מדידת הקשיחות של

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bae, Y. H., Liu, S. l., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (116), e54630, doi:10.3791/54630 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ההתקשות עורקת היא גורם סיכון משמעותי סמן למחלות לב וכלי דם סימן היכר של הזדקנות. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא כלי אנליטי צדדי לאפיון תכונות מכאניות viscoelastic עבור מגוון רחב של חומרים, החל קשה (פלסטיק, זכוכית, מתכת, וכו ') משטחים לתאים על מצע כלשהו. זה כבר נעשה שימוש נרחב על מנת למדוד את הנוקשות של תאים, אך בתדירות נמוכה יותר משמש כדי למדוד את הנוקשות של aortas. במאמר זה, נתאר את ההליכים באמצעות AFM במצב מגע, מודדי מודולוס vivo לשעבר אלסטי של עורקי עכבר טעונים. אנו מתארים הליך שלנו לבידוד תרמי של aortas עכבר, ולאחר מכן לספק מידע מפורט לניתוח AFM. זה כולל הוראות שלב-אחר-שלב עבור יישור של קרן לייזר, כיול של קבוע הקפיץ ורגישות סטיה של החללית AFM, ורכישת עקומות כוח. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מפורט analy נתוניםאחותי של עקומות כוח.

Protocol

עבודה בעלי חיים במחקר זה אושר על ידי ועדות טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת פנסילבניה. השיטות בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו.

1. הכנת העכבר והבידוד של אב העורקים

  1. להרדים עכבר עם קטמין (80 - 100 מ"ג / ק"ג), xylazine (8 - 10 מ"ג / ק"ג) ו acepromazine (1 - 2 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally. אשר הרדמה עם מבחן זנב קמצוץ. לאחר העכבר הוא בהרדמה מלאה, להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
  2. מניחים את העכבר על גבו ואת הסיכה בעכבר כדי קרש החיתוך. נקו את אזור הבטן עם 70% (v / v) מגבונים אתנול.
  3. לצבוט את העור על קו האמצע ולעשות חתך ראשוני קטן עם מספרי microsurgery בינוניים על הבטן. תוך כדי לחיצה על העור עם מלקחיים, להשתמש במספריים microsurgery בגודל בינוני לחתוך את העור הצפק מהבטן אל עצם החזה.
  4. לחתוך את הצלעות על bהצדדים oth במספריים microsurgery בינוניים. מוציאים בזהירות את הריאות והכבד במספריים microsurgery בגודל קטן, ולהשאיר את הלב ואבי העורקים. מעבירים את העכבר ולוח לנתיחה כדי מיקרוסקופ לנתח.
  5. אחוז השומן סביב האאורטה עם מלקחיים קטנים ולהשתמש מספריים קטנים לחתוך בזהירות את שומן סביב האאורטה.
  6. בעדינות לתפוס את אבי העורקים עם מלקחיים, לעשות חתך אחד עם מספריים microsurgery בגודל קטן בתחילת האאורטה עולה ואת להורדת ריבית נוספת בסוף האאורטה יורד, ממש מעל אבי העורקים בבטן.
  7. מעבירים את אבי העורקים גזור בצלחת 60 מ"מ המכיל שנאגרו מלוחים פוספט 1x (PBS; ללא סידן ומגנזיום).
  8. המשך לנתח משם את כל רקמת שומן שנותרו מן האאורטה באמצעות מספריים microsurgery בגודל קטן. השתמש במספריים קטנים כדי לפתוח את אבי העורקים longitudinally.
  9. השתמש במספריים microsurgery בגודל קטן כדי לחתוך חתיכה קטנה (~ 2 x 4 מ"מ) של אבי העורקים היורד ו aortiקשת ג לניתוח AFM (איור 1). הנח את רקמת בצלחת פלסטיק 60 מ"מ ולשמור אותו לח בטיפת PBS.

איור 1
איור 1:. תמונה המראה את המיקום של מגזרי אבי העורקים שונים עכבר אבי העורקים היה מבודד מן הלב אל הסרעפת, וחלק קטן של אבי העורקים היורד ואל קשת אבי העורקים שימשו כדי לקבוע את moduli אלסטי. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. דגימות רקמה הכנות לקראת מדידות AFM

  1. מוציאים בזהירות את PBS באמצעות מעבדה לנגב בלי לגעת האאורטה. להיות בטוח שהצד luminal של הרקמה הוא פונה כלפי מעלה.
  2. בעדינות להדביק בכל קצה של האאורטה נפתח את הצלחת על ידי הוספה ing 5 - 10 μl של דבק cyanoacrylate עם קצה ג'ל טעינה (איור 2).
    הערה: כמות דבק צורך לצרף את הרקמה בתקיפות בכל קצה צריכה להיקבע באופן אמפירי. זה קריטי, כי אבי העורקים אינו נמתח במהלך תהליך זה.
  3. בדוק את אב העורקים המודבקים כדי לוודא שזה לא מקופל או צף. לאחר אוויר ייבוש הדבק על אבי העורקים (30 - 60 שניות), בעדינות להוסיף PBS לצלול המדגם.
    הערה: הכנת ה- AFM (שלבים 3 - 5) יכול להתבצע תוך הרקמה נמצאת בהכנה לניתוח.

איור 2
איור 2: קריקטורה של פלח אבי העורקים מודבקות על צלחת תרבות 60 מ"מ באמצעות Cyanoacrylate דבק דבק cyanoacrylate מוחל קצה מדגם אבי העורקים כהכנה מדידות AFM..com / קבצים / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. טעינת Probe

  1. הר בעל חללית הנוזל על דוכן עומס בדיקה.
  2. בעזרת פינצטה, חלק בדיקת AFM סיליקון ניטריד (0.06 N / שלוחה מ ') עם קצה כדורי (השתמשנו חלקיק 1 מיקרומטר בקוטר SiO 2 אבל גדלים גדול יותר עשוי לשמש גם) על מחזיק בדיקה. ודא כי חללית AFM מאובטחת בחוזקה אל מחזיק הבדיקה.
  3. חלק את מחזיק בדיקה על הסורק-Z הר של ראש AFM, ולהבטיח כי מחזיק הבדיקה מחוברת היטב.

4. יישור לייזר על Probe

  1. פתח את תוכנת AFM. בחר את סוג הניסוי על התוכנה; קטגורית ניסוי לפנות מצב, קבוצת ניסוי לפנות מצב בנוזל ואת הניסוי לפנות מצב בנוזל. לחץ על 'טען experiment של התוכנה; זה יהפוך את הלייזר.
  2. הוסף 3 מ"ל של מים מזוקקים כדי בצלחת תחתית זכוכית 50 מ"מ ומניחים את התבנית על הבמה של יחידת יישור לייזר. יחידה זו מפשטת את התהליך של התמקדות את קרן הלייזר על חלקו האחורי של שלוחה.
  3. הר הראש AFM בתנוחה זקופה על יחידת יישור לייזר וכוח על יחידת יישור לייזר. להוסיף כ 50 μl של מים מזוקקים כדי ליצור אגל על ​​קצה AFM.
  4. באמצעות ג'ויסטיק, מנמיכים את הראש AFM כך קצה AFM עושה במגע עם מים בצלחת. אם איש הקשר אינו בין קצה AFM ומים בצלחת, בעדינות להרים את המנה עד שייוצר מגע. התאם את המיקוד, בהירות ומצב XY כך קצה AFM נמצא בתצוגה במסך LCD של יחידת היישור.
  5. מקם את מקום הליזר על הקצה של חללית AFM על ידי התאמת ידיות מיצוב ליזר של ראש AFM. באמצעות ידיות מיצוב גלאי על ראש AFM, להתאים את המניחיםיון של פוטודיודה עד ערכים בין 0 ל -1 V מתקבל על ההטיה האנכית ו ~ 0 V מתקבל עבור הסטייה האופקית.
  6. בדוק כדי לוודא את אות סכום ליזר מוגדלת. במידת הצורך, חזור על שלב 4.5 להתאים מחדש את עמדת קרן הלייזר על קצה AFM ואת המיקום של פוטודיודה להשיג את האות הסכום המרבי.
    הערה: ייתכן ותהיה צורך במיקום מחדש את חללית AFM על מחזיק בדיקה כדי לקבל אות סכום מרבית גם אם צעד 4.5 חוזר על עצמו.

5. כיול קונסטנט רגישות ההסטה והאביב של חללית AFM

  1. הפוך שריטה על צלחת תרבות 60 מ"מ עם המלקחיים ולמלא את המנה עם מים מזוקקים. מניחים את צלחת תרבות על הצלחת בעל המדגם. במקרה זה, לעגן את המנה על במת סריקת XY הממונע של מיקרוסקופ הפוכה.
  2. מניח בעל צלחת מגנטית על גבי הצלחת על מנת להגן עליהם במהלך הדמיה.
  3. נְקִישָׁה הערה: שלב זה הוא מאוד חשוב כמו זה ימנע שבירת קצה AFM.
  4. מניחים את הראש AFM על הבמה מיקרוסקופ.
  5. השתמש במיקרוסקופ כדי להתמקד השריטה על הצלחת. השתמש בג'ויסטיק, או לחץ על החץ "למטה" בתפריט הניווט, להנמיך את החללית AFM לאט ובזהירות לתוך PBS. מקם את הראש מעט מעל השריטה בצלחת.
    הערה: אם העמדה הראשונית של ראש AFM היא קרובה המדגם, לעסוק זמן יופחת באופן משמעותי.
  6. לפני העוסקים, מחדש להתאים את המיקום של קרן לייזר על קצה AFM ואת המיקום של פוטודיודה להשיג את האות הסכום המירבי לפי הצורך.
  7. בחר סוג טיפ ידי לחיצת Probe השינוי בתפריט Setup. לחץ על בדוק פרמטרים וכן להגדיר את הפרמטרים: סריקת גודל 0, קצב סריקה עד 1 רץ, לדוגמא / קו 256 הסטייה setpoint 20 ננומטר. לחץ Engage. חלון סטטוס Engage יישאר פתוח עד החללית יוצרת קשר עם פני השטח של הצלחת. לאחר שהפעיל את החללית, לחץ רמפה.
  8. לחץ מורחב מצב בתפריט סרגל כלי סריקה וכן להגדיר את הפרמטרים: גודל רמפה כדי בין 500 ננומטר ו -1 מיקרומטר, שיעור רמפה עד 2 הרץ, מספר דוגמאות ל -256, טיפ רדיוס 500 ננומטר, יחס סאמפל פואסון 0.5 (מניח את החומר כדי להימדד הוא בלתי דחיס באופן מושלם), זווית חצי עצה 0, טריגר מצב לסף יחסית וטריגר כדי ננומטר בין 20 ל -100.
  9. לחץ כבש רציף בתפריט סרגל הכלים הרמפה כדי obtaבעיקול כוח על (איור 3 א) הצלחת. ב עקומת הכוח הזה, להגדיר ערוץ 1 טעות סטיה.
    הערה: זה יאפשר את התוכנה כדי גרפה את התוצאות כפי הטיה אנכית כפונקציה של מיקום z.
    1. לחץ בקצות שמאלה או ימינה של עקומת כוח וגרור את הסמן על מנת להקיף באזור הליניארי של עקומת כוח (איור 3 א, קווים אדומים מקווקו). השתמש בשתי שורות אלה כדי לסמן את גבולות האזור המשופע להיות בכושר עם קו ישר.
  10. בחר Ramp בסרגל הכלים ולחץ רגישות Update. רשום את הערך וחזור על שלב זה עוד ארבע פעמים. בחר כיול בסרגל הכלים ולאחר מכן לחץ על גלאי. קלט ערך ממוצע של חמש מדידות בתיבת רגישות הסטה.
  11. לחץ על בטל 2 - 3 פעמים כדי להעלות את ראש AFM. שלב זה חשוב כדי למנועאינטראקציה בין קצה AFM ואת הצלחת במהלך תהליך המנגינה התרמי. לחץ Tune תרמי בסרגל הכלים.
  12. הגדר טווח Tune תרמי של 1 - 100 kHz (מידע זה ניתן לקבל את הקטלוג של היצרן) ו תיקון רגישות הסטה כדי 1.144 עבור cantilevers בצורת V ו 1.106 עבור cantilevers מלבני.
  13. בתפריט Tune התרמי, לחץ רוכשים את הנתונים כדי לקבל עקומת מנגינת תרמית (איור 3 ב). שימוש בתוכנת AFM, אדום במקום קווים מקווקווים משני צדים העקומים (כפי שמוצג באיור 3 ב) על ידי גרירת העכבר מקצה הגרף להגדיר את הגבולות עבור הולם. בחר באחת האפשרויות הלורנצי (מיזוג) או מתנד הרמוני פשוט (נוזל) מודל תלוי באיזה שיתאים יותר נתונים.
  14. לחץ נתוני Fit, ואז לחשב האביב K ולשמור על ערך זה. מִחָדָשׁ כבול כיולים באביב קבוע מספר פעמים ולהשתמש הערך הממוצע. לחץ על בטל כמה פעמים.
  15. הסר את ראש AFM משלב מיקרוסקופ ומניח אותו על יחידת היישור. מוציאים את המאפה משלב מיקרוסקופ.

איור 3
איור 3: עקומות חיל AFM ששימשו כיול של בדיקות AFM. (א) עקומת כוח AFM נציג (עקומת כיול). החלק הרחב של עקומת הכח בין אדום האנך קווים מהקווקווים שמשו כדי לקבוע את רגישות סטיית שלוחה. (ב) גרף בכושר מתנד ההרמוני פשוט להשתמש כדי לחשב את קבוע הקפיץ של השלוחה כפי שתואר לעיל 20. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

התחת = "jove_title"> 6. מדידת מודולוס האלסטיות על עורקי עכבר Ex Vivo

  1. מניח את צלחת תרבות 60 מ"מ המכילה את הרקמות העורקים על במת מיקרוסקופ, ולאבטח את הצלחת עם בעל צלחת המגנטי.
  2. מניחים את הראש AFM על הבמה מיקרוסקופ. ודא כי חללית AFM לא ליצור קשר עם אב העורקים אך בעדינות יוצרת קשר עם PBS ויוצרת המניסקוס. במידת הצורך, מקום ראש AFM על יחידת יישור ולחץ משיכה עד שיש מספיק אישור כדי למנוע מגע, ולאחר מכן למקם את הראש AFM על הבמה מיקרוסקופ.
  3. לחץ נווט. באמצעות ג'ויסטיק או לחיצה 'Down' חץ, לאט לאט להוריד את החללית AFM לאתר שלוחה מעל אבי העורקים. לשנות את מיקום פוטודיודה באמצעות ידיות מיצוב גלאי על הראש AFM במידת הצורך.
  4. לחץ Engage לאפשר שלוחה ליצור קשר עם אבי העורקים.
  5. פעם האב עורקים עוסקים, להבטיח שמרכז פייזו יציב ולחץ רמפה. אם מרכז piezo הוא משתנה, זה עשוי להיות התוצאה של מעורבות שווא. למשוך את החללית ולהגדיל את ההיסט האנכי של הלייזר על פוטודיודה בתוספות קטנות (~ 0.5 V) ושלב מחדש.
    1. כמו כן, אם החללית היא הרבה מעל פני השטח המדגמים, באופן ידני להוריד את החללית קרובה לפני השטח המדגם לפני מחדש ומרתק. אם השלבים הקודמים לא מבטלים את התנודות, נסה להחליף את החללית.
  6. הגדר את גודל הרמפה עד 3 מיקרומטר, על הדק המצב כדי יחסית ועל סף טריגר ל -100 ננומטר ולחץ כבש רציף. שים לב כי נקודת המגע בין החללית לבין המדגם מתרחשת בערך במרכז לנמוך ¾ של מחזור רמפת Z. אם זה לא הוא ציין, להתנתק מן המדגם, להתאים את גודל Ramp לפי הצורך, מחדש לעסוק המדגם.
  7. לחץ מיקרוסקופ בשורת התפריטים ולאחר מכן לעסוק הגדרות. שנה את SPM משיכה ל -30 מיקרומטר. לחץ כבש רציף בתפריט סרגל כלי רמפה.
  8. לאחר התבוננות עקומת כוח, לחץ לכידת בשורת התפריטים ולאחר מכן ללכוד שם הקובץ. זן שם קובץ רצוי עם הסיומת ".000" (זה יאפשר קבצים שנתפסו נוספים להגדלת המספר ב -1). בחר תיקייה מיועדת ולשמור את הנתונים.
  9. לחץ לכיד בתפריט סרגל הכלים הלכידים. לחץ על בטל ולאחר מכן נווט. השתמש בפקדים ג'ויסטיק או תוכנה כדי למקם השלוחה מעל לאזור אחר של אב העורקים (ליד הנקודה נמדדה לראשונה, ראה איור 4).
  10. לחץ Engage, רמפה, ואת הכבש רציף, בהתאמה. לאחר התבוננות עקומת כוח, לחץ על הפסק ולכוד.
  11. חזור על שלבים 6.9 - 6.10. לכידת לפחות 5 מדידות לכל אזור כפי שמוצג באיור 4 הערה: אנחנו בדרך כלל לאסוף 15 - 25 עקומות בתוקף מיום 3 - 5 מיקומים שונים בכל רקמות כפי שמוצג באיור 4, בהתאמה..

איור 4
. איור 4: קריקטורה של שלוחה מתקרב הפנמה לכל הרקמות (אזור 1) זה מדידת AFM חוזרת עד 15 - 25 פעמים מ 3 - 5 מיקומים שונים (תחומים 1 - 5) בכל עורק לרכוש את הנוקשות של כללי דגימת רקמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניתוח 7. נתונים

  1. תוכנת ניתוח עקומת כוח להרחיב.
  2. Clמצא להרחיב איכס בשורת התפריטים, ולחץ לחיצה כפולה על קובץ להיות מנותחת.
  3. לחץ על פרמטרי חיל שינוי בתפריט הכלים כדי לבדוק את רגישות הסטייה, קבוע קפיץ, טיפ רדיוס, טיפ חצי זווית ו Poisson של היחס. כדי לשנות את הפרמטרים סמנו את התיבה לצד זה ומזינים את הערכים הנכונים בעמודת הערך החדשה. לאחר מכן לחץ על ביצוע.
  4. אם עקומות כוח הם רועשים, לחץ על מסנן Boxcar ולהגדיר תשומות כיוון להאריך, נקודות ממוצעות כדי להזמין 3 ומסנן ל -0 ה. לחץ על בצע כדי להחליק את הנתונים.
  5. לחץ תיקון בסיס בשורת התפריטים ולהגדיר תשומות כיוון להאריך, יחידות מזימת החיל, סוג כדי הפרדה, להזמין תיקון ל -1 st ולהרחיב מקור Baseline ביצוע.
  6. לחץ הזחה בתפריט הכלים ולהגדיר תשומות Curve פעילים Extended, שיטת Fit to נקודת מגע מבוסס, אלגוריתם נקודת קשר לטיפול משתנה כמו Fit, כלול חיל הידבקות לא, מקס חיל Fit גבול עד 30%, מינימום חיל Fit גבול 0% ו דגם Fit to Hertzian (שסתומים).
    הערה: המדידות שלנו, הדבקה משמעותית בין העצה לבין המדגם (סטייה שלילית של השלוחה בעקום ההכחשה) לעתים רחוקות נצפתה. במקרים בהם הידבקות כזה הוא ציין, המודל המתאים (DMT או JKR) אמור לשמש לניתוח 18,19.
  7. שמור את הערכים של מודולוס של יאנג. נתח את מודולוס (אלסטי) של יאנג של כל אחת 3- 5 אזורים (5 עקומות כוח ליחידת שטח) נלקחו במרחק קטן זה מזה כפי שמוצג באיור 4.
    הערה: כדי להסיר חפצים, לכלול moduli של יאנג> 100 kPa (בדרך כלל ~ 10% של מדידות סה"כ) מניתוח.
  8. חישוב ערך מודול יאנג ממוצע עבור כל אחד 3 - 5 האזורים (אשר נמדדים בהתאם) ולהשתמש ערכים אלה כדי לחשב מודולוס אלסטיות ממוצעים האאורטה בכללותה.
    הערה: לפחות 3 ויותר פעמים 4 - 6 aortas הפרט משמשים כדי להשיג הערכה מדויקת של קשיות העורקים. התוצאות הסופיות הם זממו כמו ממוצע + SEM של "n" ניסויים בלתי תלויים. המספר המדויק של aortas הדרוש יהיה, כמובן, תלוי ברמת דיוק הנדרשת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 5 א מראה תמונה בניגוד שלב של אב העורקים היורד (חזה) מילדה בת 6 חודשים, עכבר C57BL / 6 גברים. שלוחת AFM היא במקום ישירות מעל הרקמה ומוכנה זחה. 5B הדמוי ו -5 ג להפגין עקומות כוח נציג מתקבלות על ידי זחת AFM במצב מגע. קווים ירוקים שמוצגים איורי 5 ב ו -5 ג לייצג את העקומות בכושר הטובות ביותר המתקבלות כתוצאה מהפעלת מודל Hertzian עבור כדור. באיור 5D, הנוקשות הממוצעות של aortas יורד וקשתות אב עורקים נקבעו משלושה עכברים בודדים כמתוארות בטקסט. ראוי לציין, כי אבי העורקים היורד ואת קשת אבי העורקים מייצגים אזורים של למינרית וזרימה מופרע, בהתאמה. אף על פי כן, שלהם (פרקו המכאני) moduli אלסטי דומה כפי שנקבע על ידי AFM.

0 / 54630fig5.jpg "/>
איור 5: Curves חיל-הזחה המנותחת נוקשות נתונים (א) מיקרוסקופ בניגוד שלב מציג שלוחת AFM מעל עכבר יורד האאורטה vivo לשעבר.. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (בי סי) סט של שתי עקומות כוח-הזחה נציג רכשה עבור (B) אבי העורקים היורד ו- (ג) קשת אבי העורקים. (ד) Mean נוקשות של אבי העורקים היורד העכבר קשת אבי העורקים נקבע על פי הפירוט מתואר לעיל. ברים שגיאים להראות ממוצעת + SEM; n = 3 משכפל ביולוגי עצמאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כניסת AFM יכול לשמש כדי לאפיין את הנוקשות (מודולוס אלסטיות) של תאים ורקמות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים צעד-אחר-צעד מפורט לבודד את אבי העורקים היורד ואת קשת אבי העורקים בתוך העכבר ולקבוע את moduli אלסטי של אזורים עורקים אלה vivo לשעבר. אנחנו עכשיו לסכם ולדון בסוגיות המגבלות הטכניות של השיטה המתוארת במאמר זה.

כמה בעיות טכניות עלולות להתעורר בבידוד והניתוח של aortas עכבר בהתחשב באופי הקטנה ורזה שלהם. כאשר העורקים ניקו נפתחים אורכים, יש להקפיד לא לשבש את אינטימה (המשטח לומינל) שבו הנתונים מודולוס אלסטיות נאספות. עודף PBS בצלחת המדגם הסופי מונעת הדבקה נאותה של העורקים על הצלחת, וזה צריך להיות מוסר בזהירות בעזרת ממחטת נייר בלי לגעת העורק לפני ההדבקה. שים לב, עם זאת, כי העורק המבודד יכול להיצמד WHI ממחטת ניירle להסרתה PBS מופרז, ודבר זה יכול לגרום נזק המדגם. בעוד הדבקת העורקים אל מנת התרבות, חשוב מאוד כי העורק אינו נמתח וכי כמות של דבק קטן מוחלת קצת-ידי סיבי לכל קצה של העורק. בעת ביצוע-הזחה AFM, היא קריטית כדי למנוע חיטוט בקצות העורק שבו דבק יושם. לבסוף, כי עורקים מבודדים טרי משמשים את המידות של מודולוס אלסטיות, הזמן שחלף מן הקציר מדידה צריך להיות ממוזער.

מאז טיפים הכדוריים המשמשים במחקר זה יש ברדיוס של 500 ננומטר, עומק הזחה של עד 500 ננומטר ניתן לנתח במדויק באמצעות מודל ההרץ. עומק הזחה זה היה לתאם עם השכבה העליונה של תאי האנדותל ממוקמים אינטימה 21. כדי לחקור את המכניקה של שכבות תת-אנדותל של דגימות עורקים, בדיקות קולואידים גדול (10 - 20 מיקרומטר קוטר) יכול לשמשעבור כניסה ושינויים קשיחים מחושב עם עומק כניסה ניתן לקבוע 22,23. כמו כן, מאז דגימות ביולוגיות הן בדרך כלל viscoelastic ולא גרידא אלסטי, מדידות הרפית מתח (ניטור הדעיכה בתוקף יישומים בעומק זחה קבוע) יכולות לשמש כדי לקבוע את המרכיב הצמיג של תכונות מכאניות עורקי 24,25.

מגבלה פוטנציאל של ניתוח AFM היא גודל הסריקה, אשר מודד רק אזור קטן של הרקמה. רוב דגימות ביולוגיות, כולל העורקים התאים, הם לא טופוגרפית biomechanically הומוגנית, ההטרוגניות זה יכול לגרום באופן פוטנציאלי שינויים גדולים artifactually של מודולוס אלסטיות תלוי החלקות של אתר הכניסה, עומק הכניסה, ואת כמות הכוח המופעל על המדגם משטח. כדי לקבל ערך נציג ממוצע של מודולוס הכוללת אלסטי, חשוב לבצע AFM-זחה חזרt מספר מיקומים אקראיים דרך העורקים, כפי שמוצגים באיור 4. יתר על כן, אנו משתמשים קצה כדורי בגודל מתאים, כמו מחקרים קודמים הראו כי AFM-זח עם קצה פירמידה חד הביאו אומדנים גבוהים יותר של מודולוס האלסטיות ופגעתי רך דגימות ביולוגיות 26,27.

למרות מדידות AFM vivo לשעבר שלנו של קשיות עורקים מופיעות להסכים גם עם סמנים מולקולריים של תאי שריר חלק מקשיח 2, חשוב להבין כי דגימות העורקות אלה אינן נטענות מכאני, ואת העומס מכאני עשוי לשחק תפקיד חשוב כללי מכניקה עורקת. השוואות של קשיות העורקים כפי שנקבע על ידי AFM, myography (שיטה vivo לשעבר תואם טעינה מכני) 28 ומהירות הדופק-גל (מדידה in vivo של קשיות העורקים) 29 צפוי לספק את ההבנה המקיפה ביותר של arterמכניקת ial.

תארנו את AFM במצב מגע, המודד את נוקשות vivo לשעבר של עורקי עכבר. שיטה זו מעריכה את רקמות נוקשות הממוצע ע"י הפנמה באקראי על אזורים מרובים של אבי העורקים. כדי לבחון את הפריסה המרחבית של קשיחות מאזורים גדולים של רקמות, נייר אחרון השתמש AFM במצב כוח בנפח 30. גישה זו זמנית השיגה מפה של וריאציות קשיחות תמונה ברזולוציה גבוהה של פני שטח טופוגרפיים של הרקמה. בנוסף למדידת קשיות של דגימות רקמה, ה- AFM במצב כוח בנפח ניתן להשתמש בתאים לפקח על הפצות המרחבי של נוקשות תאיים 10,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioScope Catalyst AFM system Bruker
Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope Nikon Instruments
Silicon nitride AFM probe Novascan Technologies PT.SI02.SN.1 0.06 N/m cantilever; 1 µm SiO2 particle
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-10 See section 1.4
Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00 See section 1.8
Fine Scissors-ToughCut Fine Science Tools 14058-11 See section 1.4 (medium sized)
Vannas-Tübingen spring scissors Fine Science Tools 15008-08 See section 1.6 (small sized)
60 mm TC-treated cell culture dish Corning 353004
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x Corning 21-031-CM Without calcium and magnesium
Krazy Glue instant all purpose liquid Krazy Glue KG58548R See section 2.2
Gel-loading tips, 1 - 200 µl Fisher 02-707-139 See section 2.2
Tip Tweezers Electron Microscopy Sciences 78092-CP See section 3.2
50-mm, clear wall glass bottom dishes TED PELLA 14027-20 See section 4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
  2. Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189 (2015).
  3. Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
  4. Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
  5. Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585 (2011).
  6. Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
  7. Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  8. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  9. Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
  10. Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57 (2014).
  11. Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
  12. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
  13. Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122 (2011).
  14. Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
  15. Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
  16. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
  17. Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974 (2015).
  18. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  19. Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).
  21. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).
  22. Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
  23. Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
  24. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  25. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
  26. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
  27. Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
  28. Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. e3733 (2012).
  29. Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
  30. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
  31. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics