माउस चीन आलिंद नोड के उच्च संकल्प ऑप्टिकल मानचित्रण

Biology

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Summary

यहाँ, हम माउस सही आलिंद और विशेष रूप से चीन-आलिंद नोड से बिजली की गतिविधि के ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, एक उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर।

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Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

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Abstract

Protocol

सभी प्रयोगों राष्ट्रीय देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड संस्थान (एनआईएच पब। सं 80-23) के अनुसार आयोजित की गई। सभी तरीकों और प्रोटोकॉल इन अध्ययनों में प्रयुक्त एनआईएच द्वारा प्रकाशित की देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए दिशानिर्देश निम्नलिखित विस्कॉन्सिन पशु देखभाल और उपयोग प्रोटोकॉल समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है (प्रकाशन नहीं 85-23, संशोधित 1996)। इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी जानवरों की देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में मानवीय देखभाल प्राप्त किया।

1. दिल को हटाने और Langendorff छिड़काव

  1. दिल अलगाव, एक पानी के स्नान और एक पानी जैकेट का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म Tyrode समाधान करने से पहले।
  2. 5% isoflurane / 95% 2 हे के साथ माउस anesthetize।
  3. दर्द पलटा के नुकसान की जाँच करके संज्ञाहरण के उचित स्तर सुनिश्चित करें।
  4. thoracotomy प्रदर्शन। घुमावदार 5.5 "मेयो कैंची और 5.5" के लिए केली hemostatic का उपयोग करके छाती खोलेंCeps एक 1 सेमी छाती के मोर्चे पर कटौती करने के लिए।
    1. जल्दी छाती (30 सेकंड के भीतर) से दिल निकाल सकते हैं। 4 "घुमावदार आइरिस संदंश फेफड़े के ऊतकों हड़पने के लिए और पेरीकार्डियम 4.3 उपयोग करने के साथ एक साथ फेफड़ों, थाइमस और दिल को काटने के लिए" का प्रयोग करें आईरिस कैंची। दिल सीधे हड़पने मत करो।
    2. ऑक्सीजन (95% 2 हे / 5% सीओ 2) में धो, लगातार तापमान (36.8 ± 0.4 डिग्री सेल्सियस) Tyrode समाधान संशोधित। निम्नलिखित समाधान रचना (मिमी) का उपयोग करें: 128.2 NaCl, 4.7 KCl, 1.19 नः 2 4 पीओ, 1.05 2 MgCl, 1.3 2 CaCl, 20.0 NaHCO 3, और 11.1 ग्लूकोज (पीएच 7.35 ± 0.05)।
  5. एक ही समाधान में स्नान करते हैं, फेफड़ों, थाइमस, और वसा ऊतकों की पहचान। ध्यान से उन्हें दिल से काटना। घुमावदार 3 "Vannas-Tubingen कैंची और 4.3" # 5 संदंश का प्रयोग करें।
  6. तब महाधमनी की पहचान करने और एक कस्टम निर्मित 21 जी प्रवेशनी पर यह cannulate। दो घुमावदार 4.3 "# 5 ब बल का प्रयोग करेंभज।
  7. केन्युलेशन के बाद, एक साथ छिड़कना, (~ 50 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर स्नान में) (~ 5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर प्रवेशनी के माध्यम से इस महाधमनी दबाव के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए, नीचे देखें) और Superfuse पूरे प्रयोग के दौरान गर्म और फ़िल्टर Tyrode समाधान के साथ दिल। कोरोनरी परिसंचरण के clogging रोकने के लिए एक लाइन में 11 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर के माध्यम से छिड़काव समाधान गुजरती हैं।
  8. एक दबाव transducer (या एक दबाव नापने का यंत्र) एक 3-तरह छिड़काव लाइन के लिए पानी निकलने की टोंटी Luer ताला के माध्यम से जुड़ा प्रयोग, महाधमनी दबाव की निगरानी और 60 और 80 एमएमएचजी के बीच इसे बनाए रखने के। छिड़काव गति को समायोजित करता है, तो इस सीमा के भीतर महाधमनी दबाव बनाए रखने के लिए जरूरी है।

Langendorff-भरकर रखा पूरे दिल से सैन 2. ऑप्टिकल मानचित्रण

  1. उपकरण
    1. दिल क्षैतिज रखें और पी के लिए 0.1 मिमी व्यास पिन का उपयोग चैम्बर के सिलिकॉन लेपित नीचे करने के लिए वेंट्रिकुलर सर्वोच्च पिनrevent धारा प्रेरित प्रयोग के दौरान आंदोलन। 12
    2. फेफड़े के नस के माध्यम से एक छोटी सी (.012 "आईडी एक्स .005") सिलिकॉन बाएं वेंट्रिकल (एल.वी.) में ट्यूब डालने, बाएं आलिंद (ला) और माइट्रल वाल्व (एमवी)। एक रेशम सिवनी (4-0) लग संयोजी ऊतक करने से ट्यूब को ठीक करें।
    3. इसके पीछे की ओर (चित्रा 1 ए, बाएं पैनल) का सामना करना पड़ के साथ दिल की स्थिति।
    4. आरए उपांग (RAA) चैम्बर 0.1 मिमी व्यास minutien पिन का उपयोग कर के नीचे करने के लिए सिलिकॉन के किनारे पिन। आदेश आरए फ्लैट के पीछे सतह बनाने के लिए और यह कैमरे के फोकल हवाई जहाज़ स्थित होने की अनुमति देने के लिए अपने स्तर पर समायोजित करें। इस आलिंद के अधिक से अधिक सतह क्षेत्र से ऑप्टिकल माप सक्षम हो जाएगा।
    5. फंदा एक रेशम सिवनी (4-0) से बेहतर (एसवीसी) और अवर (आईवीसी) रग कावा, खिंचाव और एक सिलिकॉन लेपित चैम्बर (चित्रा 3A देखें) की तह तक सिवनी के दूसरे छोर पिन। यकीन टांके ब्लॉक नहींदेखने के ऑप्टिकल क्षेत्र।
    6. RAA के किनारे पर कस्टम बनाया पेसिंग इलेक्ट्रोड रखें। इलेक्ट्रोड बनाने के लिए, उपयोग सिलिकॉन लेपित 0.25 मिमी व्यास चांदी के तारों, 0.5 मिमी अंतर-इलेक्ट्रोड दूरी के साथ और पेसिंग अंत में 1 मिमी की लंबाई के लिए सिलिकॉन से रहित। फिर दो ईसीजी 12 मिमी सुई (29 गेज) दाएं और बाएं निलय के आधार के पास Monopolar इलेक्ट्रोड जगह है। निलय के शीर्ष के पास जमीन ईसीजी इलेक्ट्रोड रखें।
  2. धुंधला हो जाना
    1. चूंकि दोनों फ्लोरोसेंट रंगों और इलेक्ट्रो मैकेनिकल uncoupler blebbistatin प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, सभी प्रक्रियाओं एक अंधेरे कमरे में नीचे वर्णित करते हैं। प्रथम (प्रत्येक 30 μl) एक शेयर समाधान, 1.25 मिलीग्राम / डाइमिथाइल sulfoxide (2.5 मिमी), यह विभाज्य में मिलीलीटर के रूप में वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई आरएच-237 या di-4-ANNEPS तैयार है और -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots की दुकान।
    2. गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Tyrode समाधान के 1 मिलीलीटर में डाई शेयर समाधान के 5-10 μl पतला और फिर कोरोनरी छिड़काव लाइन में यह इंजेक्षनएक लाइन में Luer इंजेक्शन बंदरगाह का उपयोग कर 5-7 मिनट की अवधि में।
    3. blebbistatin अग्रिम में एक शेयर समाधान (डाइमिथाइल sulfoxide में 2 मिलीग्राम / एमएल, 6.8 मिमी) के रूप में तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
    4. स्थिरीकरण के 20 मिनट के बाद, perfusate में जोड़ने गरम के 0.5 मिलीलीटर (37 डिग्री सेल्सियस) blebbistatin और गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Tyrode समाधान के 1 मिलीलीटर में blebbistatin की 0.1 मिलीलीटर पतला। फिर एक लाइन में Luer इंजेक्शन बंदरगाह का उपयोग कर 5-7 मिनट की अवधि में कोरोनरी छिड़काव लाइन में इंजेक्षन।

पृथक अलिंद तैयारी से सैन 3. ऑप्टिकल मानचित्रण

  1. उपकरण
    1. पृथक आलिंद तैयारी के लिए, अलग-थलग और के रूप में पूरे दिल तैयारी के लिए कदम 1.1-1.5 में ऊपर वर्णित दिल cannulate।
    2. निलय पूर्वकाल तरफ से दूर काटना। चित्रा 1 ए, सही पैनल देखें, जानकारी के लिए # 1 काटा।
    3. त्रिकपर्दी VA के माध्यम से काटने से आरए खोलेंLVE (टीवी) टीवी-एसवीसी अक्ष के साथ। चित्रा 1 ए, सही पैनल देखें, # 2 जानकारी के लिए काटा।
    4. RAA खोलने के लिए शिखा terminalis की औसत दर्जे का अंग कट। चित्रा 1 ए, सही पैनल देखें, # 3 काटा।
    5. , RAA के ठीक नीचे कोने के किनारे करने के पिछले # 3 कटौती midline से एक कट प्रदर्शन से पूर्वकाल आलिंद मुक्त दीवार खोलें समतल और एक सिलिकॉन लेपित चैम्बर के नीचे करने के लिए आलिंद मुक्त दीवार पिन। दिशा चित्रा 1 ए में खोखले तीर द्वारा दिखाया देखें, कट # 4। अटरिया को होने वाले नुकसान को रोकने के लिए तैयारी लगाए लिए निलय ऊतक का एक रिम को बचाना।
    6. इसी तरह, ला उपांग (ला) के एमवी ऊपरी कोने साथ एमवी के माध्यम से काटने से खुला ला।
    7. ला के एक मध्यम रिम के पास जब तक ला, खोला ला के बीच में से काट, पूर्वकाल आलिंद मुक्त दीवार के माध्यम से खोलने के लिए।
    8. पूर्वकाल आलिंद मुक्त दीवार आलो खोलेंएनजी एक ही दिशा है, तो समतल और एक Sylgard लेपित चैम्बर के नीचे करने के लिए यह पिन।
    9. आंशिक रूप से अलिंदीय सेप्टल ऊतक को हटा दें। इस ऊतक से ऑप्टिकल संकेत है कि ध्यान में नहीं है के बिखरने कम हो जाएगा। इसलिए, दोनों ला और आरए के रूप में अच्छी तरह के रूप में सैन और एट्रीयो-वेंट्रिकुलर जंक्शन (AVJ) इस तैयारी (चित्रा 1 बी) में पहुंच रहे हैं।
    10. ताकि दोनों epicardial और endocardial सतहों से superfusion अनुमति देने के लिए सिलिकॉन लेपित कक्ष के नीचे से लगभग 0.5 मिमी से अंतिम तैयारी उठा।
    11. एक केंद्रित एसवीसी के पास स्थित प्रवाह के लिए ~ 12 मिलीग्राम / मिनट एक स्थिर दर पर गर्म के साथ तैयारी (37 डिग्री सेल्सियस) Tyrode समाधान Superfuse और ~ एक स्नान superfusion के लिए 30 मिलीग्राम / मिनट।
    12. कस्टम बनाया पेसिंग एजी / AgCl 2 विच्छेदित RAA के किनारे पर इलेक्ट्रोड (0.25 मिमी व्यास) रखें। फिर दो ईसीजी 12 मिमी सुई (29G) इलेक्ट्रोड (Monopolar) RAA और ला के पास क्रमश: जगह है। जमीन ईसीजी चुनाव रखेंAVJ के पास सवारी की।
  2. धुंधला हो जाना
    1. वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई (आरएच 237 या di-4-ANNEPS) का एक सीधा आवेदन प्रदर्शन। इस के लिए, गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Tyrode समाधान के 1 मिमी में डाई शेयर समाधान के 1-2 μl पतला और धीरे धीरे एक 1 मिमी पिपेट का उपयोग करके तैयारी की सतह पर पतला डाई जारी।
    2. वैकल्पिक रूप से, पूरे दिल तैयारी (कदम 2.2.1-2.2.2) के लिए ऊपर वर्णित है कि इसी तरह Langendorff-भरकर रखा दिल का एक कोरोनरी छिड़काव के माध्यम से वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई के साथ आलिंद धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
      1. कोरोनरी छिड़काव धुंधला के बाद, के रूप में वर्णित आलिंद तैयारी अलग। जब एक संतोषजनक प्रतिदीप्ति स्तर तक पहुँचने के लिए आवश्यक अतिरिक्त सतह धुंधला प्रदर्शन करना। त्वरित आलिंद अलगाव डाई ब्लीच नहीं है और धुंधला की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करता है।
    3. इलेक्ट्रो मैकेनिकल uncoupler, blebbistatin साथ तैयारी स्थिर। 3-5 μl ble पतलागर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Tyrode समाधान में शेयर समाधान bbistatin और धीरे धीरे तैयारी की सतह और आसपास के समाधान पर पतला blebbistatin जारी। चूंकि blebbistatin प्रकाश के प्रति संवेदनशील, 13,14 से बचने के लिए लंबे समय प्रकाश में तैयारी और धुंधला के दौरान जोखिम होना दिखाया गया है।
    4. के रूप में ज्यादा के रूप में संकुचन को दबाने के लिए आवश्यक अतिरिक्त blebbistatin आवेदन प्रदर्शन। आम तौर पर 3 अतिरिक्त अनुप्रयोगों (प्रत्येक आवेदन के अनुसार 3-5 μl) तक आदेश में सही SAN और आलिंद सक्रियण फिर से संगठित करने में पर्याप्त गति विरूपण साक्ष्य को दबाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    5. perfusate में गर्म blebbistatin की अतिरिक्त 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। इस प्रक्रिया के दौरान, डाई / blebbistatin आलिंद ऊतक दाग अनुमति देने के लिए 30 सेकंड के लिए superfusion थामने।

4. ऑप्टिकल मानचित्रण सेट अप

नोट:। ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली का एक विस्तृत विवरण कहीं और उपलब्ध कराई गई है 12

  1. एक मंदिर के साथ एक कैमरे का उपयोग2,000 फ्रेम / सेक या अधिक है, और कंडेनसर लेंस की एक श्रृंखला के poral संकल्प 100 माइक्रोन / पिक्सेल या अधिक की स्थानिक संकल्प तक पहुँचने के लिए। इस सैन सक्रियण और intranodal प्रचार को फिर से संगठित करने के लिए आवश्यक है।
  2. हिल समाधान से प्रस्ताव विरूपण साक्ष्य को कम करने के लिए, दिल / पृथक आलिंद तैयारी पर समाधान की सतह पर एक छोटे से कांच कवर तय कर लो।
  3. एक निरंतर वर्तमान, कम शोर हैलोजन लैंप द्वारा प्रदान की उत्तेजना प्रकाश (520 ± 45 एनएम तरंगदैर्ध्य) का प्रयोग करें। एक लचीला बंटवारा प्रकाश गाइड का उपयोग करके छान प्रकाश किरण तैयारी पर प्रत्यक्ष।
  4. एक लंबे पास फिल्टर (> 715 एनएम) द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति फ़िल्टर। लीजिए, digitize और कैमरा निर्माता द्वारा प्रदान की गई एक कंप्यूटर का उपयोग सॉफ्टवेयर पर अधिग्रहीत फ्लोरोसेंट संकेत बचाने के लिए।

5. डाटा प्रोसेसिंग

नोट: ऑप्टिकल मानचित्रण डेटा एकत्र की है और अलग अलग समय बिंदुओं पर फ्लोरोसेंट तीव्रता का matrices की एक श्रृंखला के रूप में जमा है। प्रत्येक पिक्सेल represeएक विशिष्ट समय बिंदु पर ऊतक तैयार करने पर एक विशिष्ट स्थान से एकत्र फ्लोरोसेंट तीव्रता का एक उपाय एनटीएस। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्वचालित रूप से झिल्ली वोल्टेज परिवर्तन द्वारा निर्मित और कार्रवाई क्षमता (ए पी एस) microelectrode सिस्टम द्वारा मापा के साथ पत्र व्यवहार करने के लिए उलटा प्रतिदीप्ति परिवर्तन के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए पिक्सेल प्रति निकाल दिया जाता है। छवि विभाजन, स्थानिक छानने, अस्थायी छानने, और आधारभूत बहाव हटाने सहित ऑप्टिकल इमेजिंग डेटा, प्रसंस्करण में विभिन्न कदमों का ब्यौरा ध्यान केंद्रित समीक्षा में प्रदान की जाती हैं। 15

  1. मैन्युअल या विशेष एल्गोरिथ्म (उदाहरण के लिए, एक thresholding या पता लगाने के किनारे) 15 का उपयोग ऊतक सीमाओं का निर्धारण करने के लिए, 1 (शामिल पिक्सल) और 0 (अपवर्जित पिक्सल) की एक द्विआधारी मुखौटा बना सकते हैं और इस क्रम में प्रत्येक फ्रेम करने के लिए मुखौटा लागू होते हैं। यह प्रक्रिया एक द्विआधारी छवि है कि आगे की प्रक्रिया के लिए हित के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला गया है बनाता है।
  2. ऑप्ट के संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार करने के लिएराजनैतिक डेटा, ब्याज के चयनित क्षेत्रों के भीतर संकेतों फिल्टर। इस के लिए, (उदाहरण के 3 एक्स 3 के लिए, पड़ोसी फ्लोरोसेंट पिक्सल के रूप में एक वांछित कनवल्शनफ़िल्टर्स बिन या गिरी द्वारा परिभाषित यानी औसतन या शोर डेटा, 5 एक्स 5 के लिए,) स्थानिक का उपयोग करें और / या अस्थायी छानने (उदाहरण के लिए, बटरवर्थ, Chebyshev प्रकार के लिए 1, टाइप 2 Chebyshev, अण्डाकार आदि) (चित्रा 2)। जब डेटा की व्याख्या मन में छान प्रेरित कलाकृतियों की संभावना रखें। अधिक जानकारी के लिए समीक्षा देखें। 15
  3. ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग में आधारभूत का बहाव हटाये जब जरूरत (मूल संकेत करने के लिए उच्च पास छानने या बहुपद फिटिंग का उपयोग करके) और फिर 0 (न्यूनतम प्रतिदीप्ति) 1 (अधिकतम प्रतिदीप्ति) से प्रत्येक पिक्सेल संकेत मानक के अनुसार।
  4. एक समय खिड़की है कि एक एकल एपी प्रचार के लिए सभी पिक्सल के सक्रियण बार शामिल हैं का चयन करें। प्रत्येक पिक्सेल अधिकतम upstroke व्युत्पन्न के समय (डीएफ / डीटी मैक्स, जहां एफ fluorescen है के रूप में अपने सक्रियण समय निरुपितसीई तीव्रता)। सभी पिक्सेल सक्रियण बार प्रयोग, isochronal सक्रियण नक्शे का पुनर्निर्माण किया। प्रत्येक isochron इस प्रकार पिक्सल एक ही समय में सक्रिय दिखाएगा।
  5. एपी अवधि (APD) वितरण नक्शे को फिर से संगठित करने के लिए, के लिए प्रत्येक पिक्सेल repolarization का एक विशिष्ट स्तर पर सक्रियण समय और समय के बीच की अवधि की गणना (उदाहरण के लिए, repolarization, APD 80 में से 80% से कम)। सभी पिक्सेल APD मूल्यों का प्रयोग, APD वितरण isochronal नक्शे का पुनर्निर्माण किया। प्रत्येक isochron इस प्रकार एक ही APD के साथ पिक्सल दिखाएगा।
  6. एपी प्रचार के लिए चालन वेग की गणना करने के लिए, 5.4 में गणना सक्रियण समय के आंकड़ों के तैयारी की एक सतह फिट बैठते हैं। इस के लिए, बहुपद सतह फिटिंग या स्थानीय गिरी सतह समरेखण उपयोग करें और फिर से फिट सतह की ढाल से स्थानीय चालन वेग वैक्टर गणना।
  7. Repolarization नक्शा बनाने के लिए, प्रत्येक पिक्सेल अपने repolarization समय आवंटित, अधिकतम दूसरा व्युत्पन्न के रूप में परिभाषित (डी 2 एफ / डीटी2) OAP, या 90% repolarization के समय के अंत में ऑप्टिकल संकेत की।

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Representative Results

Langendorff-भरकर रखा दिल से बरकरार सैन के ऑप्टिकल मानचित्रण
एक आरए सक्रियण समोच्च मानचित्र सहज साइनस लय के लिए खंगाला का एक विशिष्ट उदाहरण एक Langendorff-भरकर रखा माउस दिल के लिए 3 चित्र में दिखाया गया है। प्रारंभिक सक्रियण बिंदु जहां सैन संरचनात्मक रूप से परिभाषित किया गया है एसवीसी पास intercaval क्षेत्र के भीतर स्थित है। 3,16 दो आरए सक्रियण समोच्च 1.0 और 0.5 मिसे नमूना दर पर हासिल कर लिया नक्शे चित्रा 3 बी में दिखाया जाता है।

सैन कामकाज का मूल्यांकन करने के लिए, हम 10-12 हर्ट्ज पर सैन वसूली समय (SANRT)। 9 में कम से कम 1 मिनट के लिए RAA पेसिंग के बाद मापा, बिजली की उत्तेजना के लिए बंद कर दिया गया था और SANRT पिछले कब्जा कर लिया और एपी के बीच समय अंतराल के रूप में गणना की गई पहली सहज एपी (चित्रा 3 सी)। SANRT दिल की दर (यानी SANRT <को ठीक किया गया थाउप> ग) SANRT और आधार चक्र लंबाई के बीच अंतर की गणना के द्वारा। इसके अलावा, पहली पोस्ट-पेसिंग पेसमेकर के स्थान की पहचान की थी। इस उदाहरण के लिए, SANRTc के बारे में 49 मिसे था।

पृथक अटरिया और सैन एक्टिवेशन
सहज साइनस लय के दौरान अलग-थलग आलिंद तैयारी की सक्रियता के चित्रा -4 ए में दिखाया गया है। यह पास बेहतर और अवर सैन किनारों और सेप्टल दिशा को पूरा ब्लॉक दो तरजीही चालन निर्देश के साथ संरचनात्मक रूप से एक व्यापक लहर सामने है कि आरए भर anisotropically फैल साथ एसवीसी के पास सैन परिभाषित में जन्म लिया है, (चित्रा -4 ए में सक्रियण नक्शे में चिह्नित) । सक्रियण नक्शा 1 मिसे नमूना दर पर हासिल कर लिया प्रारंभिक सक्रियण के एक व्यापक क्षेत्र से पता चलता है। 0.5 और 0.3 मिसे मिसे के लिए नमूना दर में वृद्धि हुई है हमें अग्रणी पेसमेकर स्थान की सटीक क्षेत्र की पहचान करने के लिए अनुमति देता है। डब्ल्यूई मनाया एक ठेठ, हरा-टू-हरा प्रमुख पेसमेकर जो प्राथमिक पेसमेकर क्षेत्र में पहले कांच microelectrodes 17 और ऑप्टिकल मानचित्रण 8-11,18,19 द्वारा और साथ ही connexin45 और HCN4 के लिए immunolabeling द्वारा electrophysiologically विशेषता के लिए corresponded के स्थिर monofocal स्थिति । 6,16

धीरे-धीरे बढ़ती सैन घटक और आलिंद मायोकार्डियम की तेजी से बढ़ती upstroke (आलिंद घटक) प्रकाश बिखरने की वजह से (चित्रा 4 बी) 20:। पहले से प्रदर्शन किया, सैन ऑप्टिकल संभावित कार्रवाई एक दो चरण संकेत है जो दो अलग-अलग घटक शामिल होते हैं प्रक्रियाओं, OAP ऊतक के भीतर कोशिकाओं की कई परतों से उत्पन्न होने वाली एक औसत बिजली गतिविधि प्रतिनिधित्व करता है। बिखरने गहराई और चौड़ाई एक अंतरिक्ष निरंतर है, जो प्रकाश बिखरने और अवशोषण गुण के आधार पर निर्धारित किया जाता है और 1.5-2 मिमी तक पहुंच सकता से नियंत्रित होता है। क्योंकि सैन condu कीction देरी, सैन एपी हमेशा शारीरिक सक्रियण (चित्रा 4 बी) के दौरान आलिंद गतिविधि पछाड़ दिया है। आलिंद के लिए सैन से संक्रमण की गणना करने के लिए (यानी सैन चालन समय, SANCT), तो या तो हम समय इस मुद्दे पर जहां डबल घटक सैन संकेत सैन घटक आयाम का 50%, या दो-चोटी का पहला चरम पर पहुंचता इस्तेमाल किया OAP पहले व्युत्पन्न (डीएफ / डीटी)। आरए को जल्द से जल्द सैन सक्रियण क्षेत्र से SANCT ~ 5 मिसे, कांच microelectrodes से मापा जाता है कि इसी तरह की थी।

सैन वसूली समय
इसी तरह, SANRT पृथक आलिंद तैयारी (चित्रा 4D) में मापा गया था। इस के लिए, आलिंद तैयारियों एक पेसिंग कम से कम 1 मिनट के लिए RAA के कोने पर स्थित इलेक्ट्रोड के माध्यम से 12 हर्ट्ज पर पुस्तक रहे थे। 9 इस उदाहरण के लिए, SANRTc के बारे में 34 मिसे, जो Langendorff-भरकर रखा जाता में मापा जाता है कि के साथ तुलनीय है था दिल (चित्रा -3 सी)। इसके अलावा, पहली पोस्ट-पेसिंग पेसमेकर के स्थान की पहचान की थी।

हार्ट रिदम और फ्लोरोसेंट संकेत स्थिरता समय के साथ
सर्जरी और डाई लोड प्रक्रियाओं उचित रूप से पालन कर रहे हैं, वहाँ आलिंद की शारीरिक विशेषताओं में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं होना चाहिए। चित्रा 5 में, हम दिल ताल से पहले और आलिंद अलगाव की प्रक्रिया के बाद और 3 घंटा छिड़काव के दौरान मापा प्रस्तुत करते हैं। दिल की दर से कोई महत्वपूर्ण बदलाव या तो आलिंद अलगाव के दौरान या डाई लोड के बाद मनाया गया।

हालांकि धमनी धुंधला डाई की एक बड़ी राशि की आवश्यकता हो सकती, सैन क्षेत्र के ऊतकों में फ्लोरोसेंट संकेत की स्थिरता को इस लोड हो रहा है विधि का उपयोग कर बेहतर प्रतीत होता है। चित्रा 6 में, हम दोनों कोरोनरी और सतह धुंधला के लिए समय के साथ संकेत तीव्रता क्षय प्रस्तुत करते हैं। टी में वह सैन ऊतक, आईसी 50 (जो समय था जब संकेत तीव्रता 50% तक मृतक की है इंगित करता है) कोरोनरी धुंधला के बाद 107 मिनट के बारे में, लगभग दो बार के रूप में लंबे समय सतह धुंधला के रूप में है।

आकृति 1
चित्रा 1:। माउस अलिंद तैयारी के अलगाव (ए) सर्जिकल प्रक्रियाओं माउस आलिंद तैयारी को अलग करने के लिए प्रदर्शन किया। दिल के पीछे दृश्य दिखाया गया है। सभी कटौती बिंदीदार लाल लाइनों द्वारा दिखाए गए और प्रदर्शन किया क्रम में नंबर द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। पाठ में विवरण देखें। (बी) पृथक माउस आलिंद तैयारी के योजनाबद्ध रूपरेखा छोड़ दिया और सही आलिंद उपांग की घरनदार संरचना के साथ ही चीन-आलिंद नोड के स्थान सहित मुख्य शारीरिक विशेषताओं, दिखा रहा है (सैन, एक भूरे रंग के अंडाकार द्वारा लेबल)। सभी संक्षिप्त आकृति में समझाया जाता है।tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। 0.3, 0.5 और 1 मिसे / फ्रेम में दर्ज कच्चे और प्रसंस्कृत सिग्नल कच्चे संकेतों को एक एकल पिक्सेल से एकत्र कर रहे हैं। बाद 3 एक्स 3 binning, संकेतों कम पास बटरवर्थ कलन विधि का उपयोग करके छान रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। सैन (ए) वाम के पूरे दिल ऑप्टिकल मानचित्रण, एक ठेठ बरकरार दिल से सैन की मैपिंग के लिए इस्तेमाल तैयारी की तस्वीर। नीले वर्ग के ऑप्टिकल क्षेत्र से पता चलता हैदेखें (6 मिमी 6 मिमी से)। ठीक है, देखने के ऑप्टिकल क्षेत्र कैमरा के माध्यम से कब्जा कर लिया और संरचनात्मक स्थलों के साथ आरोपित। एसवीसी और आईवीसी: बेहतर और अवर रग Cava; RAA: सही आलिंद उपांग; आर.वी. और एल.वी.: दाएं और बाएं निलय; पीवी: फेफड़े के नसों। (बी) रंग समोच्च सक्रियण नक्शे 1.0 मिसे (बाएं) और 0.5 मिसे (दाएं) नमूना दर के साथ हासिल कर ली। प्रत्येक नक्शे के अधिकार पर, इसी रंग समय के पैमाने आलिंद सक्रियण समय का संकेत दिखाया गया है (जल्द से जल्द सक्रियण बिंदु से नवीनतम सक्रियण बिंदु लाल रंग में दिखाया गया है, नीले रंग में दिखाया गया है)। जल्द से जल्द आलिंद सक्रियण साइट एक तारांकित द्वारा लेबल है। (सी) सैन वसूली समय (SANRT) पूरे दिल तैयारी में मापा जाता है। पिछले पेसिंग प्रोत्साहन (एस 1) के लिए और पहली पोस्ट-पेसिंग आलिंद हरा (A1) के लिए खंगाला आलिंद सक्रियण समोच्च नक्शे के प्रतिनिधि उदाहरण शीर्ष पर प्रतिनिधि OAP ट्रेस पर चयनित धड़कता के लिए दिखाए जाते हैं।जल्द से जल्द आलिंद सक्रियण की साइटें एक तारक से चिह्नित कर रहे हैं। बीसीएल:। बुनियादी चक्र लंबाई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: माउस चीन आलिंद नोड (सैन) पृथक अटरिया के Endocardial सतह से की उच्च संकल्प ऑप्टिकल मानचित्रण (ए) के एक ठेठ माउस सैन तैयारी (6 मिमी x 6 मिमी) फोटोग्राफ और अपनी इसी सक्रियण समोच्च नक्शे। 1.0 मिसे, 0.5 मिसे, और 0.3 मिसे नमूना दरों पर प्राप्त की। सैन और एक पड़ोसी ब्लॉक क्षेत्र तीर द्वारा दिखाए जाते हैं। रंग समय के तराजू आलिंद सक्रियण समय का संकेत मिलता है। तारांकन प्रमुख पेसमेकर के स्थान को इंगित करता है। RAA: सही आलिंद उपांग, एसवीसी और कांग्रेस: ​​बेहतर और अवर रग Cava, आर.वी.: सही वेंट्रिकल, AVJ: एट्रीयो-ventricul एआर जंक्शन, सीटी: शिखा terminalis, आईएएस: अंतर-आलिंद पट। (बी) से माउस सैन क्षेत्र OAP रिकॉर्डिंग के दोहरे घटकों के तंत्र। पाठ में विवरण देखें। (सी) OAPs के सैन क्षेत्र (नीला), जल्द से जल्द आलिंद उत्तेजना साइट (हरा) और नवीनतम आरए सक्रियण साइट (लाल) के केंद्र से दर्ज की गई Insets: कुल चालन समय 5 के बराबर के साथ आलिंद तरंग को नोडल से संक्रमण मिसे। कुल आरए सक्रियण 11 मिसे के बराबर के लिए समय की देरी के साथ तुलना करें। (डी) सैन वसूली समय (SANRT) पृथक आलिंद तैयारी में मापा जाता है। पिछले पेसिंग प्रोत्साहन (एस 1) के लिए और पहली पोस्ट-पेसिंग आलिंद हरा (A1) के लिए खंगाला आलिंद सक्रियण समोच्च नक्शे के प्रतिनिधि उदाहरण दिखाए जाते हैं। जल्द से जल्द आलिंद सक्रियण के एक साइट एक तारांकित द्वारा लेबल है। बीसीएल - मूल चक्र लंबाई।कश्मीर "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: हार्ट रिदम पहले और अलिंद अलगाव प्रक्रिया (ए) के बाद और 3 घंटा छिड़काव (बी) के दौरान मापा। (ए) उठना, दिल की धड़कन की दर से पहले और आलिंद धुंधला की दो प्रकार के लिए आलिंद अलगाव के बाद दिखाया गया है: आलिंद अलगाव से पहले अलगाव के बाद सतह धुंधला (कोई पूर्व कोरोनरी धुंधला) और कोरोनरी धुंधला हो जाना। (बी) उठना, दिल की धड़कन की लय 3 घंटा छिड़काव से अधिक स्थिरता गैर दाग आलिंद की तैयारी के लिए और फ्लोरोसेंट डाई के लिए दिखाया गया है और दाग आलिंद तैयारियों blebbistatin है। डेटा के रूप में औसत ± SEM दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। संकेत तीव्रता क्षय से अधिक समय दोनों लोड हो रहा है तरीकों से संकेत की तीव्रता (कोरोनरी लोड हो रहा है लाल रंग में संकेत दिया है, और सतह लोड हो रहा है नीले रंग में संकेत दिया) मापा जाता है और समय के साथ साजिश रची थे। (सैन) trabecula (TRAB), साइनस नोड, सही आलिंद उपांग (RAA) और कोरोनरी साइनस (सीएस): संकेत तीव्रता चार ठेठ सही आलिंद में स्थानों पर एक से 7 7 पिक्सेल क्षेत्र से औसतन थे। आईसी 50 मूल्यों तो गणना की और सभी क्षय घटता में लेबल रहे थे। दोनों लोड हो रहा है तरीकों से संकेत तीव्रता क्षय TRAB और RAA में इसी तरह की थी। सीएस में धमनी लोडिंग के आईसी 50 करीब 20 मिनट रह गया था। सान में, धमनी लोड करने के लिए इस मूल्य लगभग दो गुना बड़ा सतह लोड हो रहा है, जो इंगित करता है कि धमनी लोड हो रहा है तरीकों में सैन Tiss डाई की बेहतर स्थिरता के परिणामस्वरूप की तुलना में थासमय के साथ UE। डेटा के रूप में औसत ± SEM दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ, हम के माउस सैन तैयारियों दो प्रकार प्रस्तुत है: 1) बरकरार सैन Langendorff-भरकर रखा पूरे दिल में है, और 2) सैन पृथक में, आलिंद तैयारी खोला। तैयारी के इन दो प्रकार के विभिन्न प्रायोगिक उद्देश्यों की सेवा। Langendorff-भरकर रखा पूरे दिल तैयारी में, अक्षत आलिंद संरचना संरक्षित है जो इसे संभव रैत्रांत tachyarrhythmias दौरान सैन और आलिंद के बीच इस तरह के अलिंद के रूप में जटिल आलिंद arrhythmias के साथ ही बातचीत का अध्ययन करने के लिए बनाता है। 6 इसके विपरीत, पृथक आलिंद तैयारी में , आलिंद खोला और एक छद्म दो आयामी संरचना जहां तीन आयामी संरचनात्मक बंडलों में परेशान कर रहे हैं चपटा है। इस रैत्रांत रास्ते की शरीर रचना जो पृथक आलिंद तैयारी आलिंद arrhythmogenesis के अध्ययन के लिए आदर्श नहीं बनाता प्रभावित कर सकता है। हालांकि, तैयारी के इस प्रकार, अग्रणी पेसमेकर (s) साइटों, intranodal चालन का स्थान है, और एपी प्रचार पी का प्रयोगattern सही कल्पना और विस्तार से जांच की जा सकती है। इसके अलावा, अक्षत अटरिया जबकि पृथक तैयारी में, पूरे आलिंद सतह ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए उपलब्ध है एक पीछे दृश्य द्वारा सीमित किया जा दिखाई देते हैं।

इसके अलावा, अलग-थलग आलिंद तैयारी के रूप में चित्रा 4 में देखा trabecular नेटवर्क के जटिल microstructure हल करने के द्वारा आलिंद के संरचनात्मक-कार्यात्मक मानचित्रण सक्षम बनाता है। इसके लिए उच्च स्थानिक (100 माइक्रोन / पिक्सेल या अधिक) और लौकिक (2,000 एफपीएस या अधिक) प्रस्तावों क्योंकि यह दोनों आलिंद और सैन सक्रियण पैटर्न है, जो आगे इसी संरचनाओं के साथ छा जा सकता शुमार करने के लिए महत्वपूर्ण है इस्तेमाल किया जाना चाहिए। 1,000 एफपीएस अस्थायी समाधान आलिंद सक्रियण (जो 10 के लिए रहता है - 20 मिसे) को फिर से संगठित करने के लिए एक न्यूनतम हो सकता है, 2,000 एफपीएस intranodal चालन (जो ~ 5 एमएस के लिए रहता है और इस तरह कम से याद किया जा सकता है के लिए एक न्यूनतम अस्थायी समाधान के रूप में माना जाना चाहिए प्रस्तावों) और सैन अधिनियमivation माप के रूप में चित्रा 4 से देखा। यह (जैसे अस्थानिक foci या लंगर reentry के रूप में) arrhythmogenic 'हॉट स्पॉट' अलिंद के / स्पंदन के दौरान के स्थानीयकरण जो ऊंचा फाइब्रोसिस के लोगों के साथ महत्वपूर्ण कार्य remodeling के क्षेत्रों के superposition से उभर सकता है अनुमती दे सकते हैं और / या सेल करने वाली सेल युग्मन कम हो। 21,22 इसके अलावा, वर्णित दृष्टिकोण सैन बाहर निकलने के ब्लॉक, रुक जाता है, tachycardia-bradycardia arrhythmias, बीमार साइनस सिंड्रोम आदि सहित सैन असामान्यताओं के electrophysiological तंत्र, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक दूसरा (या यहां तक ​​कि एक तिहाई) फ्लोरोसेंट जांच शुरू करके, यह कैल्शियम से निपटने के साथ ही चयापचय और अन्य परिवर्तन के साथ मिलकर बिजली की गतिविधि की बहु पैरामीट्रिक ऑप्टिकल मानचित्रण प्रदर्शन करने के लिए संभव हो जाएगा। रंगों के विभिन्न संयोजनों एक साथ वोल्टेज-कैल्शियम, ratiometric वोल्टेज / कैल्शियम, या mitochondrial संभावित इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

उच्च अस्थायी समाधान ऑप्टिकल मानचित्रण, छोटे fluorophore संग्रह अवधि के कारण के लिए, एक कमजोर संकेत करने वाली शोर अनुपात के संकेतों की सराहना की जा सकती है। इसलिए, एक औसत प्रसंस्करण प्रक्रिया के रूप में की जरूरत साइनस दिल ताल का संकेत है या पेसिंग श्रृंखला संकेतों के लिए लागू किया जाता है। DF / डीटी अधिकतम एक लंबी अवधि रिकॉर्डिंग में प्रत्येक संकेत के लिए पता लगाया है। ये सक्रियण समय अंक तो जुड़ रहे हैं। इन बिंदुओं पर समय केंद्रित रिकॉर्डिंग का एक सेटिंग की अवधि में कटौती कर रहा है और औसतन सभी से या चयनित ए पी एस, के रूप में की जरूरत है।

इंस्ट्रूमेंटेशन का सही उपयोग और उचित धुंधला प्रक्रिया के द्वारा, चालन वेग (आंकड़े -3 सी और एस 1 सक्रियण नक्शे के लिए 4D तुलना), सहज सैन लय और सैन तैयारी (चित्रा 5) दीर्घायु सहित आलिंद electrophysiological मानकों को प्रभावित नहीं कर रहे हैं, जिसके लिए स्थिर रहेगा 3 या उससे अधिक घंटे। महत्वपूर्ण बात है, निरंतर Monitईसीजी की oring पूरे धुंधला प्रक्रिया खत्म किया जाना चाहिए दिल की सामान्य बिजली समारोह सुनिश्चित करने के लिए। Blebbistatin के आवेदन एक क्षणिक दिल दर को धीमा उत्पन्न हो सकता है, लेकिन उस के अलावा, यह एपी आकृति विज्ञान में पेसमेकर साइटों या परिवर्तन अग्रणी के रूप में भी पहले से वर्णित किया गया है में किसी भी बदलाव के लिए प्रेरित नहीं करता। 13

पृथक आलिंद तैयारी की सतह धुंधला एक महत्वपूर्ण कदम है। इस के लिए, ऊतक की सतह पर पतला डाई की तेजी से आवेदन परहेज किया जाना चाहिए; बजाय डाई DMSO के उच्च घनत्व है, जो दोनों डाई और blebbistatin dilutions के लिए इस्तेमाल करने की वजह से स्वतंत्र रूप से तैयार करने पर गिर चाहिए। उचित कुल लदान राशि और गति समायोजित किया जाना चाहिए ताकि के रूप में नाटकीय दिल दर में परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए नहीं। धुंधला प्रक्रिया में कई बार जब तक संकेत एक उचित स्तर तक पहुँच लागू किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि डाई के प्रत्यक्ष आवेदन खराब कर सकती सैन ऊतक और उसके Pacem को प्रभावितमेरा। इसलिए, डाई पतला होना चाहिए और राशि लागू सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। उचित सतह धुंधला तैयारी या सैन 23 जो तुलनीय दिल की दर और चालन वेग द्वारा मूल्यांकन किया है नुकसान नहीं होना चाहिए।

वैकल्पिक धुंधला प्रोटोकॉल पर भी विचार किया जाना चाहिए। ये एक 10-15 मिनट या 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस 10,19 पर वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई (आरएच 237 या di-4-ANEPPS) के साथ सैन / आलिंद तैयारी की superfusion तैयारी की एक 30 मिनट ऊष्मायन या तो शामिल कर सकते हैं वोल्टेज के प्रति संवेदनशील सूचक युक्त एक Tyrode समाधान में कमरे के तापमान (20-22 डिग्री सेल्सियस) पर। 11

Langendorff-भरकर रखा पूरे दिल से सैन के ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए, महत्वपूर्ण इंस्ट्रूमेंटेशन कदम एल.वी. में छोटी ट्यूब की प्रविष्टि और एसवीसी और आईवीसी के बंद में शामिल हैं। पूर्व लंबी अवधि के प्रयोगों के दौरान समाधान भीड़ से एक दबाव में वृद्धि के रूप में अच्छी तरह से रोकता बाद मैं के रूप मेंblebbistatin और छिड़काव समाधान के अम्लीकरण के द्वारा वेंट्रिकुलर संकुचन के दमन के बाद schemia विकास। उत्तरार्द्ध आरए इस प्रकार छिड़काव समाधान के साथ आलिंद भरने और उजागर करने के लिए ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए पूरे क्षेत्र सैन क्रम में intercaval क्षेत्र सपाट इंट्रा-आलिंद दबाव के कुछ स्तर पर रखने के लिए सक्षम बनाता है।

अंत में, कोरोनरी धुंधला हो जाना, डाई लोड सतह के अलावा, काफी के सैन OAPs जो अब पिछले कर सकते तीव्रता में सुधार सकता है जब शुद्ध सतह पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल धुंधला की तुलना में। 8,9

blebbistatin का उपयोग कम विषाक्तता, कम स्पष्ट साइड इफेक्ट है, और वार्शआउट प्रतिरोध जब यह सावधानी के साथ प्रयोग किया जाता है सहित अन्य विद्युत uncouplers की तुलना में कई फायदे हैं। Blebbistatin precipitates जब यह तापमान पर भंग कर रहा है, कम से कम 37 डिग्री सेल्सियस। 14 Blebbistatin क्रिस्टल सामान्य संवहनी प्रवाह बीच में है और इस प्रकार स्थानीय उत्पन्न हो सकता हैischemia और भड़काने arrhythmic घटनाओं। 24 इसके अलावा, अध्ययन है कि GFP या अन्य हरी / पीले रंगों के उपयोग में, blebbistatin वर्षा लेबल की कोशिकाओं जो ध्यान में रखा जाना चाहिए के लिए गलत हो सकता है। वर्षा blebbistatin की रोकथाम सीधा है, यानी, एक के लिए एक पूर्व गर्म में blebbistatin भंग करने के लिए है (37 डिग्री सेल्सियस और अधिक) है और सख्ती से हड़कंप मच गया मीडिया।

APD, blebbistatin के एक उच्च एकाग्रता (10 माइक्रोन के लिए) का इस्तेमाल किया जा सकता है। 13,14,25 का विश्लेषण करने के लिए। इसी तरह, अगर किसी भी दवा है कि संकुचन बढ़ जाती इस्तेमाल कर रहे हैं, blebbistatin के अतिरिक्त आवेदन की सिफारिश की है।

माउस सैन बिजली की गतिविधि, कम संकल्प बहु इलेक्ट्रोड सरणी (एक वर्ग 8 x 8 में 64 अलग इलेक्ट्रोड, 0.55 मिमी की एक अंतर-इलेक्ट्रोड दूरी के साथ विन्यास) 26 और लगातार कांच microelectrode के बीच थोड़ी दूरी पर बनाया रिकॉर्डिंग अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में impalements बनाम अप करने के लिए 50 माइक्रोन / पिक्सेल का एक संकल्प किया है मानचित्रण) और एपी आकृति विज्ञान या बहु पैरामीट्रिक इमेजिंग (जैसे एक साथ वोल्टेज और कैल्शियम ऑप्टिकल मानचित्रण) के रूप में के लिए विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। कांच microelectrode रिकॉर्डिंग एपी आकृति विज्ञान के बारे में अधिक जानकारी के लिए, एपी आयाम और विश्राम क्षमता के लिए निरपेक्ष मूल्यों सहित प्रदान करते हैं, हालांकि, यह भी एक कम स्थानिक संकल्प द्वारा सीमित है। इसलिए, यह केवल प्रमुख पेसमेकर के स्थिर स्थान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और प्रमुख पेसमेकर स्थान में हरा-टू-हरा परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए लागू नहीं है। एक ही समय में, जैसा कि पहले प्रदर्शन किया 3,20 और वर्तमान अध्ययन में प्रकाश डाला, सैन OAP सहएक दो चरण संकेत के nsists whichincludes दोनों सैन और आलिंद मायोकार्डियम एपी घटकों (चित्रा 4 बी)। यह इस प्रकार यह मुश्किल से निकालने के लिए एक शुद्ध सैन संकेत है और इसे सही सैन में एपी आकृति विज्ञान का अनुमान है बनाता है। इस उद्देश्य के लिए, कांच microelectrodes 17 या पर अलग सैन myocytes वर्तमान दबाना दृष्टिकोण से विचार किया जाना चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

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References

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