Obtención de imágenes de alteración celular de la forma y el movimiento celular en

Developmental Biology

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Karim, M. R., Haruta, T., Matsumoto, T., Oda, H., Taniguchi, H. Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies. J. Vis. Exp. (118), e54764, doi:10.3791/54764 (2016).

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Abstract

La gastrulación es el primero conjunto de eventos morfológicamente dinámicas que se producen durante el desarrollo embrionario de los animales multicelulares tales como Drosophila. Esta alteración morfológica también es reconocida como transición epitelial a mesenquimal (EMT). La desregulación de EMT está asociado con la fibrosis y la metástasis del cáncer. Hay pruebas de que EMT es controlado por un número de mecanismos moleculares. Como también se conocen tales muchos genes, clave que controlan la constricción apical a ser factores importantes en la EMT observado en la metástasis del cáncer. Como EMT durante la gastrulación Drosophila, las células epiteliales pueden ser inducidas a cambiar su forma y ser reprogramadas para redirigir el destino celular hacia otros diversos tipos de células. Aquí se proporciona un método de formación de imágenes robusta de Drosophila gastrulación para ensayar la iniciación de los movimientos celulares morfogenéticos y la identificación del destino celular durante esta etapa del desarrollo embrionario. Usando este método, identificamos cell reordenación en el momento de la gastrulación y demostrar la importancia de la constricción apical durante la gastrulación usando GFP etiquetados DE-cadherina.

Introduction

La gastrulación es el primero conjunto de eventos morfológicamente dinámicas que se producen durante el desarrollo embrionario de los animales multicelulares tales como Drosophila 1,2. Curiosamente, la evidencia emergente sugiere que este proceso está regulado a través de la interacción entre los mecanismos mecánicos y moleculares 3. Por otra parte, la transición epitelial a mesenquimal (EMT), que es un proceso crucial en la gastrulación, también está implicada en procesos de enfermedades humanas, tales como metástasis de cáncer de 4-8. Como también se conocen tal, muchos genes que controlan la constricción apical ser factores clave en la EMT observado en la metástasis del cáncer 9. Por lo tanto, la constricción apical en el momento de la gastrulación es un excelente modelo para investigar los mecanismos de regulación mencionados anteriormente y para mejorar nuestra comprensión de la metástasis del cáncer. La ventaja de esta técnica es que se puede observar el movimiento de células en el momento de la gastrulación en tiempo real y por lo tanto, estaremoscapaz de pantalla genes implicados en la gastrulación, así como la metástasis del cáncer.

Aunque relativamente desconocido, se cree que la adhesión célula a célula para jugar un papel central en la constricción apical 1. La genética de Drosophila es muy adecuado para las investigaciones nivel de células individuales que exploran los mecanismos moleculares de regulación. Este modelo nos permitirá descubrir la importancia de la constricción apical durante la gastrulación. Por otra parte, este método se puede utilizar para detectar los genes implicados en la metástasis del cáncer. La captura de imágenes en directo de Drosophila gastrulación nos ha permitido además a entender con mayor detalle los mecanismos moleculares que regulan el reordenamiento de los tejidos. En este documento, se proporciona una descripción completa de un método simple para lograrlo.

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Protocol

NOTA: Las moscas transgénicas utilizadas en este estudio son las siguientes: DE-cad 10 :: GFP.

1. Preparación de la placa de Apple

  1. Preparar una mezcla de 12,5 g de agar, 125 ml 100% disponible comercialmente jugo de manzana, 12,5 g de glucosa, y 375 ml de H 2 O. Se calienta la mezcla en el microondas y se vierte en una placa de cultivo celular de 3 cm. Almacenar la mezcla a 4 ° C para uso futuro.
  2. Después de preparar la placa de manzana, añadir una capa delgada de pasta de levadura amasada en la parte superior de la misma para permitir que las moscas de la puesta de huevos.

2. Preparación de embriones y el Protocolo de imágenes en vivo

  1. Coloque aproximadamente 50 moscas (25 machos y 25 hembras) en una botella para aparearse y posteriormente poner huevos durante la noche en una placa de manzana cubierta en la levadura amasada. Coloque la placa de jugo de manzana en la boca de la botella. Mantenga la botella boca abajo en una incubadora. Envolver las botellas de plástico Drosophila acciones con papel de aluminio para impulsar THe vuela a poner más huevos.
  2. A la mañana siguiente, reemplace la placa de jugo de manzana vieja por una nueva.
  3. Deje que las moscas ponen sus huevos durante 3 a 4 h envolviendo la botella con papel de aluminio.
  4. De tres a cuatro horas más tarde, recoger los embriones en un colador de embrión a partir de la placa de jugo de manzana con un pincel o algodón malo y lavarlos con PBS. Lavar los embriones de 2 a 3 veces más con PBS en placas de cultivo de 12 pocillos.
  5. Dechorionate los embriones con 50% de lejía por 5 min en placas de cultivo de 12 pocillos.
  6. Tras el proceso de dechorionation, lavar los embriones de 2 a 3 veces más con PBS.
  7. La transferencia de los embriones para una placa de cultivo celular 3 cm que contiene PBS y seleccione etapa 5 embriones bajo el microscopio basado en el nivel de transparencia en sus fronteras. Pipetear los embriones progresivo a través de una punta de pipeta 200 l.
  8. A continuación, coloque dos embriones seleccionados en un cubreobjetos de vidrio, y eliminar el exceso de PBS con un pañuelo de papel torcido. Orientar los embriones lado dorsal arriba enel cubreobjetos usando un papel de seda torcido. Después de eso, una los embriones a la cubreobjetos de vidrio con grasa de silicona utilizando una aguja fina y papel de seda trenzado.
  9. Añadir una pequeña gota de aceite de halocarbono 700 en los embriones y colocar el cubreobjetos que contiene los embriones al revés en la corredera dentada, dejando un poco de espacio en la parte inferior de la corredera.
  10. Examinar los embriones utilizando un sistema de imagen confocal, un / 488 láser de argón, y un objetivo de inmersión en aceite (63X).
    NOTA: La identificación del embrión en la etapa de desarrollo apropiada es importante para capturar imágenes del evento gastrulación. En estas condiciones, observan casi todos los embriones se desarrollan normalmente hasta al menos la etapa 14. El embrión se analizaron puede cultivarse más de desarrollarse como un adulto.

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Representative Results

Aquí, mostramos los eventos de gastrulación en el embrión de Drosophila y una descripción general del procedimiento de preparación del embrión (Figura 1). Las membranas celulares se marcaron utilizando DE-cadherina :: GFP y formación de imágenes en vivo de movimientos de las células se realiza en el momento de la gastrulación en Drosophila (Figura 2). Desde moscas DE-cadherina GFP nos permiten visualizar las uniones de adherencia celular, somos capaces de rastrear la forma celular apical y movimientos que utilizan este sistema. Más importante aún, este sistema también permite realizar la trazabilidad de los patrones de expresión de cadherina-DE endógenos.

Figura 1
Figura 1: Descripción general del embrión procedimiento de preparación. A) Establecer las moscas para la puesta de huevos. B) Recoger los embriones y colocarlos en un colador de embrión. C) Después de lavaring los embriones con PBS, dechorionate inmediatamente. D) transferir los embriones a una placa de cultivo celular de 3 cm usando PBS. E) Pipetear los embriones que se encuentran en la etapa de desarrollo correcto y colocarlos en un cubreobjetos. F) Una los embriones a la cubreobjetos utilizando grasa de vacío. G) A continuación añadir una gota de aceite de halocarbonos en el cubreobjetos. H) Por último colocar el cubre boca abajo sobre la corredera dentada. Los embriones ya están listos para la imagen de lapso de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: El resultado de un procedimiento experimental que utiliza el documento DE-cad :: GFP basada en imágenes en vivo durante la gastrulación. Las membranas celulares se marcaron usando DE-cadherina ::GFP y de imágenes en vivo de células movimiento a continuación, fue capturado por aproximadamente 500 s durante la gastrulación de Drosophila. perímetros apical de células se visualizaron utilizando la fluorescencia de GFP de la DE-Cad con el fin de rastrear las zonas apicales de las células individuales utilizando un conjunto representativo de imágenes con lapso de tiempo; Barra de escala = 20 micras. Las puntas de flecha indican dónde se producen constricción apical y la invaginación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Halocarbon oil 700 Sigma MKBH 5726
Vacuum grease Silicone Beckman 335148
Glass coverslip  Matsunami glass Thickness No1 24 - 36 mm
Embryo stariner Corning Corning3477
Plastic Drosophilla Stock Bottles Hitec MKC-100
DE-Cadherin knock-in flies REF (10)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15, (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193, (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13, (1), 3 (2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5, (3), (2016).
  6. Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
  7. Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35, (3), 1657-1663 (2016).
  8. Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527, (7579), 525-530 (2015).
  9. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119, (6), 1420-1428 (2009).
  10. Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (20), 8284-8289 (2009).

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