מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של צומת סין- פרוזדורי העכבר

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיפוי אופטי של פעילות חשמלית מן אטריום ימין בעכבר במיוחד צומת סין-פרוזדורים, ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם המכונים הלאומיים מדריך הבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (NIH פאב. מס '80-23). כל שיטות ופרוטוקולים שימוש במחקרים אלה אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים ויסקונסין ועדת שימוש פרוטוקול בעקבות הנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי ה- NIH (פרסום מס '85-23, מתוקנת 1996). כל בעלי החיים המשמשים במחקר זה קיבלו טיפול אנושי באמות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

הסרת לב 1. Langendorff זלוף

  1. לפני בידוד לב, פתרון Tyrode חם 37 ° C באמצעות אמבט מים ומעייל מים.
  2. להרדים את העכבר עם 5% isoflurane / 95% O 2.
  3. ודא רמה נאותה של הרדמה על ידי סימון אובדן רפלקס הכאב.
  4. בצע פתיחת בית החזה. פתח את החזה באמצעות 5.5 מעוקל "מספריים מאיו ו -5.5" קלי עוצר דמום עבורפטריות לבנות לעשות 1 ס"מ לחתוך על החלק הקדמי של בית החזה.
    1. במהירות לחלץ את הלב מהחזה (תוך 30 שניות). השתמש 4 "מלקחיים מעוקלים איריס לתפוס את רקמת הריאה ופצע את הריאות, בלוטת התימוס ולב יחד עם קרום הלב באמצעות 4.3" מספרי איריס. אין לתפוס את הלב ישירות.
    2. לשטוף אותו מחומצן (95% O 2/5% CO 2), בטמפרטורה קבועה (36.8 ± 0.4 ° C) שונה הפתרון של Tyrode. השתמש הרכב הפתרון הבא (מ"מ): 128.2 NaCl, KCl 4.7, 1.19 לאא 2 4 PO, 1.05 MgCl 2, 1.3 CaCl 2, 20.0 NaHCO 3, ו -11.1 גלוקוז (pH 7.35 ± 0.05).
  5. בעוד שטוף באותו פתרון, לזהות את הריאות, בלוטת התימוס, ורקמת שומן. בזהירות לנתח אותם מהלב. השתמש מעוקל 3 "מספרי Vannas-טובינגן ו -4.3" # 5 מלקחיים.
  6. ואז לזהות את אבי העורקים ואת cannulate אותו על צינורית מחוייט 21 G. השתמש בשתי 4.3 מעוקל "כוח 5B #ps.
  7. לאחר cannulation, perfuse זמנית (באמצעות צינורית בקצב הזרימה של ~ 5 מ"ל / דקה, זה צריך להיות מותאם בהתאם ללחץ אבי העורקים, ראה להלן) Superfuse (באמבטיה בקצב הזרימה של ~ 50 מ"ל / דקה) בלב עם פתרון Tyrode התחמם מסונן לאורך הניסוי כולו. להעביר את הפתרון זלוף דרך מסנן ניילון ב-קו 11 מיקרומטר כדי למנוע סתימה של זרימה כלילית.
  8. באמצעות מתמר הלחץ (או מד לחץ) מחובר באמצעות מנעול 3 כיווני ברזלים Luer לקו זלוף, לפקח על לחץ אאורטלי ולתחזק אותו בין 60 ל 80 מ"מ כספית. התאם את מהירות זלוף במידת הצורך כדי לשמור על לחץ אאורטלי בטווח זה.

2. מיפוי אופטי של SAN מהלב Whole-perfused Langendorff

  1. מִכשׁוּר
    1. מניחים את הלב אופקית ואת הסיכה איפקס חדרית לתחתית מצופה סיליקון של החדר באמצעות 0.1 מ"מ סיכות בקוטר pיימנע נגרמת זרם תנועה במהלך הניסוי. 12
    2. מחדיר צינורית סיליקון קטנה (0.012 "מזהה x .005") לתוך החדר השמאלי (LV) דרך הווריד ריאתי, פרוזדורי השמאל (LA) ואת שסתום צניפי (MV). תקן את הצינור על ידי תפר משי (4-0) כדי רקמת החיבור ונשמע.
    3. מקם את הלב עם הצד האחורי שלה פונה כלפי מעלה (איור 1 א ', פאנל משמאל).
    4. הצמד את קצה תוספת RA (Raa) לתחתית סיליקון של החדר באמצעות סיכות 0.1 מ"מ קוטר minutien. התאם רמתו כדי להפוך את פני השטח האחורי של הדירה RA ולאפשר לו להיות ממוקם במישור המוקד של המצלמה. זה יאפשר מדידות אופטיות מאזור המשטח המקסימאלי של אטריום.
    5. נוז מעולה (SVC) ונח (IVC) וריד נבוב ידי תפר משי (4-0), למתוח ולהדק את הקצה השני של התפר לתחתית תא מצופה סיליקון (ראה איור 3 א). ודא התפרים אינם חוסמים אתבתחום האופטי של העין.
    6. מניחים את האלקטרודה צעדה מחוייט על קצה Raa. כדי להפוך אלקטרודות, סיליקון לשימוש מצופה חוטי כסף בקוטר 0.25 מ"מ, עם 0.5 מ"מ מרחק בין האלקטרודה ונטולה סיליקון עבור באורך של 1 מ"מ בסוף הצעדה. אז במקום שני מחט מ"מ א.ק.ג. 12 (29-מד) אלקטרודות monopolar סמוך לבסיס של הימין החדרים שמאל. מניחים את האלקטרודה א.ק.ג. הקרקע ליד הקודקוד של חדרי הלב.
  2. הַכתָמָה
    1. מאז הוא צבעי ניאון ו blebbistatin uncoupler אלקטרו מכאניות הם רגישים לאור, לבצע את כל ההליכים המתוארים להלן בחדר חשוך. ראשית להכין מתח רגיש לצבוע RH-237 או di-4-ANNEPS כפתרון המניות, 1.25 מ"ג / מ"ל ​​ב דימתיל sulfoxide (2.5 מ"מ), aliquot זה (30 μl כל אחד) ולאחסן את aliquots ב -20 מעלות צלזיוס.
    2. לדלל 5-10 μl של פתרון צבע המניות ב 1 מ"ל של התחמם (37 ° C) פתרון Tyrode ואז מזריקים אותו לתוך קו זלוף כליליתעל פני תקופה של 5-7 דקות באמצעות פיית הזרקת אונליין Luer.
    3. הכן blebbistatin כפתרון המניות (2 מ"ג / מ"ל ​​ב sulfoxide דימתיל, 6.8 מ"מ) מראש ולאחסן אותו ב 4 ° C.
    4. לאחר 20 דקות של ייצוב, להוסיף 0.5 מ"ל של התחמם (37 ° C) blebbistatin ב perfusate לדלל 0.1 מ"ל של blebbistatin ב 1 מ"ל של התחמם (37 ° C) פתרון Tyrode. ואז מזריק לתוך קו זלוף כלילי על פני תקופה של 5-7 דקות באמצעות פיית הזרקת אונליין Luer.

3. מיפוי אופטי של SAN מן הכנת הפרוזדורים המבודדת

  1. מִכשׁוּר
    1. להכנת פרוזדורים מבודד, לבודד cannulate את הלב כפי שתואר לעיל בצעדים 1.1-1.5 להכנת כל-הלב.
    2. לנתח את החדרים הרחק מהצד הקדמי. ראה איור 1 א, הפאנל הימני, חתך 1 # לפרטים.
    3. פתח את RA על ידי חיתוך דרך va tricuspidlve (טלוויזיה) לאורך ציר טלוויזיה-SVC. ראה איור 1 א, פנל ימני, לחתוך 2 # לפרטים.
    4. חותכים את איבר המדיאלי של terminalis crista כדי לפתוח את Raa. ראה איור 1 א, פנל ימני, לחתוך 3 #.
    5. פתח את הקיר בחינם פרוזדורים הקדמיים על ידי ביצוע חתך קו האמצע של # לחתוך הקודם 3 לקצה בפינה הימנית התחתונה של Raa, משתטח להצמיד לקיר חינם הפרוזדורים לתחתית תא מצופה סיליקון. ראה בכיוון המסומן בחץ החלול באיור 1A, לקצץ 4 #. שמור על שפה של רקמות חדרית עבור מצמיד הכנה כדי למנוע נזק הפרוזדורים.
    6. באופן דומה, פתוח LA ידי חיתוך דרך MV יחד בפינת MV-העליונה של תוספת LA (LAA).
    7. לפתיחת LAA, לחתוך מאמצע של LAA נפתח, דרך הקיר בחינם פרוזדורים הקדמי עד סמוך שפה באמצע LAA.
    8. פתח את alo הקיר בחינם פרוזדורים הקדמיng באותו הכיוון, ואז לשטח ומהדקים אותו לחלק התחתון של תא Sylgard מצופה.
    9. חלקית להסיר את הרקמה במחיצת interatrial. זה יקטין פיזור של האות האופטי מרקמות שאינו בפוקוס. לכן, הן LA ובדלקת מפרקים שגרונית וכן SAN וצומת Atrio-חדרית (AVJ) נגישים בהכנה זו (איור 1 ב).
    10. הרם את ההכנה הסופית בכ 0.5 מ"מ מתחתית החדר צופה סיליקון על מנת לאפשר superfusion ממשטחים epicardial ו endocardial שניהם.
    11. Superfuse ההכנה עם התחמם (37 ° C) פתרון Tyrode בקצב קבוע של ~ 12 מ"ל / דקה עבור זרם ממוקד הממוקם ליד SVC ו ~ 30 מ"ל / דקה עבור superfusion אמבטיה.
    12. מניח את האלקטרודה 2 מחוייט צעדת Ag / AgCl (0.25 מ"מ קוטר) על קצה Raa הגזור. אז במקום שני מחט מ"מ א.ק.ג. 12 (29G) אלקטרודות (monopolar) ליד Raa ו LAA, בהתאמה. מניחים את הקרקע א.ק.ג. הנבחררכבו סמוך AVJ.
  2. הַכתָמָה
    1. בצע בפנייה ישירה של מתח רגיש לצבוע (RH-237 או di-4-ANNEPS). לשם כך, לדלל 1-2 μl של פתרון המניות לצבוע 1 מ"מ של התחמם (37 ° C) פתרון Tyrode ולאט לאט לשחרר את צבע מדולל על פני השטח של הכנה באמצעות פיפטה 1 מ"מ.
    2. לחלופין, לבצע מכתים פרוזדורים עם מתח רגיש לצבוע באמצעות זלוף הכליליים של הלב-perfused Langendorff דומה לזה שתואר לעיל לעריכת כל-הלב (צעדים 2.2.1-2.2.2).
      1. לאחר מכתים זלוף כלילית, לבודד את הכנת פרוזדורים כמתואר. בצע מכתים משטח נוסף בעת צורך להגיע לרמת קרינה השביע רצון. בידוד מהיר פרוזדורים לא להלבין את הצבע ואינו משפיע על האיכות מכתימה.
    3. לשתק את ההכנה עם אלקטרו-מכניות uncoupler, blebbistatin. לדלל 3-5 μl blebbistatin פתרון המניות התחמם (37 ° C) פתרון Tyrode ולאט לאט לשחרר את blebbistatin מדולל על פני השטח של הכנת הפתרון שמסביב. מאז blebbistatin הוכח להיות רגישה לאור, 13,14 להימנע מחשיפה ארוכה לאור במהלך הכנת המכתים.
    4. בצע יישום blebbistatin נוסף ככל הדרוש כדי לדכא התכווצות. בדרך כלל עד 3 יישומים נוספים (3-5 μl לכל יישום) יכול לשמש כדי לדכא את חפץ התנועה מספיק כדי במדויק לשחזר SAN והפעלת פרוזדורים.
    5. הוסף עוד 0.5 מ"ל של blebbistatin חימם את perfusate. במהלך הליך זה, להשהות את superfusion למשך 30 שניות כדי לאפשר לצבוע / blebbistatin להכתים את רקמות פרוזדורים.

4. מיפוי אופטי להגדיר

הערה:. תיאור מפורט של מערכת המיפוי האופטית מסופק במקום אחר 12

  1. השתמש מצלמה עם TEMרזולוציה poral של 2,000 מסגרות / שנייה ומעלה, וכן סדרה של עדשות הקבל להגיע ברזולוציה מרחבית של 100 מיקרומטר / פיקסל ומעלה. זה נדרש לשחזר הפעלת SAN התפשטות intranodal.
  2. כדי להפחית חפץ תנועה מהפתרון הרוטט, לתקן כוס כיסוי קטנה על פני השטח של הפתרון על הלב / הכנת הפרוזדורים המבודדת.
  3. השתמש אור עירור (520 ± 45 ננומטר אורך גל) המסופק על ידי מנורת הלוגן קבועה שוטפת, רעש נמוך. כוון את קרן האור המסוננת על ההכנה באמצעות ספר אור מפוצל גמיש.
  4. מסנן הקרינה הנפלטת על ידי מסנן ארוך לעבור (> ננומטר 715). אסוף, לספרה ולשמור אות הניאון רכשה על תוכנת מחשב באמצעות המסופקת על ידי יצרן המצלמה.

5. עיבוד נתונים

הערה: נתוני מיפוי אופטי נאסף ונשמר כסדרה של מטריצות של עוצמת פלורסנט בנקודות זמן שונות. כל פיקסל represeNTS מידה של עוצמת פלורסנט שנאספו ממיקום מסוים על הכנת הרקמה בנקודת זמן ספציפית. קרינת רקע תוסר באופן אוטומטי לפיקסל כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של שינויי קרינה המיוצרים על ידי שינויי מתח הממברנה הפוכים להתכתב עם פוטנציאל פעולה (APS) נמדד על ידי מערכות microelectrode. פירוט השלבים השונים בעיבוד נתוני הדמיה אופטיים, כוללים פילוח תמונה, סינון מרחבים, סינון זמני, והסרה להיסחף בסיס, ניתן בסקירה הממוקדת. 15

  1. באופן ידני או באמצעות האלגוריתם המיוחד (למשל, זיהוי thresholding או קצה) 15 כדי לקבוע גבולות רקמה, ליצור מסכה בינארי של 1 (פיקסלים כלולים) ו 0 (פיקסלים נשללו) ולהחיל את המסכה כל מסגרת ברצף. תהליך זה יוצר תמונה בינארית שמדגישה תחומי העניין לעיבוד נוסף.
  2. כדי לשפר את יחס אות לרעש של optנתוני iCal, לסנן את האותות בתוך האזורים הנבחרים של עניין. לשם כך, השתמש מרחבית (מיצוע כלומר מפיקסלים זוהר שכנות כפי שהוגדר על ידי פח פיתול רצוי או הקרנל, למשל 3 x 3 או עבור נתונים רועשים, 5 x 5) ו / או סינון זמני (למשל, Butterworth, סוג צ'ביצ'ב 1, סוג 2 Chebyshev, וכו אליפטיים) (איור 2). זכור את האפשרות של חפצים מסוננים הנגרמת כאשר מפרשים את הנתונים. לפרטים נוספים, ראה סקירה. 15
  3. סור סחיפה של בסיס בהקלטות אופטיות בעת צורך (באמצעות סינון גבוה לעבור או הולם פולינום כדי האות המקורי) ולאחר מכן לנרמל כל אות פיקסל בין 0 (קרינת מינימום) עד 1 (קרינה מרבית).
  4. בחר חלון זמן שמקיף את פעמי ההפעלה של כל הפיקסלים על התפשטות AP יחידה. הקצאת כל פיקסל זמן ההפעלה שלו כזמן מנגזרת upstroke המקסימלי (מקסימום DF / dt, כאשר F הוא fluorescence עצמה). שימוש בכל זמני ההפעלה פיקסל, לשחזר את מפת הפעלת isochronal. כל isochron ובכך יציג את פיקסלים מופעל בעת ובעונה האחת.
  5. כדי לשחזר את משך AP מפת התפוצה (APD), עבור כל פיקסל לחשב את המשך הזמן בין זמן ההפעלה ואת הזמן ברמה מסוימת של repolarization (למשל, ב 80% של repolarization, APD 80). באמצעות כל ערכי APD פיקסל, לשחזר את מפת isochronal הפצת APD. כל isochron ובכך יציג את פיקסלים עם אותו APD.
  6. כדי לחשב מהירות ההולכה לריבוי AP, להתאים משטח של התכשיר לנתונים בזמן ההפעלה מחושב ב 5.4. לשם כך, השתמש החלקת משטח הקרנל פולינום משטח הולם או מקומית ולאחר מכן לחשב וקטורים מהירי הולכה מקומי מפני השיפוע של המשטח המצויד.
  7. כדי ליצור את המפה repolarization, להקצות לכל פיקסל זמן repolarization שלה, כפי שהוגדר נגזרת שנייה המרבי (ד 2 F / dt2) של האות האופטי בסוף של OAP, או בזמן repolarization 90%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מיפוי אופטי של SAN ללא פגע מן הלב perfused-Langendorff
דוגמא טיפוסית של גובה מפת הפעלת RA המשוחזרת עבור קצב סינוס ספונטני מוצגת באיור 3 עבור לב עכבר-perfused Langendorff. נקודת ההפעלה מוקדם ממוקמת בתוך האזור intercaval ליד SVC שבו SAN מוגדר מבחינה אנטומית. 3,16 שתי מפות קונטור RA ההפעלה רכשו ב 1.0 ו 0.5 קצב דגימת msec מוצגות באיור 3 ב.

כדי להעריך תפקוד SAN, מדדנו את זמן החלמת SAN (SANRT). 9 לאחר צעדת Raa עבור דקות 1 לפחות 10-12 הרץ, הגירוי החשמלי הופסק SANRT חושב את מרווח הזמן בין AP האחרון שנתפס ואת הראשון AP ספונטנית (איור 3 ג). SANRT תוקן על קצב הלב (כלומר SANRT <sub> ג) על ידי חישוב ההפרש בין SANRT ואת אורך מחזור בסיס. בנוסף, מיקומו של קוצב הלב שלאחר הצעדה הראשונה זוהה. לדוגמה זו, SANRTc היה כ -49 מילי-שניות.

הפעלת Atria ו- SAN מבודדת
הפעלת הכנת הפרוזדורים המבודדת במהלך קצב סינוס ספונטני מוצגת באיור 4 א. זה מקורו אנטומית המוגדרת SAN ליד SVC עם חזית גל רחבה שהתפשטה anisotropically ברחבי RA, עם שני כיוונים מועדפים הולכה ליד קצות SAN העליונים ונחותים ולחסום מוחלטים בכיוון במחיצה (מסומן במפות הפעלה באיור 4 א) . מפת ההפעלה רכשה ב 1 קצב דגימת msec מראה על שטח נרחב של הפעלה מוקדם. גידול קצב הדגימה ל 0.5 msec ו 0.3 msec מאפשר לנו לזהות את האזור המדויק של מיקום הקוצב המוביל. Wדואר צופה טיפוסי, הכה אל הכה עמדת monofocal יציבה של קוצב הלב המוביל אשר תואם את אזור קוצב הראשים אפיינו בעבר electrophysiologically ידי microelectrodes זכוכית 17 ומיפוי אופטי 8-11,18,19 כמו גם על ידי immunolabeling עבור connexin45 ו HCN4 . 6,16

כפי שתואר קודם לכן, פוטנציאל הפעולה אופטי SAN מורכב אות דו-שלבית הכוללת שני מרכיבים נפרדים: המרכיב עולה SAN לאט ואת upstroke במהירות העולה של שריר הלב פרוזדורים (רכיב פרוזדורים) (איור 4 ב) 20 בגלל פיזור אור. תהליכים, OAP מייצג פעילות חשמלית ממוצעים הנובעים מספר שכבות של תאים בתוך הרקמה. העומק ורוחב הפיזור נשלט על ידי קבוע בחלל, אשר נקבע על ידי תכונות פיזור וקליטות אור יכול להגיע עד 1.5-2 מ"מ. בגלל condu SANעיכוב ction, הסן AP תמיד מקדים פעילות פרוזדורים במהלך הפעלה פיזיולוגית (האיור 4B). כדי לחשב את המעבר מן SAN אטריום (זמן הולכה כלומר SAN, SANCT), השתמשו גם את נקודת הזמן שבו אות SAN פעמי רכיב מגיע ל- 50% של משרעת מרכיב SAN, או השיא הראשון של דו-שיא בנגזרת הראשונה OAP (DF / dt). SANCT מאזור הפעלת SAN המוקדמת אל RA היה ~ 5 msec, דומה לזה שנמדד על ידי microelectrodes זכוכית.

SAN Recovery Time
באופן דומה, SANRT נמדדה בהכנת הפרוזדורים המבודדת (האיור 4D). לשם כך, ההכנות פרוזדורים היו בקצב של 12 הרץ באמצעות אלקטרודה צעדה הממוקם בפינה של Raa דקות לפחות 1. 9 לדוגמה זו, SANRTc היה כ -34 מילי-שניות, אשר ניתן להשוות עם זה נמדד Langendorff-perfused לב (איור 3 ג). בנוסף, מיקומו של קוצב הלב שלאחר הצעדה הראשונה זוהה.

קצב הלב ואת יציבות אות פלורסנט לאורך זמן
אם מתהליכי טענת הניתוח והצבע הם אחריו כראוי, לא צריכים להיות שום שינוי משמעותי המאפיינים הפיסיולוגיים של אטריום. באיור 5, אנו מציגים את קצב הלב נמדד לפני ואחרי ההליך בבידוד פרוזדורים במהלך 3 זלוף hr. אין שינויים משמעותיים מדופקים נצפו גם במהלך בידוד אטריום או לאחר טעינת צבע.

למרות מכתים עורק עשוי לדרוש כמות גדולה של צבע, את היציבות של אות הניאון בתוך הרקמה באזור SAN שנראית טוב יותר באמצעות שיטה זו בטעינה. באיור 6, אנו מציגים ריקבון עוצמת אות לאורך זמן הן מכתים כלילית שטח. בשנת t הוא רקמת SAN, IC 50 (אשר מציין את התקופה כאשר עוצמת אות מנוחה 50%) היא כ 107 דקות לאחר מכתים כלילית, כמעט פי שניים כל עוד זה של משטח מכתים.

איור 1
איור 1:. בידוד של הכנת פרוזדורי העכבר (א) הליכי כירורגיים המבוצעים לבודדים כנת עכבר פרוזדורים. הנוף האחורי של הלב מוצג. הקיצוצים כל מוצג על ידי קווים אדומים מנוקדים ומסומנים לפי מספרים לפי הסדר בצע. ראה פירוט טקסט. (ב) מתאר סכמטי של הכנת פרוזדורי העכבר המבודדת מראה את תכונות אנטומיות העיקריות, לרבות מבנה trabecular של השמאל וימין הנספחים פרוזדורים וכן את המיקום של הסינוס-פרוזדורים (SAN; שכותרתו ידי סגלגל אפור). כל הקיצורים מוסברים הדמות."Target =" tp_upload / 54,773 / 54773fig1large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. איתות גולמית ומעובד נרשמה ב 0.3, 0.5 ו 1 msec / מסגרת אותות גלם נאספים פיקסל בודד. לאחר 3 x binning 3, האותות מסוננים על ידי השימוש באלגוריתם Butterworth הנמוך לעבור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: Whole-לב מיפוי אופטי של SAN (א) השמאל, צילום של הכנה אופיינית בשימוש עבור המיפוי של SAN מהלב ללא פגע.. הריבוע הכחול מראה את השדה האופטי שלנוף (6 מ"מ על 6 מ"מ). נכון, בתחום אופטי מבט שנתפס באמצעות המצלמה גבי עם ציונים דרך אנטומיים. SVC ו- IVC: וריד נבוב עליונה ונחות; Raa: תוספת פרוזדורים תקינה; RV ו LV: ימין חדרי שמאל; PVS: ורידים ריאתי. (ב) מפות הפעלת קונטור צבע רכש עם 1.0 msec (משמאל) ו -0.5 msec (מימין) קצב דגימה. מהימין של כל מפה, ציר זמן צבע התואם המציין זמן הפעלת פרוזדורים (מנקודת ההפעלה המוקדמת בכחול, עד לנקודת ההפעלה האחרונה באדום) מוצגת. אתר הפעלת פרוזדורים המוקדם מסומן בכוכבית. (C) זמן ההחלמה SAN (SANRT) נמדד בהכנת-בלב שלם. דוגמאות מייצגות של ומפות מתאר הפעלת פרוזדורים משוחזרות עבור גירוי הצעדה האחרונה (S1) ועבור פעימת פרוזדורים שלאחר הצעדה הראשונה (A1) מוצגות עבור הפעימות שנבחרו על עקבות OAP נציג עליון.אתרים של הפעלת פרוזדורים המוקדמת מסומנים בכוכבית. BCL:. אורך מחזור בסיסי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של צומת סין- פרוזדורי העכבר (SAN) ממשטח Endocardial של מבודד האטרייה (א) תצלום של הכנת SAN עכבר טיפוסי (6 מ"מ x 6 מ"מ) ומפות מתאר ההפעלה המתאימה לו. להשיג ב 1.0 msec, 0.5 msec, ו -0.3 שיעורי דגימה msec. SAN ו- אזור גוש שכן מוצגים על ידי חצים. סולמות זמן צבע לציין את מועד הפעלת פרוזדורים. הכוכבית מציינת את מיקומו של הקוצב המוביל. Raa: תוספת פרוזדורים נכונה, SVC ו INC: וריד נבוב עליון ונחות, RV: ימין חדר, AVJ: Atrio-ventricul ar צומת, CT: crista terminalis, IAS: הבין-פרוזדורי מחצה. (ב) מנגנון של הרכיבים הכפולים של הקלטת OAP מאזור SAN העכבר. ראה פירוט טקסט. . (C) OAPs רשמה מהמרכז באזור SAN (הכחול), באתר עירור הפרוזדורים המוקדם (הירוק) ואתר הפעלת RA האחרון (אדום) ריבועים: מעבר קטרים כדי waveform פרוזדורים עם זמן הולכה כולל השווה ל -5 msec. תשוו את זה עם עיכוב זמן הפעלה RA כולל השווה ל -11 מילי-שניות. (ד) זמן החלמת SAN (SANRT) נמדד בהכנת הפרוזדורים המבודדת. דוגמאות מייצגות של ומפות מתאר הפעלת פרוזדורים משוחזרות עבור גירוי הצעדה האחרונה (S1) ועבור פעימת פרוזדורים שלאחר הצעדה הראשונה (A1) מוצגות. אתר של הפעלת פרוזדורים המוקדמת מסומן בכוכבית. BCL - אורך מחזור בסיסי.k "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: קצב הלב נמדד לפני ואחרי הליך הבידוד פרוזדורים (א) ו במהלך 3 זלוף שע '(B). (א) שיעור לב פועם ספונטני מוצג לפני ואחרי בידוד פרוזדורים לשני סוגים של מכתים פרוזדורים: מכתים משטח לאחר הבידוד (לא מכתימים כלילית קודם) ועל מכתים כלילית לפני בידוד פרוזדורים. (ב) יציבות בקצב הלב הפועם ספונטני על זלוף 3 hr מוצג להכנות פרוזדורים שאינו מוכתם עבור צבע פלואורסצנטי Blebbistatin ההכנות פרוזדורים מוכתמים. נתונים מוצגים כפי ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6:. עוצמת אות דעיכה לאורך זמן העוצם של אותות בשני השיטות טעינה (טעינה כלילית מצוינת אדום; וטעינת שטח מצוינת בכחול) נמדד זמם לאורך הזמן. עוצמות האות היו ממוצעים מאזור 7 על ידי 7 פיקסלים בארבעה מיקומים טיפוסיים של אטריום ימין: trabecula (TRAB), קשר הסינוס (SAN), תוספת אטריום ימין (Raa) ובסינוסים כלילית (CS). ערכי 50 IC חושבו אז ומסומן בכל עקומות הדעיכה. ריקבון עוצמת האות בשתי שיטות הטעינה היה דומה TRAB ו Raa. IC 50 של טעינת עורקי CS היה עוד כ -20 דקות. ב SAN, ערך זה לטעינה עורקת היה כמעט שני לקפל גדול יותר לעומת טעינת שטח, אשר מציינת כי שיטות טעינת עורקים הביאו יציבות טובה יותר של לצבוע Tiss SANue לאורך זמן. נתונים מוצגים כפי ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, הצגנו שני סוגי ההכנה העכבר SAN: 1) ללא פגע SAN בלב שלם-perfused Langendorff, ו -2) SAN ב מבודד, פתח הכנה פרוזדורים. אלה שני סוגים של הכנה לשרת מטרות ניסוי שונות. בהכנה בלב שלם-perfused Langendorff, מבנה הפרוזדורים ללא פגע נשמר מה שהופך אותו ניתן ללמוד הפרעות קצב פרוזדורים מורכבות כמו פרפור פרוזדורים וכן אינטראקציות בין SAN ו- אטריום במהלך tachyarrhythmias ההולך ושב. 6 לעומת זאת, בהכנת הפרוזדורים המבודדת , האטריום הנו נפתח שטוח לתוך מבנה פסאודו שני ממדי שבו חבילות אנטומיים מוטרדות תלת ממדי. זה עשוי להשפיע על האנטומיה של מסלולים ההולך ושב מה שהופך את הכנת פרוזדורים מבודד לא אידיאלי ללימוד arrhythmogenesis פרוזדורים. עם זאת, שימוש בסוג זה של הכנה, את המיקום של הקוצב המוביל (ים) אתרים, הולכת intranodal, ו- p התפשטות APattern ניתן דמיין במדויק וחקר בפירוט. בנוסף, פגעו פרוזדורים להופיע להיות מוגבלים על ידי נוף אחורי בעוד בהכנה המבודדת, פני שטח הפרוזדורים כולו זמין למיפוי אופטי.

יתר על כן, הכנה פרוזדורים מבודדים מאפשר מיפוי מבנים תפקודי של אטריום ידי פתרון מייקרו המורכב של רשת trabecular כפי שניתן לראות באיור 4. לשם כך, מרחבית גבוהה (100 מיקרומטר / פיקסל ומעלה) ובזמן (2,000 fps ומעלה) החלטות יש להשתמש כי זה קריטי לְפַרֵט הוא דפוסי הפעלת הפרוזדורים ו- SAN, אשר יכולים להיות חפיפה נוספת עם מבנים זהים. בעוד 1,000 fps ברזולוציה זמנית עלולה להיות מינימום לשחזר הפעלת פרוזדורים (שנמשכה 10 - 20 msec), 2,000 fps צריך להיחשב כהחלטה זמנית מינימום עבור הולכת intranodal (שנמשכה ~ 5 ms ולכן ניתן החמיצה נמוך החלטות) ולפעול SANמדידות ivation כפי שניתן לראות מהתרשים 4. זה עשוי לאפשר לוקליזציה של arrhythmogenic "נקודות חמות" (כגון מוקדים חוץ רחמים או החזרה מעוגנת) במהלך פרפור / רפרוף פרוזדורים אשר יכול לצאת מן סופרפוזיציה של אזורים של שיפוץ תפקודי משמעותי עם אלה של סיסטיק גבוהה ו / או צימוד התא אל התא מופחת. 21,22 בנוסף, הגישה המתוארת יכול לשמש כדי לחקור מנגנונים אלקטרו של מומים SAN, לרבות בלוקי היציאה SAN, הפסקות, הפרעות קצב-ברדיקרדיה טכיקרדיה, תסמונת סינוס חולה וכו.

על ידי החדרה (אפילו או שליש) שנייה בדיקת ניאון, ניתן יהיה לבצע מיפוי אופטי רב-פרמטרית של פעילות חשמלית בשיתוף עם טיפול סידן כמו גם מטבולית ושינויים אחרים. שילובים שונים של צבעים יכולים לשמש מתח- סידן סימולטני, מתח / סידן ratiometric, או הדמית פוטנציאל המיטוכונדריה.

למיפוי אופטי רזולוציה גבוהה זמני, בשל תקופת אוסף fluorophore הקצרה, את האותות של יחס אות לרעש חלש עשויים להיות מוערכים. לכן, הליך עיבוד מיצוע מוחל על אותות קצב לב סינוס או אותות סדרת הצעדה לפי צורך. מקסימום DF / dt מזוהה עבור כל אות בהקלטת תקופה ארוכה. מועדים לפי שעון הפעלה אלה מיושרים אז. תקופת ההגדרה של ההקלטה מרוכז בנקודות זמן אלה הוא לגזור בממוצע מכל או שנבחרו APS, לפי הצורך.

על ידי שימוש מדויק של מכשור ההליך המכתים הנכון, פרמטרי אלקטרו פרוזדורים כולל מהירות הולכה (השווה 3C דמויות 4D עבור מפות הפעלת S1), קצב SAN ספונטני ואריכות ימים של הכנת SAN (איור 5) אינם מושפעים, אשר נשארים יציב עבור 3 שעות או יותר. חשוב לציין כי monit הרציףאורינג של א.ק.ג. צריכה להתבצע על ההליך מכתים כולו כדי להבטיח תפקוד חשמלי רגיל של הלב. היישום של blebbistatin עלול לגרום להאטה בקצב לב חולפת, אבל חוץ מזה, זה לא יניע כל משמרות בהובלת אתרים קוצבים לב או שינויים במורפולוגיה AP כמו גם תואר בעבר. 13

מכתים Surface של תכשיר הפרוזדורים המבודד הוא שלב קריטי. לשם כך, יישום מהיר של הצבע המדולל על פני השטח של הרקמה יש להימנע; במקום לצבוע צריך ליפול על הכנת בחופשיות בשל צפיפות גבוהה של DMSO, אשר משמש הן לצבוע דילולים blebbistatin. הכמות ומהירות הטעינה הכוללת המתאימות צריכות להיות מותאמת כדי לא לגרום לשינויים בקצב לב דרמטיים. ההליך המכתים יכול להיות מיושם מספר פעמים עד האות מגיע לרמה סבירה. יצוין כי יישום ישיר של צבע יכול לגרום נזק לרקמות SAN ולהשפיע pacem שלהaking. לכן, לצבוע צריך להיות מדולל ואת הכמות להחיל צריכה להיות מבוקרת בקפידה. מכתים שטח מתאים אסור לפגוע הכנה או SAN 23 אשר הוערכה על ידי קצב לב בר השוואת מהירות הולכה.

פרוטוקולים מכתימים אלטרנטיביים גם צריכים להיחשב. אלו יכולים לכלול אחת מעמד superfusion 10-15 דקות של הכנה SAN / פרוזדורים עם מתח רגיש לצבוע (RH-237 או di-4-ANEPPS) ב 35 ± 1 ° C 10,19 או הדגירה 30 דקות של הכנה בטמפרטורת החדר (C 20-22 מעלות) בתמיסה Tyrode המכיל את אינדיקטור רגיש מתח. 11

למיפוי אופטי של SAN מהלב כל-perfused Langendorff, צעדי מכשור חשובים לכלול את החדרת הצינורית הקטנה לתוך LV וסגירת SVC ו- IVC. לשעבר מונע עלייה בלחץ מגודש פתרון במהלך ניסויים ארוכי טווח, כמו גם אני עוקבפיתוח schemia לאחר דיכוי התכווצויות חדרית ידי blebbistatin החמצה של הפתרון זלוף. זו האחרונה מאפשר RA כדי לשמור על רמה מסוימת של לחץ תוך פרוזדורים ובכך ממלא את אטריום עם פתרון זלוף משטח באזור intercaval על מנת לחשוף באזור SAN כולו למיפוי אופטי.

לבסוף, מכתים כלילית, בנוסף משטח הטעינה צבע, יכול לשפר באופן משמעותי את עוצמת OAPs SAN אשר עשוי להימשך זמן רב יותר בהשוואה מכתים משטח טהור המשמש במחקרים קודמים. 8,9

יש שימוש blebbistatin יתרונות מרובים לעומת uncouplers אלקטרו האחר כוללים רעילות נמוכה, תופעות לוואי בולטות פחות והתנגדות כישלון כאשר הוא משמש בזהירות. Blebbistatin משקע כאשר הוא מומס בטמפרטורות פחות מ -37 מעלות צלזיוס. 14 גבישי Blebbistatin עלולים לקטוע את שטף כלי דם נורמלי ובכך לגרום מקומיאיסכמיה ולהתגרות אירועים בקצב לא סדיר. 24 בנוסף, במחקרים המשתמשות GFP או צבעי ירוק / צהוב אחרים, משקעים blebbistatin יכול להיחשב בטעות תאים שכותרתו שאמור להילקח בחשבון. מניעת blebbistatin ממטרים היא פשוטה, כלומר, יש לפזר blebbistatin בתוך מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס ומעלה) ובחש תקשורת במרץ.

כדי לנתח APD, ריכוז גבוה של blebbistatin (עד 10 מיקרומטר) יכול לשמש. 13,14,25. באופן דומה, אם כל תרופה מגבירה התכווצות משמשת, בקשה נוספת של blebbistatin מומלץ.

כמו טכניקה חלופית ללמוד SAN עכבר פעילות חשמלית, ברזולוציה נמוכה מערך רבה-האלקטרודה (64 אלקטרודות נפרדות בתוך ריבוע 8 x 8, תצורה עם מרחק אלקטרודה יתר של 0.55 מ"מ) 26 והקלטות microelectrode הזכוכית רצופות עשו במרחק קצר בין impalements לעומת עד 50 מיקרומטר / פיקסל עבור אופטי מיפוי) ולא ניתן להשתמש כדי לנתח מורפולוגיה AP או הדמיה רב-פרמטרית (כגון מתח סימולטני מיפוי אופטי סידן). למרות הקלטות microelectrode זכוכית לספק מידע נוסף על מורפולוגיה AP, כולל ערכים מוחלטים עבור משרעת AP ופוטנציאל נח, הוא מוגבל גם על ידי ברזולוציה מרחבית נמוכה. לכן, ניתן להשתמש בו רק עבור מיקום יציב של הקוצב המוביל אינו ישים ללכוד לנצח ל-היכו שינויים במיקום הקוצב המוביל. במקביל, כפי שהוכח בעבר 3,20 והדגיש במחקר הנוכחי, שיתוף OAP SANnsists של אות דו שלבי whichincludes הן SAN ורכיבים AP שריר הלב פרוזדורים (איור 4 ב). זה ובכך מקשה לחלץ אות SAN טהור ומדויק להעריך מורפולוגיה AP ב- SAN. לשם כך, microelectrodes זכוכית 17 או גישת מהדק הנוכחית על מיוציטים SAN מבודדים צריך להיחשב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, (1), 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110, (4), 609-623 (2012).
  3. Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. (2012).
  4. Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47, (4), 658-687 (2000).
  5. Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. (2013).
  6. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36, (11), 686-697 (2015).
  7. John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133, (19), 1892-1900 (2016).
  8. Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121, (8), 3277-3288 (2011).
  9. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, (2), H482-H491 (2010).
  10. Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593, (5), 1127-1146 (2015).
  11. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (31), 9769-9774 (2015).
  12. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
  13. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  14. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464, (5), 503-512 (2012).
  15. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (7), H753-H765 (2012).
  16. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73, (4), 729-738 (2007).
  17. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52, (1), 40-50 (2001).
  18. Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
  19. Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, (6), H2634-H2643 (2004).
  20. Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106, (2), 255-271 (2010).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
  22. Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36, (35), 2390-2401 (2015).
  23. Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44, (6), 626-634 (2011).
  24. Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60, (2), 109-117 (2010).
  25. Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48, (1), 152-160 (2010).
  26. Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, (7), H1510-H1523 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics