Высокое разрешение оптического Картирование мыши китайско-предсердного узла

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы приводим протокол для оптического картирования электрической активности от мыши правое предсердие и особенно синоатриального узла, при высокой пространственным и временным разрешением.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с национальными институтами здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Pub. No. 80-23). Все методы и протоколы, используемые в этих исследованиях были одобрены в Университете штата Висконсин уходу и использованию животных комитета Протокол соответствии с рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованных NIH (публикация № 85-23, пересмотренная в 1996 году). Все животные, используемые в данном исследовании, получали гуманного ухода в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Сердце Снятие и Langendorff Перфузия

  1. До изоляции сердца, теплого Тироде раствора до 37 ° С с использованием водяной бани и водяную рубашку.
  2. Обезболить мышь с 5% изофлуран / 95% O 2.
  3. Обеспечить надлежащий уровень анестезии, проверяя потерю болевой рефлекс.
  4. Выполнение торакотомии. Откройте сундук с помощью криволинейных 5.5 "Майо ножницы и 5,5" Келли кровоостанавливающим дляCEPS, чтобы сделать 1 см разрезать на передней части грудной клетки.
    1. Быстро извлечь сердце из груди (в течение 30 секунд). Используйте 4 "изогнутые щипцы Iris, чтобы захватить легочные ткани и вырезать легких, вилочковой железы и сердца вместе с перикарда с использованием 4,3" Iris ножницы. Не хватайте сердце напрямую.
    2. Промойте его в насыщенной кислородом (95% O 2/5% CO 2), с постоянной температурой (36,8 ± 0,4 ° С) модифицированного раствора Тирода. Используйте следующий состав раствора (в мМ): NaCl 128,2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 1,3 CaCl 2, 20,0 NaHCO 3 и 11,1 глюкозы (рН 7,35 ± 0,05).
  5. В то время как купались в том же растворе, идентификации легких, вилочковой железы и жировой ткани. Осторожно рассекают их от сердца. Используйте изогнутые 3 "Vannas-Тюбинген ножницы и 4,3" # 5 пинцетом.
  6. Затем определить аорту и иглу его на заказ 21 G канюлю. Используйте две изогнутые 4,3 "# 5B силыпс.
  7. После пункции, одновременно заливать (через канюлю при скорости потока ~ 5 мл / мин, это должно быть отрегулировано на основании давления в аорте, смотри ниже) и переливать (в бане при скорости потока ~ 50 мл / мин) сердце с подогреваемой и отфильтрованного раствора Тироде в течение всего эксперимента. Пропускают перфузионный раствор через нейлоновый фильтр 11 мкм в линию, чтобы предотвратить засорение коронарного кровообращения.
  8. С помощью датчика давления (или манометр), соединенный через 3-ходовым запорным краном Luer замок к перфузионной линии, мониторинг давления в аорте и поддерживать его от 60 до 80 мм ртутного столба. Регулировка скорости перфузии при необходимости для поддержания давления в аорте в пределах этого диапазона.

2. Оптический Картирование SAN от Лангендорфа-перфузировались всего сердца

  1. измерительные приборы
    1. Поместите сердце горизонтально и пин-код желудочковой конька до дна кремния покрытием камеры с помощью штифта диаметром 0,1 мм до рРевент поток индуцированного движения во время эксперимента. 12
    2. Вставьте небольшую (.012 "ID х .005") силиконовую трубку в левый желудочек (ЛЖ) через легочную вену, левые предсердия (LA) и митральный клапан (MV). Закрепить трубку шелковым швом (4-0) к звучащей соединительной ткани.
    3. Расположите сердце его задней стороной вверх (рис 1А, левая панель).
    4. Pin края придатка РА (RAA) к кремнию нижней части камеры с использованием 0,1 мм Диаметр minutien штифтов. Настройте свой уровень, чтобы сделать заднюю поверхность плоского RA и позволяют ему быть расположены фокальной плоскости камеры. Это позволит оптические измерения от максимальной площади поверхности предсердия.
    5. Петля превосходит (SVC) и низший (IVC) полая шелковым швом (4-0), растягивать и прикрепить другой конец шовного материала в нижней части камеры кремния покрытием (смотри рисунок 3 , а ). Убедитесь, что швы не блокируютоптическое поле зрения.
    6. Поместите заказные кардиостимуляции электрод на краю УПП. Для того, чтобы электроды, использование кремния с покрытием 0,25 мм Диаметр серебряные провода, с помощью 0,5 мм межэлектродного расстояния и лишенная кремния на длине 1 мм в конце стимуляцией. Затем поместите два ЭКГ 12 мм иглы (29 калибра) монополярных электродов вблизи основания правого и левого желудочков. Поместите заземляющий электрод ЭКГ вблизи вершины желудочков.
  2. Окрашивание
    1. Так как флуоресцентные красители и электромеханическое разобщитель blebbistatin являются светочувствительные, выполнять все процедуры, описанные ниже в темной комнате. Во-первых подготовить краситель напряжения чувствительных RH-237 или ди-4-ANNEPS в качестве исходного раствора, 1,25 мг / мл в диметилсульфоксиде (2,5 мМ), аликвоты его (30 мкл каждый) и хранить аликвоты при -20 ° С.
    2. Развести 5-10 мкл исходного раствора красителя в 1 мл подогретого раствора Тироде (37 ° C), а затем вводят его в коронарной перфузии линиив течение 5-7 мин с использованием Luer инъекционный порт в режиме реального времени.
    3. Подготовка blebbistatin в качестве исходного раствора (2 мг / мл в диметилсульфоксиде, 6,8 мМ) в заранее и хранить его при температуре 4 ° С.
    4. Через 20 мин стабилизации, добавляют 0,5 мл подогретого (37 ° С) blebbistatin в перфузату и разбавить 0,1 мл blebbistatin в 1 мл подогретого (37 ° С) раствором Тироде. Затем вводят в коронарную перфузионной линии в течение периода 5-7 мин с использованием Luer инъекционный порт в режиме реального времени.

3. Оптическое отображение SAN с изолированной мерцательной Подготовка

  1. измерительные приборы
    1. Для изолированного предсердия препарата, изолировать и вводить иглу сердце, как описано выше, на этапах 1.1-1.5 для приготовления целого сердца.
    2. Рассеките желудочки от передней стороны. Смотрите рисунок 1А, правая панель, вырезать # 1 для деталей.
    3. Откройте RA путем разрезания через трехстворчатый ваLVE (TV) вдоль оси TV-SVC. Смотрите рисунок 1А, правая панель, вырезать # 2 для деталей.
    4. Обрежьте медиальной конечности гребешка, чтобы открыть терминальной САР. Смотрите рисунок 1А, правая панель, вырезать # 3.
    5. Открыть переднюю предсердная свободной стенки, выполняя разрез от средней линии предыдущего разреза № 3 к краю правого нижнего угла УПП, сплющить и прикрепить предсердии свободной стенки в нижней части камеры, силиконовой оболочкой. См направлении , обозначенном стрелкой полой на фиг.1А, вырезать # 4. Сохранение ободок желудочковой ткани для закрепления препарат, чтобы предотвратить повреждение предсердия.
    6. Кроме того, открытая LA разрезанием через MV вдоль MV-верхнем углу придаток LA (LAA).
    7. Чтобы открыть LAA, вырезанный из середины раскрытой LAA, через переднюю стенку предсердия свободной до тех пор, вблизи средней ободу LAA.
    8. Откройте переднюю предсердная свободной стенки ALOнг в том же направлении, а затем сплющить и прикрепить ее к нижней части камеры с Sylgard покрытием.
    9. Частично удалить межпредсердной перегородки ткани. Это позволит уменьшить рассеяние оптического сигнала от ткани, которая не находится в фокусе. Поэтому, как LA и RA, а также SAN и предсердно-желудочковой узел (AVJ) доступны в данном препарате (Рисунок 1В).
    10. Подними окончательную подготовку примерно на 0,5 мм от дна камеры кремния покрытием, с тем чтобы суперфузии от обоих эпикарда и эндокарда поверхностей.
    11. Переливать препарат с подогреваемой (37 ° С) раствор Тироде при постоянной скорости ~ 12 мл / мин для целенаправленного потока, расположенного вблизи ВПВ и ~ 30 мл / мин для ванны суперфузии.
    12. Поместите на заказ расхаживая Ag / AgCl 2 электрода (0,25 мм диаметр) на краю рассеченной RAA. Затем поместите два ЭКГ 12 мм иглы (29G) электроды (монополярных) вблизи RAA и LAA, соответственно. Поместите землю ЭКГ избранныйехал рядом с ÀVj.
  2. Окрашивание
    1. Выполните непосредственное применение напряжения чувствительного красителя (RH-237 или ди-4-ANNEPS). Для этого, разбавленные 1-2 мкл исходного раствора красителя в 1 мм подогретой Тироде раствора (37 ° C) и медленно высвобождают разбавленную краску на поверхность препарата с использованием 1 мм пипетку.
    2. В качестве альтернативы, выполнять предсердии окрашивание с напряжением чувствительных красителя через коронарную перфузию Лангендорфа-перфузионного сердца, подобным описанному выше для получения целого сердца (шаги 2.2.1-2.2.2).
      1. После коронарной перфузии окрашивания, изолировать предсердии препарат, как описано. Выполните дополнительное поверхностное окрашивание, когда это необходимо для достижения удовлетворительного уровня флуоресценции. Быстрый предсердия изоляция не отбеливать краситель и не влияет на качество окрашивания.
    3. Зафиксировать препарат с электромеханическим разобщитель, blebbistatin. Развести 3-5 мкл BLEbbistatin маточного раствора в утепленной Тироде растворе (37 ° C) и медленно высвобождают разбавленный blebbistatin на поверхности препарата и окружающего раствора. Так как blebbistatin было показано , чтобы быть чувствительной к свету, 13,14 избегать длительного воздействия света во время подготовки и окрашивания.
    4. Выполните дополнительное приложение blebbistatin столько, сколько необходимо для подавления сокращения. Обычно до 3 дополнительных приложений (3-5 мкл на каждое приложение) может быть использовано для подавления артефактов движения достаточно для того, чтобы точно реконструировать SAN и предсердной активации.
    5. Добавить дополнительные 0,5 мл подогретой blebbistatin в перфузату. Во время этой процедуры приостановки суперфузии в течение 30 секунд, чтобы краситель / blebbistatin для окрашивания мерцательной ткани.

4. Оптическая Mapping Set Up

Примечание:. Подробное описание оптической системы отображения обеспечивается в другом месте 12

  1. Используйте камеру с помощью ТЭМменную разрешение 2000 кадров / сек или выше, а также ряд конденсаторных линз для достижения пространственного разрешения 100 мкм / пиксель или выше. Это необходимо для восстановления активации SAN и intranodal распространения.
  2. Для уменьшения артефактов движения от вибрационного раствора, фиксируют небольшое стеклянное покрытие на поверхности раствора над сердцем / изолированном предсердии препарата.
  3. С помощью возбуждения света (520 ± 45 нм) обеспечивается постоянным током, низким уровнем шума галогенной лампой. Прямой отфильтрованный светового луча на подготовку с помощью гибкого раздвоенный световод.
  4. Фильтр излучаемый флуоресценции длиннофокусной фильтром (> 715 нм). Сбор, оцифровать и сохранить полученные флуоресцентного сигнала на программном обеспечении компьютера с помощью предоставленного производителем камеры.

5. Обработка данных

Примечание: Оптическое отображение данных собирается и хранится в виде последовательности матриц интенсивности флуоресценции в различные моменты времени. Каждый пиксель represeNTS меру интенсивности флуоресценции, полученной от конкретного местоположения на приготовление препарата ткани в определенный момент времени. Фон флуоресценции автоматически удаляется на пиксель для обеспечения лучшей визуализации изменений флуоресценции, полученных изменений мембранного напряжения и перевернутых, чтобы соответствовать потенциалов действия (AP), измеренных с помощью систем микроэлектродов. Подробная информация о различных этапах обработки данных оптических изображений, в том числе сегментации изображений, пространственной фильтрации, временной фильтрации и удаления исходных условий дрейфа, приводятся в сфокусированного обзоре. 15

  1. Вручную или с помощью специального алгоритма (например, пороговая или края обнаружения) 15 , чтобы определить границы ткани, создать двоичную маску 1 (входит пикселей) и 0 (исключенных пикселей) и примените маску к каждому кадру в последовательности. Этот процесс создает бинарное изображение, которое выдвигает на первый план области, представляющие интерес для дальнейшей обработки.
  2. Для улучшения отношения сигнал-шум оптческие данные, фильтрации сигналов в отдельных областях, представляющих интерес. Для этого используют пространственные (т.е. усреднение соседних флуоресцентных пикселей , как это определено желательном бен свертка или ядра, например 3 х 3 , или, для зашумленных данных, размером 5 х 5) и / или временной фильтрации (например, Баттерворта, типа Чебышева 1, Чебышева типа 2, Эллиптические и т.д.) (Рисунок 2). Имейте в виду возможность отфильтрованных индуцированных артефактов при интерпретации данных. Для получения более подробной информации см обзор. 15
  3. Удалить дрейф базовой линии в оптических записей, когда это необходимо (с помощью фильтров верхних частот или полиномиальная подгонка к исходному сигналу), а затем нормализовать каждый сигнал пикселя от 0 (минимальная флуоресценция) до 1 (максимум флуоресценции).
  4. Выберите окно времени, который охватывает время активации всех пикселей для одного распространения AP. Назначают каждого пикселя свое время активации в момент максимума производной хода вверх (дР / DT макс, где F является fluorescenИнтенсивность в.п.). Используя все время активации пикселей, восстановить изохронном карту активации. Каждый изохрона будет, таким образом, показывают пиксели, активированные в то же время.
  5. Для восстановления карты распределения длительности АР (APD), для каждого пикселя вычислить длительность между временем активации и времени на определенном уровне реполяризации (например, при 80% реполяризации, APD 80). Используя все значения пикселов APD, реконструировать APD распределения изохронном карту. Каждый изохрона будет, таким образом, показывают пиксели с одинаковыми ЛФД.
  6. Для расчета скорости проводимости для распространения AP, соответствовать поверхности подготовки к данным времени активации, рассчитанных в 5.4. Для этого используйте полиномиальное поверхности фитинга или локальную поверхность ядра сглаживания, а затем рассчитать локальные векторы скорости проводимости от градиента подогнанной поверхности.
  7. Чтобы создать карту реполяризации, назначить каждого пикселя свое время реполяризации, определяется как максимальное второй производной (d 2 F / DT2) оптического сигнала на конце OAP, или во время 90% реполяризации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оптический Картирование неповрежденном SAN от Лангендорфа-перфузию сердца
Типичный пример контура карты активации РА реконструированного для спонтанного синусового ритма показана на рисунке 3 для Langendorff-перфузируемом сердце мыши. Ранняя точка активации находится в пределах intercaval области вблизи SVC где САН анатомически определена. 3,16 активации карты контура Два RA , полученные при 1,0 и 0,5 мс с частотой дискретизации показаны на фигуре 3В.

Для оценки функционирования SAN, мы измерили время восстановления SAN (SANRT). 9 После RAA стимуляцией в течение по крайней мере 1 мин при 10-12 Гц, электрическая стимуляция была остановлена и SANRT рассчитывали как временной интервал между последним захваченным точкой доступа и первый спонтанный AP (рис 3C). SANRT была исправлена на частоту сердечных сокращений (т.е. SANRT <суб> C) путем вычисления разности между SANRT и длиной базисного цикла. Кроме того, был идентифицирован местоположение первого пост-шагового кардиостимулятора. Для этого, например, SANRTc было около 49 мс.

Изолированные Atria и SAN Активация
Активация изолированного предсердия препарата в период спонтанного синусового ритма, показан на рисунке 4A. Она возникла в анатомически определенном SAN рядом с SVC с широким фронтом волны , которые распространяются анизотропно по всей РА, с двумя направлениями преференциальных проводимости вблизи верхнего и нижнего краев SAN и полный блок по отношению к направлению к перегородке (обозначены на картах активации на рисунке 4A) , Карта активации приобретенного на 1 мс с частотой дискретизации показывает обширную область ранней активации. Увеличение частоты дискретизации до 0,5 мс и 0,3 мс позволяет определить точную площадь ведущего места водителя ритма. Wе наблюдается типичный, бейте к бить стабильной монофокальных позиции ведущего кардиостимулятора , который соответствовал основной зоне кардиостимулятора ранее характеризовался электрофизиологическими стеклянными микроэлектродов 17 и оптического картирования 8-11,18,19, а также иммунноокрашивания для connexin45 и HCN4 . 6,16

Как было показано ранее, потенциал САН - оптический действие состоит из двухфазного сигнала , который включает в себя два различных компонента: медленно растущей компоненты SAN и быстро растущей движении вверх от миокарда предсердий (мерцательной компонент) (фиг.4В) 20 Из - за рассеяния света. процессы, ОАП представляет собой усредненную электрическую активность, вытекающих из нескольких слоев клеток в ткани. Глубина и ширина рассеяния определяется пространственной константой, которая определяется по рассеянию света и поглощения свойств и может доходить до 1,5-2 мм. Из-за condu SANЗадержка фикция, САН AP всегда предшествует предсердии активность при физиологической активации (рис 4В). Для расчета перехода от SAN к предсердие (т.е. время проводимости SAN, Sanct), мы использовали либо момент времени , когда двухкомпонентная сигнал SAN достигает 50% от амплитуды компонентов SAN, или первый пик двухпиковая ОАП первая производная (дР / д). Sanct из зоны ранней активации SAN в РА было ~ 5 мс, подобно тому, что измеряется с помощью стеклянных микроэлектродов.

SAN Время восстановления
Точно так же, SANRT измеряли в изолированном предсердии препарата (рис 4D). Для этого, предсердные препараты изменяющемся в 12 Гц через стимуляцией электрод , расположенный на углу УПП , по крайней мере , 1 мин. 9 Для этого , например, SANRTc было около 34 мс, что сопоставимо с измеренной в Langendorff-орошаемый сердца (рис 3C). Кроме того, был идентифицирован местоположение первого пост-шагового кардиостимулятора.

Сердечного ритма и флуоресцентный сигнал стабильность во времени
Если процедуры загрузки хирургии и красителях следуют надлежащим образом, не должно быть каких-либо существенных изменений в физиологических характеристиках предсердия. На рисунке 5 приведены ритм сердца до и после процедуры мерцательной изоляции и в течение 3 ч перфузией. Не наблюдалось существенных изменений частоты сердечных сокращений либо в процессе выделения атриумным или после того, как загрузка красителя.

Несмотря на то, артериальное окрашивание может потребовать большего количества красителя, стабильность флуоресцентного сигнала в Сан-ткани, как представляется, лучше с помощью этого метода загрузки. На рисунке 6 приведены спада интенсивности сигнала с течением времени как для коронарной и поверхностного окрашивания. В т он SAN ткани, IC 50 (что указывает на период , когда интенсивность сигнала умершей до 50%) составляет около 107 мин после коронарного окрашивания, почти вдвое дольше, чем у поверхности окрашивания.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Выделение мыши мерцательной Подготовка (A) Хирургические процедуры выполнены , чтобы изолировать мыши предсердии подготовки. Вид задней сердца показана. Все разрезы показаны пунктирными красными линиями и обозначены цифрами в порядке исполнении. Подробнее в тексте. (Б) Схематическое контур изолированного мыши мерцательной препарата с указанием основных анатомических особенностей, в том числе губчатой структуры левого и правого ушек предсердий, а также по месту нахождения синоатриального узла (SAN, помечены серым овалом). Все сокращения объясняются на рисунке.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:. Необработанные и обработанные сигналы , записанные на 0,3, 0,5 и 1 мс / кадр Raw сигналы собираются из одного пикселя. После того, как 3 х 3 биннинга сигналы фильтруются с помощью нижних частот Баттерворта алгоритм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: цельнозерновой сердце Оптический Картирование SAN (A) слева, фото типичного препарата , используемого для картирования SAN от интактного сердца.. Синий квадрат показывает оптическое полевид (6 мм на 6 мм). Правый, оптическое поле зрения захватили через камеру и с наложенными анатомических ориентиров. SVC и IVC: верхняя и нижняя полая вена; RAA: в правом предсердии придаток; RV и LV: правый и левый желудочки; ЛВ: легочные вены. Карты (B) Цвет активации контура приобрела 1,0 мс (слева) и 0,5 мс (справа) с частотой дискретизации. Справа от каждой карты, соответствующее время цветовая гамма указывает на предсердии время активации (с самой ранней точки активации показаны синим цветом, до последней точки активации, показанной в красном цвете) показан. Самый ранний сайт активации предсердия помечен звездочкой. (C) SAN время восстановления (SANRT) измеряется в подготовке целого сердца. Характерные примеры предсердных контурных карт активации реконструированных за последний шагового стимула (S1) и для первого пост-расхаживая мерцательной такт (A1) показаны для ударов, отобранных на репрезентативной OAP след на вершине.Сайты ранней активации предсердий помечены звездочкой. BCL:. Базовая длина цикла Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Высокое разрешение Оптическое отображение мыши китайско-предсердного узла (SAN) от Эндокардиальный поверхности изолированного Atria (A) Фотография типичного мыши подготовки SAN (6 мм х 6 мм) и его соответствующие активации контурные карты. полученный при 1,0 мс, 0,5 мс и 0,3 мс частотой дискретизации. SAN и зону сосед блока показаны стрелками. Цвет шкалы времени указывают на предсердии время активации. Звездочка указывает местоположение ведущей кардиостимулятора. RAA: в правом предсердии придаток, SVC и МКП: верхняя и нижняя полая вена, RV: правый желудочек, AVJ: предсердно-ventricul ар перехода, CT: гребешок терминальной, IAS: между межпредсердной перегородке. (В) Механизм двойных компонентов записи OAP от мыши области SAN. Подробнее в тексте. . (C) OAPs , записанные от центра области SAN (синий), самый ранний предсердия сайта возбуждения (зеленый) и последние места активации RA (красный) Вставки: переход от узловой мерцательной сигнала с общим временем проводимости , равным 5 мс. Сравните это с задержкой по времени для полной активации РА, равным 11 мс. (D) SAN время восстановления (SANRT) , измеренная в изолированной мерцательной препарата. Характерные примеры предсердных контурных карт активации реконструированных за последний шагового стимула (S1) и для первого пост-расхаживая мерцательной такт (A1) показаны. Сайт наиболее ранней активации мерцательной помечена звездочкой. BCL - базовая длина цикла.к "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: сердечного ритма до и после межпредсердной процедуры выделения (А) и В течение 3 ч перфузии (В). (A) Спонтанное Избиение частота сердечных сокращений показана до и после мерцательной изоляции для двух типов мерцательной окрашивания: поверхность окрашивания после выделения (без предварительной коронарная окрашивания) и коронарного окрашивания перед мерцательной изоляции. (B) Спонтанное бьющееся сердце стабильность ритма в течение 3 ч перфузии показан для не окрашивали предсердия препаратов и флуоресцентным красителем и blebbistatin запятнанные предсердий препараты. Данные представлены как среднее ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рис . 6: Интенсивность сигнала Распад с течением времени интенсивности сигналов от обоих методов нагружения (коронарная нагрузка обозначена красным, и поверхность нагружения синим цветом) были измерены и построены с течением времени. Интенсивность сигнала были усреднены из зоны 7 по 7-пиксельного в четырех типичных местах в правое предсердие: трабекулы (TRAB), синусового узла (SAN), правое предсердие придатков (RAA) и коронарного синуса (CS). То значения IC 50 были вычислены и маркируется во всех кривых распада. Распад интенсивность сигнала от обоих методов загрузки была одинаковой в TRAB и УПП. IC 50 артериальной нагрузки в CS составляла около 20 минут дольше. В SAN, это значение для артериальной нагрузки почти в два раза больше по сравнению с поверхностной нагрузки, что свидетельствует о том, что методы артериальной загрузки привело к улучшению устойчивости красителя в TISS SANу.е в течение долгого времени. Данные представлены как среднее ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представили два типа препаратов мыши SAN: 1) неповрежденными SAN в Лангендорфа-перфузионного целого сердца, и 2) САН в изолированном, открыт предсердный препарат. Эти два вида подготовки служат различным экспериментальных целей. В Лангендорфа-перфузионного препарата все сердце, интактный предсердный структура сохраняется , которая позволяет исследовать сложные предсердные аритмии , такие как фибрилляция предсердий, а также взаимодействие между SAN и предсердия во время возвратных тахиаритмий. 6 В отличие от этого , в изолированном предсердии подготовки атриум открывается и сплющенные в псевдоэйнштейново двумерной структуры, где трехмерные анатомические пучки возмущенной. Это может повлиять на анатомии возвратных путей, что делает изолированный предсердии препарат не является идеальным для изучения предсердной аритмии. Однако, используя этот тип препарата, расположение ведущего кардиостимулятора (ов) сайтов, intranodal проводимости и AP распространения рattern можно точно визуализировать и детально исследован. Кроме того, неповрежденные предсердия по всей видимости, ограничены тем задним в то время как в изолированном препарате, вся поверхность предсердия доступна для оптического картирования.

Кроме того, изолированные предсердия подготовка позволяет структурно-функциональное отображение предсердия путем решения сложной микроструктурой трабекулярной сети , как показано на рисунке 4. Для этого, высокое пространственное (100 мкм / пиксель или выше) и временной (2000 кадров в секунду и выше) резолюции следует использовать, поскольку она имеет решающее значение для конкретизируем как предсердные и SAN паттерны активации, которые могут быть дополнительно перекрывается с соответствующими структурами. В то время как 1000 кадров в секунду временное разрешение может быть, как минимум, чтобы реконструировать предсердной активации (который длится в течение 10 - 20 мс), 2000 кадров в секунду следует рассматривать как минимальное временное разрешение для intranodal проводимости (которое длится в течение ~ 5 мс и, таким образом, может быть пропущена ниже резолюции) и SAN актИзмерения Ivation , как видно из рисунка 4. Это может позволить локализацию аритмогенных "горячих точках" (таких , как эктопических очагов или привязанного спускаемого) во время фибрилляции предсердий / предсердий , которые могут возникнуть в результате суперпозиции областей значительного функционального ремоделирования с таковыми повышенной фиброза и / или уменьшить клетки к клетке связи. 21,22 Кроме того, описанный подход может быть использован для изучения электрофизиологических механизмов нарушений SAN, в том числе выездных блоков SAN, паузами, тахикардии-брадикардии аритмий, синдром слабости синусового узла и т.д..

Путем введения второй (или даже третий) флуоресцентного зонда, можно будет выполнить многопараметрических оптическое отображение электрической активности в сочетании с обработкой кальция, а также метаболических и других изменений. Различные комбинации красителей могут быть использованы для одновременного напряжения-кальция, радиометрическое напряжение / кальция или митохондриального потенциала визуализации.

Для высокого временного разрешения оптического картирования, из-за более короткого периода сбора флуорофор, сигналы более слабого отношения сигнал-шум может быть оценен. Таким образом, процедура обработки усреднения применяется к сигналам, ритм синусовый сердца или Шагание серии сигналов по мере необходимости. / DT Макс йР определяется для каждого сигнала в течение длительного периода записи. Эти моменты времени активации затем выравнивается. Период настройка записи с центром в этих временных точках режется и усредненные от всех или выбранных Aps, по мере необходимости.

При аккуратном использовании контрольно - измерительных приборов и надлежащей процедуры окрашивания, предсердные электрофизиологические параметры , включая скорости проводимости (сравните рисунки 3C и 4D для S1 карт активации), спонтанный SAN ритма и долговечности препарата SAN (рисунок 5) не затрагиваются, которые остаются стабильными в течение 3 или более часов. Важно отметить, что непрерывное монитORing ЭКГ следует проводить в течение всей процедуры окрашивания для обеспечения нормальной электрической функции сердца. Применение blebbistatin может вызвать временное замедление сердечного ритма, но кроме этого, он не вызывает каких - либо сдвигов в ведущих кардиостимулятора сайтов или изменения в морфологии AP , как это было также описано выше. 13

Поверхностное окрашивание изолированной мерцательной препарата является важным шагом. Для этого, быстрое нанесение разбавленной краски на поверхность ткани следует избегать; вместо того, чтобы краситель должен падать на подготовку свободно из-за более высокой плотности ДМСО, который используется и для красителя и blebbistatin разведений. Соответствующая сумма погрузки и скорость должна быть скорректирована таким образом, чтобы не вызывать резкие изменения частоты сердечных сокращений. Процедура окрашивания может быть применена несколько раз, пока сигнал не достигнет приемлемого уровня. Следует отметить, что непосредственное применение красителя может привести к повреждению тканей SAN и влияют на его Pacemпринимая к. Следовательно, краситель должен быть разбавлен и Примененное количество необходимо тщательно контролировать. Соответствующая поверхность окрашивание не должно повредить препарат или SAN 23 , который оценивается по сопоставимым сердечного ритма и скорости проводимости.

Альтернативные протоколы окрашивания должны быть также рассмотрены. Они могут включать в себя либо 10-15 мин суперфузии от SAN / мерцательной подготовки с напряжением чувствительных красителя (RH-237 или ди-4-ANEPPS) при температуре 35 ± 1 ° C 10,19 или 30 мин инкубации препарата при комнатной температуре (20-22 ° C) в растворе Тироде , содержащего индикатор напряжения чувствительных к . 11

Для оптического картирования SAN от Langendorff-перфузируемом целого сердца, важные шаги, приборы включают в себя вставку маленькой трубы в ЛЖ и закрытие ВПВ и НПВ. Прежний предотвращает повышение давления от перегрузок раствора в процессе длительных экспериментов, а также последующего IРазвитие schemia после подавления желудочковых сокращений по blebbistatin и подкисления раствора перфузии. Последнее позволяет RA поддерживать некоторый уровень внутриотраслевой мерцательной давления, таким образом, заполняя атриум с перфузионной раствором и уплощение intercaval область, чтобы раскрыть всю область SAN для оптического картирования.

И, наконец, ишемическая окрашивание, в дополнение к поверхности нагружения красителя, может значительно повысить интенсивность SAN OAPs , которая может длиться дольше по сравнению с чистой поверхности окрашивания , используемой в предыдущих исследованиях. 8,9

Использование blebbistatin имеет несколько преимуществ по сравнению с другими электромеханическими разобщителей включая низкую токсичность, менее выраженными побочными эффектами, и сопротивление вымывания, когда она используется с осторожностью. Blebbistatin выпадает в осадок , когда он растворяется при температуре менее чем 37 ° C. 14 кристаллы Blebbistatin могут прерывать нормальную сосудистую поток и , таким образом , вызывают местноеишемия и провоцируют аритмий. 24 Кроме того, в исследованиях , которые используют GFP или другие зеленый / желтый красители, blebbistatin осадки могут быть ошибочно приняты за меченых клеток , которые должны быть приняты во внимание. Предотвращение blebbistatin осадков является простым, то есть, необходимо растворить blebbistatin в предварительно нагретом (37 ° С и выше), интенсивно перемешиваемой медиа.

Для анализа APD, высокую концентрацию blebbistatin (до 10 мкм) могут быть использованы. 13,14,25. Аналогичным образом, если используются любой препарат, который увеличивает сжатие, рекомендуется дополнительное применение blebbistatin.

В качестве альтернативного метода для изучения мыши SAN электрической активности, низкое разрешение , мульти-электродный массив (64 отдельных электродов в квадрате 8 х 8, конфигурации с межэлектродном расстоянии 0,55 мм) 26 и последовательных записей из стекла микроэлектрода , сделанные на небольшом расстоянии между посажение на кол сравнению с до 50 мкм / пиксель для оптического отображение) и не могут быть использованы для анализа морфологии или AP для многопараметрического визуализации (например, одновременное напряжение и оптического картирования кальция). Хотя стекла микроэлектродные записей обеспечивают более подробную информацию о AP морфологии, в том числе абсолютных значений амплитуды AP и потенциала покоя, она также ограничена низким пространственным разрешением. Таким образом, он может быть использован только для стабильного расположения ведущих стимулятором и не применяется для захвата биение в биений изменения в переднем месте водителя ритма. В то же время, как было показано ранее 3,20 и выделены в настоящем исследовании, ОАП совместно SANnsists двухфазного сигнала whichincludes как SAN и предсердные компоненты миокард AP (рис 4б). Таким образом, она делает его трудно извлечь чистый сигнал SAN и точно оценить AP морфологии в SAN. Для этой цели стеклянные микроэлектродов 17 или токовые клещи подход на изолированных миоцитах SAN должны быть рассмотрены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, (1), 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110, (4), 609-623 (2012).
  3. Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. (2012).
  4. Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47, (4), 658-687 (2000).
  5. Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. (2013).
  6. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36, (11), 686-697 (2015).
  7. John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133, (19), 1892-1900 (2016).
  8. Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121, (8), 3277-3288 (2011).
  9. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, (2), H482-H491 (2010).
  10. Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593, (5), 1127-1146 (2015).
  11. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (31), 9769-9774 (2015).
  12. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
  13. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  14. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464, (5), 503-512 (2012).
  15. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (7), H753-H765 (2012).
  16. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73, (4), 729-738 (2007).
  17. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52, (1), 40-50 (2001).
  18. Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
  19. Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, (6), H2634-H2643 (2004).
  20. Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106, (2), 255-271 (2010).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
  22. Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36, (35), 2390-2401 (2015).
  23. Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44, (6), 626-634 (2011).
  24. Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60, (2), 109-117 (2010).
  25. Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48, (1), 152-160 (2010).
  26. Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, (7), H1510-H1523 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics