Enkel og effektiv produktion og oprensning af Mouse Myelin oligodendrocyt Glycoprotein for Eksperimentel Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

MS er en human sygdom karakteriseret ved kronisk inflammation og neurodegeneration af CNS, som menes at være drevet af en autoimmun reaktion rettet mod myelin. Tabet af myelin og axoner over tid resultere i gradvis nedgang af kognitiv og motorisk funktion 1. "Experimental Autoimmune Encephalomyelitis" er en samlebetegnelse for dyremodeller for autoimmun sygdom rettet mod CNS myelin. Som menneskelige MS, er EAE typisk kendetegnet ved immun celle infiltration af CNS og i nogle tilfælde, demyelinisering 2. Men i hvilken grad en given EAE model ligner human MS delvis afhænger af art eller stamme anvendes, og af kompleksiteten af ​​den underliggende anti-myelin autoimmun reaktion.

Anti-myelin autoimmunitet kan eksperimentelt induceret på flere måder, men den mest almindelige metode i dag er at immunisere mus med et kort peptid af aminosyrer efterligner den immunodominante CD4 35-55), som anvendes til at inducere EAE i C57BL / 6-mus 3. For nogle eksperimentelle formål er det imidlertid ønskeligt eller endog nødvendigt at immunisere med større proteinantigener og faktisk er der flere fordele ved denne end immunisering med kort peptid. Første på grund af MHC-restriktion, korte peptider er sædvanligvis kun effektive i et meget begrænset udvalg af stammer, mens større proteinantigener repræsenterer enten hele proteinet eller et bestemt domæne kan behandles normalt til præsentation i flere indavlede musestammer eller endog i forskellige arter fire. Sekund, et større protein-antigen er i stand til at inducere en mere kompleks immunrespons inkorporerer flere typer af lymfocytter i antigengenkendelse, snarere end limiting antigengenkendelse til CD4 + T-celler. For eksempel B-celler via deres B-celle receptor (BCR) interagere direkte med hele snarere end forarbejdet protein. Vi og andre har vist, at B-celler aktiveres af MOG 35-55 immunisering ikke anerkender MOG protein 5. Da B-celler for nylig blev påvist at spille en patogen rolle i human MS 6, EAE-modeller, der inkorporerer B-celler i autoimmune patologi er stadig vigtigere.

Trods fordelene ved at anvende større proteinantigener at inducere EAE, er der stadig nogle kommercielt tilgængelige kilder for sådanne proteiner. For selv korte peptider som MOG 35-55 kan syntetiseres meget hurtigt og til en relativt lav pris, de kommercielle muligheder for MOG protein er begrænsede, og omkostningerne væsentligt mere at købe. Ikke desto mindre er der flere ekspressionsvektorer til rådighed for forskergrupper til at generere MOG ekstracellulære domæne (MOG 1-125) selv. However, alle de ekspressionssystemer, som vi har identificeret i litteraturen er baseret på ældre teknologier, der siden er blevet erstattet med mere effektive ekspressionssystemer 7. Endvidere er de fleste er baseret på rotte- eller human MOG 8. For nogle undersøgelser af autoimmunitet i mus, et antigen baseret på musen MOG autoantigenet foretrækkes. Endelig har alle MOG-baserede proteiner, som vi har identificeret, enten kommercielle eller som ekspressionsvektorer, er fusionsproteiner indeholdende yderligere aminosyrer til MOG 1-125 basen. Disse omfatter et tag til oprensning og sædvanligvis andre sekvenser samt, hvoraf mange med en funktion vi ikke kunne identificere.

For at løse disse begrænsninger, genereret vi en hidtil ukendt fusionsprotein baseret på musen MOG ekstracellulære domæne fusioneret til et mærke indeholdende thioredoxin at bekæmpe den kendte uopløselighed MOG protein 5. Tag-sekvensen indeholder også en 6xHis sekvens for oprensning og en TEV protease cleavage site, der muliggør fuldstændig fjernelse af alle tag-sekvenserne, hvis det ønskes. Dette er den eneste metode, som vi er opmærksomme på at generere ren MOG 1-125 protein. For at lette produktionen af store mængder protein, det MOG 1-125 sekvensen blev kodon-optimeret til bakteriel ekspression og MOG tag fusionsproteinet blev indsat i pET-32 ekspressionssystem. Her beskriver vi i detaljer protokollen til at producere og rense MOG tag protein, og ren MOG 1-125, ved hjælp af ikke-specialiseret udstyr til rådighed for de fleste immunologi laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Protein Induktion

BEMÆRK: I de følgende trin, BL21 Escherichia coli-bakterier transformeret med en PET-32 vektor, der indeholder sekvensen for MOG tag fusionsproteinet (se reference 5 og figur 1) dyrkes til høje tætheder og derefter induceret til at udtrykke MOG tag protein . Se figur 2 for den samlede tidslinje - bemærk, at dagen er omtrentlige og alternative stop-punkter er noteret i protokollen. Hvis man starter med renset pET-32 MOG tag vektor-DNA, vil det være nødvendigt at kemisk omdanne det til kompetent BL21 E. coli-bakterier under anvendelse af ampicillin udvælgelse, som det er blevet velbeskrevet 9. Vellykket transformation kan bekræftes ved oprensning af DNA fra udvalgte bakterier under anvendelse af et standard kommercielt kit, efterfulgt af fordøjelse med restriktionsenzymerne alder1 og SAC1 at frembringe en 424 bp bånd på en agarosegel 10.

    tag glycerolstamme og inkuberes natten over ved 37 ° C, 200 rpm.
  1. Placer to 1 L Erlenmeyer-kolber indeholdende 500 ml sterilt LB-bouillon i et 37 ° C inkubator i forberedelse til den næste dag.
  2. Der tilsættes 500 pi 100 mg / ml ampicillin til hver af kolberne indeholdende 500 ml LB fra trin 1.2 (slutkoncentration 0,1 mg / ml ampicillin). Overfør 1 ml af natten over kultur fra trin 1.1 til hver af de to kolber med LB-bouillon. Der inkuberes ved 37 ° C og 200 rpm i 5 timer eller op til en optisk densitet på 0,6.
  3. Tag en 1 ml prøve fra en af ​​kolberne og overføre den til et separat 1,5 ml centrifugerør. Pelletere cellerne ved 16.000 xg i 1 min og fjern supernatanten. Mærk røret som T 0 (præ-induktion) og derefter sætte den bakterielle pellet i en -20 ° C fryser for fremtidig natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) analyse (se afsnit 8 og figur 3).
  4. Tilsæt 0,5 ml 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid, Isopropyl β-D-thiogalactosid (IPTG) til hver dyrkningskolbe. Inkuber kolber ved 37 ° C, 200 rpm i 4 timer, derefter ved stuetemperatur ved 75 rpm natten over.

2. Høst MOG tag Protein

BEMÆRK: I denne fase, at bakterierne vil have produceret store mængder af MOG tag protein. At høste MOG tag, er bakterier først lyseret i en Triton X-100-puffer efterfulgt af lydbehandling. MOG tag frigives derefter fra inklusionslegemer og denatureret med imidazol og guanidin, hvilket resulterer i et råprotein opløsning indeholdende MOG tag proteinet.

  1. Tag en 1 ml prøve fra en af ​​de overnatskulturer fra trin 1.5 og overføre den til en 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pelletere cellerne ved 16.000 xg i 1 min og fjern supernatanten. Label karbade T O / N (post-induktion) og derefter sætte den bakterielle pellet i en -20 ° C fryser for fremtidig SDS PAGE-analyse (figur 3).
  2. Fordel kulturerne jævnt blandt 250 ml flasker er kompatible med høj hastighed centrifugering og holde disse på is fra dette punkt fremad. Pelletere bakterielle celler ved 22.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
  3. Supernatanten kasseres. Opbevar bakterielle pellets ved -20 ° C eller fortsætte til trin 2.4.
  4. Forbered lysisbuffer (0,1 mg / ml hønseæg lysozym, 0,1% Triton-X (v / v) i phosphatbufret saltvand (PBS)) ved tilsætning af 60 pi Triton X-100 og 120 pi 50 mg / ml lysozym fra hønseæg stamopløsning til 60 ml PBS.
  5. Resuspender og kombinere alle de bakterielle pellets fra trin 2.3 i alt 30 ml lysisbuffer. Overfør denne mængde til en rund bund 50 ml rør i stand til høj hastighed centrifugering. Anbring dette rør i et 30 ° C vandbad i 30 min. Under inkubationen tid, ryste røretto gange for at resuspendere cellerne.
  6. Efter inkubationen overføres røret på is og lydbehandling opløsningen ved 20 kHz, amplitude 70%, puls på 3 sek, puls off 3 sek, og fem pulser per runde. Sonikeres løsningen for seks totale runder og lad opløsningen køle på is i-mellem runder.
  7. Centrifugeres opløsningen ved 24.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og gentag trin 2,5-2,7 gang. Opbevar pellet ved -20 ° C eller fortsætte til trin 2.8.
  8. Forbered puffer A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, 5 mM imidazol, pH 7,9) ved tilsætning af 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCI, og 0,01021 g imidazol til et 100 ml bægerglas. Tilføj H2O indtil volumenet når 28 ml derefter justere opløsningens pH til 7,9. Derefter overføres opløsningen til en 100 ml måleglas og tilsæt H2O indtil volumen er 30 ml.
  9. Resuspender pellet fra trin 2.7 i 30 ml puffer A og inkuberes denne opløsning ved 4 ° C i 3 timer. I løbet af denne tidafvejes 17,2 g guanidin-HCI.
  10. Sonikeres opløsningen på is under anvendelse af de samme indstillinger som i trin 2.6. Tilsæt derefter 17,2 g guanidin-HCI til opløsningen. Inkuber dette på is i 1 time for at opløse MOG tag proteinet.
  11. Centrifugeres opløsningen ved 24.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Opsaml supernatanten og Supernatanten opbevares ved 4 ° C indtil proteinoprensning.

3. Protein Purification

BEMÆRK: I de følgende trin i MOG tag protein vil blive renset gennem 4 runder af absorption på ladet nikkel harpiks (via His-tag) og eluering.

  1. Foretag følgende Buffere:
    1. Forbered puffer B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, 5 mM imidazol, 6 M guanidin-HCI, pH 7,9). Tilføj 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCI, 0,0681 g imidazol, og 114,64 g guanidin-HCI til et 500 ml bægerglas. Tilsæt derefter H2O, indtil den når 190 ml og pH indstilles til 7,9. Overfør solenution til en 250 ml måleglas og tilsæt H2O indtil volumen er 200 ml.
    2. Forbered Elution buffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, 0,5 M imidazol, 6 M guanidin-HCI, pH 7,9). Tilføj 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g imidazol, og 114,64 g guanidin-HCI til en 500 ml bægerglas. Tilføj H2O, indtil den når 190 ml og pH indstilles til 7,9. Opløsningen overføres til en 250 ml måleglas og tilsæt H2O indtil volumen er 200 ml.
    3. Forbered Strip puffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, 100 mM EDTA, pH 7,9). Tilføj 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCI, 40 ml 500 mM EDTA til en 500 ml bægerglas. Tilføj H2O, indtil den når 190 ml og pH indstilles til 7,9. Opløsningen overføres til en 250 ml måleglas og tilsæt H2O indtil volumen er 200 ml.
    4. Forbered Charge puffer (0,1 M nikkelsulfat). Tilføj 5,257 g nikkel sulfat til et 500 ml bægerglas og tilsæt H2O, indtil den når 190 ml (ADVARSEL, ikke håndtere nikkelsulfat uden for et stinkskab, indtil nikkelsulfat er blevet opløst i H2O). Når nikkel sulfat er opløst, overføres opløsningen til en 250 ml måleglas og tilsæt H2O indtil volumen når 200 ml.
  2. Split 10 ml nikkel harpiks mellem to koniske 50 ml centrifugerør stand til at modstå centrifugalkræfter, 4.500 xg (5 ml i hvert rør).
  3. Oplad og tempereres nikkel harpiks:
    1. Resinen vaskes ved at tilsætte 40 ml H2O til hvert rør indeholdende harpiks. Lægge rørene horisontalt på en rocker og lad dem agitere i 5 minutter ved 4 ° C. Når færdig, centrifugeres rørene ved 4.500 xg i 8 minutter ved 4 ° C.
    2. Kassér supernatanten ved pipettering at undgå at forstyrre bundfaldet. Tilsæt 40 ​​ml ladning buffer til hvert rør. Overfør rørene på en rocker og lad dem agitere i 15 minutter ved 4 ° C. Når færdig, centrifugeres rørene ved 4.500 xg i 8 minutter ved 4 ° C.
  4. Valgfrit: Tag 150 ul af opløste protein indsamlet i trin 2.11 og overføre det til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Mærk røret som præ-inkubering og fryse dette ved -20 ° C til fremtidig SDS PAGE-analyse (figur 3, Crude MOG tag).
  5. Oprens MOG tag Protein:
    1. Overfør hele mængden af opløst protein fra trin 2.11 (~ 40 ml, minus den lille prøve fjernet i trin 3.4) til det første rør (figur 2, rør 1), der indeholder nikkel harpiks fra trin 3.3, mix, og placere horisontalt på en rocker ved 4 ° C i 1 time.
    2. Centrifugeres røret ved 4.500 xg i 8 minutter ved 4 ° C. Når færdig, overføre supernatanten til den andenrør (figur 2, røret 2) af nikkel harpiks og inkuberes som beskrevet i det foregående trin. I mellemtiden fortsætter med trin 3 til 6 nedenfor med rør 1.
    3. Resuspender nikkel harpiks i røret 1 i 40 ml elueringsbuffer, og glasset anbringes vandret på en rocker ved 4 ° C i 5 min. Derefter centrifugeres røret ved 4.500 xg i 8 minutter ved 4 ° C.
    4. Overfør supernatanten indeholdende eluerede MOG tag protein i en 250 ml flaske mærket "oprenset MOG tag protein 'og holde denne flaske ved 4 ° C. Med hvert elueringstrin, pool den resulterende supernatant i denne flaske.
    5. Tilsæt 40 ​​ml strimmel puffer til nikkel harpiks og placere horisontalt på en rocker i 5 min ved 4 ° C.
    6. Centrifugeres røret ved 4.500 xg i 8 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og derefter genoplade nikkel harpiks som anført i trin 3.3.
    7. Når færdig, gå videre med det andet rør som anført i trin 3.5. I alt 4 rundes fra absorption af det opløste protein fra trin 2.11 onto opladet nikkel harpiks og eluering vil genvinde det meste af proteinet selv, om ønsket, yderligere protein kunne udvindes i yderligere runder af absorption og eluering.
  6. Når fire (eller flere) runder af absorption og eluering er afsluttet, opbevares den poolede oprenset protein ved 4 ° C natten over. Nikkel harpiks kan opbevares i 40 ml af en ethanolopløsning på 20% ved 4 ° C indtil det er nødvendigt igen.

4. Måling Proteinkoncentration

BEMÆRK: Før der fortsættes yderligere, er det nødvendigt at kvantificere mængden af oprenset MOG tag protein genereret i afsnit 3. Denne værdi vil blive anvendt til at bestemme det endelige volumen til at koncentrere proteinet til ved afslutningen af protokollen. Vi beskriver en standard Bradford assay her. Koncentrationen af oprenset MOG tag protein bestemmes ved at sammenligne den absorbansskala serielt diluted MOG tag protein til en standardkurve for bovint serumalbumin (BSA) ved en kendt koncentration.

  1. Gør 10x acetatpuffer ved tilsætning 23 ml iseddike til 8,2 g natriumacetat i et 3 liters bægerglas og derefter tilføje 1,9 liter H2O for at opløse natriumacetat. Opløsningen overføres til en 2 L måleglas og tilsæt H2O indtil volumen når 2 L. Så gemme det i en 2 L flaske ved stuetemperatur. Foretag 1 ml 1x acetatpuffer ved tilsætning af 100 pi 10x acetatpuffer til 900 pi H 2 O.
  2. Opsæt en 96-brønds plade til fortyndinger ved tilsætning 30 pi 1x acetatpuffer til brønde G2-8 og 60 pi til G9. Tilføj 48 pi 1x acetatpuffer til H2 og H3.
  3. Indstil start- seriel fortynding af BSA standarden i række G som følger: Tilføj 216 pi 1x acetatbuffer og 54 pi kommercielt tilgængelig 2 mg / ml BSA standard i godt G1 og bland grundigt. Tilføj 210 pi fra godt G1 til godt G2, bland grundigt,og derefter tilføje 180 ul godt G2 til godt G3. Tilsæt 150 pi godt G3 til godt G4, bland grundigt, og fortsætte denne tendens med at tilføje 30 pi færre til hver efterfølgende godt indtil godt G8. (Se tabel 1 for lister over tilsvarende fortyndingsfaktorer).
  4. Oprettet tredobbelte prøver af hver fortynding ved at overføre 10 pi godt G1 til hul A1, B1 og C1, og 10 pi godt G2 til brønde A2, B2 og C2, og så videre. Brug en multikanalpipette.
  5. At oprette fortyndinger af MOG tag, tilføje 60 ul renset MOG tag protein fra trin 3,6 til godt H1. Tilføj 12 pi fra godt H1 til godt H2, bland grundigt, tilsæt derefter 12 ul godt H2 til godt H3, bland grundigt (dette giver en 1x fortynding i H1, 1/5 fortynding i 2. halvår, og 1/25 fortynding i H3) .
  6. Oprettet tredobbelte prøver for MOG tag fortyndinger ved at overføre 10 pi af brønde H1-H3 til rækkerne D, E og F, som beskrevet i trin 4.4.
  7. Bland 2 ml proteinassay farvestofreagens koncentrat med 8 ml H2O Tilsæt 200 pi af denne blanding til alle forudindlæste brønde i række A, B, C, D, E og F, under anvendelse af en multikanalpipette, hvis de er tilgængelige. Pop eventuelle bobler i brøndene ved hjælp af en nål, før du læser protein koncentration.
  8. Inden for 10 min af tilsætning af farvereagens, måle 595 nm absorbansen af ​​alle brønde i række A, B, C, D, E og F.
  9. Brug Rækker A, B, og C til at oprette en standardkurve, hvor positionerne 1-9 svarer til 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 og 0 mg / ml BSA. Baseret på denne kurve, beregnes koncentrationen af MOG tag protein ved hjælp af fortynding af MOG tag, der passer bedst til standardkurven. Normalt vil der være 200 til 250 mg MOG tag protein fra 1 liter bakteriekultur under anvendelse af protokollen beskrevet her.
    BEMÆRK: For at gøre MOG 1-125 videre herfra til den valgfrie sektion 7 anført i slutningen af protokollen. Ellers fortsæt til afsnit 5.

BEMÆRK: Dialyse udføres for gradvis at fjerne guanidin fra opløsningen som indeholder renset, denatureret MOG tag for at tillade proteinet at refolde. Der skal udvises forsigtighed under dette trin som MOG selv er meget uopløselig, og mens dette er forbedret ved tilstedeværelsen af ​​thioredoxin tag, er det stadig tilbøjelige til at komme ud af opløsning. Derfor bør udføres gradvist refoldning og til en relativt lav koncentration MOG tag.

  1. Før du starter dialyse, fortyndes renset MOG tag protein med buffer B (buffer B kan foretages som anført i trin 3.1), indtil koncentrationen er 0,5 mg / ml eller mindre, baseret på mængden af MOG tag beregnet i afsnit 4.
  2. Skåret ca. 30 cm af slangeskind dialyserør og fastgør den ene ende med en låsende hæmostat ved at folde enden af ​​slangeskind over tre gange og fastspænde foldede ende med arterieklemmen. Fyld slangeskind med fortyndetMOG tag protein (mellem 60 til 90 ml MOG tag protein pr rør) derefter fjerne luftbobler fra slangeskind ved at tvinge dem ud af den åbne ende. Endelig forsegle den anden ende af røret under anvendelse af en anden låsning hæmostat.
  3. Gentag trin 5.2 for at fylde yderligere afsnit af dialyserør indtil alle MOG tag protein er blevet overført til slangeskind dialyse slangen. Sørg der ikke er utætheder.
  4. Gør 1x acetat med 4 M guanidin ved at afveje 382,12 g guanidin-HCI og tilsætte 100 ml 10x acetatbuffer fremstillet i trin 4.1 til en 2 liters bægerglas. Tilsæt 0,5 l H2O til bægerglasset og tillade guanidin-HCI for at opløse. Når opløst, overføres opløsningen til en 1 L måleglas og tilsæt H2O, indtil lydstyrken når 1 L. Gentag denne opskrift for hver 2 snakeskins, der er nødvendige.
  5. Udfør dialyse som følger: fylde en stor spand (minimum 10 L) med en l 1x acetat buffer med 4 M guanidin fra trin 5.4. Placer op to 2 sektioner af dialyserør indeholdende MOG tag i spanden, efterlader plads til en magnetisk omrører til spin uhindret i bunden. Sæt spanden i et 4 ° C værelse på en magnetomrører plade og tænde den til en langsom rotation sats (dvs. ikke høj, lige nok til at flytte væske):
    BEMÆRK: Udfør følgende trin for at gradvist at reducere mængden af ​​guanidin i bufferen. Stir gange er givet som minima, men kan stå natten over. Dialyse vil tage mindst 3 dage, men dette kan udvides, hvis det ønskes. Kontrollér regelmæssigt for at sikre, at slangen er intakt, og at enderne er forsvarligt lukket.
    1. Lad spanden sidde og omrør i 4-5 timer.
    2. Tilsæt 1 l 1x acetatpuffer (100 ml 10x acetatpuffer og 900 ml H2O) til hver spand.
    3. Gentag trin 5.5.1 og 5.5.2 i alt 3 gange for i alt 4 l puffer i spanden.
    4. Kassér halvdelen af ​​bufferen i spanden og fyld med 1 I 1x acetatpuffer (100 ml 10x acetat buffer og 900 ml H2O, ingen guanidin) og oprette slangen og omrører.
    5. Gentag trin 5.5.1 og 5.5.2 én gang (dvs. indtil der er i alt 4 liter buffer i spanden).
    6. Endelig udskifte hele 4 L volumen i spanden med 4 l frisk 1x acetatpuffer og omrørt i 4-5 timer. For de bedste resultater, gøre dette skridt på dagen for koncentrationen protein.
    7. Fjern forsigtigt dialyse slangen med refoldet MOG tag og kassér spand buffer.

6. Koncentrere MOG tag Protein

BEMÆRK: I det sidste trin, refoldes MOG tag protein koncentreret til den fortynding til opbevaring. Som MOG tag er meget uopløselig, bør den ikke overstige 5 mg / ml. Denne koncentration er ca. ækvimolær med 0,4 mg / ml MOG 35-55 peptid, som er almindeligt anvendt til at inducere EAE i mus (blandet 1: 1 med komplet Freunds adjuvant (CFA)). Under koncentreringen proces er det ikke ualmindeligt, at en lille mængde protein til at komme ud af opløsningen i form af hvide bundfald. Overdreven nedbør er et problem, dog.

  1. Beregn den endelige ønskede volumen for at opnå en MOG tag koncentration på 5 mg / ml, baseret på værdien beregnet i afsnit 4.
  2. Linje en gryde med aluminiumsfolie og dækker aluminiumfolien med polyethylenglycol (PEG) 3350 og PEG 8000 i et 1: 1 forhold. PEG 3350 er indarbejdet i denne blanding, da det kan hjælpe med at forhindre protein aggregering under koncentration og er en effektiv cyropreservative 11.
  3. Sæt slangeskind slangen (med MOG tag protein inde) oven på aluminiumfolie og dække med PEG 8000. Lad denne stå ved stuetemperatur og kontrollere størrelsen regelmæssigt indtil volumenet er lig med eller under den estimerede slutvolumen (beregnet i trin 6.1), vil den faktiske volumen måles i det næste trin. Hvis panden bliverovermættet med vand under koncentrationen processen, oprette en ny gryde med aluminiumsfolie og PEG 3350 og PEG 8000.
  4. Vask ydersiden af snakeskins med H2O og overføre MOG tag protein til en separat glasflaske under anvendelse af en serologisk pipette. Hold styr på volumen som proteinet overføres til sikre volumen er korrekt.
    1. Hvis lydstyrken er blevet reduceret under den anslåede endelige volumen, tilføjer 1x acetatbuffer, indtil den ønskede mængde er nået. Hvis lydstyrken er over den anslåede endelige volumen, overføre MOG tag protein tilbage i dialyse slanger og fortsætte koncentrationen (trin 6,2-6,3).
    2. Fordel MOG tag protein blandt 1,5 ml rør (0,5 ml pr rør), gemme rørene ved -80 ° C indtil brug. For at fremkalde EAE, bland dette bind 1: 1 med CFA.
  5. Kør en SDS PAGE-gel for at bekræfte ekspressionen af MOG tag protein under anvendelse af de udtagne prøver trin 1.4, 2,1, 3,4, og det oprensede MOG protein fra trin 6.4.

7. Generering MOG 1-125 fra MOG tag Brug TEV Protease (valgfri)

BEMÆRK: Denne valgfrie trin fortsætter fra afslutningen af trin 4. Hvis MOG 1-125 uden ekstra tag-sekvenserne er påkrævet, kan de tag-sekvenserne fjernes med TEV-protease (figur 4). Så vidt vi ved, er der ingen andre ekspressionssystem kan generere ren MOG 1-125. Imidlertid bør det bemærkes, at uden thioredoxin tag, MOG 1-125 er meget tungtopløseligt, og dette kan give problemer under oprensning og håndtering, og derfor fjerne mærket hvis det er absolut nødvendigt til forsøg grunde. Der kræves flere trin til at generere ren MOG 1-125. MOG tag er først dialyseret i TEV proteasespaltning buffer. Efter fordøjelse med TEV protease, er lydstyrken reduceret til støtte med senere rensning steps, derefter dialyseret i buffer B, og derefter His-mærket indeholdende tag-sekvens fjernes ved anvendelse af nikkel harpiks. Endelig protein kvantificeres og ren MOG 1-125 koncentreres til slutkoncentrationen.

  1. Lav 1 liter 10x TEV spaltning buffer (500 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA) ved tilsætning 1,861 g EDTA, 44,4 g Tris-HCI og 26,5 g Tris til en 2 liters bægerglas. Tilføj H2O indtil volumen når 990 ml derefter justere pH til 8 for at opløse EDTA. Opløsningen overføres til en 1 L måleglas og bringe lydstyrken op til 1 L ved hjælp H2O
  2. Fortynd MOG tag protein fra trin 3,6-0,5 mg / ml med buffer B (den samme buffer beskrevet i trin 3.1), baseret på mængden af protein beregnet i afsnit 4. Overfør 120 ml fortyndet MOG tag protein til slangeskind dialyse slangen, som beskrevet i trin 5.2 til 5.3. Volumenet kan skaleres op men mængden af TEV-protease nødvendig for at spalte alle de MOG tag protein være substantial.
  3. Følg dialyse protokol anført i trin 5.5, bortset erstatte 10x acetatpuffer med 10x TEV-spaltning buffer foretaget i trin 7.1.
  4. Overfør MOG tag, nu i TEV-spaltning buffer, til en ny 250 ml glasflaske og overvåge den øgede mængde fra dialyse. Tilsæt 1 pi β-mercaptoethanol pr hver 2,85 ml MOG tag protein tilsat til flasken. Tilsæt mindst 1 mg TEV protease (stock TEV opløsning ved 5 mg / ml) i hver 50 mg af MOG tag protein (TEV protease kan tilsættes op til en 1:10 TEV: MOG protein-forhold), og der inkuberes ved stuetemperatur, beskyttet mod lys i mindst 72 timer.
    BEMÆRK: I slutningen af ​​TEV-protease inkubation bør hvide bundfald ses i bunden af ​​glasset flaske.
  5. Før overførsel af proteinet til dialyserør, tilsæt guanidin-HCI til opløsningen, indtil proteinerne opløses for at forhindre proteinet præcipiterer klistrer til glasflaske. Overfør 150 uldenne løsning til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og mærke røret som "MOG med TEV". opløsningen ved -20 ° C for fremtidig SDS-PAGE analyse lagre.
  6. Overfør hele af fluidet fra trin 7.5 i dialyserør som anført i trin 5.2 til 5.3. Fyld en stor spand med 2 I H2O og placere dialyserøret i spanden. Inkuber dette ved 4 ° C med let omrøring natten over. Dette trin er vigtigt at fortynde den guanidin at tillade proteinkoncentration at forekomme hurtigt og til at begynde at fjerne EDTA fra den løsning, der vil forstyrre proteinoprensning.
  7. Koncentrer proteinet i dialyserøret som anført i trin 6.2 til 6,3 (undtagen kun bruge PEG 8000), således at det endelige volumen af ​​opløsningen er ~ 40 ml. Vask dialyserøret med H2O og fjerne eventuelle PEG 8000 stadig fastgjort til slangen. Denne reduktion i volumen gør det muligt at passe alle de fordøjede protein i et 50 ml rør indeholdende nikkel resynd, som beskrevet i trin 3.5.
  8. Dialysere det fordøjede protein til buffer B:
    1. Fyld en stor spand med 1 I buffer B (29,22 g NaCl, 3,152 g Tris-HCI, 0,3405 g imidazol, 573,18 g guanidin-HCI, pH 7,9).
    2. Placer snakeskins indeholdende fordøjet protein fra trin 7.7 i spanden sammen med en omrører magnet (som beskrevet mere detaljeret i trin 5.5). Sæt spanden ind i en 4 ° C koldt rum på en røre plade indstillet til en langsom opsigt og lade snakeskins at dialyse i 5 eller flere timer.
    3. Tøm spanden og fyld det med en anden 1 l buffer B og lad det sidde i 4 ° C koldt rum på en røre plade indstillet til en langsom opsigt og lade snakeskins at dialyse i 5 eller flere h.
  9. Udfør rensning af MOG 1-125 protein som beskrevet i afsnit 3, med den vigtige forskel, at de spaltede tag sekvenser vil blive bundet af nikkel harpiks, efterlader MOG 1-125 i opløsning. Igen vil 4 runder oprensning væreudført på det samme volumen, men i dette tilfælde er målet at forbedre renheden, snarere end at inddrive så meget protein som muligt. Se figur 4.
    1. Foretag proteinrensningskonstruktionen buffere anført i trin 3.1
    2. Oplade begge rør af nikkel harpiks som beskrevet i trin 3.3.
    3. Oprens MOG 1-125 af protokollen beskrevet i trin 3.5, med den væsentlige undtagelse, at eluatet fra nikkel harpiks indeholdende tag kasseres (holde 150 pi af eluatet i et 1,5 ml mikrocentrifugerør til fremtidig SDS-PAGE analyse), mens opløsningen indeholdende MOG 1-125 bevares, så slutproduktet.
  10. Måle koncentrationen af MOG 1-125 protein som beskrevet i afsnit 4:
    1. Opsætning af BSA standard kurve fortyndinger som beskrevet i trin 4.2 og 4.4.
    2. Opsætning af fortyndinger af MOG 1-125 som beskrevet i trin 4.5 og 4.6. Alternativt kan det være værdifuldt at generere et større intervalfortyndinger (1x, 1/2, 1/4 og 1/8, for eksempel). Juster volumener 1x acetatpuffer og MOG 1-125 overensstemmelse hermed.
    3. Udfør Bradford assay som beskrevet i trin 4.7 til 4.9 og beregne mængden af MOG 1-125 genereret. Det forventede afkast er cirka 4 mg eller mere protein.
  11. Foldes igen MOG 1-125 ved gradvis fjernelse af guanidin via dialyse, som beskrevet i afsnit 5.
  12. Koncentrat MOG 1-125 protein som beskrevet i afsnit 6. Slutkoncentrationen bør være 2,24 mg / ml, som er ækvimolær til 5 mg / ml MOG tag.

8. SDS-PAGE-gel til Bekræft MOG tag Produktion og Renhed

BEMÆRK: Prøver taget fra trin 1.4, 2.1, 3.4, og 6.4 analyseres ved standard SDS-PAGE for at bekræfte MOG tag produktion og renhed. Dette trin bør udføres efter den endelige oprensning af enten MOG tag eller MOG 1-125.

    <li> Lav en 2x SDS-PAGE loading buffer ved at tilsætte 1,576 g Tris-HCI til 2 ml H2O og indstil pH til 6,8. Tilføj 0,4 g SDS i Tris-HCI-opløsning og derefter tilføje H2O indtil volumenet når 7 ml.
  1. Tilsæt 0,2 g bromphenolblåt til 10 ml H2O derefter tilsættes 1 ml af denne til opløsningen fremstillet i trin 8.1. Endelig tilsættes 2 ml glycerol at afslutte 2x SDS-PAGE loading buffer. Ved opbevaring denne opløsning holde ved 4 ° C og beskytte den mod lys i op til 3 måneder.
  2. Optø frosne alikvoter af bakterier fra trin 1.4 og 2.1 samt den solubiliserede MOG tag protein fra trin 3.4 og 6.4 ved stuetemperatur.
  3. Fjern saltene fra de løsninger, der er indsamlet i trin 3.4 og 6.4 ved tilsætning 60 pi af hver til protein afsaltningssøjler. Oprense proteiner efter producentens anvisninger.
  4. Tilsæt 20 pi β-mercapto-ethanol til 1 ml af opløsningen fremstillet i trin 8.2. Tilsæt 40 ​​pi af denne til to bacrielle piller fra trin 8.3 og 60 pi til afsaltet proteiner fra trin 8.4 og inkuber disse ved 95 ° C i 10 min.
  5. Gør 1x SDS side løbebufferen ved at afveje 5 g Tris, 28,8 g glycin og 1 g SDS. Tilføj disse til en 1 L bægerglas og tilsæt 500 ml H2O at opløse alt. Når opløst, overføres opløsningen til en 1 L måleglas og fyld med H 2 O, indtil lydstyrken når 1 L.
  6. Opsætning af en 12% polyacrylamidgel i en gel apparat tilsæt derefter 1x SDS-PAGE løbebufferen til gelen apparatet, således at løbebufferen er lige over toppen af ​​brøndene i gelen. Vask brøndene i gelen ved pipettering 50 pi løbebuffer i brøndene fem gange hver.
  7. Load 10 pi af protein stige i den første brønd og tilsæt 10 pi af de kogte løsninger fra trin 8.5 til at adskille brønde. Kør gelen ved 115 V i 60 minutter.
  8. Fjern gelen fra apparatet og overføre den til en lille beholder. Fyld container med 100 ml ren H2O og overføre beholderen til en langsomt roterende platform i 8 min. Efter 8 min, dump vandet og vaske gelen to gange mere med H 2 O.
  9. Dumpe H2O fra beholderen og tilsættes 100 ml hurtig plet reagens til beholderen. Tillad denne til at sidde på en langsomt roterende platform natten, dække med aluminiumsfolie.
  10. Dump den hurtige pletten reagens og tilføje ca. 100 ml H2O til beholderen. Tillad denne til at sidde på en roterende platform for 8 min. Dumpe H2O og gentag H2O vask to gange.
  11. Billede gelen under anvendelse af en billeddanner for Coomassie Blue pletter. Kig efter et band omkring 31,86 kDa (MOG tag protein) og en svagere bånd på 63,72 kDa (MOG tag dimerer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når oprensningen er fuldført, prøver opsamlet i trin 1.4, 2.1, 3.4, og slutproduktet fra trin 6.4 skal køres på et protein gel (figur 3A). MOG tag bør først fremstå som en 31,86 kDa bånd i T O / N prøve, men ikke t 0, og bør være det eneste band i det endelige rent produkt. For at teste, om MOG tag protein er korrekt foldet, kan MOG tag proteinet anvendes til mærkning MOG-protein specifikke B-celler ved FACS. Ved mærkning mus lymfocytter med en 1: 1.000 fortynding af MOG tag sammen med et sekundært antistof rettet mod His-mærket og en fluorescens-mærket tertiært anti-IgG1-antistof, kan MOG-specifikke B-celler identificeres (figur 3B). Alternativt kan MOG tag direkte konjugeret til fluoroforer at reducere baggrundsfarvning (som følge af B-celler binder til de sekundære og tertiære antistoffer) sombeskrevet i reference 5 for at finde MOG-specifikke B-celler. Dette er nødvendigt, når de forsøger at identificere MOG-bindende B-celler i vildtypemus, da disse celler normalt meget sjælden 5. IgH MOG mus har en tung kæde Knockin at, når parret med en passende kappa let kæde, giver specificitet for MOG. Som den binding af MOG tag er forbedret blandt IgH MOG B-celler, bekræfter, at denne protokol genererer en korrekt foldet antigen. Vigtigere, IgH MOG B-celler bidrager til autoimmun patologi i modeller for MOG-rettet EAE 12, hvilket bekræfter, at MOG tag inducerer både T og B-celle-autoimmunitet.

Før start dialyse for at genfolde proteinet som beskrevet i afsnit 5, er det nødvendigt at måle proteinkoncentrationen ved anvendelse af et Bradford-assay, som beskrevet i afsnit 4. Repræsentative resultater af et Bradford-assay er vist i tabel 1 figur 5.

Frembringelsen af ren MOG 1-125 opnås ved tilsætning af TEV-protease til MOG tag protein i sidste ende resulterer i spaltning af MOG tag protein i MOG 1-125 og tag-sekvens som vist i figur 6. Efterfølgende nikkel harpiks oprensning fjerner MOG tag, tag-sekvens, og TEV protease urenheder i sidste ende resulterer i ren MOG 1-125 som vist i figur 6.

figur 1
Figur 1: MOG tag protein (Duplicated her med tilladelse fra Dang et al 5..).. Lineær struktur, og aminosyre- og DNA-sekvenserne af den MOG tag fusionsprotein. DNA-sekvensen for det ekstracellulære domæne af muse MOG (MOG1-125, lavere sekvens med blåt) blev kodon-optimeret til ekspression i bakterier (sort). Denne sekvens blev syntetiseret og indsættes i en vektor for at skabe en N-terminal fusion til et mærke indeholdende thioredoxin og en S-Tag at modvirke den kendte uopløselighed af MOG proteinet 13,14, samt en 6x His-tag til oprensning 15. En TEV proteasespaltningssted adskiller MOG 1-125 fra tag-sekvenserne. TEV-medieret spaltning mellem glutamin-164 og glycin-165 ved hjælp af en alternativ konsensus TEV spaltningssitet 16 resultater i fjernelse af alle ikke-MOG aminosyrer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Oversigt over de trin, der kræves for at producere ren MOG tag protein Til.generere MOG tag protein, er bakterier, der udtrykker MOG tag protein dyrkes til høje densiteter derefter induceret til at udtrykke MOG tag under anvendelse IPTG som angivet i afsnit 1. Efter en overnatskultur bakterierne lyseret, og gennem en række pelletering trin proteinfraktionen indeholder inklusionslegemer, som indeholder MOG tag, udvindes som anført i afsnit 2. MOG tag derefter oprenset fra den rå proteinfraktion gennem fire cyklusser af absorption onto opladet nikkel harpiks og eluering af MOG tag protein som anført i afsnit 3. En del af den samlede eluat derefter taget for en Bradford assay for at bestemme udbyttet af MOG tag protein og resten af eluatet dialyseret i acetatpuffer i løbet af flere dage som anført i punkt 4 og 5. Endelig er proteinet koncentreres under anvendelse PEG 3350 og PEG 8000 til en endelig koncentration på 5 mg / ml baseret på udbyttet af MOG tag bestemt i BRadford assay som anført i afsnit 6. Hele processen kan tage mindst 10 dage, med start dagen for hvert trin er vist i parentes. Alternativ stop og starter punkter er imidlertid opført i protokollen, og trin kan fordeles over en større mængde tid, hvis det ønskes. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Oprensning af MOG tag protein og vurdering af dets aktivitet (A) Vist er protein prøver, der blev indsamlet fra forskellige steder på tværs proteinoprensning procedure og kører på en SDS-PAGE-gel. T 0 = BL21 bakterier forud for protein-induktion (indsamlet i trin 1.4), T O / N = BL21 bakterier efter induktion af proteinekspression (indsamleti trin 2.1), Crude MOG tag = Solubiliseret MOG tag protein forud for proteinoprensning (indsamlet i trin 3.4), Pure MOG tag = MOG tag protein efter oprensning (indsamlet i trin 6.4). (B) Binding af MOG tag proteinet til CD19 pos CD4 neg naive B-celler fra lymfeknuder fra enten vildtype C57BL / 6-mus eller IgH MOG mus, der udtrykker en tung immunglobulinkæde specifikt for MOG protein 7,17 blev vurderet ved anvendelse af flowcytometri . MOG tag -specifikke B-celler blev identificeret ved farvning lymfeknudeceller med MOG tag efterfulgt af et sekundært anti-His-mærke-antistof og et fluorescerende tertiær anti-lgG1-antistof. Farvning af celler fra C57BL / 6 eller IgH MOG mus er vist sammen med en MOG tag fluorescens minus én (FMO) kontrol plet af IgH MOG celler. Venligst cslikke her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Oversigt over de skridt til at generere MOG 1-125 fra MOG tag protein. Efter opsamling af MOG tag eluatet som beskrevet i trin 3.5 i protokollen, er MOG tag protein dialyseres i TEV protease spaltning buffer. Når dialyse er fuldstændig, TEV protease tilsat til MOG tag opløsning resulterer i spaltning af MOG tag i MOG 1-125 proteinet. Volumenet af spaltningsopløsningen reduceres derefter og dialyseres ind før proteinoprensning puffer B. Urenheder fra spaltning opløsning ekstraheres gennem fire successive absorption onto opladet nikkel harpiks og eluering af urenhederne i sidste ende resulterer i en opløsning af ren MOG < sub> 1-125. Koncentrationen af MOG 1-125 protein bestemmes gennem et Bradford-assay, og proteinet er foldet i løbet af flere dage ved dialyse. Når dialyse er færdig, MOG 1-125 protein koncentreret til 2,24 mg / ml ved hjælp PEG 3350 og PEG 8000. Denne protokol er diskuteret i detaljer i afsnit 7. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Eksempel på et Bradford assay standardkurve til bestemmelse af koncentrationen af MOG tag protein. BSA standard aflæsninger taget fra tabel 1 blev plottet for at opnå en lineær regression formel til beregning af MOG tag koncentration baseret på den optiske densitet ved 595 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6:. TEV spaltning af MOG tag protein og efterfølgende oprensning af MOG 1-125 Vist er proteinprøver kørt på en SDS-PAGE-gel demonstrerer oprensningen af MOG 1-125 Pure MOG tag = MOG tag protein forud for TEV spaltning (opsamlet. i trin 6.4), MOG tag m / TEV = Protein fraktion, der blev opsamlet efter 72 timers inkubation af MOG tag med TEV-protease (indsamlet i trin 7.5), Eluering = proteinfraktion, der forblev bundet til nikkel harpiksen under MOG 1- 125 rensningsprotokol (indsamlet i trin 7.9), Pure MOG 1-125 = MOG1-125 protein efter oprensning (indsamlet i trin 7.12). Klik her for at se en større version af dette tal.

BSA (mg / ml) 0.4 0,35 0,3 0.25 0.2 0,15 0,1 0.05 0
1,079 0,998 0,948 0,853 0,769 0,699 0,583 0,493 0,373
1,071 1,014 0,95 0,854 0,777 0,681 0,579 0,484 0,375
1,069 1,017 0,944 0,848 0,781 0,592 0,494 0,374
MOG tag fortynding 1 1/5 1/25
1,327 1.013 0,493
1,332 1,063 0,491
1,367 1,088 0,488

Tabel 1: Repræsentative værdier fra en Bradford assay til bestemmelse af koncentrationen af MOG tag protein BSA Dilu.tioner på kendte koncentrationer anvendes til bestemmelse af standardkurven vist i figur 5. De fortyndinger af MOG tag protein efter oprensning anvendes til at bestemme den endelige MOG tag proteinkoncentration. Rækker indeholder den optiske densitet målt ved 595 nm, og hver række repræsenterer en gentagelse af i alt 3 replikater ved hver målte koncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi beskrevet en protokol for produktion af MOG tag protein og hvordan man kan generere ren MOG 1-125 fra MOG tag protein. Denne protokol er baseret både på standard His-mærke baseret proteinoprensningsmetoder, samt en tidligere beskrevet protokol for frembringelse af en ældre MOG-baserede protein 15. Selvom det ikke beskrives her, den primære brug af MOG tag protein er at inducere EAE gennem immunisering med proteinantigen. En protokol der beskriver, hvordan EAE induceres i mus, som er forenelige med MOG tag protein, kan findes i reference 3. Vi har tidligere vist, at immunisering med MOG tag eller MOG 1-125 stammer fra MOG tag ikke kun inducerer CNS autoimmun sygdom med større rygmarven inflammation og demyelinisering i forhold til standard MOG 35-55 peptid, men også at patogene IgH MOG B-celler that genkende MOG-protein aktiveres til frembringelse af et kimcentret respons som respons på MOG tag eller MOG 1-125, men ikke at MOG 35-55 5. Derfor immunisering med MOG tag indeholder faktisk inducere en passende anti-MOG B-celle respons.

MOG tag protein oprenses ved absorption på ladet nikkel harpiks (via His-tag) og eluering. På grund af den store mængde af protein frembragt i de foregående trin, multiple runder af absorption og eluering skal opkræve meste af proteinet. Vi har fundet, at mindst 4 runder skal isolere størstedelen af ​​proteinet, hvis anvendelse af en passende mængde af harpiks i 50 ml rør. Hvis det ønskes, kan protokollen skaleres op til at bruge flere eller større slanger mm nikkel harpiks at reducere antallet af runder af absorption. Alternativt kan højtryksvæskekromatografi (HPLC) med nikkel kolonner effektivt rense His-mærket proteiner 18 </ sup> og faktisk har vi fundet, at HPLC effektivt kan rense MOG tag protein (upublicerede observationer). Da HPLC er ikke tilgængelige for mange standard immunologi labs, er protokollen anført her designet til at blive udført under anvendelse af fælles laboratorieudstyr. Udover His-mærke oprensning, gør MOG tag proteinet indeholder et S-mærke, der er kompatibel med S-tag oprensningsprotokoller hvis det foretrækkes 14.

Rekombinante proteiner baseret på MOG (hovedsagelig human eller rotte) er tidligere 8 beskrevet. Disse var baseret på ældre ekspressionssystemer, som siden er blevet erstattet af systemer drevet af stærkere transkriptionelle promotorer kan frembringe større mængder af protein i Escherichia coli-bakterier. Vores MOG tag udtryk system bruger den effektive T7-promotoren i pET-32a (+) vektor, hvilket er betydeligt mere effektiv end systemer til rådighed for egenproduktion af MOG protein 19. Men det should bemærkes, at MOG tag proteinet beskrevet her er baseret på muse MOG. Immunisering med humant MOG protein er blevet vist at inducere EAE i mus, der har forskellige funktioner i forhold til sygdom induceret ved hjælp murine MOG 8. Endvidere kan rotte MOG være mere immunogene end muse MOG i mus i nogle tilfælde 20. Derfor, for nogle eksperimentelle formål mus-baserede MOG tag måske ikke ideel. Vi er i gang med at generere flere forskellige version af MOG tag protein end kan passe nogle formål bedre, og den her beskrevne oprensningsprotokol vil arbejde for alle disse. I mellemtiden er det muligt, at den her beskrevne oprensningsprotokol kan arbejde for andre MOG ekspressionssystemer, eller endog andre proteiner, så længe de indeholder en 6x His tag for absorption til nikkel harpiks. Men uden thioredoxin tag, kan opløseligheden af ​​MOG-protein ved højere koncentrationer være et problem, og naturligvis vil det ikke være muligt at ge nerate ren MOG 1-125 da dette er unik for MOG tag system.

Måling af MOG tag koncentration før proteinrefoldning protein via dialyse er afgørende for succesen af denne oprensning protokol. Hvis koncentrationen er for høj, kan proteinet aggregere og falde ud af opløsning i stedet for foldning til individuelle proteiner. Dette kan ses under dialyse protokol som hvidt bundfald danner i bunden af ​​dialyserøret. Hvis dette sker, opløse MOG tag proteinet igen med 6 M guanidin og måle proteinkoncentrationen. Fortynd proteinet til 0,5 mg / ml derefter starte dialyse igen som uden bundfald bør udgøre ved 0,5 mg / ml. For MOG 1-125, kan forventes præcipitater til dannelse som proteinet er meget tungtopløseligt. Vi har fundet, at dette ikke vil påvirke foldningen af MOG 1-125 forudsat at proteinet var tilstrækkeligt fortyndes før dialyse.

nt "> På TEV protease til effektivt spalte MOG tag proteinet til ren MOG 1-125 er det vigtigt at anvende en tilstrækkelig mængde af TEV-protease. Ældre versioner af TEV proteaser inaktiveres ved selvspaltning 21 dog mere moderne versioner lider uopløselighed spørgsmål 22 derfor er det vigtigt at tilføje nok TEV protease at opnå tilstrækkelig spaltning af MOG tag protein før TEV protease inaktivering. Siden kommercielt tilgængelig TEV protease kan være dyrt, anbefaler vi producerer og rensende TEV protease som beskrevet i reference 22. Ved brug af ren muse MOG 1-125 protein for eksperimenter, er det vigtigt at bemærke, at proteinet er meget tungtopløseligt og kan præcipitere ud af opløsning, og derfor skal blandes grundigt før brug.

Sammenfattende, vi her har beskrevet en simpel protokol til fremstilling og rensning af store mængder MOG tag protein. Furthermmalm, tilsætning af en TEV proteasespaltningssted til vores MOG tag protein giver mulighed for at generere ren MOG 1-125 hvis nødvendigt. MOG tag protein genkendes og bindes af anti-myelin autoimmune B-celler og MOG tag induceret EAE inkorporerer B-celle-medieret patologi 5. Derfor MOG tag protein overvinder de største hindringer begrænser den udbredte anvendelse af proteinantigen at inducere EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372, (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7, (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142, (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70, (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171, (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10, (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153, (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6, (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188, (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77, (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278, (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87, (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14, (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55, (1), 53-68 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics