Høy oppløsning Optisk Kartlegging av Mouse sinoatrielt Node

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for optisk kartlegging av elektrisk aktivitet fra musen høyre forkammer og spesielt sinoatrielt node, til en høy romlig og tidsmessig oppløsning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Alle forsøkene ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (NIH Pub. No. 80-23). Alle metoder og protokoller som brukes i disse studiene har blitt godkjent av The University of Wisconsin Animal Care og bruk protokollutvalget følgende retningslinjer for Pleie og bruk av forsøksdyr publisert av NIH (publikasjon nr 85-23, revidert 1996). Alle dyr som brukes i denne studien fikk human behandling i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.

1. Hjerte Fjerning og Langendorff Perfusjons

  1. Før hjerte isolert varm Tyrode-løsning til 37 ° C ved hjelp av et vannbad, og en vannkappe.
  2. Bedøve mus med 5% isofluran / 95% O 2.
  3. Sørg for riktig nivå av anestesi ved å kontrollere tap av smerte refleks.
  4. Utfør torakotomi. Åpne brystet ved hjelp av buede 5,5 "Mayo saks og 5,5" Kelly hemostatisk forceps for å lage en 1 cm kutt på forsiden av thorax.
    1. Raskt trekke ut hjertet fra brystet (innen 30 sek). Bruk 4 "buede Iris pinsett til å ta tak i lungevevet og kutte ut lungene, thymus og hjerte sammen med hjerteposen bruker 4,3" Iris saks. Ikke ta tak i hjertet direkte.
    2. Vask den i oksygenert (95% O 2/5% CO2), konstant temperatur (36,8 ± 0,4 ° C) modifisert Tyrodes løsning. Bruke følgende løsning sammensetning (i mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2PO 4, 1,05 MgCl2, 1,3 CaCl2, 20,0 NaHCO3, og 11,1 glukose (pH 7,35 ± 0,05).
  5. Mens badet i den samme oppløsning, identifisere lunge, thymus, og fettvev. Nøye dissekere dem fra hjertet. Bruk buet 3 "Vannas-Tübingen saks og 4,3" # 5 tang.
  6. Deretter identifisere aorta og cannulate det på en skreddersydd 21 G kanyle. Bruk to buede 4,3 "# 5B kraftps.
  7. Etter kanylering, samtidig perfuse (gjennom kanylen med en strømningshastighet på ~ 5 ml / min, og dette bør bli justert basert på den aortiske trykk, se nedenfor) og superfuse (i badet ved en strømningshastighet på ~ 50 ml / min) hjertet med varmet og filtrert for Tyrode-oppløsning gjennom hele forsøket. Bestå perfusjon oppløsningen gjennom en in-line 11 mikrometer nylonfilter for å hindre tilstopping av koronare sirkulasjon.
  8. Ved hjelp av en trykktransduser (eller en trykkmåler) som er forbundet via en 3-veis stoppekran Luer-lås til perfusjonslinjen, overvåke aorta trykk og opprettholde den mellom 60 og 80 mmHg. Juster perfusjon fart hvis det er nødvendig for å holde aortic trykket innenfor dette området.

2. Optisk Kartlegging av SAN fra Langendorff-dynket hele sitt hjerte

  1. instrumentering
    1. Plasser hjerte horisontalt og feste den ventrikulære apeks til silisium-belagte bunnen av kammeret ved hjelp av 0,1 mm diameter stiftene til pRevent stream-induserte bevegelser under eksperimentet. 12
    2. Sett inn en liten (0,012 "ID x 0,005") silisium rør inn i venstre ventrikkel (LV) via lungevenen, venstre atrium (LA) og mitralklaffen (MV). Fest røret ved en silke sutur (4-0) til å høres bindevev.
    3. Plasser hjerte med sin bakre siden opp (figur 1A, venstre panel).
    4. Pin kanten av RA vedheng (RAA) til silisium bunnen av kammeret ved hjelp av 0,1 mm diameter minutien nålene. Justere nivået for å gjøre den bakre overflate av RA-flate og tillate det å bli plassert kameraets fokalplan. Dette vil muliggjøre optiske målinger fra den maksimale overflatearealet av atrium.
    5. Løkke overlegen (SVC) og nedre (IVC) vena cava ved en silkesutur (4-0), strekke og feste den andre enden av sutur til bunnen av en silisiumbelagt kammeret (se figur 3A). Sørg sting ikke blokkereroptisk synsfelt.
    6. Plasser skreddersydde pacing elektrode på kanten av RAA. For å gjøre elektrodene, bruk silikonbelagt 0,25 mm diameter sølvtråder, med 0,5 mm inter-elektrodeavstand og blottet for silisium til en lengde på 1 mm ved enden pacing. Deretter plasserer to EKG 12 mm nål (29 gauge) monopolare elektroder nær bunnen av høyre og venstre ventrikkel. Plasser bakken EKG-elektrode i nærheten av toppen av ventriklene.
  2. farging
    1. Siden begge fluorescerende fargestoffer og elektromekanisk uncoupler Blebbistatin er lysømfintlig, utføre alle prosedyrene som er beskrevet nedenfor i et mørkt rom. Først fremstille spenningsfølsomt fargestoff RH-237 eller di-4-ANNEPS som en stamløsning, 1,25 mg / ml i dimetylsulfoksid (2,5 mM), aliquot det (30 pl hver) og lagre alikvotene ved -20 ° C.
    2. Fortynn 5-10 ul av fargestoff stamløsningen i 1 ml oppvarmet (37 ° C) Tyrode-oppløsning, og deretter injisere den i den koronare perfusjon linjeover en periode på 5-7 min ved bruk av en in-line Luer injeksjonsport.
    3. Forbered Blebbistatin som en stamløsning (2 mg / ml i dimethylsulfoxyd, 6,8 mM) i forveien og oppbevare den ved 4 ° C.
    4. Etter 20 min av stabilisering, tilsett 0,5 ml oppvarmet (37 ° C) Blebbistatin i perfusatet og fortynne 0,1 ml Blebbistatin i 1 ml oppvarmet (37 ° C) Tyrode-oppløsning. Deretter injiseres inn i den koronare perfusjon linje over en periode på 5-7 min ved bruk av en in-line Luer injeksjonsport.

3. Optisk kartlegging av SAN fra Isolated Atrial Forberedelse

  1. instrumentering
    1. For den isolerte atrial forberedelse, isolere og cannulate hjerte som beskrevet ovenfor i trinn 1,1-1,5 for hel-hjerte preparat.
    2. Dissekere ventriklene bort fra den fremre side. Se figur 1A, panel rett, kuttet # 1 for detaljer.
    3. Åpne RA ved å skjære gjennom trikuspidalklaff valve (TV) langs TV-SVC-aksen. Se figur 1A, panel rett, kuttet # 2 for detaljer.
    4. Skjær den mediale lem av crista termin å åpne RAA. Se figur 1A, panel rett, kuttet # 3.
    5. Åpne fremre atrial frie veggen ved å utføre et kutt fra midtlinjen av tidligere kutt # 3 til kanten av høyre hjørne av RAA, flate og pin atrial frie veggen til bunnen av en silisium-belagt kammeret. Se den retning som er vist ved den hule pilen i figur 1A, kutt # 4. Bevare en rand av ventrikkel vev for låsing tilberedning for å unngå skade på atriene.
    6. Tilsvarende åpen LA ved å kutte gjennom MV langs MV-øvre hjørnet av LA vedheng (LAA).
    7. For å åpne LAA, kuttet fra midten av åpnet LAA, gjennom fremre atrial frie veggen til nær en midt kanten av LAA.
    8. Åpne fremre atrial frie veggen along samme retning, deretter flate og pin den til bunnen av en Sylgard-belagt kammeret.
    9. Delvis fjerne interatrial septal vev. Dette vil redusere spredning av det optiske signal fra vev som ikke er i fokus. Derfor både LA og RA samt SAN og atrioventrikulær krysset (AVJ) er tilgjengelig i dette preparatet (figur 1B).
    10. Løft opp det endelige preparat med omtrent 0,5 mm fra bunnen av silikonbelagt kammeret for å tillate superfusjons fra både epikardiale og endokardiale overflate.
    11. Superfuse fremstillingen med varmet (37 ° C) Tyrode-oppløsning ved en konstant hastighet på ~ 12 ml / min for en fokusert strømning ligger nær SVC og ~ 30 ml / min i et bad superfusjons.
    12. Plasser skreddersydde pacing Ag / AgCl to elektroder (0,25 mm diameter) på kanten av dissekert RAA. Deretter plasserer to EKG 12 mm nål (29g) elektroder (monopolare) i nærheten av RAA og LAA, henholdsvis. Plasser bakken EKG utvalgtered nær AVJ.
  2. farging
    1. Utfør en direkte anvendelse av spenningssensitive fargestoff (RH-237 eller di-4-ANNEPS). For dette fortynne 1-2 ul av fargestoffet stamløsning i 1 mm varmet (37 ° C) Tyrode-oppløsning og langsomt frigi den fortynnede fargestoffet på overflaten av blandingen ved anvendelse av en 1 mm pipette.
    2. Alternativt kan utføre atrial farging med spenningsfølsomme fargestoff gjennom en koronar perfusjon av Langendorff-hjerte perfusert lik den som er beskrevet ovenfor for hele hjerte-preparat (trinn 2.2.1-2.2.2).
      1. Etter koronar perfusjon flekker, isolere atrial forberedelse som beskrevet. Utføre ytterligere overflatefarging når det er nødvendig for å oppnå et tilfredsstillende nivå fluorescens. Hurtig atrial isolasjon ikke bleke fargestoff og påvirker ikke kvaliteten på farging.
    3. Immobilisere tilberedning med elektromekanisk uncoupler, Blebbistatin. Fortynnet 3-5 pl ligbbistatin stamløsning i den oppvarmede (37 ° C) Tyrode-oppløsning og langsomt frigi den fortynnede Blebbistatin på overflaten av blandingen og omgivende oppløsning. Siden Blebbistatin har vist seg å være lysfølsom, 13,14 unngå lang eksponering for lys under forberedelse og farging.
    4. Utfør tilleggs Blebbistatin søknaden så mye som nødvendig for å undertrykke sammentrekning. Normalt opptil 3 ekstra programmer (3-5 mL per hvert program) kan brukes til å undertrykke bevegelsesartefakt tilstrekkelig for å nøyaktig rekonstruere SAN og atrial aktivering.
    5. Legg ytterligere 0,5 ml varmet Blebbistatin i perfusatet. Under denne prosedyren, pause superfusjons for 30 sek å tillate dye / Blebbistatin å farge atrial vev.

4. Optisk Mapping sette opp

MERK:. En detaljert beskrivelse av det optiske kartsystem er anordnet et annet sted 12

  1. Bruk et kamera med en temporal oppløsning av 2.000 bilder / sek eller høyere, og en serie av samlelinser for å nå romlig oppløsning på 100 um / pixel eller høyere. Dette er nødvendig for å rekonstruere SAN aktivering og intranodal forplantning.
  2. For å redusere bevegelsesartefakter fra den vibrerende oppløsning, feste en liten dekkglass på overflaten av løsningen i løpet av hjerte / isolerte atrial preparat.
  3. Bruk eksitasjon lys (520 ± 45 nm bølgelengde) som leveres av en konstant strøm, lav støy halogenlampe. Rett filtrert lysstråle mot forberedelse ved hjelp av et fleksibelt todelt lys guide.
  4. Filtrer slippes fluorescens av en lang-pass filter (> 715 nm). Samle, digitalisere og lagre det oppkjøpte fluorescerende signal på en datamaskin med programvare levert av kameraprodusenten.

5. Behandling av data

MERK: Optisk kartlegging data er samlet inn og lagret som en serie av matriser av fluorescerende intensitet på ulike tidspunkter. Hver piksel represents et mål på fluorescerende intensitet oppsamlet fra et bestemt sted på vev-preparatet på et bestemt tidspunkt. Bakgrunnsfluorescens blir automatisk fjernet per piksel for å tillate bedre visualisering av fluorescensen forandrer seg produsert av membranspenningsendringer og invertert for å korrespondere med aksjonspotensialer (APS), målt ved microelectrode systemer. Detaljer om de ulike stegene i behandlingen av optiske bildedata, inkludert bilde segmentering, romlig filtrering, tidsmessig filtrering, og baseline drift fjerning, er gitt i fokus anmeldelse. 15

  1. Manuelt eller ved hjelp av spesiell algoritme (for eksempel en terskelverdier eller kantdeteksjon) 15 for å avgjøre vev grenser, skape en binær maske av 1 (inkludert piksler) og 0 (ekskludert piksler) og bruke masken til hvert bilde i sekvensen. Denne prosessen skaper et binært bilde som fremhever områder av interesse for videre behandling.
  2. For å forbedre signal-til-støy-forholdet for de optiCal data, filtrere signalene innenfor utvalgte områder av interesse. Til dette bruker romlig (dvs. midling av nabo fluorescerende piksler som er definert av en ønsket konvolusjon bin eller kjernen, for eksempel 3 x 3 eller, for støyende data, 5 x 5) og / eller tidsmessig filtrering (for eksempel, Butterworth, Tsjebysjov typen 1, Chebyshev type 2, elliptiske etc.) (figur 2). Husk muligheten for filtrerte-indusert gjenstander ved tolkning av data. For mer informasjon, se gjennomgang. 15
  3. Fjern drift av grunnlinjen i optiske opptak når det er nødvendig (ved hjelp av høy-pass filtrering eller polynom tilpasning til det opprinnelige signal), og deretter normalisering av hvert bildeelement signal fra 0 (minimum fluorescens) til en (maksimal fluorescens).
  4. Velg et tidsvindu som omfatter aktiverings tider av alle piksler for en enkelt AP forplantning. Gi hver piksel sin aktivering tid som tiden for maksimal upstroke derivat (dF / dt max, hvor F er fluorescence intensitet). Ved hjelp av alle pixel aktiverings ganger, rekonstruere isokron aktivering kartet. Hver isochron vil således vise bildeelementene aktivert på samme tid.
  5. For å rekonstruere fordeling kartet AP varighet (APD), for hver piksel beregne varigheten mellom innkoblingstid og tiden ved et bestemt nivå av repolarisasjon (for eksempel ved 80% av repolarisasjon, APD 80). Bruke alle piksel APD verdier, rekonstruere distribusjon isokron kartet APD. Hver isochron vil således vise bildeelementene med den samme APD.
  6. For å beregne ledningshastigheten for AP forplantning, passer en overflate av blandingen til aktivering tid data beregnet på 5,4. Til dette bruker polynomet overflate montering eller lokal kernel overflaten utjevning og deretter beregne lokale ledningshastighet vektorer fra gradienten av montert overflaten.
  7. For å lage kart repolariseringen, tilordne hver piksel sin repolarization tid, definert som det maksimale andre deriverte (d 2 F / dt2) av det optiske signal ved slutten av OAP, eller tiden på 90% repolarisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optisk Kartlegging av Intakt SAN fra Langendorff-perfusert hjerte
Et typisk eksempel på en RA aktiverings konturkart rekonstruert for spontan sinusrytme er vist i figur 3 for et Langendorff-perfusjon mus hjerte. Den tidlige aktiveringspunkt ligger innenfor intercaval regionen nær SVC hvor SAN er anatomisk definert. 3,16 To RA aktivering konturkart ervervet ved 1,0 og 0,5 ms samplingsfrekvens er vist i figur 3B.

For å evaluere SAN fungerer, vi målte SAN restitusjonstid (SANRT). 9 Etter RAA pacing i minst 1 min ved 10-12 Hz, ble elektrisk stimulering stoppet og SANRT ble beregnet som tidsintervallet mellom siste fanget AP og første spontane AP (figur 3C). Den SANRT ble korrigert til hjertefrekvensen (dvs. SANRT <sub> c) ved å beregne differansen mellom SANRT og basis sykluslengde. I tillegg ble plasseringen av den første post-pacing pacemaker identifisert. For dette eksempelet SANRTc var ca 49 msek.

Isolert Atria og SAN Activation
Aktiveringen av den isolerte atrial fremstillingen under spontan sinusrytme er vist i figur 4A. Det oppsto i anatomisk definerte SAN nær SVC med en bred bølgefront som sprer anisotropisk hele RA, med to fortrinnsrett lednings retninger nærheten superior og inferior SAN kanter og komplett blokk til septal retning (markert med aktiverings kart i figur 4A) . Aktiveringen kartet kjøpt til en ms samplingsfrekvens viser et omfattende område med tidlig aktivering. En økning i samplingsraten til 0,5 ms og 0,3 msek tillater oss å identifisere den nøyaktige området av de ledende pacemaker plassering. We observert en typisk, beat-til-slå stabil monofokal stilling av ledende pacemakeren som samsvarer med primære pacemakeren området tidligere karakteriserte elektrofysiologisk ved hjelp av glassmikroelektroder 17 og optisk kartlegging 8-11,18,19, så vel som ved immunolabeling for connexin45 og HCN4 . 6,16

Som vist tidligere, SAN optiske aksjonspotensial består av en to-fase-signal som omfatter to atskilte deler: den langsomt stigende SAN komponent og den raskt stigende oppoverslaget av atriemyokard (atrial komponent) (figur 4B) 20 På grunn av lysspredning. prosesser, representerer OAP en gjennomsnittlig elektrisk aktivitet som følge av flere lag av celler i vev. Adspredelse dybde og bredde er styrt av en plass konstant, som bestemmes av lysspredning og absorpsjon egenskaper og kan nå opp til 1,5-2 mm. På grunn av SAN conduDette skjer forsinkelse, SAN AP forut alltid atrial aktivitet under fysiologiske aktivering (figur 4B). For å beregne overgangen fra SAN til atrium (dvs. SAN ledningstid, Sanct), benyttet vi enten det tidspunkt hvor den dobbeltkomponent SAN signal når 50% av den SAN komponent amplitude, eller den første topp av to-peak OAP første deriverte (dF / dt). Den Sanct fra området tidligste SAN aktivering til RA var ~ 5 ms, lik som målt ved glassmikroelektroder.

SAN Recovery Time
På lignende måte ble det SANRT målt i den isolerte atrial preparat (figur 4D). For dette ble atrial forberedelser tempoet på 12 Hz gjennom en pacing elektrode plassert på hjørnet av RAA i minst 1 min. 9 For dette eksemplet SANRTc var omtrent 34 millisekunder, noe som er sammenlignbart med det som ble målt i Langendorff-perfused hjerte (Figur 3C). I tillegg ble plasseringen av den første post-pacing pacemaker identifisert.

Hjerterytme og fluorescerende signal stabilitet over tid
Hvis kirurgi og dye lasteprosedyrer blir fulgt på riktig måte, bør det ikke være noen vesentlig endring i de fysiologiske egenskapene til atrium. I figur 5 presenterer vi hjerterytmen målt før og etter den atriale isolasjonsprosedyren og i løpet av 3 timer perfusjon. Det ble ikke observert signifikante endringer i hjertefrekvensen enten under atrium isolasjon eller etter fargestoff lasting.

Selv om arteriell flekker kan kreve en større mengde av fargestoff, stabiliteten av det fluorescerende signalet i SAN området vev synes å være bedre ved hjelp av denne lastemetode. I Figur 6 presenterer vi signalintensitet nedbrytning over tid for både koronar og overflatefarging. i t han SAN vev, IC 50 (som angir den periode da signalintensiteten er avdøde til 50%) er omtrent 107 minutter etter koronar farging, nesten dobbelt så lang som for overflatefarging.

Figur 1
Figur 1:. Isolering av Mouse Atrial Forberedelse (A) Kirurgiske prosedyrer utført for å isolere mus atrial forberedelse. Den bakre riss av hjerte er vist. Alle kutt er vist med stiplede røde linjer og merket med tall i den rekkefølgen utført. Se detaljer i teksten. (B) Skjematisk oversikt over den isolerte musen atrial forberedelse viser de viktigste anatomiske trekk, inkludert trabekulært strukturen i venstre og høyre atrial vedheng, samt plasseringen av sinoatrielt node (SAN, merket med en grå oval). Alle forkortelser er forklart i figuren.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Rå og Behandlet Signaler innspilt på 0,3, 0,5 og 1 ms / ramme Raw signaler er hentet fra en enkelt piksel. Etter 3 x 3 binning, blir signalene filtreres ved hjelp av lav-pass Butterworth algoritme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Hel-hjerte Optisk Kartlegging av SAN (A) Høyre, bilde av en typisk preparat som brukes til kartlegging av SAN fra det intakte hjertet.. Den blå firkanten viser den optiske feltetview (6 mm x 6 mm). Høyre, optisk synsfelt fanget gjennom kameraet og lagt med anatomiske landemerker. SVC og IVC: overlegen og vena cava inferior; RAA: høyre atrial vedheng; RV og LV: høyre og venstre ventrikkel; Musikkvideoer: lungevener. (B) Color kontur aktiverings kart kjøpt med 1,0 msek (til venstre) og 0,5 msek (høyre) samplingsfrekvens. På høyre side av hvert kart, tilsvarende farge tidsskalaen indikerer atrial aktiveringstiden (fra tidligst aktiveringspunkt vises i blått, til den siste aktiveringspunktet vises i rødt) vises. Den tidligste atrial aktiveringssete er merket med en stjerne. (C) SAN restitusjonstid (SANRT) målt i hel-hjerte forberedelse. Representative eksempler på atrial aktiverings konturkart rekonstruert for siste pacing stimulus (S1) og for første post-pacing atrial beat (A1) er vist for de utvalgte på representant OAP spor på toppen beats.Nettsteder av de tidligste atrial aktivering er merket med en stjerne. BCL. Basic sykluslengden Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Høy oppløsning Optisk kartlegging av Mouse sinoatrielt Node (SAN) fra Endokardial Overflaten av Isolated Atria (A) Fotografi av en typisk mus SAN forberedelse (6 mm x 6 mm) og dets tilhørende aktiverings konturkart. innhentet på 1,0 ms, 0,5 msek, og 0,3 ms samplingsfrekvens. SAN og en naboblokk sone er vist med piler. Fargetidsskalaer indikere atrial aktiveringstiden. Stjernen indikerer plasseringen av de ledende pacemaker. RAA: høyre atrial vedheng, SVC og INC: øvre og nedre vena cava, RV: høyre hjertekammer, AVJ: atrioventrikulær ventricul ar veikryss, CT: crista termin, IAS: inter-atrial septum. (B) Mechanism av dobbelt komponentene i OAP opptak fra musen SAN området. Se detaljer i teksten. . (C) OAPs tatt opp fra midten av SAN området (blå), den tidligste atrial eksiteringsområdet (grønn) og den siste RA aktiveringssetet (rød) innfellinger: overgang fra nodal til atrial bølgeform med en total ledningstiden lik 5 msek. Sammenlign det med tidsforsinkelsen for total RA aktivering lik 11 msek. (D) SAN restitusjonstid (SANRT) målt i isolerte atrial forberedelse. Representative eksempler på atrial aktiverings konturkart rekonstruert for siste pacing stimulus (S1) og for første post-pacing atrial beat (A1) er vist. Et nettsted av de tidligste atrial aktivering er merket med en stjerne. BCL - grunnleggende sykluslengde.k "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Hjerte Rhythm målt før og etter den atrial Isolation Procedure (A) og i løpet av tre timer Perfusjons (B). (A) Spontan juling hjertefrekvens vises før og etter atrial isolasjon for to typer atrial flekker: overflaten flekker etter isolasjon (ingen tidligere koronar farging) og koronar flekker før atrial isolasjon. (B) Spontan bankende hjerte rytme stabilitet over tre timer perfusjon er vist for ikke-farget atrial forberedelser og for fluorescerende fargestoff og Blebbistatin farget atrial forberedelser. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6:. Signalstyrke Decay over tid intensiteter av signaler fra både lastemetoder (coronary lasting angitt i rødt, og overflaten lasting angitt i blått) ble målt og plottet over tid. Signal intensiteter ble i gjennomsnitt fra en 7 av 7-pikselområde på fire typiske steder i høyre forkammer: trabekler (TRAB), sinusknuten (SAN), høyre forkammer vedheng (RAA) og koronar sinus (CS). IC50-verdiene ble deretter beregnet og merket i alle desintegrasjons-kurver. Signalet intensitet forfall fra begge lastemetoder var lik i TRAB og RAA. IC 50 av arteriell lasting i CS var rundt 20 min lenger. I SAN, denne verdien for arteriell lasting var nesten to ganger større sammenlignet med overflate lasting, noe som indikerer at arteriell lastende metoder resultert i bedre stabilitet av fargestoffet i SAN tissue over tid. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterte vi to typer mus SAN preparater: 1) intakt SAN i Langendorff-dynket hele hjertet, og 2) SAN i den isolerte, åpnet atrial forberedelse. Disse to typer forberedelser tjene ulike eksperimentelle formål. I Langendorff-perfusert hele hjertet preparat, blir det intakte atrial struktur bevares som gjør det mulig å studere komplekse atrielle arytmier slik som atrial flimmer samt samspillet mellom SAN og atrium i løpet av innadgående takykardier. 6 I motsetning til dette, i den isolerte atrial fremstillingen , atrium blir åpnet og flatet inn i en pseudo todimensjonal struktur, hvor de tredimensjonale anatomiske bunter blir forstyrret. Dette kan påvirke anatomi innadgående trasé som gjør det isolerte atrial forberedelse ikke ideelt for å studere atrial arrhythmogenesis. Men ved å bruke denne type forberedelse, plasseringen av de ledende pacemaker (s) områder, intranodal ledning, og AP forplantning pattern kan være nøyaktig visualiseres og undersøkt i detalj. I tillegg intakte atria synes å være begrenset av en bakre syn mens i det isolerte fremstillingen, er tilgjengelig for optisk kartlegging hele atrial overflaten.

Videre muliggjør isolert atrial fremstilling strukturell-funksjonell kartlegging av atrium ved å løse den komplekse mikrostrukturen av det trabekulære nettverk som vist i figur 4. For dette, høy romlig (100 um / pixel eller høyere) og tidsmessig (2000 bps eller høyere) oppløsninger bør brukes fordi det er avgjørende å particularize både atrial og SAN aktiveringsmønstre, noe som kan bli ytterligere overlappet med tilsvarende strukturer. Mens 1000 fps tidsoppløsning kan være et minimum for å rekonstruere atrial aktivering (som varer i 10 - 20 millisekunder), bør 2000 fps betraktes som et minimum tidsmessig oppløsning for intranodal ledning (som varer i ~ 5 ms og dermed kunne bli savnet ved nedre resolusjoner) og SAN handleivation målinger sett fra Figur 4. Dette kan tillate lokalisering av arytmogene "hot spots" (som ektopisk foci eller forankret reentry) i løpet av atrieflimmer / flutter som kan dukke opp fra superposisjon av regionene i betydelig funksjonell ombygging med de av forhøyet fibrose og / eller redusert celle-til-celle-kobling. 21,22 i tillegg kunne den beskrevne tilnærming brukes til å studere elektrofysiologiske mekanismer for SAN abnormiteter, inkludert SAN exit blokker, pauser, takykardi-bradykardi arytmier, syk sinus syndrom osv.

Ved å innføre et andre (eller tredje) fluorescerende probe, vil det være mulig å utføre multi-parametriske optisk kartlegging av elektrisk aktivitet i forbindelse med kalsium håndtering så vel som metabolske og andre endringer. Forskjellige kombinasjoner av fargestoffer som kan brukes for samtidig spennings kalsium, proporsjonal spenning / kalsium, eller mitokondriell potensiell avbildning.

For høy tidsoppløsning optisk kartlegging, på grunn av den kortere fluoroforen innsamlingsperioden, kan signalene til et svakere signal-til-støyforholdet bli verdsatt. Derfor er en gjennomsnitts prosesser brukt til sinus hjerterytme signaler eller pacing serien signalene etter behov. Den dF / dt max blir detektert for hvert signal i en lang periode opptak. Disse aktivering tidspunkter blir deretter justert. En innstilling periode på opptak sentrert ved disse tidspunktene er kuttet og i gjennomsnitt fra alle eller utvalgte Aps, etter behov.

Ved nøyaktig bruk av instrumentering og riktig fargeprosedyre, er atrial elektrofysiologiske parametere inkludert ledningshastighet (sammenlign figur 3C og 4D for S1 aktivering kart), spontan SAN rytme og lang av SAN forberedelse (Figur 5) påvirkes ikke, som forblir stabil for 3 eller flere timer. Viktigere, den kontinuerlige monitOring av EKG bør utføres over hele fargeprosedyre for å sikre normal elektrisk funksjon av hjertet. Anvendelsen av Blebbistatin kan indusere en forbigående puls bremse, men annet enn det, betyr det ikke forårsake noen endringer i ledende pacemaker nettsteder eller endringer i AP morfologi som også ble beskrevet tidligere. 13

Overflate farging av det isolerte atrial preparatet er et kritisk trinn. For dette, bør hurtig påføring av den fortynnede fargestoff på overflaten av vevet unngås; i stedet fargestoffet skulle falle på preparatet fritt på grunn av den høyere tetthet av DMSO, som anvendes både fargestoff og Blebbistatin fortynninger. Den passende totale laste mengden og hastigheten bør justeres slik at man ikke fremkalle dramatiske hjerterytmen endres. Den fargeprosedyre kunne anvendes flere ganger inntil signalet når et rimelig nivå. Det bør bemerkes at den direkte anvendelse av fargestoff kan skade SAN vev og påvirke dens PacemAking. Derfor bør fargestoffet fortynnes og påført mengde bør reguleres omhyggelig. Passende overflaten flekker bør ikke skade forberedelse eller SAN 23 som vurderes av sammenlign hjertefrekvens og ledningshastighet.

Alternative flekker protokoller bør også vurderes. Disse kan omfatte enten en 10-15 min superfusjons av SAN / atrial-preparat med den spenningsfølsomme fargestoff (RH-237 eller di-4-ANEPPS) ved 35 ± 1 ° C 10,19 eller en 30 minutters inkubasjon av preparatet ved romtemperatur (20-22 ° C) i en Tyrode-oppløsning inneholdende den spenningsfølsomme indikator. 11

For optisk kartlegging av SAN fra Langendorff-perfusert hele hjertet, viktige instrumentering måten omfatter innsetting av det lille røret inn i LV og nedlegging av SVC og IVC. Den tidligere hindrer en trykkøkning fra løsningen lunger under langvarige eksperimenter samt etterfølgende jegschemia utvikling etter undertrykkelsen av ventrikkelkontraksjoner av Blebbistatin og forsuring av perfusjon løsning. Sistnevnte gjør det mulig for RA for å holde en viss grad av intra-atrial press og dermed fylle atrium med perfusjon løsning og flatere intercaval regionen for å avdekke hele SAN området for optisk kartlegging.

Til slutt, koronar flekker, i tillegg til overflaten fargestoff lasting, kunne gi en betydelig forbedre intensiteten av SAN OAPs som kan vare lengre tid sammenlignet med ren overflatefarging anvendt i tidligere studier. 8,9

Bruk av Blebbistatin har flere fordeler sammenlignet med andre elektromekaniske uncouplers inkludert lav toksisitet, mindre uttalte bivirkninger, og utvaskingsbestandighet når den brukes med forsiktighet. Blebbistatin utfellinger når det er oppløst ved temperaturer lavere enn 37 ° C. 14 Blebbistatin krystaller kan forstyrre normal vaskulær flyt og dermed indusere lokaliskemi og provosere arytmisk arrangementer. 24 I tillegg, i studier som bruker GFP eller andre grønne / gule fargestoffer, kan Blebbistatin nedbør forveksles med merkede celler som bør tas i betraktning. Forebygging Blebbistatin nedbør er grei, det vil si, man må oppløse Blebbistatin i en forvarmet (37 ° C og høyere) og kraftig omrørt media.

For å analysere APD, en høy konsentrasjon av Blebbistatin (opp til 10 uM) kan benyttes. 13,14,25. Tilsvarende, hvis ethvert medikament som øker sammentrekningen er brukt, er tilleggs anvendelse av Blebbistatin anbefalt.

Som et alternativ teknikk for å studere mus SAN elektrisk aktivitet, lav oppløsning multi-elektrode array (64 separate elektroder i en firkantet 8 x 8, konfigurasjon med en inter-elektrode avstand på 0,55 mm) 26 og påfølgende glass microelectrode opptak gjort på kort avstand mellom impalements sammenlignet med opp til 50 um / pixel for optisk mapping) og kan ikke brukes til å analysere AP morfologi eller for multi-parametrisk avbildning (som samtidig spenning og kalsium optisk mapping). Selv om glass microelectrode innspillinger gi mer informasjon om AP morfologi, inkludert absolutte verdier for AP amplitude og hvilepotensialet, er det også begrenset av en lav romlig oppløsning. Derfor kan det bare brukes for stabil plassering av de ledende pacemaker og er ikke aktuelt å fange Beat-to-beat endringer i ledende pacemakeren plassering. Samtidig, som demonstrert tidligere 3,20 og uthevet i denne studien, SAN OAP consists av en to-fase-signal whichincludes både SAN og atriale myocardium AP-komponenter (figur 4B). Det gjør det dermed vanskelig å trekke ut en ren SAN signal og nøyaktig beregne AP morfologi i SAN. For dette formål bør glassmikroelektroder 17 eller strømklemmen tilnærming på isolerte myocytter SAN vurderes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, (1), 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110, (4), 609-623 (2012).
  3. Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. (2012).
  4. Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47, (4), 658-687 (2000).
  5. Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. (2013).
  6. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36, (11), 686-697 (2015).
  7. John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133, (19), 1892-1900 (2016).
  8. Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121, (8), 3277-3288 (2011).
  9. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, (2), H482-H491 (2010).
  10. Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593, (5), 1127-1146 (2015).
  11. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (31), 9769-9774 (2015).
  12. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
  13. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  14. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464, (5), 503-512 (2012).
  15. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (7), H753-H765 (2012).
  16. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73, (4), 729-738 (2007).
  17. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52, (1), 40-50 (2001).
  18. Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
  19. Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, (6), H2634-H2643 (2004).
  20. Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106, (2), 255-271 (2010).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
  22. Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36, (35), 2390-2401 (2015).
  23. Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44, (6), 626-634 (2011).
  24. Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60, (2), 109-117 (2010).
  25. Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48, (1), 152-160 (2010).
  26. Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, (7), H1510-H1523 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics