マウス洞房結節の高分解能光学マッピング

Biology

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Summary

ここでは、高い空間分解能と時間分解能で、マウス右心房、特に洞房結節から電気活動の光学マッピングするためのプロトコルを提示します。

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Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

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Abstract

Protocol

全ての実験は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所(NIHパブ号80から23)に従って行きました。これらの研究で使用されているすべての方法およびプロトコルは、(公開番号85から23は、1996年改訂)NIHによって公開実験動物の管理と使用に関するガイドライン以下のウィスコンシン大学の動物実験プロトコル委員会によって承認されています。本研究で用いた全ての動物は、実験動物の管理と使用に関する指針に準拠して人道的な世話を受けました。

1.ハートの取り外しおよびランゲンドルフ灌流

  1. 心分離、水浴、水ジャケットを使用して、37℃に暖かいタイロード液の前に。
  2. 5%イソフルラン/ 95%O 2と、マウスを麻酔。
  3. 痛みの反射の消失を確認することにより、麻酔の適切なレベルを確認してください。
  4. 開胸術を行います。湾曲した5.5 "メイヨーはさみと5.5"ケリーの止血用を使用して、胸を開きます胸部の前面に1cmのカットを作るためにCEPS。
    1. 迅速に(30秒以内)胸から心臓を抽出します。 「肺組織をつかむと4.3使用して心膜と一緒に肺、胸腺および心臓をカットするように湾曲アイリス鉗子「アイリスはさみを4を使用してください。直接心をつかむしないでください。
    2. 酸素(95%O 2/5%CO 2)でそれを洗って、一定温度(36.8±0.4°C)は、タイロード液を変更しました。 128.2のNaCl、4.7のKCl、1.19のNaH 2 PO 4、1.05のMgCl 2、1.3のCaCl 2、20.0のNaHCO 3、および11.1グルコース(pHは7.35±0.05):以下の溶液組成(mMの中)を使用します。
  5. 同じ溶液に浸しながら、肺、胸腺、および脂肪組織を識別します。慎重に心臓からそれらを分析。湾曲した3「Vannas - テュービンゲンはさみと4.3 "#5鉗子を使用してください。
  6. その後、大動脈を識別し、カスタムメイドの21 Gカニューレの上にカニューレを挿入。 2つの湾曲4.3」#5Bの力を使用しますpsの。
  7. 挿管後、同時に灌流;(〜50ml /分の流速で浴中)(〜5ml /分の流速でカニューレを通してこれは大動脈圧に基づいて調整されるべきである、以下参照)、表面かん流します実験全体を通して温め、そして濾過タイロード溶液で心。冠循環の目詰まりを防止するために、インライン11ミクロンのナイロンフィルターを通して灌流液を渡します。
  8. 灌流ラインに三方活栓ルアーロックを介して接続された圧力変換器(または圧力計)を用いて、大動脈の圧力を監視し、60から80 mmHgの間に維持します。この範囲内で大動脈圧を維持するために必要な場合、灌流速度を調整します。

ランゲンドルフ灌流心臓全体からSANの2光学マッピング

  1. 計装
    1. 水平に心を置き、Pに直径0.1mmのピンを使用して、チャンバのシリコンコーティングされた底部に心室頂点をピン実験中reventストリーム誘発性運動。12
    2. 左心房(LA)と僧帽弁(MV)、肺静脈を介して左心室(LV)に小(0.012 "IDのx 0.005")シリコンチューブを挿入します。響きの結合組織に絹縫合糸(4-0)によりチューブを固定してください。
    3. その後方側が( 1A、 左パネル)を上にして心を置きます。
    4. 直径0.1mm minutienピンを用いてチャンバのシリコン底部までのRA心耳(RAA)のエッジをピン。 RAの後面を平坦にし、それはカメラの焦点面に配置されることを可能にするために、そのレベルを調整します。これは、心房の最大表面積から光学的測定を可能にします。
    5. 絹縫合糸(4-0)による縄優れた(SVC)および(IVC)下大静脈、シリコンコーティングチャンバの底部に縫合糸のもう一方の端を伸ばし、ピン( 図3Aを参照てください)。縫合糸はブロックしないことを確認してください光学視野。
    6. RAAの端にカスタムメイドのペーシング電極を配置します。電極を作製するために、使用したシリコンを0.5mm、電極間距離は、直径0.25mmの銀線を被覆し、ペーシング端1mmの長さのためにシリコンを欠きます。その後、2 ECG 12ミリメートル針(29ゲージ)の右心室と左心室の底部近くモノポーラ電極を配置します。心室の頂点に近いグランドECG電極を配置します。
  2. 染色
    1. 蛍光染料及び電気機械脱共役剤のブレビスタチンの両方が光に敏感であるため、暗い部屋で、以下に記載されているすべての手順を実行します。まず、ジメチルスルホキシド(2.5 mM)の、アリコートそれをストック溶液、1.25 mg / mlでのように(30μLずつ)電位感受性色素RH-237またはジ-4- ANNEPSを準備し、-20℃でアリコートを保存します。
    2. 温めた(37℃)タイロード溶液1ml色素ストック溶液の5-10μLに希釈した後、冠動脈灌流ラインに注入イン・ラインルアー注入ポートを使用して5-7分間かけて。
    3. 事前にストック溶液(ジメチルスルホキシド中で2 mg / mlで、6.8 mm)とブレビスタチンを準備し、4℃で保管してください。
    4. 安定化の20分後、灌流液に温めた0.5mlの(37°C)ブレビスタチンを追加して温めた(37℃)タイロード液1mlでブレビスタチン0.1mlの希薄。次に、インラインルアー注入ポートを使用して5-7分かけて冠動脈灌流ラインに注入。

単離された心房準備からSANの3光学マッピング

  1. 計装
    1. 全心の準備のためのステップ1.1から1.5で説明したように、単離された心房の準備のために、心を分離し、カニューレを挿入。
    2. 離れた前方側から心室を解剖。 1A、 右パネルを参照てください、詳細については、#1を切りました
    3. 三尖弁VAを切断することにより、RAを開きます。TV-SVC軸に沿っLVE(TV)。 1A、 右パネルを参照てください、詳細については#2をカット
    4. RAAを開くには稜終の内側手足をカット。 1A、 右パネルを参照てください、#3を切りました
    5. RAAの右下隅の端に、以前のカット#3の正中線からのカットを行うことにより、前方心房自由壁を開き、シリコンコーティングチャンバの底部に心房自由壁を平らにし、ピン。 #4をカットし図1(a)の白抜き矢印で示す方向を参照してください。心房への損傷を防止するために準備を固定するための心室組織の縁を保持します。
    6. LAの付属物(LAA)のMV-上隅に沿ってMVを切断することによりLA同様に、開きました。
    7. LAAを開くには、LAAの中央縁近くまで前方心房自由壁を通って、開かれたLAAの真ん中からカット。
    8. 前方心房自由壁ALOを開きます同じ方向をngの、その後のSylgardコーティングされたチャンバーの底にそれを平らにし、ピン。
    9. 部分的に心房間中隔組織を削除します。これがフォーカスされていない組織からの光信号の散乱を低減します。したがって、LAおよびRAだけでなく、SANおよび房室接合部(AVJ)の両方がこの準備( 図1B)でアクセス可能です。
    10. 心外膜と心内膜面の両方から灌流を可能にするためにシリコンコーティングチャンバの底部から約0.5ミリメートルによる最終準備を持ち上げます。
    11. お風呂の灌流のためのSVCおよび〜30ミリリットル/分の近くにある集束されたフローのための〜12ミリリットル/分の一定速度で加温した(37℃)タイロード溶液で準備を表面かん流します。
    12. 解剖RAAの端にカスタムメイドペーシング銀/塩化銀2電極(直径0.25mm)を配置します。そして、それぞれ、2 ECG 12ミリメートル針(29G)RAAおよびLAA近い電極(単極)を配置。地面ECG当選者を配置AVJの近くに乗りました。
  2. 染色
    1. 電位感受性色素(RH-237またはジ-4- ANNEPS)の直接適用を実行します。このために、暖めた(37℃)タイロード溶液1mmの色素ストック溶液を1-2μLに希釈し、ゆっくりと、1mmのピペットを使用して製剤の表面上に希釈された色素を放出します。
    2. また、全体の心の準備(ステップ2.2.1-2.2.2)のために上記と同様のランゲンドルフ灌流心臓の冠状動脈の灌流を介して電圧感受性色素を持つ心房染色を行います。
      1. 記載されているように冠動脈灌流染色した後、心房準備を隔離します。十分な蛍光レベルに到達するために必要なときに追加の表面染色を実行します。クイック心房分離は、色素を漂白しないと染色の品質には影響しません。
    3. 電気機械脱共役剤、ブレビスタチンと準備を固定化。 BLE 3-5μLを希釈温めておいた(37℃)タイロード溶液中の原液bbistatin、ゆっくり準備と周囲の溶液の表面に希釈したブレビスタチンをリリース。ブレビスタチンので13,14が準備し、染色時の光に長時間露光を避けるため、光に敏感であることが示されています。
    4. 収縮を抑制するために必要な量の追加のブレビスタチンのアプリケーションを実行します。通常、3つの追加アプリケーション(各アプリケーション当たり3~5μL)まで正確にSANおよび心房活性化を再構成するために十分なモーションアーチファクトを抑制するために使用することができます。
    5. 灌流液中で温めたブレビスタチンの追加の0.5ミリリットルを追加します。この手順の間、心房組織を染色する色素/ブレビスタチンを可能にするために30秒間灌流を一時停止します。

4.光学マッピングの設定します

注:光学マッピングシステムの詳細な説明は他の場所に提供されている12。

  1. TEMでカメラを使用poral 2,000フレーム/秒以上の解像度、及び100ミクロン/ピクセル以上の空間分解能に到達する集光レンズのシリーズ。これは、SAN活性化および結節内伝播を再構成するために必要とされます。
  2. 振動溶液からモーションアーチファクトを低減するために、心臓/孤立性心房準備の上、溶液の表面に小さなカバーガラスを固定します。
  3. 定電流、低ノイズのハロゲンランプが提供する励起光(520±45 nmの波長)を使用します。柔軟な二股ライトガイドを使用して準備にフィルタされた光ビームを向けます。
  4. ロングパスフィルタ(> 715 nm)を発する蛍光をフィルタリングします。収集し、デジタル化し、カメラメーカーが提供するソフトウェアを使用しているコンピュータ上で、取得した蛍光シグナルを保存します。

5.データ処理

注記:光学的マッピングデータを収集し、異なる時点での蛍光強度の行列の列として格納されます。各画素represe特定の時点での組織標本上の特定の位置から採取した蛍光強度の測定をNTS。バックグラウンド蛍光は、自動的に、膜電位の変化によって生成され、微小電極システムによって測定された活動電位(APS)に対応して倒立蛍光変化のより良好な視覚化を可能にするために、画素毎に除去されます。画像分割、空間フィルタリング、時間フィルタリング、ベースラインドリフト除去を含む光学撮像データを処理における様々なステップの詳細、集束レビューに設けられている。15

  1. 手動で、または組織の境界を決定するための特別なアルゴリズム(例えば、閾値化、エッジ検出)15を用いて、1(含まれる画素)と0(除外画素)のバイナリマスクを作成し、シーケンス内の各フレームにマスクを適用します。このプロセスは、さらなる処理のために関心のある領域を強調した二値画像を作成します。
  2. OPTの信号対雑音比を改善するためにiCalのデータは、関心のある選択された領域内の信号をフィルタリングします。このため、空間的な( すなわち 、所望の畳み込みビンまたはカーネルによって定義されるように、隣接する蛍光画素の平均値、例えば3×3または、ノイズの多いデータ、5×5の場合)、および/または時間フィルタリング(例えば、バターワース、チェビシェフ型を使用1、チェビシェフ型2、楕円 )( 図2)。データを解釈する際に念頭に置いて、ろ過によって誘発されるアーティファクトの可能性をキープ。詳細については、レビューを参照してください。15
  3. 必要なときに(元の信号にハイパスフィルタまたは多項式フィッティングを使用して)、光学録音でベースラインのドリフトを削除してから1に0(最小蛍光)から各画素信号を正規化(最大蛍光)。
  4. 単一のAP伝播の全画素の活性化時間を含む時間ウィンドウを選択します。 Fはfluorescenで最大アップストローク誘導体(DF / dtの最大の時間として、各画素に、その起動時間を割り当てCE強度)。全画素活性化時間を使用して、等時間活性化マップを再構築します。各アイソクロンは、このように同時に作動ピクセルが表示されます。
  5. AP持続時間(APD)の分布マップを再構築するために、画素ごとに(例えば、再分極の80%で、APD 80)再分極の特定のレベルでの活性化時間と時間の間の持続時間を計算します。全ての画素APDの値を使用して、APD分布等時マップを再構築します。各アイソクロンは、このように同じAPDを持つピクセルが表示されます。
  6. APの伝播の伝導速度を計算するために、5.4で算出起動時間データに製剤の表面に合います。このために、多項式表面フィッティングまたはローカルカーネルの表面平滑化を使用し、フィット表面の勾配からローカル伝導速度ベクトルを算出します。
  7. 再分極マップを作成するには、各ピクセルにその再分極時間を割り当て、最大の第2導関数として定義される(D 2 F / dtは2)OAP、または90%の再分極の時間の終わりに光信号の。

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Representative Results

ランゲンドルフ灌流心臓から無傷SANの光学マッピング
自発的な洞調律のために再構成されたRA活性化等高線の典型的な例は、ランゲンドルフ灌流マウス心臓については、 図3に示されています。早期活性化点がSANを解剖学的に定義されているSVC周辺intercaval領域内に位置している。1.0および0.5ミリ秒のサンプリングレートで取得3,16つRA活性輪郭マップは図3Bに示されています。

SANの機能を評価するために、我々は、10~12 Hzで少なくとも1分間RAAペーシング後SAN回復時間(SANRT)。9の測定、電気刺激を停止し、SANRTは、最後に撮影APとの間の時間間隔として計算しました。最初の自発的AP( 図3C)。 SANRTは、心拍数( すなわち SANRT <に修正されましたSANRTと基本周期との差分を算出することにより、サブ> C)。また、第一のポストペーシングペースメーカーの位置を同定しました。この例では、SANRTcは約49ミリ秒でした。

孤立しアトリアとSANのアクティブ化
自発的な洞調律の間に単離された心房製剤の活性化は、 図4Aに示されています。これは、( 図4Aの活性化マップにマークされている)中隔方向に上位および下位SANエッジと完全なブロックに近い2つの優先導通方向で、RAを通じて異方的に広がる広い波面とSVCの近くに解剖学的に定義されたSANで始まりました。 1ミリ秒のサンプリングレートで取得された活性化マップは、早期活性の広い範囲を示しています。 0.5ミリと0.3ミリ秒のサンプリングレートの増加は、私たちは大手ペースメーカーの場所の正確な面積を識別することができます。 Weは以前にガラス微小電極17と光学マッピング8-11,18,19によってだけでなく、connexin45とHCN4のための免疫標識によって電気生理学的に特徴付けられる主要なペースメーカーの面積に相当する大手ペースメーカーの典型的な、拍動ごとの安定した単焦点位置を観察しました。6,16

ゆっくりと上昇するSANコンポーネントと心房心筋の急上昇アップストローク(心房成分)( 4B)20ため、光散乱の:以前に実証されているように、SAN光学活動電位は、2つの別個の構成要素を含む2相信号で構成されていプロセスは、OAPは、組織内の細胞の複数の層から生じる平均電気活動を表します。拡散深さと幅は、光散乱および吸収特性によって決定され、1.5-2ミリメートルまで到達できる空間定数によって支配されます。そのため、SAN conduのction遅延は、SAN APは常に生理的活性化( 図4B)の間に心房活動に先行します。心房( すなわち SAN伝導時間、SANCT)へのSANからの遷移を計算するために、我々は、二成分SAN信号50はSANコンポーネントの振幅の%、または二ピークの最初のピークに達した時点のいずれかを使用しましたOAP一次導関数(DF / DT)。 RAへの最古のSAN活性化のエリアからSANCTは、ガラス微小電極によって測定されたものと同様〜5ミリ秒でした。

SAN回復時間
同様に、SANRTは、単離された心房製剤( 図4D)で測定しました。このために、心房の製剤は、少なくとも1分間、RAAの角に位置ペーシング電極を介して12 Hzでペースた。9この例では、SANRTcはランゲンドルフ灌流で測定されたものに匹敵する約34ミリ秒でした心臓( 図3C)。また、第一のポストペーシングペースメーカーの位置を同定しました。

ハートリズムと蛍光シグナル経時安定性
手術や染料ロード手順が適切に続いている場合は、心房の生理的特性に大きな変化があってはなりません。 図5では、私たちは前と心房単離手順の後、3時間灌流の間に測定心臓のリズムを提示します。心拍数の有意な変化は、心房の単離の間または色素負荷後のいずれかで観察されませんでした。

動脈染色色素を多く必要とする場合があるが、SAN領域組織における蛍光シグナルの安定性は、このローディング法を用いた方がよいと思われます。 図6では、我々は両方の冠状動脈および表面染色のために時間をかけて信号強度の減衰を提示します。トンで彼SAN組織は、(信号強度が50%に死亡している期間を示している)のIC 50は 、冠状動脈の染色後にほぼ2倍長い表面染色の約107分です。

図1
図1:マウス心房調製の単離は、(A)外科的処置は、マウス心房製剤を単離するために行います。心臓の後面図が示されています。すべてのカットは赤い点線の線で示され、実行さ順に数字でラベル付けされています。テキストで詳細を参照してください。 (;灰色の楕円で標識されたSAN)(B)左と右心耳の骨梁構造だけでなく、洞房結節の位置を含む主な解剖学的特徴を示す単離したマウス心房準備の概要図。すべての略語は図で説明されています。tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:0.3、0.5および1ミリ秒/フレームで録画生と処理された信号の生の信号は、単一のピクセルから収集されています。 3×3ビニング後、信号はローパスバタワースアルゴリズムを用いてフィルタリングされる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3:SAN(A) の全ハート光学マッピング 無傷の心からのSANのマッピングに使用される典型的な調製の写真。青い四角は、光学フィールドを示していますビュー(6ミリメートルで6 mm)です。 右、ビューカメラを通して捕捉され、解剖学的ランドマークと重ね合わせの光学分野。 SVCとIVC:スーペリア、下大静脈。 RAA:右心耳。 RVおよびLV:右心室と左心室。 PV:肺静脈。 (B)色輪郭活性化マップ( )1.0ミリ秒および0.5ミリ秒( サンプリングレートで取得されました。各マップの右側には、心房活性化時間を示す、対応する色の時間スケールに示されている(最も早い活性化の点からは、赤で示した最新の活性化ポイントに、青で示されています)。最も初期の心房活性化部位は、アスタリスクで標識されています。 (C)SAN回復時間(SANRT)全心臓調製物において測定しました。最後のペーシング刺激(S1)のためにと、最初のペーシング後の心房拍動(A1)のために再構成された心房興奮の等高線の代表的な例としては、上に代表OAPのトレースを選択したビートのために示されています。最も初期の心房活性化の部位はアスタリスクで標識されています。 BCL:基本サイクル長、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:単離されたアトリアの心内膜表面からのマウス洞房結節(SAN)の高分解能光学マッピング代表的なマウスのSANの準備(6ミリメートル×6 mm)での(A)写真と、それに対応する活性化等高線 1.0ミリ、0.5ミリ秒、0.3ミリ秒のサンプリングレートで得られます。 SANと隣接ブロックゾーンは、矢印で示されています。色の時間スケールは、心房活性化時間を示しています。アスタリスクは、大手ペースメーカーの位置を示しています。 RAA:右心耳、SVCおよびINC:スーペリア、下大静脈、RV:右心室、AVJ:房ventricul ARジャンクション、CT:稜終、IAS:心房間中隔。 (B) マウスSANエリアからOAP記録の二重構成要素のメカニズム。テキストで詳細を参照してください。 (C)OAPsは、SAN領域(青)の中心、最も初期の心房興奮部位(緑)、最新のRA活性化部位(赤)から記録されたインセット :5に等しい総通電時間との結節から心房波形への移行ミリ秒。 11ミリ秒に等しい合計RAの活性化のための時間遅延と比較してみてください。 (D)SAN回復時間(SANRT)単離された心房製剤で測定。最後のペーシング刺激(S1)および第一のポストペーシング心房拍動(A1)のために再構成された心房活性化等高線マップの代表的な例が示されています。最も初期の心房活性化の部位は、アスタリスクで標識されています。 BCL - 基本的なサイクル長。K ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:ハートリズムの前と後に心房の単離操作(A)と3時間の灌流(B)の間に測定。 (A)自発的な拍動する心臓率は前と心房染色の2つのタイプのための心房分離した後に示されている:心房分離の前に表面染色単離後(なし前冠動脈染色)および冠動脈染色。 3時間灌流オーバー(B)自発的な拍動する心臓のリズムの安定性は、非染色心房の準備のために、蛍光色素のために示され、染色された心房準備をブレビスタチンされます。データは、平均±SEMとして示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6:信号強度ディケイオーバータイム両方の読み込みメソッドからの信号の強度が(冠動脈ローディングが赤で示され、かつ表面負荷が青色で表示)を測定し、経時的にプロットしました。骨梁(TRAB)、洞結節(SAN)、右心房の心耳(RAA)と冠状静脈洞(CS):信号強度は、右心房内の4つの典型的な場所で7で7画素領域から平均しました。 IC 50値を計算し、すべての減衰曲線で標識しました。両方の積載方法からの信号強度の減衰はTRABとRAAで同様でした。 CSにおける動脈搭載のIC 50は約20分長かったです。 SANでは、動脈ロードするため、この値は、動脈のロード方法は、SAN TISS中の染料のより良好な安定性をもたらしたことを示している表面負荷に比べてほぼ2倍大きかったです時間をかけてUE。データは、平均±SEMとして示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ランゲンドルフ灌流心臓全体で1)無傷のSAN、および2)SANは、単離された中で、心房の準備を開いた:ここでは、マウスのSAN製剤の2種類を発表しました。製剤のこれらの2つのタイプは、異なる実験的な目的を果たします。ランゲンドルフ灌流心臓全体の製造においては、無傷の心房構造は、心房細動と同様に再入頻脈性不整脈の間にSANと心房の間の相互作用などの複雑な心房性不整脈を研究することを可能にするどの保存されている。これとは対照的に6、孤立心房準備中、心房三次元解剖学的束が乱れている擬似二次元構造体に開口し、平坦化します。これは、心房不整脈原性を研究するための理想的ではない孤立性心房準備をするリエントラント経路の解剖学的構造に影響を与える可能性があります。しかし、調製のこのタイプを使用して、主要なペースメーカーの位置(単数または複数)の部位、結節内の伝導、およびAP伝播Patternを正確に可視化し、詳細に調べることができます。また、無傷の心房が単離された調製物で、全体の心房表面は光学的マッピングのために利用可能である一方で後方図によって限定されるように思われます。

さらに、単離された心房準備は、図4に見られるように、小柱網の複雑な微細構造を解決することによって、心房の構造的・機能的マッピングを可能にします。このため、高い空間(100ミクロン/ピクセル以上)および時間(2000 FPS以上)解像度さらに、対応する構造と重なることができ、両方の心房およびSAN活性化パターンを、詳細に述べることが重要であるため、使用すべきです。千fpsの時間分解能は(10続く - 20ミリ秒)、心房活性化を再構築するための最小かもしれませんが、2000 fpsのは〜5ミリ秒持続し、したがって下で見逃すことができた結節内伝導(の最小時間分解能として考慮されるべきです解像度)およびSAN行為図4から分かるようにivation測定は。これは高架線維症のものと有意な機能改造の地域の重ね合わせから出てくる可能性心房細動/粗動時の催不整脈「ホットスポット」(このような異所性病巣またはアンカーリエントリーなど)の局在化を可能にすることができますおよび/または細胞間の結合を減少させた。また21,22、記載されたアプローチは、電気生理学的SAN出口ブロックを含むSAN異常のメカニズム、一時停止、頻脈、徐脈性不整脈、洞不全症候群などを研究するために使用することができました。

第二(または第三)の蛍光プローブを導入することにより、カルシウム処理、ならびに代謝および他の変更に関連して電気的活動のマルチパラメトリック光学マッピングを行うことが可能であろう。色素の異なる組み合わせは、同時電圧カルシウム、レシオメトリック電圧/カルシウム、またはミトコンドリア電位イメージングのために使用することができます。

短いフルオロフォア収集期間に高い時間分解能光学的マッピングのために、より弱い信号対雑音比の信号が理解されるかもしれません。したがって、必要に応じて、平均化処理の手順は、洞心拍信号又はペーシング系列信号に適用されます。 dF / dtのmaxは長時間記録における各信号のために検出されます。これらの活性化の時点は、次いで位置合わせされます。必要に応じて、これらの時点を中心と記録の設定期間は、APを切断し、平均すべてまたは選択されます。

計装の正確な使用と適切な染色手順により、伝導速度(S1活性化マップの図3Cおよび図4Dを比較)、SANの準備の自発的なSANのリズムと長寿( 図5)を含む、心房電気生理学的パラメータは、安定したままである、影響を受けません3時間以上。重要なことは、連続MONITECGの論理和は、心臓の正常な電気的機能を確保するために、全体の染色手順を介して行われるべきです。ブレビスタチンのアプリケーションは、過渡心拍の減速を引き起こすことがあり、それ以外は、それはまた、先に説明したようなAP形態でペースメーカー部位や変更をリード内の任意のシフトを誘導しない。13

孤立性心房準備の表面染色は重要なステップです。このため、組織の表面上に希釈された染料の高速アプリケーションは避けるべきです。代わりに染料が原因染料とブレビスタチン希釈液の両方に使用するDMSOの高密度化、自由に準備に落ちる必要があります。劇的な心拍数の変化を誘発しないように適切な総積載量と速度が調整されるべきです。信号が妥当なレベルに達するまで、染色手順を数回適用することができます。染料の直接適用は、SAN組織を損傷し、そのpacemに影響を与える可能性があることに留意すべきですaking。したがって、染料を希釈する必要があり、塗布量は、注意深く制御されるべきです。適切な表面染色は、同程度の心拍数と伝導速度によって評価される製剤またはSAN 23に損傷与えないようにしてください。

代替染色プロトコルも考慮すべきです。これらは、35±1℃で10,19の電圧感受性色素(RH-237またはジ- 4 - ANEPPS)とSAN /心房準備の10〜15分の灌流または調製の30分間のインキュベーションのいずれかを含むことができ、電位感受性指示薬を含むタイロード溶液中で室温(20-22℃)で11

ランゲンドルフ灌流心臓全体からSANの光学的マッピングのために、重要な計装ステップはLVとSVCとIVCの閉鎖に小さなチューブの挿入が含まれます。前者は、その後の私としてだけでなく、長期的な実験中のソリューションの混雑からの圧力上昇を防止します灌流液のブレビスタチンおよび酸性化により心室収縮の抑制後のschemia開発。後者は、このように灌流液とのアトリウムを充填し、光学マッピングのためのSAN全体の面積を発見するためにintercaval領域を平坦化する心房内の圧力のいくつかのレベルを維持するためにRAを可能にします。

最後に、冠動脈染色は、色素負荷を表面に加えて、かなり以前の研究で使用される純粋な表面染色と比較した場合、長く続くかもしれSAN OAPsの強度を向上させることができます。8,9

ブレビスタチンの使用は、それを注意して使用される低毒性、あまり顕著な副作用、およびウォッシュアウト抵抗を含む他の電気機械脱共役剤に比べて多くの利点があります。それは温度が37℃未満で溶解したときブレビスタチンが沈殿。14ブレビスタチンの結晶は、正常な血管の流れを中断し、したがって、ローカル誘導する可能性があります虚血や不整脈事象を引き起こす。また24は 、GFPまたは他の緑/黄色の染料を使用した研究では、ブレビスタチン降水量が考慮されるべきである標識された細胞のために誤解される可能性があります。ブレビスタチンの沈殿を防止すること、すなわち 、単純である、一つは(予め温めに37をブレビスタチン溶解するために持っています °C以上)、激しく撹拌したメディア。

APD、(10μMまで)ブレビスタチンの高濃度に使用することができる。13,14,25を分析します。収縮を増加させる任意の薬剤が使用されている場合同様に、ブレビスタチンの追加のアプリケーションをお勧めします。

マウスSANの電気的活動、低解像度マルチ電極アレイ(正方形の8×8で64の別々の電極、0.55ミリメートルの電極間距離で構成)26との間の短い距離で行われた連続したガラス微小電極記録を研究するための代替技術として、串刺し対最大50ミクロン/ピクセルの解像度を有しますマッピング)とAPの形態や、同時電圧およびカルシウム光学マッピング)などのマルチパラメトリックイメージング(のための分析に使用することはできません。ガラス微小電極記録はAPの振幅と静止電位の絶対値を含むAPの形態の詳細な情報を、提供しているが、それはまた、低空間分解能によって制限されます。したがって、それは唯一の大手ペースメーカーの安定した場所に使用され、大手ペースメーカーの場所に心拍間変化を捕捉するためには適用されないことができます。同時に、としては、以前に3,20を実証し、本研究で強調され、SANのOAPの共同2相信号whichincludes SANと心房心筋APコンポーネント( 図4B)の両方のnsists。従って、純粋なSAN信号を抽出し、正確なSANにAPの形態を推定することを困難にします。この目的のために、ガラス微小電極17または単離されたSAN筋細胞の電流クランプ法を考慮すべきです。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

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References

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