og perfusionen buffer omhyggeligt forberedt sandsynligvis indikere en forurening af apparatet (enten af ​​bakterier eller rester af opløsningsmidler). Hvis dette sker, skal vask og skylning procedurer fuldstændigt gentages.

Nedskalering til musen hjerte

Selvom den foregående protokol fokuserer på bestemmelse af stofskifte i en isoleret arbejdsmiljø rotte hjerte, kan de samme procedurer anvendes til musen hjerte med et par modifikationer af perfusion apparater og dataopsamling udstyr 36. På grund af sin mindre størrelse det isolerede fungerende mus hjerte er teknisk mere udfordrende, men på grund af dens signifikantlavere strømningshastighed det har den fordel at den kræver en meget lavere mængde perfusion buffer. Det store antal genetisk modificerede musemodeller, der allerede findes også gør det isolerede fungerende mus hjerte meget attraktivt at studere funktionen af ​​et enkelt genprodukt på hjertets metaboliske og funktionelle remodeling. Men de seneste teknologiske fremskridt inden for genom redigering og en hastigt voksende katalog af transgene og knockout rotter hurtigt lukke hullet mellem de to gnavere. Desuden har rotten længe været rost som en overlegen dyremodel til at undersøge hjertekarsygdomme, fordi dens patofysiologi nøje efterligner menneskelige vilkår 37. Af disse grunde, mener vi, at det isolerede rotte hjerte arbejder stadig holde en vigtig plads i den moderne æra af hjerte-kar-forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) Fisher Scientific M63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific S233
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g Bio-Rad 1401441 This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form  (see reference below), but this will cost almost 8 times more
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g Bio-Rad 1432445 Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder Fisher Scientific 09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318 Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder Fisher Scientific 11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder EMD Millipore 820027 We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.
Sodium Oleate Sigma-Aldrich O7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- PerkinElmer NET289005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter Fisher Scientific 08-667E
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose, D-[14C(U)]- PerkinElmer NEC042B005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Humulin R U-100 Eli Lilly and Company NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate Sigma-Aldrich T133 Controlled substance on USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid Roboz Surgical SUT-15-3
10x Hyamine Hydroxide PerkinElmer 6003005 Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
20 ml Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-341-25E Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2
20 ml HDPE Scintillation Vials Fisher Scientific 03-337-23B Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O
Red Rubber Sleeve Stoppers Fisher Scientific 14-126DD Fit 20 mL scintillation vials; Reusable
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm BD 305194 Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap
Perchloric Acid, 60% Fisher Scientific A228 Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
Ultima Gold, Scintillation Cocktail PerkinElmer 6013327
Glass Wool Fisher Scientific AC38606
Decon Dri-Clean Detergent Powder Fisher Scientific 04-355 For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent Fisher Scientific 16-000-115 For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
  2. Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
  3. Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
  4. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
  5. Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
  6. Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
  7. Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
  8. Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. (2016).
  9. Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
  10. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
  11. Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
  12. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
  13. Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
  14. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
  15. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. (2015).
  16. Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
  17. Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
  18. Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
  19. Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
  20. Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
  21. Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochemistry. 6, 1-5 (1967).
  22. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  23. Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
  24. Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
  25. Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit? Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
  26. Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
  27. Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
  28. Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
  29. Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
  30. Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
  31. Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
  32. Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
  33. Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model? J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
  34. Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
  35. Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect? Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
  36. Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
  37. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics