Forberedelse og

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver fremstillingen og karakterisering af en dendrimer magnetisk resonans imaging (MRI) kontrastmiddel, som bærer cyclen baserede makrocykliske chelater koordinerende paramagnetiske gadolinium ioner. I en række MRI eksperimenter in vitro, denne agent produceret et amplificeret MRI-signal i forhold til det kommercielt tilgængelige monomere analoge.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gündüz, S., Savić, T., Toljić, Đ., Angelovski, G. Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54776, doi:10.3791/54776 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Paramagnetiske komplekser af gadolinium (III) med acykliske eller makrocykliske chelater er de mest almindeligt anvendte kontrastmidler (CAS) for magnetisk resonans (MRI). Deres formål er at forbedre afslapning på vand protoner i væv, hvilket øger MR billedet kontrast og specificiteten af ​​MRI målinger. Aktuelle klinisk godkendte kontrastmidler er lavmolekylære molekyler, der hurtigt udskilles fra kroppen. Brugen af ​​dendrimerer som bærere af paramagnetiske chelatorer kan spille en vigtig rolle i den fremtidige udvikling af mere effektive MRI-kontrastmidler. Specifikt stigning i den lokale koncentration af de paramagnetiske resultater arter i et højere signal kontrast. Desuden er denne CA tilvejebringer en længere retentionstid væv gang på grund af den høje molekylvægt og størrelse. Her viser vi en bekvem fremgangsmåde til fremstilling af makromolekylære MRI-kontrastmidler baseret på poly (amidoamin) (PAMAM) dendrimerer med monomacrocykliske DOTA-typen chelatorer (DOTA - 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetat). Det chelaterende enhed blev vedlagt ved at udnytte reaktiviteten af ​​isothiocyanatet (NCS) gruppe mod amin overfladegrupper af PAMAM dendrimer til dannelse thiourinstof broer. Dendrimere produkterne blev oprenset og analyseret ved hjælp af kernemagnetisk resonansspektroskopi, massespektrometri og elementaranalyse. Endelig blev høj opløsning MR-billeder optaget og signalet kontraster opnået fra den forberedte dendrimere og de kommercielt tilgængelige monomere midler blev sammenlignet.

Introduction

Magnetisk resonans (MRI) er en stærk og ikke-ioniserende billeddannelsesteknik meget udbredt i biomedicinsk forskning og klinisk diagnostik grundet dens invasiv karakter og fremragende iboende bløddele kontrast. De mest almindeligt anvendte MRI-fremgangsmåder udnytter signalet opnået fra vandprotoner, der giver billeder i høj opløsning og detaljerede oplysninger inden for de væv baseret på forskelle i densiteten af ​​vand signaler. Signalet intensitet og specificiteten af ​​MRI eksperimenter kan forbedres yderligere ved hjælp af kontrastmidler (CAS). Disse er paramagnetiske eller superparamagnetiske arter, der påvirker den langsgående (T 1) og tværgående (T2) relaksationstider henholdsvis 1,2.

Komplekser af lanthanidionen gadolinium med polyaminosyrer polycarboxylsyreestere ligander er de mest almindeligt anvendte T 1 CA'er. Gadolinium (III) forkorter afslapning T 1tid af vand protoner, hvilket øger signal kontrast i MRI eksperimenter 3. Men ionisk gadolinium er giftigt; dens størrelse tilnærmer at calcium (II), og det har alvorlige konsekvenser for calcium-assisteret signalering i celler. Derfor er acykliske og makrocykliske chelater anvendes til at neutralisere denne toksicitet. Forskellige multidentate ligander er blevet udviklet hidtil, hvilket resulterer i gadolinium (III) komplekser med høj termodynamisk stabilitet og kinetisk inerthed 1. De er baseret på de 12-leddede azamacrocycle cyclen, især dens tetracarboxylsyre derivat DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraacetat) er de mest undersøgte og anvendte komplekser af denne CA klasse.

Alligevel GdDOTA-typen CA'er er lavmolekylære systemer, der udviser visse ulemper, såsom lav kontrast effektivitet og hurtig renal udskillelse. Makromolekylær og multivalente CA'er kan være en god løsning på disse problemer 4. Da CA biodistribution er primært bestemt af deres størrelse, makromolekylære CA'er vise meget længere opholdstider inden væv. Lige så vigtigt, at multivalensen af disse midler resulterer i en forøget lokal koncentration af det monomere MR probe (f.eks GdDOTA kompleks), væsentligt forbedrer erhvervet MR-signalet og kvaliteten måling.

Dendrimerer er blandt de mest foretrukne stillads til fremstilling af multivalente CA'er til MRI 4,5. Disse stærkt forgrenede makromolekyler med veldefinerede størrelser er tilbøjelige til forskellige koblingsreaktioner på deres overflade. I dette arbejde, rapporterer vi forberedelse, rensning og karakterisering af en dendrimer CA for MRI bestående af en generation 4 (G4) poly (amidoamin) (PAMAM) dendrimer koblet til GdDOTA-lignende chelater (DCA). Vi beskriver syntesen af ​​den reaktive DOTA-derivat og dets kobling til PAMAM dendrimeren. Efter kompleksdannelse med Gd (III), standard fysisk-kemiske karakterisering Procedure af DCA blev udført. Endelig blev udført MRI eksperimenter for at demonstrere evnen af ​​DCA til at producere MR-billeder med en stærkere kontrast end dem, der opnås fra lav molekylvægt CA'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af DCA

  1. Syntese af den monomere enhed 4 6.
    1. Syntese af 4- (4-nitrophenyl) -2- (4,7,10-tris- tert butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) smørsyre-tert-butylester (2).
      1. Opløs (4,7-bis-tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-yl) eddikesyre-tert-butylester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) i N, N-dimethylformamid ( DMF, 5 ml), tilsættes kaliumcarbonat (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 ækv.) og omrør blandingen ved stuetemperatur i 45 minutter.
        BEMÆRK: makrocyklus 1 blev fremstillet ud fra cyclen og tert-butylbromacetat ifølge den tidligere offentliggjorte fremgangsmåde 7.
      2. Tilføj tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrophenyl) butanoat (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 ækv.) Portionsvis i løbet af 1 time. Omrøring af blandingen fortsættes under than samme reaktionsbetingelser for følgende 18 timer.
        Bemærk: tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrophenyl) butanoat blev fremstillet ud fra 4- (4-nitrophenyl) -smørsyre, thionylchlorid, og brom ifølge den tidligere offentliggjorte fremgangsmåde 8.
      3. Fjern DMF ved hjælp af kolbe-til-kolbe vakuumdestillation ved 40-60 ° C 9.
      4. Remanensen renses ved søjlekromatografi (silicagel, 7% methanol / dichlormethan) til opnåelse produkt 2 som et brunt, amorft faststof (1,09 g, 72%) 10.
    2. Syntese af 4- (4-aminophenyl) -2- (4,7,10-tris- tert butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) smørsyre-tert-butylester (3).
      1. Opløs nitrobenzenderivat 2 (1,00 g, 1,28 mmol) i ethanol (10 ml) og 7 N ammoniakopløsning i methanol (150 ul). Tilføj palladium på aktiveret carbon som katalysator (Pd / C, 150 mg, 15 vægt%) til solutipå.
      2. Ryst heterogene blanding i 16 timer under en hydrogenatmosfære (2,5 bar) i Parr hydrogenator apparat.
      3. Der fremstilles en kage af diatoméjord ved at suspendere det i ethanol og filtrering af suspensionen gennem en sintret glastragt. Hæld suspensionen fra 1.1.2.2 over forberedte kage at fjerne Pd / C-katalysator ved filtrering.
      4. Fjern opløsningsmidlet ved forsigtig destillation på en rotationsfordamper (vand badtemperatur ~ 40 ° C) til opnåelse af forbindelse 3 som et brunt, amorft faststof (0,91 g, 95%).
    3. Syntese af 4- (4-isothiocyanatophenyl) -2- (4,7,10-tris- tert butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-yl) smørsyre-tert-butylester (4).
      1. Tilføj thiophosgen (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 ækv.) Til en blanding af 3 (0,91 g, 1,22 mmol) og triethylamin (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 ækv.) I dichlormethan (15 ml).
      2. Energisk røre reaktionen mixture med en magnetomrører ved stuetemperatur i 16 timer.
      3. Fjern opløsningsmidlet ved forsigtig destillation på en rotationsfordamper (vand badtemperatur ~ 40 ° C), og derefter oprense råproduktet ved søjlekromatografi (silicagel, 5% methanol / dichlormethan) til opnåelse af produktet 4 som et lysebrunt amorft fast stof (0,51 g, 53%).
  2. Syntese af dendrimer DCA.
    1. Syntese af dendrimer fem.
      1. Tag G4-PAMAM dendrimer (667 mg, 10% dendrimer opløsning i methanol, 4,67 pmol), afdamp methanol ved forsigtig destillation på en rotationsfordamper (vand badtemperatur ~ 40 ° C), og remanensen i DMF opløses (4 ml) .
      2. Tilføj triethylamin (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 ækv.), Omrøres i 45 minutter ved 60 ° C, og der tilsættes isothiocyanat 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 ækv. I forhold til amino-overfladegrupper af dendrimeren) portionsvis oveR 1 time.
      3. Omrør reaktionsblandingen med en magnetomrører ved 45 ° C i 48 timer.
      4. Opløsningsmidlet fjernes ved hjælp af kolbe-til-kolbe vakuumdestillation ved 40-60 ° C.
      5. Remanensen renses ved gelpermeationskromatografi ved anvendelse af en lipofil gelfiltreringsmedium og methanol som eluent. At pakke kolonnen kvælde filtermediet i methanol i mindst 3 timer ved stuetemperatur (> 4 ml methanol pr 1 g pulver) uden pres. Udfør tyngdekraften separation ved isolering af 1 ml fraktioner.
      6. Analysere de opsamlede fraktioner med tyndtlagskromatografi (TLC). Udvikle TLC-pladen i 15% methanol / dichlormethan (kun den mest polære stedet placeret på basislinien er afledt af dendrimere produkt). Fordampe de opsamlede fraktioner ved forsigtig destillation på en rotationsfordamper (vand badtemperatur ~ 40 ° C) for at opnå produkt 5 (270 mg, 91%).
    2. Syntese af dendrimeren
    3. Opløs den beskyttede dendrimere chelatoren 5 (270 mg, 4,23 pmol) i myresyre (5 ml) og omrør blandingen ved 60 ° C i 24 timer.
    4. Inddamp myresyre ved destillation på en rotationsfordamper (~ 15 mbar tryk, vandbadstemperatur ~ 40 ° C) og frysetørre produktet for at give 6 (tryk ~ 0,2 mbar) 9.
  3. Syntese af dendrimere kontrastmiddel (DCA)
    1. Opløs dendrimere chelatoren 6 (4,35 pmol) i vand og pH indstilles til 7,0 med 0,1 M natriumhydroxid.
    2. Opløs GdCl 3 · 6H 2 O (113 mg, 304 pmol) i vand (1 ml) og føje den dråbevis til opløsning af chelatoren 6 over en periode på 4 timer; opretholde pH ved 7,0 med vandig natriumhydroxidopløsning (0,05 M) ved måling pH med et pH-meter.
    3. Blandingen omrøres med en magnetomrører ved stue temperatur i 24 timer.
    4. Tilføj ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, 158 mg, 426 pmol) til opløsningen portionsvis i løbet 4 timer for at fjerne overskud af Gd (III) under opretholdelse af pH-værdien på 7,0 med vandig natriumhydroxidopløsning (0,05 M). Omrør blandingen ved stuetemperatur i 24 timer.
    5. Udføre gelpermeationskromatografi for at fjerne størstedelen af ​​GdEDTA og overskuddet af EDTA. Brug en hydrofil gelfiltreringsmedium kvældet i vand til at pakke kolonnen. Reducer blandingen til en egnet volumen og indlæse kolonnen. Søjlen elueres med deioniseret vand uden pres.
    6. Centrifugeres prøven ved anvendelse af en 3 kDa centrifugalfilterenhed i 30 minutter ved centrifugalkraft 1.800 xg for at fjerne rester af GdEDTA og EDTA. Gentag dette trin (ca. fem gange), indtil filtratet viser fraværet af EDTA og GdEDTA. Overfør prøven i en kolbe, fordampe den og derefter frysetørre opløsningsmidlet til opnåelse af et off-white produkt som den endelige DCA (186 mg, 71%).
      BEMÆRK: Kontroller fravær af EDTA og GdEDTA ved hjælp af ESI-MS.
    7. Bekræfte fravær af Gd (III) som en fri ion hjælp af xylenol appelsin test. filtratet (0,5 ml) i en acetatpuffer-opløsning (pH 5,8) opløses. Tilsæt et par dråber af en xylenol orange opløsning og spore farveændringen (gul eller violet farve indikerer fravær eller nærvær af frit Gd (III) ioner i opløsning henholdsvis) 11.

2. In vitro karakterisering af Dendrimere Products

  1. Overslag over antallet af makrocykliske DOTA-enheder koblet til PAMAM dendrimer (lastning af dendrimeren med DOTA-lignende makrocykler)
    1. Estimation med 1H NMR (NMR - kernemagnetisk resonansspektroskopi).
      BEMÆRK: Denne procedure er mulig på dendrimerer 5 og 6, men ikke på DCA.
      1. Notér 1H NMR-spektrum 12.
      2. Integrere den aromatiske region og de to separate alifatiske regioner (1. signaler af den alifatiske dendrimer og makrocykliske protoner, 2. signalerne fra t-Bu-grupper) eller blot en alifatisk region for dendrimerer 5 og 6, henholdsvis.
        Bemærk: Der er ingen separat signal i den alifatiske region stammer fra t-Bu grupper i dendrimer 6, eftersom de er blevet hydrolyseret.
      3. Brug Eq. 1 eller Eq. 2 at estimere antallet af makrocykliske enheder (n), hvor R = forholdet mellem integraler (alifatisk / aromatisk i Eq. 1 eller alifatisk-dendrimer / aliphatic- t- Bu i ligning. 2), H af udbytte = antallet af protoner i dendrimer, H Ar = antallet af aromatiske protoner, H Bu = antallet af protoner i t-Bu grupper og H mac = antallet af protoner i en makrocyklus.
        Bemærk: Enten Eq. 1 eller Eq. 2 kan anvendes for dendrimer 5, mens kun Eq. 1 kan anvendes til dendrimer 6. Da udskiftelige protoner (på aminer, amider, thiourinstoffer eller carboxylater) er typisk bliver erstattet med deuterium, blev de ikke til grund for beregningerne. Her, H af udbytte = 1.128 (for 5) eller 1.000 (for 6), H Ar = 4, og H mac = 27 blev anvendt.
        ligning 1 (1)
        ligning 2 (2)
    2. Skøn fra elementaranalyse ved anvendelse af forholdet mellem nitrogen til svovl.
      1. Udfør den elementaranalyse på den faste dendrimere prøve (DCA i dette arbejde).
      2. Brug Eq. 3 at estimere antallet af makrocykliske enheder (n), hvor R = forholdet bestemt% N og% S, N af udbytte eller S af udbytte = antallet afnitrogen eller svovlatomer i dendrimeren, og N mac eller S mac = antallet af nitrogen- eller svovlatomer i én makrocyklisk enhed.
        Bemærk: Faktoren 2.29 opnås fra forholdet i atommasserne af svovl og kvælstof. I dette arbejde blev N af udbytte = 250, S af udbytte = 2, N mac = 5, og S mac = 1 anvendes.
        ligning 3 (3)
    3. Estimering med matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid søgning (MALDI-TOF).
      1. Udfør MALDI-TOF MS-analyse 13.
      2. Beregne antallet af makrocykliske enheder (n) ifølge ligning. 4, hvor M z = den observerede masse (m / z), z = ladningen af arter, M af udbytte = massen af den dendrimere side og M mac = massen af en makrocyklisk enhed.
        INGENTE: M af udbytte = 14.306 og M mac = 719 blev anvendt i dette arbejde.
        ligning 4 (4)
  2. Bestemmelse af DCA-koncentration ([DCA]): Bulk magnetisk følsomhed måling (BMS)
    1. Opløs DCA (5-10 mg) i vand (360 pi) i en plast hætteglas rør ([DCA] ~ 5-10 mM).
      BEMÆRK: [DCA] bør være i området 5-10 mM for at undgå mulig overlapning af t- BuOH resonanser ved prøvernes koncentrationer> 15 mM, med resonans af vand ved δ = 4,7 ppm.
    2. Tilføj 60 pi D2O: t- BuOH blanding (2: 1 v / v) til den vandige opløsning af DCA og bland den resulterende opløsning (420 pi) under anvendelse af en Vortex-blander.
    3. Transfer 400 ul af prøven i et ydre NMR-rør og placere et koaksialt NMR insert rør med en t-BuOH: H2O-blanding (10:90 v / v) i prøverøret.
    4. Optage1H NMR-spektret og måle frekvens skift mellem resonanssignaler følger af t- BuOH i de indre og ydre NMR rør (reference) 12.
    5. Brug Eq. 5 at bestemme [DCA], hvor T = den absolutte temperatur, Δχ = den indspillede skift, u eff = den effektive magnetiske moment for en lanthanidion eff = 7,94 for Gd (III) 14, og s = en konstant afhængig af formen af ​​prøven og dens position i magnetfeltet (0, 1/3, og 1/6 i tilfælde af en kugle, cylinder parallelt med og cylinder vinkelret på magnetfeltet, henholdsvis).
      BEMÆRK: Den beregnede værdi opnået for [DCA] bør rettes til den oprindelige koncentration på grund af tilsætningen af D2O: t- BuOH opløsning (60 pi).
      ligning 5 (5)
  3. Dynamisk lysspredning (DLS) målinger.
    1. Forbered en filtreret DCA-opløsning (0,2 um polytetrafluorethylen / PTFE filter, 0,75 mM pr Gd (III)) i 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) puffer (25 mM, pH 7,4) og overføre den til en kuvette til DLS måling.
    2. Anbring kuvetten i DLS apparat og indstille følgende parametre: 5 gentagelser af 15 scanninger (1 scan = 12 sec, brydningsindeks = 1,345, absorption = 1%) uden forsinkelser i mellem scanningerne og med temperaturækvilibrering 30 sek forud for optagelse .
    3. Eksportere de indsamlede data og opnå størrelsesfordelingen histogram ved afbildning population (%) som funktion af størrelse (hydrodynamisk diameter).
  4. Måling af de langsgående og tværgående relaxiviteter.
    BEMÆRK: En lignende fremgangsmåde blev allerede beskrevet ved hjælp hviletiden analysator 15; denne procedure blev udført under anvendelse af en 300 MHz NMR-spektrometer med Topspinsoftware.
    1. Forberede en række DCA opløsninger i H2O: D2O (500 pi, 10% D2O i H2O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, og 5,0 mM, [HEPES ] = 25 mM) fra DCA lager prøven (se afsnit 2.2).
    2. Overfør 450 ul opløsningen i et NMR-rør og læg det i instrumentet.
    3. Optimer parametrene erhvervelse (90 ° excitation impulsvarighed (p1), og bestråling frekvens offset (O 1)) og derefter udføre T 1 og T 2 forsøg med inversion recovery (IR) og Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) impulssekvenser hhv.
    4. Bestemmelse af T 1 og T 2-relaksationstider.
      1. Vælg den indspillede måling, proces 2D spektrum i F2 dimension, og udføre den interaktive fase korrektion.
      2. Vælg den relevante skive (spids med maksimal intensitet) i Analyse / T 2 afslapning vindue, integrere den, og eksportere regionen til afslapning modulet.
      3. Vælg den relevante fitting funktion (invrec eller uxnmrt2 for IR og CPMG eksperimenter, henholdsvis) for at opnå T 1 eller T 2 afslapning gange.
    5. Gentag trin 2.4.4.2-2.4.4.4 for alle de resterende [DCA] løsninger.
    6. Beregn afslapning satser (R 1 og R 2) fra de opnåede T 1-værdier (R 1,2 = 1 / T 1,2).
    7. Plot R1 og R2 (sek-1) som en funktion af Gd (III) koncentration i mM.
    8. Beregningen af de langsgående og tværgående relaxiviteter, R1 og R2 (mM -1 sek-1), fra hældningen af den tilpassede linje, som defineret af ligning. 6, hvor Ri, obs = længderetningen (i = 1) eller tværgående (i = 2) diamagnetisk relaksationstiden afvand i fravær af paramagnetiske arter og [Gd] = koncentrationen af ​​Gd (III) anvendt i eksperimentet.
      ligning 6 (6)

3. In vitro MRI; Sammenligning mellem DCA og GdDOTA

  1. Udarbejdelse af rør fantomer
    1. Fremstilling af vandige opløsninger af DCA (4 x 350 pi) og GdDOTA (4 x 350 pi) samt vandprøver (4 x 350 pi) for to sæt eksperimenter, hvor koncentrationen af ​​kontrastmidlerne beregnes: (3.1.1.1) pr Gd (III) eller (3.1.1.2) per molekyle.
      1. Forbered to DCA prøver og to GdDOTA prøver med koncentrationer på 0,5 og 1,0 mM pr Gd (III), henholdsvis. Derudover forbereder to vandprøver (som kontrol rør).
      2. Forbered to DCA prøver (2,5 og 5,0 mm pr Gd (III) eller 0,05 og 0,1 mm pr dendrimere molekyle), to GdDOTA prøver (0,25, 0,5 mM) og to vandprøver (control rør).
        BEMÆRK: De relevante DCA og GdDOTA koncentrationer bør fremstilles ved fortynding af de respektive lager prøver med koncentrationer bestemmes via BMS-metoden (se afsnit 2.2) med HEPES-buffer (pH 7,4). For at forenkle beregningerne, n = 50 blev antaget for det gennemsnitlige antal makrocykliske enheder pr dendrimermolekyle. Derfor er forholdet mellem DCA,: GdDOTA var 1: 5, beregnet pr molekyle basis.
    2. Placer prøverne i 300 pi plast hætteglas rør, undgå tilstedeværelsen af ​​luftbobler i opløsningen.
      BEMÆRK: Størrelsen af ​​plast hætteglas rør afhænger af den type og størrelse af radiofrekvens spole anvendt (her et eksempel med mængden spolen er givet).
    3. Sæt prøverne i en sprøjte (60 ml volumen), fyld den med 1 mM GdDOTA løsning, og læg den i scanneren.
      BEMÆRK: Prøver blev anbragt i den vandige opløsning af GdDOTA at undgå modtagelighed virkninger (variationer i magnetfeltet strength at optræde i nærheden grænseflader mellem stoffer med forskellig magnetisk modtagelighed).
  2. Parameter optimering og billeddannelse.
    1. Brug anatomiske scanning (Localizer / TriPilot) til position sprøjten med prøverne i isocentret af magneten.
    2. Tryk trafiklys (tilpasning scanning) for at udføre justeringer for lagdannelse (tilpasning af magnetfeltet homogenitet) af hele volumenet, det centrale frekvens (O 1), modtageren (RG), og sende-gain (TX0 og TX1).
    3. For T 1 vægtede (T 1w) billedbehandling, skal du vælge den hurtige lav vinkel shot (FLASH) metode.
    4. Vælg koronale skive for prøverne placeres lodret (sprøjte vandret) i scanneren ved hjælp af Localizer scanningen.
    5. Brug Eq. 7 for optimering af kontrast-støj (CNR) erhvervelse parametre 16, hvor α = klappen vinkel, TE = den ekkotid, TR =gentagelse tid, og T 1, A, T 1, B = T 1 gange af prøve A (T 1, A) og prøve B (T 1, B) for hvilke der bør maksimeres CNR (det samme gælder for T 2 gange: T 2, A og T 2, B).
      BEMÆRK: T 1 og T 2 relaksationstider skal indstilles til værdier opnået fra målingerne af langsgående og tværgående relaxiviteter (afsnit 2.4), mens TE, bør indhentes TR, og α fra optimering beregning CNR.
      ligning 7 (7)
    6. Anskaf billedet ved hjælp af parametrene er opnået i det foregående trin (3.2.5).
    7. Beregn signal-støj-forholdet (SNR).
      1. Læg den erhvervede T 1W billede (scanning) i displayet & forarbejdningvindue, og klik på Definer område af interesse (ROI).
      2. Vælg en cirkulær ROI og trække det på prøve position og baggrund. Efterfølgende klik på displayet for at få den gennemsnitlige signal amplitude (S signal) og standardafvigelse af baggrunden (S støj).
      3. Gentag trin 3.2.7.2 til DCA, GdDOTA, og vandprøver.
      4. Beregn SNR hjælp af formlen: SNR = S signal / S støj.
    8. Efter en let modificeret procedure, udføre T2-vægtede (T 2w) billeddannelse ved hjælp af den hurtige overtagelse med ekstraudstyr afslapning (RARE) metode. For optimering af CNR erhvervelse parametre, bruge Eq. 8.
      ligning 8 (8)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremstillingen af DCA bestod af to faser: 1) Syntese af den monomere DOTA-typen chelator (figur 1) og 2) kobling af chelatoren med G4 PAMAM dendrimer og efterfølgende fremstilling af dendrimere Gd (III) kompleks (figur 2) . I det første trin blev en cyclen-baserede DOTA-typen chelator indeholdende fire carboxylsyrer og en ortogonal gruppe egnet til yderligere syntetiske modifikationer fremstilles. Fremstillingen påbegyndt fra 1 (DO3A- tert-butylester) 7, der blev alkyleret med tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrophenyl) butanoat 8 for at tilvejebringe DOTA-derivat 2. Den palladium-katalyserede hydrogenering reducerede den aromatiske nitrogruppe i 2 til opnåelse af anilin 3. Omdannelsen af 3 med thiophosgen resulterede i isothiocyanat 4, which er tidligere blevet anvendt som et amin-reaktivt middel til fremstillingen af dendrimere CA'er 17.

I det følgende trin blev makrocyklus 4 anvendes som den grundlæggende monomerenhed i en koblingsreaktion til det kommercielt tilgængelige G4 PAMAM dendrimer. De amin-overfladegrupper af dendrimeren reagerer med isothiocyanatgrupperne af monomeren 4 i nærvær af en base. Overskuddet af 4 blev fjernet ved gelpermeationskromatografi ved anvendelse af en lipofil gelfiltreringsmedium med methanol som eluent. De tert-butyl-estere på den opnåede dendrimer-makrocyklisk konjugat 5 blev hydrolyseret med myresyre, hvilket gav 6, som derefter blev lyofiliseret og anvendt i det næste trin uden rensning. Dannelsen af Gd (III) komplekser af DOTA-typen makrocykliske blev udført ved tilsætning GdCl 3 · 6H 2 O til en vandig opløsning of 6 under opretholdelse af pH-værdien på ca. 7. Overskuddet af Gd (III) blev kompleksbundet med et fælles chelator ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Den GdEDTA komplekset og overskydende EDTA blev fjernet fra systemet ved gelpermeationskromatografi ved anvendelse af en hydrofil gel filtration medium med vand som elueringsmiddel. De resterende urenheder lille størrelse blev fjernet fra opløsningen ved centrifugering under anvendelse af 3 kDa centrifugal filtreringsenheder.

Efter syntesen af ​​dendrimerens-makrocyclen konjugater, har en kombineret analytisk tilgang blevet anvendt til at karakterisere produkterne. For at bestemme overfladen-amin belægningsprocent på 5 og 6, er blevet analyseret 1 H NMR-spektre. Resultaterne blev sammenlignet og bekræftet med det endelige produkt (DCA), hvor belastningen af dendrimeren med makrocykler er blevet anslået under anvendelse elementæranalyse og MALDI-TOF-massespektrometri (figur3). En kombination af disse tre metoder resulterede i et gennemsnit på 49 makrocykliske enheder er konjugeret til G4 dendrimeren, hvilket svarer til ~ 75% amin overflade gruppe belægning.

Yderligere karakterisering af det dendrimere kompleks inkluderet bestemmelse af relaksiviteten værdier, hvilket resulterer i 6,2 ± 0,1 mM -1 sek-1 pr Gd (III) (eller groft omkring 300 mM -1 sek-1 pr dendrimer) til den langsgående relaksivitet og 30,5 ± 0,6 mM -1 sek-1 pr Gd (III) (næsten 1.500 mM -1 sek-1 pr dendrimer) til den tværgående relaksivitet. DLS målinger viste en hydrodynamisk diameter på 7,2 ± 0,2 nm for DCA (figur 4).

Endelig, for at demonstrere effekten af ​​den dendrimere MRI-kontrastmiddel, blev MR scanning udføres på to sæt fantomer med DCA og klinikkenallieret tilgængelig GdDOTA til sammenligning (figur 5). Det første sæt fantomer blev udarbejdet med henblik på at sammenligne disse to kontrastmidler ved identiske koncentrationer Gd (III), mens det andet sæt er designet til at påvise effekten ved sammenlignelige koncentrationer af dendrimere og monomere kontrastmidler molekyle, hhv.

figur 1
Figur 1: Syntese af den makrocykliske DOTA-typen chelatoren 4. Reagenser, betingelser og isolerede udbytter: (i) tert-butyl-2-brom-4- (4-nitrophenyl) butanoat, K 2 CO 3, DMF, 45 ° C , 16 timer, 72%; (ii) H2, Pd / C, EtOH, RT, 16 timer, 95%; (iii) CSCL 2, Et 3 N, RT, 2 timer, 53%. Klik her for at se en større version af denne fi gur.

Figur 2
Figur 2: Syntese af dendrimere MRI-kontrastmiddel DCA Reagenser og betingelser: (i) 4, Et3N, DMF, 45 ° C, 48 timer, 91%;. (Ii) myresyre, 60 ° C, 24 timer, kvant; (iii) GdCl 3 ∙ 6H 2 O, pH 7,0, RT, 24 timers, 71%. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Karakterisering af dendrimere produkt ved hjælp af MALDI-TOF-massespektrometri En typisk MALDI-TOF massespektrum opnået for DCA.rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:.. Karakterisering af den dendrimere produkt ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) DLS måling af DCA (HEPES, pH 7,4) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: In vitro MRI eksperimenter på rør fantomer ved 7 T magnetfelt (a, b) T 1 vægtede og (c, d) T2-vægtede MR-scanning af DCA og GdDOTA.. Hver MRI forsøg blev udført med to forskellige koncentrationer af kontrastmidlet: (a, c) med sammenlignelig Gd (III) koncentrationer (Hepes, pH 7,4); (B, d) med en DCA: GdDOTA koncentration på 1: 5 (HEPES, pH 7,4). Koncentrationerne er udtrykt pr molekyle og SNR værdier vises i parentes. Parametrene anvendt i disse eksperimenter var: field-of-view (FOV) = 40 x 40 mm 2, skivetykkelse = 0,5 mm, antal excitationer (NEX) = 30; (A) matrix størrelse (MTX) = 256 x 256, gentagelse tid (TR) = 100 ms, ekkotid (TE) = 2,95 ms, flipvinkel (FA) = 90 °, erhvervelse tid (TA) = 12 min 48 sek ; (B) MTX = 256 x 256, TR / TE = 20 / 2,95 ms, FA = 90 °, TA = 2 min 34 sec; (C) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 130 msek, Sjælden faktor (RF) = 16, TA = 26 min 40 sec; (D) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 100 msek, RF = 16, TA = 26 min 40 sek.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fremstilling af dendrimere MRI-kontrastmiddel kræver passende udvælgelse af den monomere enhed (dvs. chelatoren for Gd (III)). De reducerer toksicitet af denne paramagnetiske ion og til dato, en bred vifte af acykliske og makrocykliske chelateringsmidler tjener dette formål 1-3. Blandt disse makrocykliske DOTA-typen chelatorer besidder den højeste termodynamiske stabilitet og kinetisk inerthed og dermed er de mest foretrukne valg til fremstilling af inert MRI kontrastmidler 1,18. Endvidere er de tilbøjelige til forskellige syntetiske transformationer, der resulterer i bifunktionelle chelatorer, i stand til at linke til forskellige funktionelle molekyler (f.eks targeting vektorer eller nano-carriers), mens den stadig danner stabile Gd (III) komplekser 19. Til dette formål blev DOTA-typen monomerenhed beskrevet i denne procedure fremstillet ud fra DO3A--tert.butylesteren, den almindelige og let tilgængelige precursor, og bromidet derivat af4- (4-nitrophenyl) butansyre. Dette molekyle er afledt af DOTA og besidder en lignende struktur til at koordinere Gd (III). Det syntetiske ændring har til formål at gøre denne chelator tilbøjelige til at koble reaktioner på forskellige funktionelle molekyler og luftfartsselskaber. Nemlig fremstillingen af ​​DOTA-modificerede molekyle resulterer i en chelator stadig med fire carboxylgrupper rådighed til koordinering til Gd (III) til dannelse af et indifferent kompleks og en ortogonal nitrophenylgruppe, som ved omdannelse tillægger dette chelator til dendrimeren overflade. Denne procedure muliggør også fleksibilitet i valget af den ortogonale reaktive gruppe (f.eks, NH2 eller COOH), der kan tjene til at koble Gd (III) chelateringsmiddel til en ønsket bærer på en foretrukken måde.

Det opnåede bifunktionelle chelator kan kobles til andre molekyler på to forskellige måder (dvs. syntetiske procedurer). Når nitrogruppen reduceres til en aminogruppe, kan den resulterende anilin undergå en kondensationsreaktion med carboxylsyregruppen af det andet molekyle 8. Desuden kan en aromatisk primær amin funktionel gruppe i nærvær af thiophosgen let omdannes til et isothiocyanat, en gruppe, som let reagerer med aminer i polære organiske opløsningsmidler samt vand, der tilbyder flere reaktionstrin muligheder for kobling af monomere enheder til dendrimerer 17 , 20,21.

Til at koble bifunktionelle chelator til dendrimere bærer, bør vælges en passende dendrimer stillads. skal der redegøres Flere faktorer relateret til den endelige dendrimer konjugat struktur og det ønskede program i dette trin. På grund af udbredt kommerciel tilgængelighed af dendrimere bærere, kan vælges produkter med forskellige kernestrukturer, overfladeaktive reaktive grupper eller generationer. Derfor vil konjugeringsreaktionen afhænge overfladen gruppe af dendrimeren og det ortogonale gruppe af chelatoren, medensendelige konjugat kan være neutral, opladet, eller har forskellige størrelser (op til 15-20 nm, afhængigt af dendrimer generation) 22. Der bør træffes alle disse aspekter i betragtning forud for udarbejdelsen af ​​den dendrimere CA, da de kan påvirke opløselighed, relaksivitet (MRI signal enhancement), diffusion og andre farmakokinetiske egenskaber af kontrastmidlet, som potentielt kan true dens anvendelse i MRI. For eksempel kan kationiske dendrimerer udvise toksicitet i biologiske systemer. Imidlertid kan denne effekt reduceres ved konjugering af negativt ladede grupper på dendrimeren overflade, og derved reducere deres samlede positive ladning 23.

I denne protokol, har vi udarbejdet den dendrimere kontrastmiddel DCA anvendelse af proceduren, hvor isothiocyanat gruppe af det monomere makrocyklus 4 blev koblet til en kommerciel cystamin-core G4-PAMAM udstyret med 64 primære amin overflade grupper. Den indledende oprensning af hydrophobic dendrimere produkt 5 blev udført ved gelchromatografi under anvendelse af en søjle med en lipofil gelfiltreringsmedium og methanol som eluent for at fjerne det meste af de uomsatte monomere enheder. Hydrolysen af t-butyl-estere med myresyre er ligetil, hvilket resulterer i et vandopløseligt dendrimer produkt, som kan renses med gelpermeationschromatografi under anvendelse af en hydrofil gel filtration medium. Kompleksdannelsen af ​​de multimere og dendrimere chelatorer med Gd (III) blev udført under opretholdelse af opløsningen ved en neutral pH for at lette kompleksdannelsen. Ellers kompleksdannelsen af ​​Gd (III) (tilsat som chloridsaltet) reducerer pH, bremse reaktionen. Endelig er det værd at bemærke, at amingrupper i dendrimeren kernen også tendens til at koordinere med Gd (III), men kun med det overskydende, som ikke kunne chelateret med DOTA enheder. Undgå tilstedeværelse af Gd (III) uden for DOTA chelatoren er afgørende, da leakage af Gd (III) fra CA kan have uønskede virkninger; nemlig, kan det fremkalde toksicitet in vivo 18. Det overskydende Gd (III) kan fjernes effektivt ved kompleksdannelse med EDTA efterfulgt af ultrafiltrering af GdEDTA og frie EDTA under anvendelse af 3 kDa molekylvægt cut-off (MWCO) filtre. Lavere MWCO filtre kan anvendes, når de dendrimere konjugater har lavere molekylvægte.

Der er to store fejlfinding spørgsmål i forbindelse med forberedelsen af ​​DCA. På grund af den store udvidelse virkningen af ​​Gd (III) om NMR-signaler, analysen af ​​DCA ved hjælp af NMR-spektroskopi er ikke informativ. I stedet bør udføres denne analyse i tidligere trin (forbindelser 5 og 6). Dernæst konjugering af monomacrocyclic enheder til dendrimeren overflade aldrig opnået med 100% omdannelse, men det er sandsynligt at være mellem 50-90% (se nedenfor). Typisk kan reaktionen udbyttet forøges ved tilsætning af en anden portion af monomeric reaktiv enhed efter den første konjugering af dendrimer og monomer enhed er afsluttet 24. Men hver forberedelse batch resultater i noget forskellige gennemsnitlige antal chelatorer konjugeret på dendrimer overflade, selv når identiske dendrimer og DOTA enheder anvendes som materialer til kobling. Selvom den endelige størrelse af Gd (III) til stede i DCA kan bestemmes uafhængigt via BMS-metoden (se afsnit 2.2), for bedre karakterisering af dendrimere konjugater, er det nødvendigt at foretage estimeringen af ​​bundne monomere enheder, hver gang et nyt parti af DCA fremstilles (se 2.1 og diskussionen nedenfor).

Den analytiske karakterisering af de isolerede dendrimere produkter kan udføres ved hjælp af 1H NMR spektroskopi (kun for produkter 5 og 6), elementæranalyse og MALDI-TOF MS. Typiske udbytter til omdannelse af amino overflade grupper ligger mellem 50-90%, afhængig af dendrimer Generatipå, hvilken type chelator, og de anvendte reaktionsbetingelser (opløsningsmiddel og temperatur) 6,20,24,25. I dette særlige tilfælde er de beregnede masser opnået fra de kombinerede analyser svarer til et gennemsnit på 49 monomere chelater er koblet til dendrimeren (dvs. ~ 75% belægning af dendrimeren overflade aminer). Selv kunne forventes en mindre uoverensstemmelse i det endelige antal reagerede aminogrupper mellem disse metoder 25, deres direkte sammenligning giver rimeligt bevis for dannelsen af det ønskede DCA med et bestemt gennemsnitlige antal vedhæftede chelaterende enheder.

In vitro karakterisering formål at vurdere potentialet af DCA at øge kontrasten i MRI eksperimenter bestod af DLS, relaxometric, og MRI eksperimenter. Den hydrodynamiske diameter DCA blev bestemt til at være 7,2 ± 0,2 nm ved DLS målinger, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporterede konjugater af denne artmed G4 generation 4 PAMAM-dendrimerer 26. Bestemmelse af den langsgående relaksivitet af DCA fulgte den tidligere beskrevne procedure 15 og afslørede værdien på 6,2 ± 0,1 mM -1 sek-1 pr Gd (III). Ca. 50% af forøgelsen i R1 af paramagnetiske Gd (III) i DCA forhold til små-størrelse molekyler af en tilsvarende type (f.eks GdDOTA) kan forklares med den mellemliggende størrelse af dendrimere kontrastmiddel. Nemlig nedsat bevægelighed af Gd-chelater fastgjort til dendrimeren overflade forøger rotationskorrelationstiden og dermed r 1; denne virkning kan stadig observeres ved høje magnetfelter for mindre nanostørrelse agenter. Ellers stigningen i rotationskorrelationstiden bidrager overvejende til R1 forbedring ved lave magnetfelter 27. På den anden side er størrelsen af ​​den dendrimere kontrastmiddel havde en udtalt virkning på den tværgående relaxivity 28, hvilket resulterer i værdien på 30,5 ± 0,6 mM -1 sek-1 pr Gd (III). Sammenfattende metoderne til in vitro-vurdering af DCA er ligetil og kræver kun omhyggelig forberedelse prøve, så der forventes ikke problemer, når de erhverver data og analysere resultaterne.

For at demonstrere udførelsen af ​​dendrimere kontrastmiddel og dens magt til at påvirke billedets kontrast, vi udførte MRI eksperimenter på rør fantomer med den nyligt forberedt kontrastmiddel DCA. Vi anvendte også en opløsning af et kommercielt tilgængeligt og klinisk godkendt MRI-kontrastmiddel, GdDOTA, som en sammenligning og rør med vand som kontrol. I det første T 1-vægtede MRI eksperiment, når lige store (III) koncentrationer Gd blev anvendt (0,5 eller 1 mM Gd (III) i DCA eller GdDOTA), SNR i rørene med DCA allerede var op til 12% højere som følge til en stigning på omkring 50% i længderetningen relaksivitet af DCA forhold til GdDOTA (Figur 5a). Den anden T 1-vægtede MRI eksperiment var designet til at demonstrere effekten af DCA når koncentrationerne blev beregnet pr molekyle. Selvom 5 gange mindre DCA blev påført sammenlignet med GdDOTA (50 vs. 250 uM eller 100 vs. 500 uM DCA vs. GdDOTA henholdsvis), en høj ladning af DCA med Gd (III) resulterede i en signifikant stigning i billedets kontrast, hvilket igen resulterede i de observerede SNR værdier er mindst tre gange højere i fantom rør fyldt med DCA. Forventeligt, både T2-vægtede MR-eksperimenter udviste store (3-20 gange) forskelle i SNR mellem fantom rør fyldt med DCA og GdDOTA.

Afslutningsvis denne protokol beskriver en bekvem udarbejdelse af en dendrimer CA for MRI ved hjælp af fælles syntetiske procedurer for at give DCA med forbedrede egenskaber i forhold til små-størrelse CA'er. DCA udviser foretrukne termodynamiske stabilitet og kinetisk inerthed sammenlignettil sine monomere CA analoger. Ikke desto mindre multivalensen af ​​DCA og dermed den høje lokale koncentration af de paramagnetiske arter i målregionen inducerer høj kontrast i MR-billeder. I betragtning af de ofte foretrukne farmakokinetiske egenskaber (f.eks længere væv retentionstid) i forhold til deres monomere CA analoger, eller evnen til at bære yderligere funktionaliteter (f.eks målrettede vektorer), disse dendrimere-makrocyklen konjugater udgør et lovende og værdifuld klasse af kontrastmidler til forskellige fremtidige MRI og molekylær billeddannelse applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyclen CheMatech C002
tert-Butyl bromoacetate  Alfa Aesar A14917
N,N-Dimethylformamide Fluka 40248
Potassium carbonate Sigma-Aldrich 209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid Aldrich 335339
Thionyl chloride  Acros Organics 382662500 Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine Acros Organics 402841000 Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled 
Diethyl ether any source
Sodium sulphate Acros Organics 196640010
Chloroform  VWR Chemicals 22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate Aldrich 364789 Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate Acros Organics 174560250 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate Acros Organics 424270010
Ethyl-acetate any source For column chromatography
n-Hexane any source For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus Büchi Model type: Glass oven B-585
Silicagel Carl Roth GmbH P090.2
Methanol any source For column chromatography
Dichloromethane  any source For column chromatography
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
Ammonia Acros Organics 428381000 7 N Solution in Methanol
Palladium Aldrich 643181 15% wet
Hydrogenation apparatus PARR PARR Instrument Company
Celite 503 Aldrich 22151
Sintered glass funnel any source
Thiophosgen Aldrich 115150 Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine Alfa Aesar A12646
Dichloromethane  Acros Organics 348460010 Extra dry 
Magnetic stirrer any source
PAMAM G4 Dendrimer Andrews ChemService AuCS - 297 10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20 Sigma LH20100
Thin-layer chromatography plates Merck Millipore 1.05554.0001
Formic acid VWR Chemicals 20318.297
Lophylizer  any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate Aldrich G7532
Sodium hydroxide Acros Organics 134070010
pH meter any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Aldrich E5134
Mass spectrometer (ESI) Agilent Ion trap SL 1100 
Acetate buffer any source pH 5.8
Xylenol orange Aldrich 52097 20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15 GE Healthcare 17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Merck Millipore UFC900324 Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge any source
NMR spectrometer  Bruker Avance III 300 MHz
Topspin Bruker Version 2.1
Combustion analysis instrument EuroVector SpA EuroEA 3000 Elemental Analyser 
MALDI-ToF MS instrument Applied Biosystems Voyager-STR
Deuteriumoxid Carl Roth GmbH 6672.3
tert-Butyl alcohol Carl Roth GmbH AE16.1
Vortex mixer any source
Norell NMR tubes Deutero GmbH 507-HP-7
NMR coaxial tube Deutero GmbH coaxialb-5-7
DLS instrument Malvern Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter  Carl Roth GmbH KC94.1
HEPES Fisher BioReagents BP310
Plastic tube vials any source
Dotarem Guerbet NDC 67684-2000-1
MRI scanner Bruker BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil Bruker Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software) Bruker Version 5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. Wiley. (2013).
  2. Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4, (1), 1-23 (2009).
  3. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, (9), 2293-2352 (1999).
  4. Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110, (5), 2921-2959 (2010).
  5. Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31, (7), 1152-1160 (2007).
  6. Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80, (3), 612-622 (2015).
  7. Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
  8. Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11, (8), 1294-1305 (2013).
  9. Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. Longman. (1989).
  10. Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. Wiley-VCH. (2013).
  11. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1, (5), 184-188 (2006).
  12. Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. Wiley. (2010).
  13. Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. Wiley-VCH. (2007).
  14. Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
  15. Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
  16. Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8, (6), 456-465 (2013).
  17. Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5, (4), 527-539 (2008).
  18. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30, (6), 1240-1248 (2009).
  19. Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56, (6), 759-765 (2015).
  20. Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20, (11), 2142-2153 (2009).
  21. Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14, (24), 7250-7258 (2008).
  22. Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31, (18), 6259-6265 (1998).
  23. Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394, (1-2), 122-142 (2010).
  24. Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17, (4), 975-987 (2006).
  25. Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50, (14), 3185-3193 (2007).
  26. Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21, (6), 1014-1017 (2010).
  27. Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1, (1), 30-39 (2006).
  28. Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130, (15), 5335-5340 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics