애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

Biology

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Otis, J. P., Farber, S. A. High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake. J. Vis. Exp. (116), e54735, doi:10.3791/54735 (2016).

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Abstract

Introduction

소장식이 지질 처리를 규제하는 메커니즘은 간 복합 지질 단백 합성 및 대사 조절, 이들 기관은 음식 섭취를 조절하는 중추 신경계 작동 방법 불완전하게 이해된다. 또한 비만, 심혈관 질환, 당뇨, 비 알코올성 지방간 질환의 현재 유행의 빛이 생물 해명 생의학 관심사이다. 세포 배양에서 연구와 마우스는식이 지질과 질병, 그리고 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 사이의 역학적 관계에 대한 우리의 이해의 대부분을 제공 한이 작품을 보완하는 이상적인 모델로 부상하고있다.

제브라 피쉬는 높은 척추 동물 1, 2와 유사한 위장관 (GI) 기관, 지질 대사 및 지질 단백질 수송을 신속하게 개발 및 유전자 다루기 쉬운입니다. 애벌레 제브라 피쉬의 광학 선명도가 생체 내 연구에 용이하게하는 particula그 외 환경로 GI 시스템의 연구 연구의 장점 (즉, 담즙, 미생물은 내분비 시그널링)은 생체가. 따라서, 유전자 취급 용이성 및 conduciveness 조합 연구의 본체와 제브라 애벌레의 촬상 라이브 모델 사실상 불가능 식이 조작 (고지방 3,4, - 콜레스테롤 5, -carbohydrate 다이어트 6,7), 심혈관 질환 (8) 모델의 다양한 당뇨 9, 10, 간 지방증 11-13, 비만 14-16, 신진 대사 통찰력의 호스트를 제공하기 위해 등장하고있다.

대사 연구로 유생 전환 지브라 피쉬의 중요한 양태는 제브라 피쉬와의 고유의 장점을 활용할 새로운 분석법의 개발에 다른 모델 동물 개발 기술의 최적화이다. 이 프로토콜은 기술이 LIPI 애벌레 제브라 피쉬를 공급하기 위해 개발 및 최적화 제공D가 풍부한 식사, 세포 내 해상도로 몸 전체에서식이 지질 처리를 시각화하고, 음식 섭취를 측정한다. 그것은 지방과 콜레스테롤 (지질이 ~ 닭 계란, 60 %가 중성 지방은 콜레스테롤입니다 ~ 5 %가되는 노른자, 35 %의 58 %는 인지질이 구성의 높은 수준을 포함로 닭고기 달걀 노른자는 지방이 풍부한 식사를 구성하기 위해 선택되었다 ). 제브라 피쉬 사료 및 먹이 연대는 랩 17에서 표준화되지 않은으로 닭고기 달걀 노른자는 전형적인 상업 제브라 피쉬 micropellet 식품 (~ 15 %의 지질)과 특정 지방산 종의 알려진 비율과 표준화 공급되는 장점보다 더 많은 지방을 제공합니다. 또한, 달걀 노른자에서 제공하는 형광 지질 유사체는 박층 크로마토 그래피를 통해 신진 대사를 조사, 운송 및식이 지질 (18)의 축적과 같은 중요한 염료 3 복잡한 지질에 공유 결합을 통해 모두 작용하여 지질 방울 포함 이미지 세포 성분을 시각화 (TLC) (19) 20 정량적 분석을 제공한다.

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Protocol

이 프로토콜은 과학 기관 동물 관리 및 사용위원회 카네기 연구소 (프로토콜 없음. 139)에 의해 승인되었습니다.

1. 동물 준비

  1. 14 시간에 28 ° C에서 성인과 애벌레 유지 : 10 시간 빛 : 어두운주기를. 쉘 무료 아테 미아 (디 캡슐 레이트, 비 부화, 14 DPF에서 시작) 및 상업 micropellets으로 하루에 두 번 성인 피드.
  2. 이 프로토콜은 AB 배경의 자연 산란에 의해 수집 6-7 DPF 유충의 사용에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 다른 연령대와 배경의 유충에 대한 수정 될 수 있습니다. 외래 음식을 이전 6 DPF를 제공하지 않습니다.
  3. 배아 매체 Tricaine (EM)와 유충 실온 (RT) (4 mg을 100 ㎖의 EM 당 / ㎖ Tricaine 4.2 ㎖) 마취.

지질이 풍부한 달걀 노른자 피드 2. 준비

  1. 준비하고 닭고기 달걀 노른자를 저장합니다. 12 닭고기 달걀의 노른자와 흰색을 구분합니다. , 나누어지는 1 ml의 1.5에 노른자를 풀1 년에 -80 ° C 최대의 ML의 튜브, 저장 (12 노른자는 ~ 80 분취를 만들 것입니다). 백인, 저장 수영장, 지질 가난한, 단백질이 풍부한 사료로 사용합니다.
  2. 원한다면 준비 형광 리피드 유사체 (들) 난황 사료에 첨가한다.
    1. 제조업체의 지침에 따라, 불투명 유리 튜브에 나누어지는 (다음 참고 용매를 논의 참조) / μL 0.1 μg의 100 % 에탄올 또는 100 % 클로로포름 구입, 분말 형광 지질 아날로그를 일시 중단 파라 필름으로 밀봉, 저장. 때문에 유기 용매의 빠른 증발에 장기 저장을 위해 ~ 400 μL 이하 분취 볼륨을 사용하지 않는다.
      주 : 지질 아날로그 에탄올에 현탁하는 경우는, 클로로포름보다 N 2하에 빠르게 건조되므로 지질 아날로그 다량 사용한다. 지질 아날로그 에탄올에 현탁 경우 단계 2.2.4에서 리포솜 피드에 추가하기 전에 건조시키고, 재현 탁 될 수 없지만, 전체 에탄올 농도는 0을 초과하지 않아야한다.리포좀 피드의 1 % 에탄올 잠재적으로 혼란 생리 학적 효과를 방지 할 수 있습니다.
    2. 형광 지방산 유사체의 경우 : EM 20 mL의 5 % 난황 에멀젼의 총 부피를 준비한다. 그 라이브 공 초점 이미지 및 음식 섭취 분석 또는 1 μg의 / ㎖ 6.4 μM 4,4- 디 플루오로 -4- 보라 -3a, 4a- 디아 자 - S - 인다 센의 최종 농도 (BODIPY C 16)와 5 ml의 분취 량을 준비 입체 영상에 대한 BODIPY C (12). 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 형광 지질 아날로그 원하는 금액을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조.
    3. 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 5 μL의 100 % 에탄올에 재현 탁을 95 μL의 EM을 추가하고, 잘 혼합한다.
      참고 : 혼합물이 균질 나타납니다; 컬러 지질 튜브의 측면에 유지되거나 액체가 덩어리 진 나타나면 지질 완전히 용해 에탄올 등을 필요로하지 않았다. 이리저리 튜브를 보호얼음 m 빛과 상점.
    4. 형광 콜레스테롤 아날로그의 경우 : 라이브 영상 연구를위한 5 ml의 0.5 % 달걀 노른자 에멀젼 2.4 μg의 / ㎖ 콜레스테롤의 최종 농도를 준비합니다. 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 콜레스테롤의 정량을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조.
    5. 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 정제 H 2 O. RT에서 1 %의 지방산이없는 BSA 85 μL와 혼합하여 RT 100 % 에탄올 15 μL에 재현 탁 빛으로부터 튜브를 보호하고 얼음에 저장합니다.
  3. 계란 노른자 리포좀 피드를 준비합니다.
    1. 50 ML 원뿔 튜브에 EM에 달걀 노른자의 해동 나누어지는을 추가합니다. 1-2 분 동안 희석 된 난황 혼합물을 와동; 혼합물이 균질 한 에멀젼으로 나타납니다.
    2. 새로운, 신선한 50 ML 원뿔 튜브에 단백질 대기업을 제거하고 수집하는 좋은 메쉬 스트레이너를 통해 혼합물을 붓고.
    3. 펄스 SONICA리포좀을 만들 RT에서 :; 한 네 번째 인치 테이퍼 마이크로 팁과 (6 W 출력 강도 각 세트 사이에 5 ~ 10 초 일시 중지 5 회 (5 × 1 초, 1 초 오프)) 계란 혼합물을 테. 초음파기 전원 설정 종속 기기이며, 따라서 각각의 악기와 마이크로 팁에 대한 최적화를 필요로한다.
      주 : 계속 사용할 때까지 동질성을 유지하기 위해 RT에서 리포좀 혼합물을 흔들어.
  4. 원하는 경우, 달걀 노른자 리포좀에 형광 지질 아날로그를 추가합니다. 즉시 초음파 처리 한 후, 리포솜에 통합 30 초 동안 고속으로 리포솜 혼합물 소용돌이로 제조 된 지질 피펫. 호일에 튜브를 배치하여 빛의 혼합물을 보호하고 실온에서 락을 계속합니다.

3. 수유 패러다임

  1. 먹이의 애벌레를 준비합니다.
    1. 공급을 방해 할 수 명백한 형태 학적 결함에 대한 공급, 화면 애벌레를 시작하기 전에. 60mm X 15mm 페트리 접시 또는 6 또는 12도 괞 찮아로 전송 애벌레TES, EM 최소로 감소시키고, 제조 된 리포좀 용액 5 ㎖로 교체한다.
    2. 필요한 경우, EM 5 ML의 EM 및 / 또는 5 ml의 5 % 달걀 흰색에 unfed 제어 유충을 전송하고 병렬로 처리합니다.
  2. 부드럽게 형광 지질 유사체가있는 경우 빛으로부터 보호하기 위해 계속하는 동안 음식 섭취를 장려하기 위해 공급 전반에 걸쳐 배양 로커의 유충 (30 rpm에서 29 ~ 31 °의 C를) 바위. 애벌레 필요가 빛에 노출 될 경우, 착색 유리 인큐베이터 덮개 노출을 최소화 할 수 있습니다.
  3. 공급 기간의 끝에서, EM 3 회 자유롭게 수영 유충을 헹군다.
    참고 : 애벌레 피드 동안 어느 시점에서 리포좀을 소비 시작할 수 있습니다. 이 유충이 동시에 공급하기 시작하는 것이 중요한 경우, 음식 섭취에 대한 화면 급전 1 시간 후 (3.4 참조) 공급을 완료 난황 에멀젼 공급을 개시 한 경우에만 애벌레를 반환한다.
  4. 소수로 음식 섭취량이 시점에서 유충 화면 EA 않을 수도t (일반적 ~ 0~5%). 그들이 공급 한 경우 결정하기 위해 얼음에 금속 블록에 마취 또는 약간 냉각 된 유충의 장을 검사 : 리포좀을 섭취 한 유충은 어두운 소장 (그림 1)을해야합니다.
  5. 바로 음식 섭취에 대한 이미지 또는 공정 애벌레. 또는, 장소 신선한 EM의 유충 및 28 ° C에서 부화 대사 처리가 발생 할 수 있습니다.

라이브 영상에 대한 유충을 설치 (4)

  1. 장착 미디어를 준비합니다.
    1. 3 % 메틸 셀룰로오스의 경우 : -20 ° C에서 년 동안 근처 끓는 EM, 소용돌이, 4 ° C에서 2~3일 완전히 용해 될 때까지 실온에서 바위, 저장 25 ml의 0.75 g의 메틸 셀룰로오스를 추가합니다. 4 ° C에서 동결 융해의 반복주기는 공기 방울을 제거합니다. 애벌레를 설치하는 동안 얼음에 3 % 메틸 셀룰로오스를 저장합니다.
    2. 1.2 % 낮은 마운트 아가로 오스의 경우 : 0.3 g 추가 25 ㎖ EM에 아가로 오스 낮은 용융 및 2 ML의 t에 종기, 나누어지는로 가져 와서 용해ubes, 그리고 열 블록에 26 ~ 28 ℃로 유지한다. 미사용 분취 량을 RT에서 저장 또는 -20 ° C 및 사용시에 다시 비등 될 수있다. 아가로 오스는 유충에 노출하거나 가열을 통해-수 있습니다 전에 처리 할 수있을만큼 멋진 있는지 확인합니다.
  2. 낮은 배율, 중간 처리량 라이브 영상의 경우, 얼음에 금속 블록에 조직에 유리 슬라이드를 배치하고 슬라이드가 식을 때까지 기다립니다. 에 붙어 낚시 줄 포커를 사용하여 3 % 메틸 셀룰로오스에 유충을 전송, 슬라이드에 (얼음에 4 ° C로 유지 된) 3 % 메틸 셀룰로오스의 충분한 양을 적용 (0.41 mm 직경의 낚시 줄 유리 모세관의 끝)이 메틸 셀룰로오스 희석되지 않는다 (따라서 과잉 EM 드레인) 및 원하는대로 유충 위치로 약속하다를 생성한다.
  3. 단기 (<20 분)의 경우, 수직 오일 에멀젼의 목적으로 고배율 라이브 영상은, 방법 희박로 커버 슬립과 애벌레를 탑재합니다.
    1. 에 시아 노 아크릴 레이트 기반의 접착제 (순간 접착제)를 사용하여유리 슬라이드의 일단에 AA 22mm X 30mm의 coverslip에 연결합니다. 커버 슬립에 인접한 슬라이드에 3 % 메틸 셀룰로오스의 세선을 넣어 전체 보어 파스퇴르 피펫으로 슬라이드에 유충을 전송 포커를 사용한다. 는 메틸 셀룰로오스를 희석되지 않도록 초과 EM을 제거합니다.
    2. 포커를 사용하여 부드럽게 커버 슬립 옆에 그들의 머리와 함께 (오른쪽 이미지에 담낭을 측면이 위로 간 더 많은 이미지 왼쪽) 자신의 양쪽에있는 메틸 셀룰로오스에 애벌레를 놓습니다.
    3. 부드럽게 두 번째 커버 슬립의 코너에서 스팟 순간 접착제는 애벌레를 브리징, 장착 된 커버 슬립에 커버 슬립 및 슬라이드의 다른 한쪽 끝을 배치합니다. 이 단계 동안이나 그 유충이 손상되지 않은 상태로 유지하면서 이미지 있도록 목적으로 과잉 압력을 적용하지 않도록 조심해서.
  4. 장기의 경우, 수직 침지 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스에 애벌레를 탑재합니다. 아가로 오스 다음 전송 1.2 % 낮은 용융의 작은 나누어지는에 유충을 추가배양 접시에 아가로 오스의 작은 볼륨에서 애벌레.
    1. 빨리 아가로 오스 응고 전에 포커와 애벌레를 놓습니다. 아가로 오스는 2 ~ 3 분 동안 건조 건조되는 것을 방지하기 위해 신선한 EM 완벽 아가로 오스를 포함 할 수 있습니다.
  5. 장기의 경우, 역 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스의 유리 바닥 접시에 애벌레를 탑재합니다.
    1. 얼음에 금속 블록 쿨. 과도한 냉각 및 유충의 동결을 방지하기 위해 조직에 의해 분리 된 금속 블록에 접시를 놓습니다. 접시에 애벌레를 전송하고 티슈로 위킹하여 EM을 제거합니다.
    2. 유충의 상단에 28 ° C 낮은 용융 아가로 오스 (1.2 %)의 하락을 놓고 즉시 포커 (아래 최상의 이미지에 왼쪽 간, 아래로 담낭 이미지 오른쪽)에 위치. 추위 블록에서 요리를 제거 2 ~ 3 분 동안 건조 할 수 있도록하고, 아가 로스를 커버하는 신선한 EM의 충분한 볼륨을 추가 (~ 2-5 ㎖).

5. 식품 섭취시험

  1. 6.4 μM BODIPY C 16 함유 난황 리포솜 공급의 마지막에, 플라스틱이 1.5 ㎖의 튜브 10 세정 유충 최소 EM 풀을 제거하고 동결 스냅. 샘플을 몇 달 동안 빛으로부터 보호 -80 ° C에서 저장 될 수있다.
    참고 : 가능하면 여러 복제를 수집합니다. (사용되는 동일한 클러치에서 이상적으로 유충) 배경 지질 형광에 대한 정상화를이 단계에서 unfed 애벌레를 수집하는 것이 중요하다.
  2. 수정 후 Bligh-다이어 지질 추출 3,21을 수행합니다.
    1. 얼음 샘플 (2 O를 사용할 수 있습니다 대안 정제 H) 100 ㎕를 균질화 버퍼 (20 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA)를 추가합니다. (1 초 오프 1 초 5 초 총)는 마이크로 팁의 초음파기와 얼음에 균질화. 그 애벌레 완전히 균질화를 확인; 하지 않을 경우, 반복합니다. 13 ml의 일회용 유리 배양 관에 전송 (다른 유리관이 사용될 수있다).
      참고 : 클로로포름은 위험합니다; 이후의 모든 지질 전을 수행화학 후드에서 실온에서 견인 단계.
    2. (: 메탄올 클로로포름) 2 : 사용 균질화 버퍼의 각 100 μL, 1의 375 μl를 추가합니다. 소용돌이 30 ~ 60 초, 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 당 클로로포름, 소용돌이 30 초 125 μl를 추가, 10 분을 품어.
    3. 200 mM 트리스 산도의 125 μl를 추가 7.5 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 (빛으로부터 보호 2,000 X g, 5 분, RT) 소용돌이 30 초, 원심 분리기 당. 조심스럽게 원심 분리기에서 샘플을 제거합니다. 상부상은 수성이다 유생 파편의 인터페이스 및 하부 유기상 (지질을 포함)은 이들 두 개의 단계로 구분된다.
    4. 깨끗한 유리 피펫 하단 유기상을 수집하고 깨끗한 13 mL 유리 튜브로 옮긴다.
      주 : 계면의 성상 및 유생 파편을 피하기 위해주의; 오염이 발생하는 경우, 원심 분리 단계 및 배열 회수 반복한다. 상단, 수성 상을 폐기; 그것을 제거하고이를 폐기하는 것이 도움이 될 수 있습니다유기상을 수집하기 전에 단계. 샘플 1 개월까지 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
    5. 빛으로부터 보호하면서 진공 유기상 (0.12 기압)을 건조. 이 지질 용해도가 감소하므로 액체가 증발 후 샘플을 건조 계속하지 마십시오. 2의 지질을 재현 탁 : 얼음에 저장 : 1 (메탄올 클로로포름). 클로로포름의 최적 량 : 메탄올 용액을 사용하는 측정 방법에 따라, 낮은 시작하고 필요에 따라 희석을 계속합니다. 일반적인 지침은 10 풀링 유충 10 μl를 사용하는 것입니다.
  3. 채널 화 TLC 판에 균등 간격으로 전체 샘플 볼륨을 파악하고 정기적으로 생체 분자 영상 (예를 들어, 형광 플레이트 리더)에 사용되는 레이저 스캐너와 함께 접시를 검사합니다. 510-665 nm 내지 500-650 nm의 최대 발광의 여기 최대 값을 가진 물질의 목록에 포함 된 형광 리피드 유사체를 들어, 520 nm의 발광 회수를 가진 488 nm의 레이저를 사용하여.
    1. 이미징 소프트웨어 각 스폿의 총 형광 정량화.
      참고 : 자연스럽게 쌍, unfed 애벌레 샘플의 형광을 뺀 배경 지질 형광을 발생에 대한 올바른.

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Representative Results

29 ~ 31 ° C에서 로커에 공급되면, 건강 유충 (≥95 %)의 대부분이 1 시간 내에 먹는다. 계란 노른자 에멀젼을 소모하면, 애벌레 소장 컬러로 어둡게. 아주 어두운 장 2 시간 (그림 1)에서 관찰 할 수있다. 애벌레 unfed 또는 공급하지 않을 경우, 소장은 분명 남아있다. 애벌레 먹이 계란 흰자 전시 컬러로 어둡게하지 않는 팽창 장 루멘.

그림 1
그림 1 :. 식품 섭취를 위해 애벌레를 선별 야생 타입 6-DPF 유충은 2 시간 동안 EM 5 % 달걀 노른자를 공급 또는 unfed 컨트롤을 얻기 위해 EM에서 병렬로 처리 하였다. 입체경에 10 배에서 몇 군데 때 계란 노른자를 섭취 한 먹이 애벌레 어두운 장을하면서 Unfed 유충은 분명 창자가 있습니다. 스케일 바는 0.1 mm를 나타냅니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형광 지질 유사체로 공급하면 전신 전송 및식이 지질의 세포 내 축적의 시각화를 허용합니다. 8 시간이 희박한에 대한 방법 및 수직 목적으로 이미징 된 커버 슬립 (그림 장착을위한 형광 신호는 6.4 μM 형광 C (16) 아날로그와 애벌레 공급 5 % 달걀 노른자의 소화 기관 (대장, 간, 췌장)에 걸쳐 존재 2) 3.

그림 2
그림 2 :. 6 DPF 유충의 형광 지질 유사체 시각화식이 지질 전송 대표 합성 이미지 (오른쪽 직면 헤드) 8 시간 동안 C 16 6.4 μM BODIPY FL과 EM 5 % 달걀 노른자를 공급. 애벌레는 의지-에있어서, 상기 커버 슬립에 의해 3 % 메틸 셀룰로오스에 장착하고 수직 63X로 이미지화 하였다 아르곤 레이저와 단일 광자 공 초점 현미경에 기름 침지 목표. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 간, L; 장, I; 췌장, P, 담낭, GB; 데브 바이오 3의 허가 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그들이 차등 복잡한 지질 (즉, 중성 지방, 콜레스테롤 에스터, 인지질)로 대사되기 때문에 다양한 지질 유사체 세포 구조의 독특한 세트를 시각화 할 수 있습니다. 다음 4 - 8 시간은, 피드 형광 C (16)와 C (12) 유사체 지질 방울, 형광등 FL의 C 5 라벨 지질 방울, 간 및 췌장 덕트, 세포막, 동맥 네트워크 및 형광 C 2 아날로그 간 및 췌장 덕트 및 세포 레이블 레이블 멤브레인 (그림 3) 3.

ove_content "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 그림 3
그림 3 :. 다른 형광 지질 유사체 라벨 고유 세포 기관은 유충의 대표적인 합성 이미지는 4-8 시간 (6 DPF)에 대한 C 16, C 12, C 5, C 2 6.4 μM BODIPY FL과 EM 5 % 달걀 노른자를 공급 . C (16) 아날로그 장 세포의 지질 방울 (LD)에서 관찰되어, 장 루멘에서 enterocyte의 LD 및 장 루멘, 및 C 2 아날로그 C 12 및 C 5 유사체. 애벌레는 의지-에있어서, 상기 커버 슬립에 의해 3 % 메틸 셀룰로오스에 장착하고, 아르곤 레이저와 단일 광자 공 초점 현미경에 수직 63X 기름 침지 목적으로 몇 군데 있었다. 스케일 바는 20 미크론을 나타냅니다. 약 Discov 오늘 지 모델 (22)의 허가 재판."_blank>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

애벌레 음식 섭취 분석 방법은 유전자 돌연변이, 유전자 과발현 형질 전환을 조사하기 위해 개발 된, 및 / 또는 외래 치료 유생 음식물 섭취에 영향을 미친다. 유충 소비 음식의 양을 나타 내기 위해 형광 지질 아날로그 타서 지질이 풍부한 음식을 공급된다. Unfed 유충 형광 지질 아날로그 검출 할 수있는 감도를 향상 유충에있는 배경 형광의 양에 대해 정규화 병렬로 수집된다. 이 분석은 아포 지단백 A-IVb.1 (apoA-IVb.1) 음식 섭취를 감소의 과발현을 표시하는 데 사용되었다. 이전 unfed의 Tg (HSP70 : apoA-IVb.1 : mCherry) 유충은 7 DPF에서 4 시간 동안 6.4 μM 형광 C (16) 아날로그와 10 % 달걀 노른자를 공급 (그림 4) (20) 야생 형 유충보다 약 30 % 적은 지질을 소비했다.


그림 4 :. 대표 음식 섭취의 분석 야생 타입 (WT)과의 Tg (HSP70 : apoA-IVb.1 : mCherry) (Tg)가 유충이 공급 된 10 % 닭고기 달걀 노른자 4 시간 (연준) 또는 6.4 μM BODIPY FL C16와 EM (Unfed)에서 병렬로 처리 하였다. (A) 유생 (N = 10)을 모으고, 지질을 추출하고, 추출물을 TLC 플레이트에서 목격 하였다. (B) 총 형광 정량 하였다는 감산에 의해 unfed 형제의 배경 형광을위한 표준화 된 임의의 형광 단위 (AFU), 표현 및 WT를 기준으로 표시. WT에 비해 같이 ApoA-IVb.1가 적은 형광 표지 된 지질 유사체를 섭취 과다 발현의 Tg 유충은 (학생의 t 검정, P <0.001 쌍, N = 9, 실험 당 20 유충). 박스는 25 ~ 75 번째 백분위 수를 나타내며, 평균이 표시된다. 수염은 10 ~ 90 번째 백분위 수를 표시합니다. 재판지 모델 메크 (20)의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 설명 된 기술은 연구자, 지질이 풍부한 피드 유생 제브라 치료 라이브 유충식이 지질을 시각화 처리 한 애벌레 음식 섭취를 정량화 할 수있다. 성공을 보장하기 위해 특별한주의는 몇 가지 중요한 단계에 주어져야한다. 상업 닭고기 달걀 변화; 잠재적 인 변동성을 최소화하기 위해 우리는 오메가 -3 지방산에 대한 풍부한되지 않은 케이지가없는 닭에서 유기농 계란에 대한 모든 분석을 수행합니다. 낮은 공급 속도 미만 6 음식 섭취 (즉, 턱 또는 소장 기형, 제대로 수영을 할 수없는)을 방해 발달 돌연변이 내생 노른자 에너지 공급, 건강에 해로운 고기, 생선 남아와 DPF 물고기를 관찰 할 수있다. 자신의 내생 노른자 저장이 소진되고 노른자 고갈이 소화 시스템을보다 효율적으로 시각화 할 수 있습니다 때까지 애벌레 외래 음식을 필요로하지 않기 때문에 파버 연구소는 일반적으로 6~7일 게시물 수정 (DPF)에 공급하는 연구를 수행한다. 급송RT에서도 크게 먹는 애벌레의 수를 줄일 수 있습니다. 음식 섭취량과 결과를 혼동 할 수 있습니다 후속 실험에서 unfed 유충의 의도하지 않은 포함을위한 화면 유충에 실패. 또한, 최대 형광, 따라서 분석의 감도를 유지하기 위해 가능하면 빛 형광 리피드 유사체 및 동족체가 공급 모든 유충 샘플을 보호하는 것이 중요하다. 음식물 섭취 측정 할 경우 결국, 식사가 배출되기 시작하기 때문에 공급 체이스 (포스트 피드 대사 기간), 4 시간의 합계를 초과하는 것을 허용하지 않는다. 현재, 식사와 관련된 형광 지질 유사체가 배설되는 속도를 알 수 있지만, 형광은 최소 2 일 후 피드 (JPO와 SAF 게시되지 않은 데이터)의 애벌레 몸 전체 지속 할 수 있습니다.

수정하고 관심있는 실험 질문에 대답 프로토콜의 문제를 해결하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 지질이 풍부한 공급 물 t 다양한 기간 동안 수행 될 수있다IME 4 시간 지질 다량으로 소장을 채울하면서 1 시간이 작은 식사를 제공한다. 그러나, 이상 6 시간 이상 애벌레를 공급하는 노른자로 권장되지 않으며 EM 결과를 혼동 할 수 멸균 조건 및 계란 노른자 / 화이트 에멀젼의 세균 증식에 (즉, 증가 염증, 변경 장내 미생물 프로필을) 준비되지 않습니다. 애벌레는 빠르게 재가 후 다시 공급하기 시작 간단한 냉각 또는 마취에 의해 고정화 공급 애벌레의 급성 효과를 조사하기 위해 수유 후 즉시 검사 할 수 있지만, 냉각 마취에 구토가 발생할 수 있습니다 애벌레와 같은 고정의 바람직한 방법 (SAF 게시되지 않은 관찰)입니다. 대안 적으로, 추적 기간은 연구 전에식이 지질 대사 전송을 허용하도록 이송 후에 수행 될 수있다. 피드는 일반적으로 5 ㎖ 리포좀 용액에서 수행되지만, 피드 성공적으로 1 내지 20 ㎖ 부피의 범위에서 수행되었다. 다양한 농도계란 노른자의의는 애벌레 피드에 사용할 수 있습니다; 파버 연구소는 정기적으로 5 % 달걀 노른자 (1 ml의 계란 노른자 19 ML의 EM에 추가), 0.5 % 달걀 노른자, 10 % 달걀 노른자와 실험을 수행한다.

고려되어야 형광 지질 유사체의 잠재적 인 제한이 있습니다. 형광 리피드 유사체를 선택할 때 그 결과를 해석 할 때 형광 부분이 지질의 화학 구조에 어떻게 지질 생리 처리되고 여기서 고려하는 것이 중요하다. 예를 들면, 트리글리 세라이드 전에 흡수 장 루멘, 무료 콜레스테롤 및 지방산으로 유리 지방산 및 글리세롤 및 콜레스테롤 에스테르로 세분화된다. 형광 중성 지방 또는 콜레스테롤 에스터 아날로그은 다이어트에 제공되는 경우, 따라서, 신체에서 관찰 된 형광은 형광 부분이 아닌 본래 중성 또는 콜레스테롤 에스테르에 부착 된 지방산, 무료 콜레스테롤, 또는 글리세롤을 추적한다. 다른 fluorescent 지질 유사체는 고유의 세포 구조를 레이블,이 사실은 선택 3시에 고려되어야한다. 또한 노트 원시 지방산의 대사에 비해 BODIPY 잔기의 첨가는 지방산 쇄 길이 (SAF 미발표 데이타)에게 ~ 2-3 개의 탄소를 첨가 대략 동일하다.

여기에 설명 된 기술 분야에 기재된 분석법 이전에 비해 상당한 진보를 나타낸다. 유충에 전원이 공급 된이 닭 계란 노른자 사료의 개발에 앞서,이 원고는 상세한 연구는 하드 계란은 4,23 노른자. 여기에 설명 된 기술은 난황 인한 ​​급속한 산화하기 어려운 해당 분말 난황은 매우 짧은 반감기 비등 전에 사용할 분쇄 할 필요가 없다는 장점을 제공한다. 액체 계란 노른자도 용이 효과적인식이 배달 형광 리피드 유사체 동의 리포좀을 제조 할 수있다. 또한, 방사성 표지 지질 inves의로 사용할 수 있습니다식이 지질 대사를 tigate과 음식 섭취를 측정하지만, 형광 지질 유사체는 방사능과 관련된 안전 위험을 제시하지 않습니다. 연구팀은 방사성 표지 된 지질을 사용하려면 그러나 경우 파버 연구소는 방사성 표지 지질에 통합 될 수 있는지 확인하기 위해 연구를 수행하고, 성공적으로 공급, 19 리포좀있다. 여기에 설명 된 형광 리피드 유사체는 내인성 및 방사성 표지 된 지질 대사에 매우 유사한 표시를 선택하기 때문에, 그리고 저 고전력 촬상 충분히 밝은이었다 하였다.

유충 형광 리피드 유사체를 공급하는 이러한 기법의 개발을 선행하는 다른 방법은 생체 내에서식이 지질 수송과 축적을 가시화 할 수 없었다. 형광 리피드 유사체의 직접적인 시각화 혈청 지질 등 생리학 간접적 인 측정을 이용하여 위에 이점을 제공 할 수있다. 애벌레 제브라 피쉬의 음식 섭취의 정확한 측정은 긴 역이었다현장에서 문제를 찾아내는. 애벌레는 먹이를 할 수 있도록, N -methylpyridinium 요오드 (4- 디-10-ASP), 그리고 형광을 측정 - 유일한 대안은 형광 친 유성 추적 4- (4- (didecylamino) 스티 릴)로 레이블을, 문화 paramecia이었다 플레이트 리더 (24)와 복부 영역. 마지막으로, 이들 기술은 모두 중간 처리량 스크린 (식이 지질 처리 즉, 순방향 유전자 스크린)뿐만 아니라 초점 고배율 촬상 연구에 적용 할 수 있다는 장점이있다 (즉, 유전 가설 구동 연구 역방향). 미래에, 이들 기술은 표현형에 적용 할 수 있고, 제브라 대사 및 GI 질환의 다양한 모델을 화면.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) Sigma-Aldrich A5040-25G Anesthesia for larval zebrafish
Chicken eggs N/A N/A Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids
Ultrasonic processor 3000 sonicator Misonix, Inc. S-3000 To make egg yolk liposomes
Sonabox acoustic enclosure Misonix, Inc. 432B To make egg yolk liposomes
1/8” tapered microtip Misonix, Inc. 419 To make egg yolk liposomes
Amber vials (4 ml, glass) National Scientific 13-425 Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa
Incu-Shaker Mini  Benchmark 1222U12 Incubated shaker for feeds
BODIPY FL C16  Thermo Fisher Scientific D3821 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)
BODIPY FL C12  Thermo Fisher Scientific D3822 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)
BODIPY FL C5  Thermo Fisher Scientific D3834 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher Scientific D2183 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)
TopFluor cholesterol  Avanti Polar Lipids Inc. 810255 Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol
Fatty acid-free BSA Sigma-Aldrich A0281-1G For TopFluor cholesterol solubilization
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387 Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm
Low melt agarose Thermo Fisher Scientific BP165-25 Mounting media for live larval imaging; 22 x 30
VWR microscope slides  VWR  16004-422 Mounting larvae for live imaging
Coverslips  Cover Glass 12-544A Mounting larvae for live imaging
Super glue Loctite LOC01-30379 Mounting larvae for live imaging
FluoroDish (glass bottom dish) World Precision Instruments, Inc.  FD35-100 Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness  
Confocal microscope Leica Microsytems SP-2, SP-5 Microscope for high magnification live imaging
Stereoscope Nikon SM21500 Microscope for low magnification live imaging
Glass culture tubes  Kimble 73500-13100 Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)
Savant SpeedVac Plus  ThermoQuest SC210A Lipid extraction
Channeled TLC plates Whatman Scientific WC4855-821 Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued
Channeled TLC plates Analtech, Inc. 66911 Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates
Typhoon 9410 Variable Mode Imager GE Healthcare 9410 Fluorescent plate reader for food intake assay
ImageQuant software GE Healthcare 29000605 Analysis of food intake assay
5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets    Kimble 63A53WT Transfering larvae

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References

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