Визуализация Cell Shape Переоборудование и Cell движения в

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Karim, M. R., Haruta, T., Matsumoto, T., Oda, H., Taniguchi, H. Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies. J. Vis. Exp. (118), e54764, doi:10.3791/54764 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Гаструляция первый набор морфологически динамических событий , которые происходят во время эмбрионального развития многоклеточных животных , таких как дрозофилы. Это морфологическое изменение также признается как эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT). Дисрегуляция EMT связано с фиброзом и метастазирование рака. Существует доказательство того, что возникающие ЕМТ контролируется ряда молекулярных механизмов. Как также известны такие, многие ключевые гены, контролирующие верхушечный перетяжку являются важными факторами в ЕМТ наблюдается в метастазирования рака. Как EMT во время гаструляции Drosophila, эпителиальные клетки можно заставить изменить свою форму и быть перепрограммирован перенаправлять судьбу клеток по отношению к различным другим типам клеток. Здесь мы предлагаем надежный метод визуализации дрозофилы гаструляцией для анализа инициации морфогенетических клеточных движений и идентификации клеточных судеб на этой стадии эмбрионального развития. Используя этот метод, мы определяем грELL перегруппировки во время гаструляции и демонстрируют важность апикального сужения во время гаструляции с помощью GFP маркированы DE-кадгерин.

Introduction

Гаструляция первый набор морфологически динамических событий , которые происходят во время эмбрионального развития многоклеточных животных , таких как Drosophila 1,2. Интересно отметить , что возникающие данные свидетельствуют о том, что этот процесс регулируется через взаимодействие между механическими и молекулярных механизмов 3. Кроме того, эпителиальный к переходу мезенхимальной (EMT), которая представляет собой важный процесс в гаструляцией, также участвует в процессах заболеваний человека , таких как рак 4-8 метастаз. Как также известны такие, многие гены , которые контролируют верхушечный перетяжку, являются ключевыми факторами в ЕМТ наблюдается при раке метастазирования 9. Таким образом, верхушечный Сужение во время гаструляции является отличной моделью для исследования вышеупомянутых регулирующих механизмов и повысить понимание метастазирования рака. Преимущество этого метода заключается в том, что мы можем наблюдать движение клеток во время гаструляции в режиме реального времени и, следовательно, мы будемвозможность скрининга генов, участвующих в гаструляции, а также метастазирование рака.

Хотя относительно неизвестной, клеточная адгезия к клетке , как полагают , играет центральную роль в вершинной сужением 1. Drosophila генетика хорошо подходит для отдельных исследований на уровне клеток , исследующих регуляторных молекулярных механизмов. Эта модель позволит нам раскрыть важность апикального сужения во время гаструляции. Более того, этот метод может быть использован для скрининга генов, участвующих в метастазировании рака. Захват живые образы Drosophila гаструляцией еще больше позволило нам понять более подробно молекулярные механизмы , регулирующие перестановку ткани. Здесь мы приводим подробное описание простого способа для достижения этой цели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Трансгенные мухи , используемые в настоящем исследовании , включают следующее: DE-хама :: GFP 10.

1. Подготовка компании Apple плиты

  1. Приготовить смесь из 12,5 г агара, 125 мл 100% коммерчески доступного яблочный сок, 12,5 г глюкозы и 375 мл H 2 O. Смесь нагревают в микроволновой печи и вылить его в 3 см для культивирования клеток блюдо с. Хранить смесь при температуре 4 ° С для последующего использования.
  2. После приготовления яблочного тарелку, добавить тонкий слой замешанного дрожжевого пасты поверх него, чтобы позволить мухи заложить яйца.

2. Эмбрион Подготовка и протокол Живая съемка

  1. Поместите около 50 мух (25 мужчин и 25 женщин) в бутылке к спариванию, а затем откладывают яйца на ночь на яблочной пластины, покрытой в замешанного дрожжей. Установите яблочный сок пластины во рту бутылки. Держите бутылку вверх дном в инкубаторе. Оберните пластиковые бутылки Drosophila акции с алюминиевой фольгой , чтобы подсказать йе летит заложить больше яиц.
  2. На следующее утро, заменить старый яблочный сок пластины с новым.
  3. Пусть мухи откладывают яйца в течение 3 до 4 часов, обернув бутылку с алюминиевой фольгой.
  4. Через три-четыре часа спустя, собирают эмбрионов в зародыше ситечко из яблочного сока пластины с помощью кисти или ватный плохо, и мыть их с PBS. Вымойте эмбрионов от 2 до 3 раз больше с PBS в 12-луночные планшеты для культивирования.
  5. Dechorionate эмбрионов с 50% хлорной извести в течение 5 мин в 12-луночные планшеты для культивирования.
  6. После процесса dechorionation, мыть эмбрионов от 2 до 3 раз больше с PBS.
  7. Перенос эмбрионов до 3 см для культивирования клеток блюдо, содержащую PBS и выберите стадии 5 эмбрионов под микроскопом на основе уровня прозрачности в их границах. Пипетировать инсценированном эмбрионов с использованием 200 мкл кончиком пипетки.
  8. Затем поместите два выбранных эмбрионов на покровного стекла, и удалить избыток PBS с бумагой крученого ткани. Сориентировать эмбрионов спинной стороной вверх напокровное с использованием бумаги крученого ткани. После этого, приложите эмбрионов к покровного стекла с силиконовой смазкой с помощью тонкой иглы и бумаги витую ткани.
  9. Добавьте небольшую каплю масла галоидоуглеводородов 700 на зародышах и помещают покровное, содержащий зародыши вверх дном на отступом горкой, оставляя некоторое пространство в нижней части слайда.
  10. Изучение эмбрионов с помощью конфокальной системы визуализации, аргоновой / 488 лазера, а также цель нефти погружения (63x).
    Примечание: Определение эмбриона на соответствующей стадии развития имеет важное значение для захвата изображений события гаструляции. В этих условиях наблюдается почти все эмбрионы развиваются нормально до, по меньшей мере стадии 14. Анализируемый эмбрионов можно культивировать в дальнейшем развивать как взрослый.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы покажем , гаструляции события зародыша дрозофилы и общий обзор процедуры подготовки эмбриона (Рисунок 1). Клеточные мембраны помечены с помощью DE-кадгерин :: GFP и живой визуализации движений клеток производится во время гаструляции у дрозофилы (рисунок 2). Так как DE-кадгерин GFP мух позволяют визуализировать приверженности клеток перекрестки, мы можем проследить верхушечный форму и движения с использованием этой системы клеток. Что еще более важно, эта система также позволяет проследить эндогенные паттерны экспрессии DE-кадгерина.

Рисунок 1
Рисунок 1: Общий обзор Эмбрион Методика получения. A) Установите мух для откладки яиц. Б) Сбор эмбрионов и поместить их в зародыше ситечко. C) После промывкиИНГ эмбрионов с PBS, dechorionate их немедленно. D) Перенос эмбрионов до 3 см для культивирования клеток блюдо с использованием PBS. Е) пипеткой эмбрионы , которые находятся на правильной стадии развития и поместить их на покровное. F) Прикрепите эмбрионов к покровное с помощью вакуумной смазки. G) Затем добавьте каплю масла на галоидоуглеводородов покровное. H) Наконец поместите покровное вверх дном на отступом слайде. Эмбрионы теперь готовы к покадровой обработки изображений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Результат процедуры экспериментального использования DE-кадмиевые :: GFP на основе живого изображения во время гаструляции. Клеточные мембраны метили DE-кадгерин ::GFP и живой визуализации движения клеток был захвачен в течение примерно 500 секунд во время гаструляции у дрозофилы. Верхушечные периметры клеток визуализировали с помощью GFP флуоресценции DE-Cad для того, чтобы проследить вершинные участки отдельных клеток с использованием репрезентативного набора покадровой изображений; Шкала бар = 20 мкм. Стрелки показывают, где происходят апикального сужения и инвагинации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Halocarbon oil 700 Sigma MKBH 5726
Vacuum grease Silicone Beckman 335148
Glass coverslip  Matsunami glass Thickness No1 24 - 36 mm
Embryo stariner Corning Corning3477
Plastic Drosophilla Stock Bottles Hitec MKC-100
DE-Cadherin knock-in flies REF (10)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15, (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193, (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13, (1), 3 (2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5, (3), (2016).
  6. Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
  7. Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35, (3), 1657-1663 (2016).
  8. Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527, (7579), 525-530 (2015).
  9. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119, (6), 1420-1428 (2009).
  10. Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (20), 8284-8289 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics