Enkel och effektiv produktion och rening av mus Myelin Oligodendrocyte Glykoprotein för experimentell autoimmun encefalomyelit Studies

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

MS är en sjukdom hos människor som kännetecknas av kronisk inflammation och neurodegeneration i CNS som tros för att drivas av en autoimmun respons riktas mot myelin. Förlusten av myelin och axoner över tiden resultera i den gradvisa minskningen av kognitiv och motorisk funktion 1. "Experimentell autoimmun encefalomyelit" är ett samlingsnamn för djurmodeller av autoimmun sjukdom riktad mot CNS myelin. Som mänskliga MS, är EAE kännetecknas typiskt av immuncellinfiltration av CNS och, i vissa fall, demyelinering 2. Men i vilken utsträckning en viss EAE-modellen liknar human MS delvis beror på arten eller stam som används och komplexiteten i den underliggande anti-myelinautoimmunt svar.

Anti-myelin autoimmunitet kan experimentellt inducerad på flera sätt, men den vanligaste metoden som används idag är att immunisera möss med en kort peptid av aminosyror som imiterar den immunodominanta CD4 35-55), som används för att inducera EAE hos C57Bl / 6-möss tre. Men det är för vissa försöksändamål önskvärd eller ens nödvändigt att immunisera med större proteinantigener och faktiskt det finns flera fördelar med detta över immunisering med kort peptid. Först på grund av MHC-restriktion, korta peptider är oftast bara effektiva i ett mycket begränsat antal av stammar, medan större proteinantigener som representerar antingen hela proteinet eller en specifik domän kan behandlas normalt för presentation i flera stammar inavlade mus eller ens i olika arter 4. För det andra är en större proteinantigen med förmåga att inducera en mer komplex immunsvar som innefattar flera typer av lymfocyter i antigenigenkänning, snarare än limiting antigen-igenkänning till CD4 + T-celler. Till exempel, B-celler via sin B-cellsreceptor (BCR) interagera direkt med hela snarare än bearbetat protein. Vi och andra har visat att B-celler aktiveras av MOG 35-55 immunisering inte känner igen MOG protein 5. Eftersom B-celler har nyligen visat sig spela en patogen roll i människans MS 6, EAE-modeller som innehåller B-celler vid autoimmun patologi blir allt viktigare.

Trots fördelarna med att använda större proteinantigener för att inducera EAE, kvarstår några kommersiellt tillgängliga källor för sådana proteiner. Faktiskt, medan korta peptider som MOG 35-55 kan syntetiseras mycket snabbt och till en relativt låg kostnad, de kommersiella alternativ för MOG-proteinet är begränsade och kostnad betydligt mer att köpa. Det finns dock flera expressionsvektorer tillgängliga för forskargrupper att generera MOG extracellulära domänen (MOG 1-125) själva. However, alla uttryckssystem som vi har identifierat i litteraturen är baserade på äldre tekniker som sedan har ersatts med mer effektiva uttryckssystem 7. Vidare är de flesta är baserade på råtta eller människa MOG 8. För vissa undersökningar av autoimmunitet hos möss, är en antigenbaserade på musen MOG autoantigen föredra. Slutligen, alla MOG-baserade proteiner som vi har identifierat, antingen kommersiella eller som expressionsvektorer, är fusionsproteiner som innehåller ytterligare aminosyror till MOG 1-125 bas. Dessa inkluderar en tagg för rening och oftast andra sekvenser också, många med en funktion som vi inte kunde identifiera.

Ta itu med dessa begränsningar, genererade vi ett nytt fusionsprotein baserat på musen MOG extracellulära domänen fusionerad till en tagg som innehåller tioredoxin att bekämpa den kända olösligheten av MOG-protein 5. Markörsekvensen innehåller även en 6xHis-sekvens för rening och en TEV-proteas cleAvage webbplats som gör det möjligt att fullständigt avlägsnande av alla taggsekvenser, om så önskas. Detta är den enda metod som vi är medvetna om att generera ren MOG 1-125 protein. För att underlätta produktion av stora mängder protein, den MOG 1-125 sekvensen kodon-optimerad för bakteriell expression och MOG tagg fusionsproteinet sattes in i pET-32 expressionssystem. Här beskriver vi i detalj protokollet för att producera och rena MOG tag protein och ren MOG 1-125, med användning av icke-specialiserad utrustning som finns tillgänglig för de flesta immunologi laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Protein Induktion

OBS: I följande steg, BL21 Escherichia coli bakterier transformerade med en Pet-32 vektor innehållande sekvensen för MOG tag fusionsprotein (se referens 5 och Figur 1) odlas till höga densiteter och därefter induceras att uttrycka MOG tag proteinet . Se figur 2 för den totala tidslinjen - Observera att dagarna är ungefärliga och alternativa stoppställen noteras i protokollet. Om börjar med renat pET-32 MOG tag vektor-DNA, kommer det att bli nödvändigt att kemiskt omvandla det till kompetenta BL21 E. coli-bakterier med användning av ampicillinselektion, såsom har väl beskrivits 9. Framgångsrik transformation kan bekräftas genom att rena DNA från utvalda bakterier med en vanlig kommersiell kit, följt av klyvning med restriktionsenzymema Age1 och Sac1 att producera en 424 bp band på en agarosgel 10.

    tagg glycerolförråd och inkubera över natten vid 37 ° C, 200 rpm.
  1. Placera två 1 L Erlenmeyer-kolvar innehållande 500 ml sterilt LB-buljong i en 37 ° C inkubator i förberedelse för nästa dag.
  2. Tillsätt 500 | il av 100 mg / ml ampicillin till vardera av de kolvar innehållande 500 ml LB från steg 1,2 (slutkoncentration 0,1 mg / ml ampicillin). Överför 1 ml av den över natten odlade kulturen från steg 1,1 till vardera av de två kolvar med LB-buljong. Inkubera vid 37 ° C och 200 rpm under 5 h eller upp till en optisk densitet av 0,6.
  3. Ta en 1 ml alikvot från en av kolvarna och överföra den till en separat 1,5 ml centrifugrör. Pelletera cellerna vid 16.000 xg under 1 min och avlägsna supernatanten. Märk röret som T 0 (pre-induktion) och sedan lägga den bakteriella pelleten i ett -20 ° C frys för framtida natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) analys (se avsnitt 8 och Figur 3).
  4. Tillsätt 0,5 ml av 1 M isopropil- β-D-1-tiogalaktopyranosid, isopropyl β-D-tiogalaktosid (IPTG) till varje odlingskolv. Inkubera kolvar vid 37 ° C, 200 rpm under 4 h, därefter vid rumstemperatur vid 75 varv per minut över natten.

2. Skörde MOG tagg Protein

OBS: I det här skedet, bakterierna kommer att ha producerat stora mängder MOG tag protein. Att skörda MOG tagg, är bakterier först lyseras i en Triton X-100-buffert följt av sonikering. MOG taggen frigörs sedan från inklusionskroppar och denaturerat med imidazol och guanidin, vilket resulterar i en råproteinlösning innehållande det MOG taggen proteinet.

  1. Ta en 1 ml alikvot från en av de nattgamla kulturer från steg 1,5 och överföra den till en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Pelletera cellerna vid 16.000 xg under 1 min och avlägsna supernatanten. Märk badkarete T O / N (post-induktion) sätter sedan den bakteriella pelleten i ett -20 ° C frys för framtida SDS PAGE-analys (Figur 3).
  2. Fördela kulturerna jämnt mellan 250 ml flaskor som är kompatibla med höghastighetscentrifugering och hålla dessa på is från denna punkt framåt. Pelletera de bakteriella cellerna vid 22.000 xg under 15 min vid 4 ° C.
  3. Kassera supernatanten. Förvara bakteriella pellets vid -20 ° C eller fortsätta till steg 2,4.
  4. Förbered lyseringsbuffert (0,1 mg / ml hönsägglysozym, 0,1% Triton-X (volym / volym) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) genom att tillsätta 60 | il Triton X-100 och 120 | il av 50 mg / ml hönsägglysozym stamlösning till 60 ml PBS.
  5. Resuspendera och kombinera alla de bakteriella pellets från steg 2,3 i totalt 30 ml lysbuffert. Överför denna volym till en rundbottnad 50 ml tub kan höghastighetscentrifugering. Placera detta rör i en 30 ° C vattenbad i 30 min. Under inkubationstiden, skaka rörettvå gånger för att återsuspendera cellerna.
  6. Efter inkuberingen överföra röret på is och sonikera lösningen vid 20 kHz, amplitud 70%, puls på 3 sek, puls av 3 sek, och fem pulser per runda. Sonikera lösningen för totalt sex omgångar och låt lösningen svalna på is i-mellan omgångarna.
  7. Centrifugera lösningen vid 24.000 xg under 15 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten och upprepa steg 2,5-2,7 gång. Lagra pelleten vid -20 ° C eller fortsätta till steg 2,8.
  8. Förbereda buffert A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, pH 7,9) genom tillsats av 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCl, och 0,01021 g imidazol till en 100 ml bägare. Lägg H2O tills volymen nått 28 ml sedan justera lösningens pH till 7,9. Sedan överför lösningen till en 100 ml graderad cylinder och tillsätt H2O tills volymen är 30 ml.
  9. Suspendera pelleten från steg 2,7 i 30 ml buffert A och inkubera denna lösning vid 4 ° C under 3 h. Under denna tidVäg upp 17,2 g av guanidin-HCl.
  10. Sonikera lösningen på is med samma inställningar som i steg 2,6. Tillsätt sedan 17,2 g guanidin-HCl till lösningen. Inkubera detta på is under en timme för att lösa den MOG tag proteinet.
  11. Centrifugera lösningen vid 24.000 xg under 30 min vid 4 ° C. Samla upp supernatanten och lagra supernatanten vid 4 ° C tills proteinrening.

3. Protein Purification

OBS: I följande steg i MOG tag proteinet renas genom 4 omgångar av absorption på laddade nickel harts (via His-tag) och eluering.

  1. Gör följande buffertar:
    1. Förbereda Buffert B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, 6 M guanidin-HCl, pH 7,9). Lägga 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 0,0681 g imidazol, och 114,64 g guanidin-HCl till en 500 ml bägare. Tillsätt sedan H2O tills den når 190 ml och reglera pH till 7,9. Överföra solenution till en 250 ml graderad cylinder och tillsätt H2O tills volymen är 200 ml.
    2. Förbereda elueringsbuffert (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazol, 6 M guanidin-HCl, pH 7,9). Lägga 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g imidazol, och 114,64 g guanidin-HCl till en 500 ml bägare. Lägga H2O tills den når 190 ml och reglera pH till 7,9. Överför lösningen till en 250 ml graderad cylinder och tillsätt H2O tills volymen är 200 ml.
    3. Förbereda Strip-buffert (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Lägga 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA till en 500 ml bägare. Lägga H2O tills den når 190 ml och justera pH till 7,9. Överför lösningen till en 250 ml graderad cylinder och tillsätt H2O tills volymen är 200 ml.
    4. Förbered Charge-buffert (0,1 M nickelsulfat). Lägga 5,257 g nickelsulfat till en 500 ml bägare och tillsätt H2O tills den når 190 ml (FÖRSIKTIGHET, inte hanterar nickelsulfat utanför ett dragskåp till dess att nickelsulfat har lösts i H2O). När väl nickelsulfat har lösts upp, överför lösningen till en 250 ml graderad cylinder och tillsätt H2O tills volymen nått 200 ml.
  2. Split 10 ml av nickel harts mellan två koniska 50 ml centrifugrör kan motstå centrifugalkrafter över 4500 xg (5 ml i varje rör).
  3. Ladda och balansera nickel harts:
    1. Tvätta hartset genom att tillsätta 40 ml H2O till varje rör innehållande harts. Lägga rören horisontellt på en vippa och låt dem agitera under 5 minuter vid 4 ° C. När sökningen är klar, centrifugera rören vid 4500 xg under 8 minuter vid 4 ° C.
    2. Kassera supernatanten genom pipettering för att undvika att störa pelleten. Tillsätt 40 ml laddningsbuffert till varje rör. Överför rören till en vippa och låt dem agitera under 15 minuter vid 4 ° C. När sökningen är klar, centrifugera rören vid 4500 xg under 8 minuter vid 4 ° C.
  4. Valfritt: Ta 150 pl av det solubiliserade proteinet samlas i steg 2,11 och överföra den till en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Märk röret som pre-inkubation och frysa detta vid -20 ° C för framtida SDS PAGE-analys (Figur 3, Crude MOG tagg).
  5. Rena MOG tag Protein:
    1. Överföra hela volymen av solubiliserat protein från steg 2,11 (~ 40 ml, minus det litet prov avlägsnades i steg 3.4) till det första röret (figur 2, rör 1) innehållande nickel-harts från steg 3,3, blanda och placera horisontellt på en vippa vid 4 ° C under 1 timme.
    2. Centrifugera röret vid 4500 xg under 8 minuter vid 4 ° C. När du är klar, överföra supernatanten till den andrarör (figur 2, rör 2) av nickel harts och inkubera enligt beskrivningen i det föregående steget. Under tiden fortsätter med steg 3 till 6 nedan med röret 1.
    3. Resuspendera nickel harts i röret 1 i 40 ml elueringsbuffert och placera röret horisontellt på en rocker vid 4 ° C under 5 min. Därefter centrifugera röret vid 4500 xg under 8 minuter vid 4 ° C.
    4. Överför supernatanten innehållande eluerade MOG tag protein i en 250 ml flaska märkt "renat MOG tag protein och hålla denna flaska vid 4 ° C. Med varje elueringssteg, pool den resulterande supernatanten i denna flaska.
    5. Tillsätt 40 ml av bandbuffert till nickel hartset och placera horisontellt på en vippa under 5 minuter vid 4 ° C.
    6. Centrifugera röret vid 4500 xg under 8 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten, sedan ladda nickel harts som anges i steg 3,3.
    7. När du är klar, gå vidare med det andra röret som anges i steg 3,5. Totalt fyra rundas absorption av det solubiliserade proteinet från steg 2,11 på den laddade nickel harts och eluering kommer att återhämta det mesta av proteinet även, om så önskas, ytterligare protein kan utvinnas i ytterligare omgångar av absorption och eluering.
  6. När fyra (eller fler) rundor av absorption och eluering är färdig lagrar poolade renade proteinet vid 4 ° C över natten. Nickel harts kan lagras i 40 ml av en 20% etanollösning vid 4 ° C tills den behövs igen.

4. Mätning Proteinkoncentration

OBS: Innan vi går vidare är det nödvändigt att kvantifiera mängden renat MOG tagg-protein som genereras i avsnitt 3. Detta värde kommer att användas för att bestämma den slutliga volymen för att koncentrera proteinet till vid slutet av protokollet. Vi beskriver en standard Bradford Assay här. Koncentrationen av renat MOG taggen protein bestäms genom att jämföra den spektrala absorbansen hos seriellt diluted MOG tagg-protein med en standardkurva av bovint serumalbumin (BSA) vid en känd koncentration.

  1. Göra 10x acetatbuffert genom tillsats av 23 ml isättika till 8,2 g natriumacetat i en tre liter bägare och tillsätt sedan 1,9 L av H2O för upplösning av natriumacetat. Överför denna lösning till en 2 L graderad cylinder och tillsätt H2O tills volymen nått två L. lagra Då i en 2 L flaska vid rumstemperatur. Göra 1 ml 1x acetatbuffert genom tillsats av 100 ul av 10x acetatbuffert till 900 | j, l H2O
  2. Ställa in en 96-brunnsplatta för utspädningar genom att tillsätta 30 pl 1 x acetatbuffert till brunnar G2-8 och 60 | j, l till G9. Lägg 48 pl 1x acetatbuffert till H2 och H3.
  3. Ställ in den första serieutspädning av BSA standard i rad G enligt följande: Lägg till 216 pl 1x acetatbuffert och 54 ul av kommersiellt tillgänglig 2 mg / ml BSA standard väl G1 och blanda väl. Lägg 210 ul från väl G1 väl G2, blanda väl,och sedan lägga till 180 pl väl G2 väl G3. Tillsätt 150 mikroliter av väl G3 väl G4, blanda väl, och fortsätta denna trend att lägga 30 ul färre till varje efterföljande bra tills väl G8. (Se tabell 1 för en förteckning över motsvarande utspädningsfaktorer).
  4. Inrättat trippelprover av varje spädning genom att överföra 10 | il väl G1 till brunnar A1, B1 och C1, och 10 | il av väl G2 till brunnarna A2, B2 och C2, och så vidare. Använd en flerkanalspipett.
  5. För att ställa in utspädningar av MOG tag, tillsätt 60 pl renat MOG tag protein från steg 3,6 till väl H1. Tillsätt 12 pl från väl H1 väl H2, blanda väl, tillsätt sedan 12 pl väl H2 väl H3, blanda väl (detta ger en 1x utspädning i H1, 1/5 utspädning i H2, och 1/25 utspädning i H3) .
  6. Inrättat trippelprover för MOG tagg utspädningar genom att överföra 10 | il av brunnar H1-H3 till raderna D, E, och F, som beskrivs i steg 4,4.
  7. Blanda 2 ml proteinanalys färgämnereagenskoncentrat med 8 ml H2O Tillsätt 200 pl av denna blandning till alla förinstallerade brunnar i raderna A, B, C, D, E, och F, med hjälp av en flerkanalspipett, om sådana finns. Pop några bubblor i brunnarna med hjälp av en nål innan behandlingen proteinkoncentrationen.
  8. Inom 10 min av tillsats av färgreagens, mät 595 nm absorbans av samtliga brunnar i raderna A, B, C, D, E, och F.
  9. Använd raderna A, B och C för att ställa in en standardkurva där positionerna 1-9 motsvarar 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05, och 0 mg / ml BSA. Baserat på denna kurva, beräkna koncentrationen av MOG-tagg-protein med användning av utspädning av MOG tagg som bäst passar standardkurvan. Vanligtvis kommer det att finnas 200 till 250 mg av MOG-tagg-protein från en liter bakteriekultur med användning av det protokoll som beskrivs här.
    OBS: För att göra MOG 1-125 vidare härifrån till valfritt avsnitt 7 anges i slutet av protokollet. Annars fortsätter till avsnitt 5.

OBS: Dialys utförs för att gradvis avlägsna guanidin från lösningen innehållande renade, denaturerad MOG taggen för att göra det möjligt för proteinet att återveckas. Man måste vara försiktig under detta steg som MOG själv är mycket olöslig, och medan detta förbättras genom närvaron av thioredoxin tag, är det fortfarande en benägenhet att komma ut ur lösningen. Därför återveckning bör utföras stegvis och vid en relativt låg MOG tagg koncentration.

  1. Innan du börjar dialys, späd det renade MOG tag protein med buffert B (buffert B kan göras som anges i steg 3,1) tills koncentrationen är 0,5 mg / ml eller mindre, baserat på mängden MOG tag beräknas i avsnitt 4.
  2. Klippa ungefär 30 cm av ormskinn dialysrör och säkra en ände med en låsande hemostat genom att vika änden på ormskinn mer än tre gånger och kläm den vikta änden med hemostat. Fylla ormskinn med utspäddMOG tag-protein (mellan 60 till 90 ml av MOG-tagg-protein per rör) och sedan ta bort luftbubblor från ormskinn genom att tvinga dem ut ur den öppna änden. Slutligen, täta den andra änden av röret med användning av en andra låsnings hemostat.
  3. Upprepa steg 5,2 för att fylla ytterligare sektioner av dialysrör tills all MOG tagg-protein har överförts till ormskinn dialysrör. Se till att det inte finns några läckor.
  4. Göra 1x acetat med 4 M guanidin genom att väga upp 382,12 g guanidin-HCl och tillsätta 100 ml av 10x acetatbuffert som gjorts i steg 4,1 till en 2 liter bägare. Lägg 0,5 L av H2O till bägaren och låta guanidin-HCl för att lösa upp. När löst, överför lösningen till en 1 L graderad cylinder och tillsätt H2O tills volymen nått en L. Upprepa detta recept för varje 2 snakeskins som krävs.
  5. Utför dialys enligt följande: Fyll en stor hink (minst 10 L) med ett L 1x acetatbuffert med 4 M guanidin från steg 5,4. Placera upp to 2 delar av dialysrör innehållande MOG tag i hinken, lämnar utrymme för en magnetisk omrörarstav att snurra obehindrat i botten. Sätt skopan i en 4 ° C rum på en magnetisk omrörningsplatta och slå på den till en långsam rotationshastighet (dvs. inte hög, precis tillräckligt för att flytta vätska):
    OBS: Utför följande steg för att gradvis minska mängden guanidin i bufferten. Stir tider ges som minimum, men kan lämnas över natten. Dialys tar minst 3 dagar, men det kan förlängas om så önskas. Kontrollera regelbundet för att se till att slangen är hel och att ändarna är ordentligt stängda.
    1. Låt skopan sitta och rör om under 4-5 h.
    2. Lägg 1 L av 1x acetatbuffert (100 ml 10x acetatbuffert och 900 ml H2O) till varje hink.
    3. Upprepa steg 5.5.1 och 5.5.2 totalt 3 gånger för totalt fyra L buffert i hinken.
    4. Kassera hälften av bufferten i hinken och fyll på med ett L av 1x acetatbuffert (100 ml 10x acetatbuffert och 900 ml H2O, ingen guanidin) och ställa in slangen och omrörare.
    5. Upprepa steg en gång 5.5.1 och 5.5.2 (dvs. tills det finns totalt fyra L buffert i skopan).
    6. Slutligen, ersätta hela 4 L volym i hinken med 4 liter färsk 1x acetatbuffert och låt rör för 4-5 timmar. För bästa resultat, gör detta steg på dagen för proteinkoncentrationen.
    7. Försiktigt bort dialysrör med återveckad MOG tag och kasta hink buffert.

6. Koncentrera MOG tagg Protein

OBS: I det sista steget, är vikbar MOG tag protein koncentrerad till arbetsutspädning för förvaring. Som MOG taggen är mycket olöslig, bör det inte överstiga 5 mg / ml. Denna koncentration är ungefär ekvimolär med 0,4 mg / ml MOG 35-55-peptiden, som vanligtvis används för att inducera EAE i möss (blandade 1: 1 med fullständigt Freunds adjuvant (CFA)). I anrikningsprocessen är det inte ovanligt att en liten mängd protein att komma ut ur lösningen i form av vit fällning. Överdriven nederbörd är ett problem, dock.

  1. Beräkna den slutliga önskade volymen för att uppnå en MOG tag koncentration av 5 mg / ml, baserat på det värde som beräknas i avsnitt 4.
  2. Linje en kastrull med aluminiumfolie och täcka aluminiumfolien med polyetylenglykol (PEG) 3350 och PEG 8000 vid en 1: 1-förhållande. PEG 3350 införlivas i denna blandning, eftersom det kan bidra till att förhindra proteinaggregering under koncentrering och är ett effektivt cyropreservative 11.
  3. Sätt ormskinn slang (med MOG tag protein inne) på toppen av aluminiumfolie och täck med PEG 8000. Låt denna sitta vid rumstemperatur och kontrollera volymen regelbundet tills volymen är lika med eller lägre än den beräknade slutvolym (beräknat i steg 6,1), kommer den faktiska volymen mätas i nästa steg. Om pannan blirövermättad med vatten i anrikningsprocessen, skapa en ny panna med aluminiumfolie och PEG 3350 och PEG 8000.
  4. Tvätta utsidan av snakeskins med H2O och överför MOG taggen proteinet till en separat glasflaska med användning av en serologisk pipett. Hålla reda på volymen som proteinet överförs för att säkerställa att volymen är korrekt.
    1. Om volymen har minskat under den beräknade slutvolym, lägga 1x acetatbuffert tills önskad volym uppnåtts. Om volymen är över den uppskattade slutvolym, överföra MOG taggen proteinet tillbaka in i dialysslangen och fortsätta koncentrationen (steg 6,2-6,3).
    2. Distribuera MOG taggen proteinet bland 1,5 ml rör (0,5 ml per rör), förvara rören vid -80 ° C tills de behövdes. För att inducera EAE, blanda denna volym 1: 1 med CFA.
  5. Köra en SDS PAGE-gel för att bekräfta uttrycket av MOG taggprotein med användning av de prover som tagits i steg 1.4, 2,1, 3,4, och det renade MOG proteinet från steg 6,4.

7. Generera MOG 1-125 från MOG tag Använda TEV proteas (tillval)

OBS: Denna valfria steget fortsätter från slutet av steg 4. Om MOG 1-125 utan extra taggsekvenser krävs kan taggsekvenser tas bort med hjälp TEV-proteas (Figur 4). Så vitt vi känner till, finns det ingen annan expressionssystem med förmåga att generera ren MOG 1-125. Det bör dock noteras att utan thioredoxin tag, MOG 1-125 är mycket olösligt och detta kan orsaka problem under rening och hantering, och av denna anledning att ta bort etiketten om det är absolut nödvändigt för experimentella skäl. Flera steg krävs för att generera ren MOG 1-125. MOG taggen först dialyseras i TEV-proteas-klyvningsbuffert. Efter digestion med TEV-proteas, volymen reduceras till stöd med senare rening steps, dialyserades sedan i buffert B, och sedan His-tag som innehåller markörsekvensen avlägsnas med användning av nickel-harts. Slutligen, är protein kvantifieras och ren MOG 1-125 koncentreras till den slutliga koncentrationen.

  1. Göra en yl 10X TEV klyvningsbuffert (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA) genom att tillsätta 1,861 g EDTA, 44,4 g Tris-HCl, och 26,5 g Tris till en 2 liter bägare. Lägg H2O tills volymen nått 990 ml sedan justera pH till 8 för att upplösa EDTA. Överför lösningen till en 1 L graderad cylinder och bringa volymen upp till 1 L med användning av H2O
  2. Späd MOG tagg-protein från steg 3,6-0,5 mg / ml med användning av buffert B (samma buffert som beskrivits i steg 3,1), baserad på mängden av protein som beräknas i avsnitt 4. Överför 120 ml utspätt MOG tagg-protein till ormskinn dialysrör såsom beskrivits i steg 5.2 till 5.3. Volymen kan skalas upp dock mängden TEV-proteas som krävs för att klyva alla av MOG-taggen proteinet kommer att vara substantial.
  3. Följ dialysprotokoll som anges i steg 5,5, utom ersätta 10x acetatbuffert med 10x TEV klyvningsbuffert i steg 7,1.
  4. Överför MOG tag, nu i TEV klyvnings buffert, till en ny 250 ml glasflaska och övervaka den ökade volymen från dialys. Tillsätt 1 pl β-merkaptoetanol per varje 2,85 ml MOG tag protein tillsätts till flaskan. Lägg till minst 1 mg TEV proteas (lager TEV lösning vid 5 mg / ml) för varje 50 mg av MOG tag protein (TEV-proteas kan tillsättas upp till en 1:10 TEV: MOG proteinhalt) och inkubera vid rumstemperatur, skyddas från ljus i minst 72 timmar.
    OBS: Vid slutet av TEV-proteas inkubation bör vita fällningar ses på botten av glasflaska.
  5. Innan överföring av proteinet till dialysrör, tillsätt guanidin-HCl till lösningen tills proteinerna upplösa att förhindra att proteinet faller ut från att fastna på glasflaskan. Överföra 150 pldenna lösning till en 1,5 ml mikrocentrifugrör och märka röret som "MOG med TEV". Lagra lösningen vid -20 ° C för framtida SDS-PAGE-analys.
  6. Överför all vätska från steg 7,5 till dialysrör som anges i steg 5.2 till 5.3. Fylla en stor hink med 2 L av H2O och placera dialysröret in i skopan. Inkubera detta vid 4 ° C med ljus omröring över natten. Detta steg är viktigt för att späda ut den guanidin för att tillåta proteinkoncentrationen att inträffa snabbt och för att börja avlägsna EDTA från lösningen som kommer att störa proteinrening.
  7. Koncentrera proteinet i dialysslangen enligt förteckningen i steg 6,2-6,3 (utom endast använda PEG 8000) så att den slutliga volymen av lösningen är ~ 40 ml. Tvätta dialysrör med H2O och avlägsna eventuellt kvarvarande PEG 8000 fortfarande fäst till slangen. Denna minskning i volym gör det möjligt att montera alla av den digererade proteinet in i ett 50 ml rör innehållande nickel resynd, som beskrivs i steg 3,5.
  8. Dialysera Diger protein till buffert B:
    1. Fylla en stor hink med ett L av buffert B (29,22 g NaCl, 3,152 g Tris-HCl, 0,3405 g Imidazol, 573,18 g guanidin-HCl, pH 7,9).
    2. Placera snakeskins innehållande digere protein från steg 7.7 i hinken tillsammans med en omrörningsmagnet (såsom beskrivs mer i detalj i steg 5,5). Sätt skopan i en 4 ° C kallt rum på en omrörningsplatta inställd på en långsam uppståndelse och låta snakeskins att dialysera för fem eller mer hr.
    3. Töm skopan och fylla den med ytterligare 1 liter buffert B och låt detta sitta i 4 ° C kallt rum på en omrörningsplatta inställd på en långsam uppståndelse och låta snakeskins att dialysera för fem eller mer h.
  9. Utför rening av MOG 1-125 proteinet som beskrivs i avsnitt 3, med den viktiga skillnaden att de kluvna taggsekvenser kommer att vara bunden av nickel harts, lämnar MOG 1-125 i lösning. Återigen kommer 4 omgångar av rening varautföras på samma volym, men i detta fall är målet att förbättra renhet, snarare än att återvinna så mycket protein som möjligt. Se figur 4.
    1. Gör proteinreningsbuffertar som anges i steg 3,1
    2. Debitera båda rören av nickel-harts såsom beskrivs i steg 3,3.
    3. Rena MOG 1-125 av det protokoll som beskrivs i steg 3,5, med den väsentliga skillnaden att eluatet från nickel harts innehållande taggen kasseras (hålla 150 | il av eluatet i en 1,5 ml mikrocentrifugrör för framtida SDS-PAGE-analys), medan lösningen innehållande MOG 1-125 behålls som den slutliga produkten.
  10. Mäta koncentrationen av MOG 1-125 Protein som beskrivs i avsnitt 4:
    1. Ställ upp BSA standard förtunningar som beskrivs i steg 4.2 och 4.4.
    2. Ställ upp utspädningar av MOG 1-125 som beskrivs i steg 4,5 och 4,6. Alternativt kan det vara värdefullt att generera ett större utbudav utspädningar (1x, 1/2, 1/4 och 1/8, till exempel). Justera volymerna av 1x acetatbuffert och MOG 1-125 i enlighet därmed.
    3. Utför Bradford analys som beskrivs i steg från 4,7 till 4,9 och beräkna mängden MOG 1-125 genereras. Den förväntade avkastningen är ca 4 mg eller mer protein.
  11. Vik MOG 1-125 genom gradvis avveckling av guanidin via dialys, som beskrivs i avsnitt 5.
  12. Koncentrera MOG 1-125 protein som beskrivs i avsnitt 6. Den slutliga koncentrationen bör vara 2,24 mg / ml, vilket är ekvimolär till 5 mg / ml MOG tag.

8. SDS-PAGE gel för att bekräfta MOG tag Produktion och renhet

OBS: Prov tas från steg 1,4, 2,1, 3,4, och 6,4 analyseras genom standard SDS-PAGE för att bekräfta MOG tag produktion och renhet. Detta steg bör utföras efter den slutliga reningen av antingen MOG tag eller MOG 1-125.

    <li> Gör en 2x SDS-PAGE-laddningsbuffert genom att tillsätta 1,576 g av Tris-HCl till 2 ml H2O och ställ in pH till 6,8. Lägg 0,4 g SDS i Tris-HCl-lösning och sedan lägga till H2O tills volymen nått 7 ml.
  1. Lägg 0,2 g bromfenolblått till 10 ml H2O tillsätt sedan 1 ml av denna till lösningen i steg 8,1. Slutligen, tillsätt 2 ml glycerol för att avsluta 2x SDS-PAGE-laddningsbuffert. När du lagrar denna lösning, hålla vid 4 ° C och skydda den mot ljus i upp till 3 månader.
  2. Tina frusna portioner av bakterier från steg 1,4 och 2,1 samt solubiliserade MOG tag protein från steg 3,4 och 6,4 vid rumstemperatur.
  3. Avlägsna salterna från de lösningar som samlats in i steg 3.4 och 6.4 genom att tillsätta 60 fil av varje protein avsaltningskolonner. Rena de proteiner följande tillverkarens instruktioner.
  4. Tillsätt 20 mikroliter av β-merkapto-etanol till 1 ml av lösningen i steg 8,2. Tillsätt 40 pl av denna till två bacUNDERLAG pellets från steg 8,3 och 60 mikroliter till den avsaltade proteinerna från steg 8,4 och inkubera dessa vid 95 ° C under 10 minuter.
  5. Göra 1x SDS sida rinnande buffert genom att väga upp 5 g Tris, 28,8 g glycin och 1 g SDS. Lägg till dessa till en 1 liter bägare och tillsätt 500 ml H2O för att lösa allt. När löst, överför lösningen till en 1 L graderad cylinder och fyll med H2O tills volymen nått en L.
  6. Ställa in en 12% polyakrylamidgel i en gelapparat sedan lägga till 1x SDS-PAGE löpbufferten till gelén apparaten så att löpbufferten är precis ovanför toppen av brunnarna i gelén. Tvätta brunnarna hos gelén genom att pipettera 50 ul av löpbufferten i brunnarna fem gånger vardera.
  7. Belastning 10 pl av protein stege i den första brunnen och tillsätt 10 pl av kokt lösningar från steg 8,5 till separata brunnar. Kör gelen vid 115 V under 60 min.
  8. Ta gelen från apparaten och överföra den till en liten behållare. Fylla container med 100 ml ren H2O och överföra behållaren till en långsamt roterande plattform under 8 min. Efter 8 min, dumpa vatten och tvätta gelén ytterligare två gånger med H2O
  9. Dumpa H2O från behållaren och tillsätt 100 ml snabb fläck reagens till behållaren. Låt detta att sitta på en långsamt roterande plattform över natten, täck med aluminiumfolie.
  10. Dumpa snabba fläcken reagens och tillsätt ca 100 ml H2O till behållaren. Tillåta detta att sitta på en roterande plattform under 8 min. Dumpa H2O och upprepa H2O tvätt två gånger.
  11. Bild gelén med användning av en avbildnings för Coomassie blue fläckar. Leta efter ett band runt 31,86 kDa (MOG tag protein) och ett svagare band vid 63,72 kDa (MOG tag dimerer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När reningen är klar prover i steg 1,4, 2,1, 3,4, och den slutliga produkten från steg 6,4 bör köras på en proteingel (figur 3A). MOG taggen ska först visas som en kDa band i T O / N prov 31,86, men inte t 0, och bör vara det enda bandet i den slutliga ren produkt. För att testa om MOG tag proteinet har rätt vikt, kan MOG tag proteinet användas för att märka MOG-proteinspecifika B-celler genom FACS. Genom märkning mus lymfocyter med en 1: 1000-spädning av MOG-taggen tillsammans med en sekundär antikropp riktad mot His-taggen och en fluorescensmärkt tertiär anti-lgG1-antikropp, kan MOG-specifika B-celler identifieras (Figur 3B). Alternativt kan MOG tagg vara direkt konjugerade till fluoroforer för att minska bakgrundsfärgning (erhållna från B-celler som binder till de sekundära och tertiära antikroppar) sombeskrivas med hänvisning 5 att identifiera MOG specifika B-celler. Detta är nödvändigt när man försöker identifiera MOG bindande B-celler i möss av vildtyp, eftersom dessa celler är normalt mycket sällsynt 5. IgH MOG möss har en tung kedja knockin att när det paras ihop med en lämplig kappa lätt kedja, ger specificitet för MOG. Eftersom bindningen av MOG tag förstärks bland de IgH MOG B-celler, bekräftar detta att detta protokoll genererar en korrekt veckad antigen. Viktigt är IgH MOG B-celler bidrar till autoimmun patologi i modeller av MOG-riktade EAE 12, bekräftar att MOG tag inducerar både T och B-cellsautoimmunitet.

Innan du börjar dialys för att återvecka proteinet som beskrivs i avsnitt 5, är det nödvändigt att mäta proteinkoncentrationen med hjälp av en Bradford-analys, som beskrivs i avsnitt 4. Representativa resultat av en Bradford-analys visas i tabell 1 figur 5.

Generering av ren MOG 1-125 åstadkommes genom tillsats av TEV-proteas till MOG taggprotein slutligen resulterar i klyvningen av MOG taggen proteinet in MOG 1-125 och tagg-sekvensen som visas i Figur 6. Efterföljande nickelharts rening avlägsnar MOG tagg, tag-sekvens, och TEV-proteas föroreningar i slutänden resulterar i ren MOG 1-125 såsom visas i figur 6.

Figur 1
Figur 1: MOG tag protein (Duplicated här med tillstånd från Dang et al 5..).. Linjär struktur, och aminosyra- och DNA-sekvenser enligt MOG tagg fusionsproteinet. DNA-sekvensen för den extracellulära domänen av mus MOG (MOG1-125, lägre sekvens i blått) till kodon-optimerad för uttryck i bakterier (svart). Denna sekvens syntetiserades och infogades i en vektor för att skapa en N-terminal fusion till en tagg som innehåller tioredoxin och en S-Tag att motverka den kända olöslighet MOG proteinet 13,14, samt en 6x His-markör för rening 15. En TEV proteas klyvningsstället skiljer MOG 1-125 från taggsekvenser. TEV-klyvning mellan glutamin-164 och glycin-165 med hjälp av en alternativ konsensus TEV klyvningsstället 16 resulterar i avlägsnande av alla icke-MOG aminosyror. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Översikt över de åtgärder som krävs för att producera ren MOG tag protein till.generera MOG tag protein, är bakterier som uttrycker MOG tag proteinet vuxit till höga densiteter sedan inducerade att uttrycka MOG tag med hjälp av IPTG som anges i avsnitt 1. Efter en över natten kultur, bakterierna lyseras och genom en serie av pellete steg proteinfraktion innehållande inklusionskroppar, som innehåller MOG tag, utvinns som anges i avsnitt 2. MOG tag sedan renas från den råa proteinfraktionen genom fyra cykler av absorption på laddade nickel harts och eluering av MOG taggen protein som anges i avsnitt 3. En del av den sammanslagna eluatet tas sedan till en Bradford-analys för att bestämma utbytet av MOG tag protein och resten av eluatet dialyseras i acetatbuffert under loppet av flera dagar som anges i avsnitt 4 och 5. Slutligen proteinet koncentreras användning av PEG 3350 och PEG 8000 till en slutlig koncentration av 5 mg / ml, baserat på utbytet av MOG tagg bestäms i BRadford analys som anges i avsnitt 6. Hela processen kan ta minst 10 dagar, med start dag för varje steg anges inom parentes. Men alternativa stoppa och starta punkter som anges i protokollet, och steg kan spridas över en större mängd tid om så önskas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Rening av MOG tag protein och bedömning av sin verksamhet (A) Visas är proteinprover som samlades in från olika punkter över förfarandet proteinrening och körs på en SDS-PAGE-gel. T 0 = BL21 bakterier före proteininduktion (samlas i steg 1,4), T O / N = BL21 bakterier efter induktion av proteinuttryck (samlasi steg 2,1), rå MOG tag = Solubiliserat MOG tag proteinet före proteinrening (samlas i steg 3,4), ren MOG tag = MOG tag protein efter rening (samlas i steg 6,4). (B) Bindning av MOG taggen protein till CD19 pos CD4 neg naiva B-celler från lymfkörtlar från antingen vildtyp C57BL / 6-möss eller IgH MOG möss som uttrycker en tung immunglobulinkedja specifik för MOG protein 7,17 bedömdes med användning av flödescytometri . MOG tagg -specifika B-celler identifierades genom färgning lymfnodceller med MOG tagg följt av en sekundär anti-his-märkning antikropp och en fluorescerande tertiär anti-lgG1-antikropp. Färgning av celler från C57BL / 6 eller IgH MOG möss visas tillsammans med en MOG tag fluorescens minus ett (FMO) kontroll fläck av IgH MOG celler. Vänligen cslicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Översikt över stegen för att generera MOG 1-125 från MOG tag protein. Efter uppsamling av MOG tag eluatet som beskrivs i steg 3,5 i protokollet, är MOG tag proteinet dialys i TEV proteas klyvning buffert. När dialysen är fullbordad, TEV-proteas sattes till MOG taggen lösning resulterar i klyvningen av MOG-taggen i MOG 1-125 proteinet. Volymen av klyvningslösningen reduceras sedan och dialyserades in i buffert B före proteinrening. Föroreningar från klyvningslösningen extraheras genom fyra på varandra följande rundor av absorption på laddade nickel harts och eluering av föroreningar i slutänden resulterar i en lösning av ren MOG < sub> 1-125. Koncentrationen av MOG 1-125 protein bestäms genom en Bradford-analys och proteinet viks under loppet av flera dagar genom dialys. När dialys är klar, är MOG 1-125 proteinet koncentrerades till 2,24 mg / ml med hjälp av PEG 3350 och PEG 8000. Detta protokoll diskuteras i detalj i avsnitt 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Exempel på en Bradford-analys standardkurva för bestämning av koncentrationen av MOG-tagg protein. BSA standard avläsningar från tabell 1 avsattes för att erhålla en linjär regressionsformel för beräkning av MOG taggen koncentration baserad på den optiska densiteten vid 595 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6:. TEV klyvning av MOG-tagg-protein och efterföljande rening av MOG 1-125 Man visar proteinprover kördes på en SDS-PAGE-gel demonstrerar reningen av MOG 1-125 Ren MOG tag = MOG tag proteinet före TEV klyvning (uppsamlas. i steg 6,4), MOG tag w / TEV = Protein fraktion som samlades efter 72 timmar av inkubation av MOG tag med TEV-proteas (samlas i steg 7,5), Eluering = Proteinfraktion fraktion~~POS=HEADCOMP som förblev bunden till nickel harts under MOG 1- 125 reningsprotokoll (samlas i steg 7,9), ren MOG 1-125 = MOG1-125 protein efter rening (samlas i steg 7,12). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

BSA (mg / ml) 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
1,079 0,998 0,948 0,853 0,769 0,699 0,583 0,493 0,373
1,071 1,014 0,95 0,854 0,777 0,681 0,579 0,484 0,375
1,069 1,017 0,944 0,848 0,781 0,592 0,494 0,374
MOG tagg utspädning 1 05/01 25/01
1,327 1,013 0,493
1,332 1,063 0,491
1,367 1,088 0,488

Tabell 1: Representativa värden från en Bradford-analys för att bestämma koncentrationen av MOG-taggen protein BSA dilu.tioner på kända koncentrationer används för att bestämma standardkurvan visas i Figur 5. De utspädningar av MOG-tagg-protein efterrening används för att bestämma den slutliga MOG taggen proteinkoncentration. Raderna innehåller den optiska densiteten mäts vid 595 nm och varje rad representerar en kopia av totalt 3 replikat vid varje avlästa koncentrationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här har vi beskrivit ett protokoll för produktion av MOG tag protein och hur man skapar ren MOG 1-125 från MOG tag proteinet. Detta protokoll är baserad både på standard His-tagg baserade proteinreningsmetoder, liksom tidigare beskrivna protokollet för generering av en äldre MOG-baserade protein 15. Även om det inte beskrivs här, är den primära användningen av MOG tag protein för att inducera EAE genom immunisering med proteinantigen. Ett protokoll som beskriver hur EAE induceras i möss, som är kompatibel med MOG tag proteinet kan återfinnas i referens 3. Vi har tidigare visat att immunisering med MOG-tagg eller MOG 1-125 härledd från MOG tagg inducerar inte bara CNS autoimmun sjukdom med större ryggmärgsinflammation och demyelinisering jämfört med standard MOG 35-55 peptid, men också att patogena IgH MOG B-celler thainte igen MOG-proteinet aktiveras för att producera en germinal center svar som svar på MOG-tagg eller MOG 1-125, men inte till MOG 35-55 5. Därför immunisering med MOG tag visserligen inducerar en lämplig anti-MOG B-cellssvar.

MOG tag proteinet renas genom absorption på laddade nickel harts (via His-tag) och eluering. På grund av den stora mängd protein som alstras i de föregående stegen, finns flera omgångar av absorption och eluering som krävs för att samla in det mesta av proteinet. Vi har funnit att åtminstone 4 rundor krävs för att isolera huvuddelen av protein om användning av en lämplig volym av harts för 50 ml rör. Om så önskas kan det protokoll skalas upp för att använda fler eller större rör och mer nickel harts för att minska antalet omgångar av absorption. Alternativt, kan högupplösande vätskekromatografi (HPLC) med nickelkolonner effektivt rena His-märkta proteiner 18 </ sup> och faktiskt har vi funnit att HPLC effektivt kan rena MOG tag protein (opublicerade observationer). Eftersom HPLC är inte tillgänglig för många standard immunologi labb är det protokoll som visas här avsedd att utföras med hjälp av vanlig laboratorieutrustning. Förutom hans-taggen rening gör MOG tag protein innehåller en S-tagg som är kompatibel med S-tag reningsprotokoll om så önskas 14.

Rekombinanta proteiner baserade på MOG (mestadels från människa eller råtta) har beskrivits tidigare åtta. Dessa baserades på äldre uttryckssystem som sedan har ersatts av system som drivs av starkare transkriptionspromotorer som kan producera större mängder av protein i Escherichia coli-bakterier. Vår MOG tag expressionssystem använder effektivt T7-promotorn i pET-32a (+) vektor, som är betydligt effektivare än system som finns i egen produktion av MOG protein 19. Men är dethould noteras att MOG taggen protein som beskrivs här baseras på mus MOG. Immunisering med humant MOG-protein har visat sig inducera EAE hos möss som har olika funktioner jämfört med sjukdom inducerad med hjälp av murin MOG 8. Vidare kan råtta MOG vara mer immunogent än mus MOG i möss i vissa fall 20. Därför, för några experimentsyfte mus-baserade MOG taggen inte kan vara perfekt. Vi är i färd med att skapa flera olika versioner av MOG tag protein än kan passa vissa syften bättre och reningsprotokollet som beskrivs här fungerar för alla dessa. Under tiden är det möjligt att reningsprotokollet som beskrivs här kan fungera för andra MOG expressionssystem, eller till och med andra proteiner, så länge de innehåller en 6x His-markör för absorption nickel harts. Men utan thioredoxin tag, kan lösligheten av MOG protein vid högre koncentrationer vara ett problem, och naturligtvis kommer det inte att vara möjligt att ge nerate ren MOG 1-125 eftersom detta är unik för MOG taggsystem.

Mätning av MOG tag proteinkoncentrationen före proteinveckning via dialys är avgörande för framgången av detta reningsprotokoll. Om koncentrationen är för hög, kan proteinet aggregera och falla ut ur lösningen i stället för vikning till enskilda proteiner. Detta kan ses under dialysprotokoll som vit fällning formning vid botten av dialysslangen. Om detta sker, upplösa MOG taggen proteinet igen med 6 M guanidin och mäta proteinkoncentrationen. Späd proteinet till 0,5 mg / ml sedan börja dialys igen som inga fällningar bör bildas vid 0,5 mg / ml. För MOG 1-125 kan fällningar förväntas bilda som proteinet är mycket olösligt. Vi har funnit att detta inte kommer att påverka veckningen av MOG 1-125, förutsatt att proteinet var tillräckligt spädas före dialys.

nt "> För TEV proteas att effektivt klyva MOG tag protein i ren MOG 1-125 är det viktigt att använda en tillräcklig mängd TEV proteas. Äldre versioner av TEV proteaser inaktiveras genom självklyvning 21 men modernare versioner lider olöslighet ger 22 därför är det viktigt att lägga tillräckligt med TEV proteas att uppnå tillräcklig klyvning av MOG tag proteinet innan TEV proteas inaktivering. eftersom kommersiellt tillgängliga TEV proteas kan bli kostsamt, rekommenderar vi att producera och rening TEV proteas som beskrivits i referens 22. Vid användning av ren mus MOG 1-125 protein för experiment, är det viktigt att notera att proteinet är mycket olösligt och kan fällas ut ur lösning, och därför måste blandas utförligt före användning.

Sammanfattningsvis, här har vi beskrivit ett enkelt protokoll för att producera och rena stora mängder av MOG tag protein. Furthermmalm, tillsats av en TEV-proteas-klyvningsställe till vår MOG tagg-protein ger möjlighet att generera ren MOG 1-125 om det behövs. MOG tag protein känns igen och binds av anti-myelin autoimmuna B-celler och MOG tag inducerad EAE innehåller B-cell-medierad patologi 5. Därför vinner MOG tag protein de största hindren som begränsar den utbredda användningen av proteinantigen för att inducera EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372, (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7, (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142, (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70, (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171, (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10, (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153, (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6, (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188, (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77, (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278, (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87, (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14, (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55, (1), 53-68 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics