Mesure de la rigidité de

Biology

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Bae, Y. H., Liu, S. l., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (116), e54630, doi:10.3791/54630 (2016).

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Abstract

raidissement artérielle est un facteur de risque significatif et biomarqueur pour une maladie cardiovasculaire et une caractéristique de vieillissement. La microscopie à force atomique (AFM) est un outil d' analyse polyvalent pour la caractérisation des propriétés mécaniques viscoélastiques pour une variété de matériaux allant du disque (plastique, verre, métal, etc.) des surfaces à des cellules sur tout substrat. Il a été largement utilisé pour mesurer la rigidité des cellules, mais moins fréquemment utilisé pour mesurer la rigidité des aortes. Dans cet article, nous allons décrire les procédures d'utilisation de l' AFM en mode contact pour mesurer l'ex vivo module d' élasticité des artères de souris non chargées. Nous décrivons notre procédure d'isolement des aortes de souris, puis des informations détaillées pour l'analyse de l'AFM. Cela inclut des instructions étape par étape pour l'alignement du faisceau laser, l'étalonnage de la constante du ressort et de la sensibilité de déviation de la sonde AFM, et l'acquisition de courbes de force. Nous fournissons également un protocole détaillé pour analy de donnéessis des courbes de force.

Protocol

le travail des animaux dans cette étude a été approuvée par les soins et l'utilisation des comités institutionnels animales de l'Université de Pennsylvanie. Les méthodes ont été réalisées conformément aux lignes directrices approuvées.

1. Préparation de la souris et l'isolement de l'aorte

  1. Anesthésier une souris avec de la kétamine (80 - 100 mg / kg), de xylazine (8 - 10 mg / kg) et d'acépromazine (1 - 2 mg / kg) par voie intrapéritonéale. Confirmer l'anesthésie avec un test de queue de pincement. Une fois que la souris est complètement anesthésié, euthanasier la souris par dislocation cervicale.
  2. Placez la souris sur le dos et la broche de la souris sur une planche à dissection. Nettoyez la région de l'abdomen avec 70% (v / v) d'éthanol lingettes.
  3. Pincer la peau à la ligne médiane et de faire une petite incision initiale avec des ciseaux de microchirurgie de taille moyenne à l'abdomen. Tout en maintenant la peau avec des pinces, des ciseaux de microchirurgie de taille moyenne pour couper la peau et du péritoine de l'abdomen au sternum.
  4. Coupez les nervures sur bcôtés OTH avec des ciseaux de microchirurgie de taille moyenne. Retirez délicatement les poumons et le foie avec de petits ciseaux de microchirurgie de taille, et de laisser le cœur et l'aorte. Transfert de la souris et planche de dissection à un microscope à dissection.
  5. Attrapez la graisse entourant l'aorte avec de petites pinces et utiliser de petits ciseaux pour couper soigneusement la graisse autour de l'aorte.
  6. saisir délicatement l'aorte avec une pince, faire une coupe avec de petits ciseaux de microchirurgie de taille au début de l'aorte ascendante et une autre coupe à la fin de l'aorte descendante, juste au-dessus de l'aorte abdominale.
  7. Transférez l'aorte disséquée dans un plat de 60 mm contenant 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS; sans calcium et magnésium).
  8. Continuer à disséquer les tissus adipeux restant de l'aorte à l'aide de petits ciseaux de microchirurgie de taille. Utilisez de petits ciseaux pour ouvrir l'aorte longitudinalement.
  9. Utilisez de petits ciseaux de microchirurgie de taille pour couper un petit morceau (~ 2 x 4 mm) de l'aorte descendante et aortic arc pour l' analyse AFM (Figure 1). Placez le tissu dans un plat en plastique de 60 mm et le garder humide dans une goutte de PBS.

Figure 1
Figure 1:. Une image montrant l'emplacement des segments aortiques différents dans une souris L'aorte a été isolé du coeur à la membrane, et une petite partie de l'aorte descendante et la crosse aortique ont été utilisés pour déterminer les modules élastiques. Barre d'échelle, 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Les échantillons de tissus Préparation pour les mesures de l'AFM

  1. Retirez délicatement le PBS en utilisant un laboratoire essuyez sans toucher l'aorte. Soyez certain que le côté luminal du tissu vers le haut.
  2. coller doucement chaque extrémité ouverte de l'aorte à la plaque par adjonction ing 5 - 10 pi de colle cyanoacrylate avec une pointe de gel-chargement (Figure 2).
    NOTE: La quantité de colle nécessaire pour fixer fermement le tissu à chaque extrémité doit être déterminée empiriquement. Il est essentiel que l'aorte est pas étirée pendant ce processus.
  3. Vérifiez l'aorte collée à assurer qu'il ne soit pas plié ou flottant. Après séchage à l'air de la colle sur l'aorte (30 - 60 s), ajouter doucement PBS et immerger l'échantillon.
    NOTE: Préparation de l'AFM (étapes 3-5) peut être effectuée alors que le tissu est en cours de préparation pour l' analyse.

Figure 2
Figure 2: Cartoon d'un segment de l' aorte Collé sur une boîte de culture de 60 mm en utilisant l' adhésif cyanoacrylate L'adhésif cyanoacrylate est appliqué sur le bord d'un échantillon de l' aorte en préparation pour les mesures de l' AFM..com / fichiers / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Chargement de la sonde

  1. Monter un porte-sonde fluide sur le support de charge de la sonde.
  2. En utilisant des pinces, faites glisser une sonde AFM de nitrure de silicium (0,06 N / m cantilever) avec une pointe sphérique (nous avons utilisé un diamètre de 1 um SiO 2 particules , mais de plus grandes tailles peuvent également être utilisés) sur le support de sonde. Assurez-vous que la sonde AFM est fermement fixé au support de la sonde.
  3. Faites glisser le porte-sonde sur le Z-scanner monter de la tête AFM, et veiller à ce que le porte-sonde est solidement fixé.

4. Alignement du laser sur la sonde

  1. Ouvrez le logiciel de l'AFM. Choisissez le type d'expérience sur le logiciel; Experiment Catégorie à contacter mode, Groupe d'essais pour contacter le mode de fluide et des essais pour contacter le mode dans le liquide. Cliquez sur Charger experiment dans le logiciel; cela tournera sur le laser.
  2. Ajouter 3 ml d'eau distillée dans un plat de fond de verre de 50 mm et placez le plat sur la scène de l'unité d'alignement laser. Cette unité simplifie le processus de focalisation du faisceau laser sur le dos du cantilever.
  3. Monter la tête AFM en position verticale sur l'unité d'alignement au laser et la puissance de l'unité d'alignement laser. Ajouter environ 50 pi d'eau distillée pour former une gouttelette sur la pointe de l'AFM.
  4. En utilisant le joystick, abaisser la tête AFM de sorte que la pointe de l'AFM est en contact avec de l'eau dans le plat. Si le contact ne se fait pas entre la pointe de l'AFM et de l'eau dans le plat, soulevez doucement le plat jusqu'à ce que le contact est établi. Réglez la mise au point, la luminosité et la position XY de sorte que la pointe de l'AFM est en vue sur l'écran LCD de l'unité d'alignement.
  5. Positionner la tache laser sur la pointe de la sonde AFM en ajustant les boutons de la tête AFM de positionnement laser. En utilisant les boutons de positionnement du détecteur sur la tête de l'AFM, ajuster la position de la photodiode jusqu'à ce que des valeurs comprises entre 0 et -1 V, on obtient pour la déviation verticale et ~ 0 V, on obtient pour la déviation horizontale.
  6. Vérifiez que le signal de somme laser est maximisée. Si nécessaire, répétez l'étape 4.5 de re-régler la position du faisceau laser sur la pointe de l'AFM et la position de la photodiode pour obtenir le signal de somme maximale.
    NOTE: Il peut être nécessaire de repositionner la sonde AFM sur le support de sonde pour obtenir un signal de somme maximale même si l' étape 4.5 est répétée.

5. Calibrage de la constante Déviation de sensibilité et de printemps de l'AFM Probe

  1. Faire une égratignure sur une boîte de culture de 60 mm avec une pince et remplir la cuve avec de l'eau distillée. Placez la boîte de culture sur la plaque porte-échantillon. Dans ce cas, monter le plat sur la XY motorisée étape de balayage d'un microscope inversé.
  2. Placez un support de plaque magnétique sur le dessus de la plaque pour conserver en toute sécurité lors de l'imagerie.
  3. Cliquez NOTE: Cette étape est très importante car elle permet d' éviter la rupture de la pointe de l' AFM.
  4. Placez la tête AFM sur la platine du microscope.
  5. Utilisez le microscope pour se concentrer sur le scratch sur la plaque. Utilisez le joystick, ou cliquez sur la flèche «bas» dans le menu de navigation, lentement et soigneusement abaisser la sonde AFM dans le PBS. Positionner la tête légèrement au-dessus de zéro dans la plaque.
    NOTE: Si la position initiale de la tête AFM est plus proche de l'échantillon, le temps engager sera considérablement réduit.
  6. Avant d'engager, re-régler la position du faisceau laser sur la pointe de l'AFM et la position de la photodiode pour obtenir le signal SUM maximale nécessaire.
  7. Sélectionnez un type de pointe en cliquant sur Modifier la sonde dans le menu de configuration. Cliquez sur Vérifier les paramètres et définir les paramètres: Balayez Taille à 0, vitesse de balayage à 1 Hz, Sample / ligne à 256 et des fléchissements de consigne à 20 nm. Cliquez sur Engage. La fenêtre d'état Engage restera ouvert jusqu'à ce que la sonde est en contact avec la surface de la plaque. Après avoir engagé la sonde, cliquez sur la rampe.
  8. Cliquez sur Expanded Mode dans le menu Barre d' outils d' analyse et de définir les paramètres: Ramp Taille comprise entre 500 nm et 1 pm, Taux de rampe à 2 Hz, Nombre d'échantillons 256, Conseil de rayon à 500 nm, le ratio de l' échantillon de Poisson à 0,5 ( en supposant le matériau à mesurer est parfaitement incompressible), Tip demi - angle à 0, le mode de déclenchement à seuil de déclenchement relatif et entre 20 et 100 nm.
  9. Cliquez sur rampe continue dans le menu Rampe Barre d'outils pour bénéficier du droitdans une courbe de force sur la plaque (figure 3A). Dans cette courbe de force, réglez le canal 1 à l' erreur de déviation.
    NOTE: Cela permettra au logiciel de représenter graphiquement les résultats sous forme de déviation verticale vs. position z.
    1. Cliquez sur les extrémités gauche ou droite de la courbe de force et faites glisser le curseur pour englober une région linéaire de la courbe de force (figure 3A, les lignes rouges en pointillés). Utilisez ces deux lignes pour marquer les limites de la région en pente pour être en forme avec une ligne droite.
  10. Sélectionnez la rampe dans la barre d' outils et cliquez sur Mettre à jour la sensibilité. Enregistrer la valeur et répétez cette étape quatre fois plus. Sélectionnez Calibrer dans la barre d' outils puis cliquez sur Detector. Entrez une valeur moyenne des cinq mesures dans la zone de déflexion Sensibilité.
  11. Cliquez sur Retrait 2 - 3 fois pour relever la tête de l' AFM. Cette étape est importante pour prévenirl'interaction entre la pointe de l'AFM et la plaque au cours du processus de mise au point thermique. Cliquez sur Tune thermique dans la barre d' outils.
  12. Set thermique Tune gamme de 1-100 kHz (Cette information peut être obtenue à partir du catalogue du fabricant) et des fléchissements Sensibilité Correction à 1.144 pour les cantilevers en forme de V et 1.106 pour les cantilevers rectangulaires.
  13. Dans le menu Tune thermique, cliquez sur Acquérir les données pour obtenir une courbe de hauteur thermique (figure 3B). Utilisation du logiciel de l' AFM, le lieu lignes pointillées rouges de chaque côté de la courbe (comme le montre la figure 3B) en faisant glisser la souris à partir du bord du graphique pour définir les limites pour le montage. Sélectionnez l'Lorentzienne (Air) ou le modèle simple oscillateur harmonique (Fluid) selon le mieux adapté aux données.
  14. Cliquez Fit données, puis Calculer Spring K et enregistrer cette valeur. Rétourbe du printemps étalonnages constants plusieurs fois et utiliser la valeur moyenne. Cliquez sur Extraire plusieurs fois.
  15. Retirez la tête AFM de la platine du microscope et le placer sur l'unité d'alignement. Retirer le plat du stade de microscope.

Figure 3
Figure 3: Courbes AFM force utilisée dans l'étalonnage de l' AFM sondes. (A) Une courbe de force de l' AFM représentant (une courbe d'étalonnage). La partie d'extension de la courbe de force entre la verticale rouge lignes pointillées a été utilisé pour déterminer la sensibilité cantilever de déviation. (B) Un graphe en forme de l' oscillateur harmonique simple utilisée pour calculer la constante du ressort du cantilever comme décrit précédemment 20. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ex vivo

  1. Placez la boîte de culture de 60 mm contenant le tissu aortique sur la platine du microscope, et fixer la plaque avec le support de plaque magnétique.
  2. Placez la tête AFM sur la platine du microscope. Assurez-vous que la sonde AFM ne fait pas contact avec l'aorte, mais fait doucement contact avec PBS et forme un ménisque. Si nécessaire, placez la tête AFM sur l'unité d'alignement , puis cliquez sur Retirer jusqu'à ce qu'il y a suffisamment d' espace pour éviter le contact, puis placer la tête AFM sur la platine du microscope.
  3. Cliquez sur Naviguer. Utilisation du joystick ou en cliquant sur 'Down' flèche, abaissez lentement la sonde AFM pour localiser le cantilever au-dessus de l'aorte. Ajustez la position de photodiode en utilisant les boutons de positionnement du détecteur sur la tête AFM si nécessaire.
  4. Cliquez sur Engagez pour permettre à la console de prendre contact avec l'aorte.
  5. Une fois laaorte est engagée, veiller à ce que le centre de piezo est stable et cliquez sur rampe. Si le centre de piezo est fluctuante, cela peut être le résultat d'un faux engagement. Retirer la sonde et augmenter le décalage vertical du laser sur la photodiode par petits incréments (~ 0,5 V) et réengager.
    1. En outre, si la sonde est bien au-dessus de la surface de l'échantillon, abaisser manuellement la sonde près de la surface de l'échantillon avant de re-engagement. Si les étapes précédentes ne suppriment pas la fluctuation, essayez de remplacer la sonde.
  6. Régler la rampe Taille à 3 pm, le mode de déclenchement de relative et le seuil de déclenchement à 100 nm et cliquez sur rampe continue. Notez que le point de contact entre la sonde et l'échantillon se produit à peu près au centre de la partie inférieure ¾ du cycle Z de rampe. Si cela n'a pas été observé, se désengager de l'échantillon, ajuster la taille de la rampe, au besoin, et réengager l'échantillon.
  7. Cliquez sur Microscope dans la barre de menu, puis engager Paramètres. Changer le SPM Retrait à 30 pm. Cliquez sur rampe continue dans le menu Rampe barre d' outils.
  8. Après avoir observé la courbe de force, cliquez sur Capturer dans la barre de menu, puis Capturer Nom du fichier. Entrez un nom de fichier désiré avec la fin ".000" (ce qui permettra les fichiers capturés supplémentaires pour augmenter en nombre par 1). Sélectionnez un dossier désigné et enregistrer les données.
  9. Cliquez sur Capturer dans le menu de la barre d'outils Capture. Cliquez sur Retirer puis Naviguer. Utilisez le joystick ou les commandes de logiciels pour positionner la console sur une autre zone de l'aorte ( à côté du point initialement mesurée; voir la figure 4).
  10. Cliquez sur Engage, rampe et rampe continue, respectivement. Après avoir observé la courbe de force, cliquez sur Arrêter Capturer.
  11. Répétez les étapes 06.09 à 06.10. Capture au moins 5 mesures par zone comme le montre la Figure 4 NOTE: Nous recueillons généralement 15 - 25 courbes de 3 force - 5 endroits différents dans chaque tissu comme le montre la figure 4, respectivement..

Figure 4
. Figure 4: bande dessinée d'un cantilever approchant et Indentation Tissue (zone 1) Cette mesure de l' AFM est répété jusqu'à 15 - 25 fois à partir de 3 - 5 endroits différents (zones 1 - 5) dans chaque artère d'acquérir la rigidité de l'ensemble échantillon de tissu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Analyse 7. Données

  1. Ouvrir la force logiciel d'analyse de la courbe.
  2. Click Trouver et Open dans la barre de menu, puis double - cliquez sur un fichier à analyser.
  3. Cliquez sur Modifier les paramètres de la Force dans le menu de la barre d' outils pour vérifier la sensibilité de déviation, le ratio de Constant Spring, Tip Radius, Tip demi - angle et Poisson. Pour modifier les paramètres, cochez la case à côté de lui et entrez les valeurs correctes dans la nouvelle colonne de valeur. Ensuite , cliquez sur Exécuter.
  4. Si les courbes de force sont bruyants, cliquez sur Boxcar Filter et réglez les entrées de direction pour étendre, Moyenne des points à 3 et Commande de filtre à 0 e. Cliquez sur Exécuter pour lisser les données.
  5. Cliquez Baseline Correction dans la barre de menu et définir des entrées pour Instructions Extend, Plot unités à la force, type de séparation, Correction ordonner au 1 er et Extend Baseline Source Exécuter.
  6. Cliquez sur indentation dans le menu de la barre d' outils et définir des entrées pour Curve Active Extended, Méthode Fit to Point de contact Based, Point de contact Algorithme pour traiter comme Fit Variable, Inclure Adhérence Force pour Non, Fit Boundary Force Max à 30%, Fit Boundary Force de Min à 0% et Fit Model à hertzienne (Spherical).
    NOTE: Dans nos mesures, l' adhérence significative entre la pointe et l' échantillon (une déviation négative de la console dans la courbe de rétraction) a été rarement observée. Dans les cas où une telle adhérence est observée, le modèle approprié (DMT ou JKR) doit être utilisé pour l' analyse 18,19.
  7. Enregistrer les valeurs de module de Young. Analyser (élastique) de chacun des trois de Young- 5 zones (5 courbes de force par unité de surface) pris à l'intérieur d' une petite distance les uns des autres comme représenté sur la figure 4.
    REMARQUE: Pour supprimer les artefacts, exclure les modules d'Young> 100 kPa (normalement ~ 10% du nombre total de mesures) de l'analyse.
  8. Calculer une valeur de module d'Young moyen pour chacun des 3 - 5 zones (qui ont été mesurés) et utiliser ces valeurs pour calculer le module d'élasticité moyenne de l'aorte dans son ensemble.
    REMARQUE: au moins 3 et plus souvent 4 - 6 aortes individuels sont utilisés pour obtenir une évaluation précise de la rigidité artérielle. Les résultats finaux sont représentés par la moyenne ± ETM de «n» expériences indépendantes. Le nombre exact de aortes nécessaires sera, bien sûr, dépendra du niveau de précision requis.

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Representative Results

La figure 5A montre une image de contraste de phase de la descente (thoracique) aorte d'un enfant de 6 mois, mâle C57BL / 6 de souris. Le cantilever AFM est en place directement au- dessus du tissu et prêt pour l' indentation. Figures 5B et 5C montrent des courbes de force représentatives obtenues par AFM indentation en mode contact. Lignes vertes représentées sur les figures 5B et 5C représentent les meilleures courbes d'ajustement obtenus en utilisant le modèle Hertzienne pour une sphère. Sur la figure 5D, la rigidité moyenne des aortes descendantes et des arcs aortiques ont été déterminées à partir de trois souris individuelles , comme décrit dans le texte. A noter que l'aorte descendante et l'arc aortique représentent des régions d'écoulement laminaire et perturbé, respectivement. Néanmoins, leurs (déchargés mécaniquement) modules élastiques sont similaires, tel que déterminé par l'AFM.

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Figure 5: Les courbes force-indentation analysées et Rigidité de données (A) contraste de phase micrographie montrant un cantilever AFM sur une souris aorte descendante ex vivo.. Barre d'échelle, 100 um. (BC) Un ensemble de deux courbes force-indentation représentatifs acquis pour (B) l'aorte descendante et (C) la crosse de l' aorte. (D) la rigidité moyenne de l'aorte souris descendante et l' arc aortique a été déterminée comme décrit ci-dessus. Les barres d'erreur montrent moyenne + SEM; n = 3 répétitions biologiques indépendants. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

AFM indentation peut être utilisée pour caractériser la rigidité (module d'élasticité), des cellules et des tissus. Dans cet article, nous fournissons des protocoles étape par étape détaillées pour isoler l'aorte descendante et l' arc aortique chez la souris et déterminer les modules élastiques de ces régions artérielles ex vivo. Nous résumons maintenant et discuter les problèmes techniques et les limites de la méthode décrite dans le présent document.

Plusieurs problèmes techniques peuvent survenir dans l'isolement et l'analyse des aortes de souris étant donné leur petit et mince nature. Lorsque les artères nettoyées sont ouverts longitudinalement, il faut prendre soin de ne pas perturber l'intima (surface luminale) lorsque les données de module d'élasticité est recueilli. L'excès de PBS dans le plat final de l'échantillon empêche bon collage des artères sur le plat, et cela doit être soigneusement enlevé en utilisant un mouchoir en papier sans toucher l'artère avant le collage. Notez, cependant, que l'artère isolée peut coller à la WHI de mouchoir en papierle tenter de retirer excessive PBS, et cela peut endommager l'échantillon. Alors que le collage des artères à la boîte de culture, il est extrêmement important que l'artère ne soit pas tendue et que seule une petite quantité d'adhésif est appliquée bit par bit à chaque extrémité de l'artère. Lors de l'exécution de l'AFM-indentation, il est essentiel d'éviter palpage aux extrémités de l'artère où l'adhésif a été appliqué. Enfin, parce que les artères fraîchement isolés sont utilisés pour les mesures de module d'élasticité, le temps écoulé depuis la récolte jusqu'à la mesure doit être minimisée.

Etant donné que les pointes sphériques utilisées dans cette étude ont un rayon de 500 nm, une profondeur allant jusqu'à 500 nm d'empreinte peut être analysée avec précision en utilisant le modèle Hertz. Cette profondeur de pénétration serait corrélée avec la couche supérieure de cellules endothéliales situées dans l'intima 21. Pour sonder la mécanique des couches sous-endothéliale des échantillons artériels, des sondes plus grandes colloïdales (10 - 20 um de diamètre) pourrait être utilisépour l' indentation et les changements dans la rigidité calculée avec la profondeur d'indentation peut être déterminé 22,23. En outre, puisque les échantillons biologiques sont habituellement viscoélastique plutôt que purement élastique, les mesures de relaxation de contrainte (surveillance de la désintégration en force appliquée à une profondeur d'indentation constante) pourraient être utilisées pour déterminer la composante visqueuse des propriétés mécaniques artérielles 24,25.

Une limitation potentielle de l'analyse AFM est la taille de balayage, qui ne mesure qu'une petite région du tissu. La plupart des échantillons biologiques, y compris les artères et les cellules ne sont pas topographiquement et biomécaniquement homogène et cette hétérogénéité peut potentiellement entraîner artifactually grandes variations du module d'élasticité en fonction de lissage du site de pénétration, la profondeur de pénétration et la quantité de force appliquée à l'échantillon surface. Pour obtenir une valeur moyenne représentative du module d'élasticité globale, il est important d'effectuer répétée AFM-indentation unet de multiples endroits aléatoires à travers les artères, comme le montre la figure 4. De plus, nous utilisons une pointe sphérique de taille appropriée, comme des études antérieures ont démontré que l' AFM-indentation avec une pointe pyramidale forte a donné lieu à des estimations plus élevées du module d' élasticité et endommagé doux des échantillons biologiques 26,27.

Même si nos ex vivo mesures AFM de la rigidité artérielle semblent bien d' accord avec les marqueurs moléculaires de cellules du muscle lisse de raidissement 2, il est important de réaliser que ces échantillons artériels ne sont pas chargés mécaniquement, et la charge mécanique est susceptible de jouer un rôle important dans l' ensemble mécanique artériel. Les comparaisons de la rigidité artérielle tel que déterminé par l' AFM, myographie (une méthode ex vivo compatible avec la charge mécanique) 28 et de la vitesse d'onde d' impulsion (une mesure in vivo de la rigidité artérielle) 29 vont probablement fournir la compréhension la plus complète de artermécanique ial.

Nous avons décrit l'AFM en mode contact pour mesurer l'ex vivo la rigidité des artères de souris. Cette méthode évalue la rigidité des tissus en moyenne par indentation de façon aléatoire sur de multiples régions de l'aorte. Pour examiner la répartition spatiale de la rigidité des plus grands régions de tissus, une étude récente a utilisé AFM en mode force le volume 30. Cette approche a obtenu simultanément une carte des variations de rigidité et une image à haute résolution de la surface topographique du tissu. En plus de mesurer la rigidité d'échantillons de tissus, l'AFM en mode de force volume peut être utilisé dans les cellules pour contrôler la distribution spatiale de la rigidité intracellulaire 10,31.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioScope Catalyst AFM system Bruker
Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope Nikon Instruments
Silicon nitride AFM probe Novascan Technologies PT.SI02.SN.1 0.06 N/m cantilever; 1 µm SiO2 particle
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-10 See section 1.4
Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00 See section 1.8
Fine Scissors-ToughCut Fine Science Tools 14058-11 See section 1.4 (medium sized)
Vannas-Tübingen spring scissors Fine Science Tools 15008-08 See section 1.6 (small sized)
60 mm TC-treated cell culture dish Corning 353004
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x Corning 21-031-CM Without calcium and magnesium
Krazy Glue instant all purpose liquid Krazy Glue KG58548R See section 2.2
Gel-loading tips, 1 - 200 µl Fisher 02-707-139 See section 2.2
Tip Tweezers Electron Microscopy Sciences 78092-CP See section 3.2
50-mm, clear wall glass bottom dishes TED PELLA 14027-20 See section 4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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