Preparazione e

Chemistry

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Summary

Questo protocollo descrive la preparazione e caratterizzazione di un agente di contrasto dendrimerica risonanza magnetica (MRI) che porta chelati macrociclici cyclen basati coordinamento ioni paramagnetici gadolinio. In una serie di esperimenti in vitro MRI, questo agente prodotto un segnale RM amplificato rispetto all'analogo monomerica disponibile in commercio.

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Gündüz, S., Savić, T., Toljić, Đ., Angelovski, G. Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54776, doi:10.3791/54776 (2016).

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Abstract

complessi paramagnetici di gadolinio (III) con aciclico o chelati macrociclici sono gli agenti di contrasto più comunemente usati (CAS) per la risonanza magnetica (MRI). Il loro scopo è quello di migliorare la velocità di rilassamento dei protoni dell'acqua nel tessuto, aumentando così il contrasto dell'immagine MR e la specificità delle misurazioni MRI. mezzi di contrasto clinicamente approvati attuali sono molecole a basso peso molecolare che sono rapidamente eliminato dal corpo. L'utilizzo di dendrimeri come portatori di chelanti paramagnetiche possono giocare un ruolo importante nel futuro sviluppo di agenti di contrasto per MRI più efficienti. In particolare, l'aumento della concentrazione locale dei paramagnetici risultati specie in contrasto segnale più alto. Inoltre, questa CA fornisce un tempo di ritenzione del tessuto più grazie al suo elevato peso e dimensione molecolare. Qui, dimostriamo un procedimento conveniente per la preparazione di agenti di contrasto MRI macromolecolari a base di poli (amidoamine) (PAMAM) dendrimeri con monomacrociclici DOTA tipo chelanti (DOTA - 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetato). L'unità chelante è stato aggiunto sfruttando la reattività del gruppo isotiocianato (NCS) verso i gruppi superficiali ammina del dendrimero PAMAM per formare ponti tiourea. prodotti dendrimerici sono stati purificati e analizzati mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, spettrometria di massa e analisi elementare. Infine, ad alta risoluzione immagini RM sono state registrate e contrasti segnale ottenuto dal dendrimero preparato e agenti monomeriche disponibili in commercio sono stati confrontati.

Introduction

La risonanza magnetica (MRI) è una tecnica di imaging potente e non ionizzanti ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e diagnostica clinica per la sua natura non invasiva e un eccellente contrasto dei tessuti molli intrinseca. I metodi MRI più comunemente utilizzati utilizzano il segnale ottenuto da protoni dell'acqua, fornendo immagini ad alta risoluzione e informazioni dettagliate all'interno dei tessuti a base di differenze di densità dei segnali acqua. L'intensità del segnale e la specificità degli esperimenti di risonanza magnetica possono essere ulteriormente migliorate utilizzando mezzi di contrasto (CA). Questi sono specie paramagnetiche o superparamagnetiche che influenzano il longitudinale (T 1) e trasversale (T 2) tempi di rilassamento, rispettivamente 1,2.

Complessi di lantanidi gadolinio ionico con poliamminici ligandi acidi policarbossilici sono i più comunemente usati T 1 CA. Gadolinio (III) accorcia il rilassamento T 1tempo di protoni dell'acqua, aumentando così il contrasto del segnale in esperimenti MRI 3. Tuttavia, gadolinio ionica è tossico; le sue dimensioni approssima quella del calcio (II), e colpisce seriamente calcio assistita segnalazione nelle cellule. Pertanto, aciclici e macrociclici chelati sono impiegati per neutralizzare questa tossicità. Vari leganti multidentati sono stati sviluppati finora, con conseguente gadolinio complessi (III) con elevata stabilità termodinamica e cinetica inerzia 1. Quelli basati sul Cyclen azamacrocycle 12-membered, in particolare la sua tetracarbossilico DOTA derivata (1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetato) sono complessi più studiati e applicati di questa classe CA.

Tuttavia, GdDOTA tipo CA sono sistemi a basso peso molecolare, che mostrano alcuni svantaggi come l'efficienza e basso contrasto escrezione renale veloce. Macromolecolare e polivalente CA possono essere una buona soluzione a questi problemi 4. Dal momento che CA biodistribuzione è determinata principalmente dalla loro dimensione, CA macromolecolari mostrano tempi di ritenzione molto più lunghi all'interno dei tessuti. Ugualmente importante, il multivalenza di questi agenti si traduce in un aumento della concentrazione locale della sonda monomerica MR (ad esempio, complessi GdDOTA), migliorando sostanzialmente il segnale MR acquisite e la qualità della misura.

I dendrimeri sono tra i ponteggi preferite per la preparazione di polivalente CA per MRI 4,5. Queste macromolecole altamente ramificate con determinate dimensioni sono inclini a varie reazioni di accoppiamento sulla loro superficie. In questo lavoro, si segnala la preparazione, purificazione e caratterizzazione di una CA dendrimerica per la risonanza magnetica costituito da un 4 (G4) poli generazione (amidoamine) (PAMAM) dendrimero accoppiato ad chelati GdDOTA-like (DCA). Descriviamo la sintesi del reattiva derivata DOTA e il suo accoppiamento con il dendrimero PAMAM. Su complessazione con Gd (III), la caratterizzazione chimico-fisica di serie Operazire di DCA è stata eseguita. Infine, gli esperimenti di risonanza magnetica sono stati eseguiti per dimostrare la capacità di DCA di produrre immagini RM con un contrasto più forte di quelli ottenuti da basso peso molecolare CA.

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Protocol

1. Preparazione di DCA

  1. Sintesi della unità monomerica 4 6.
    1. Sintesi di 4- (4-nitrofenil) -2- (tert 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazaciclododec-1-il) butirrico terz butil estere (2).
      1. Sciogliere (4,7-bis- tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-il) acetico tert-butil estere dell'acido 1 (1,00 g, 1,94 mmoli) in N, N -dimethylformamide ( DMF, 5 ml), aggiungere carbonato di potassio (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 equiv.) e mescolare la miscela a temperatura ambiente per 45 min.
        NOTA: macrociclo 1 è stato preparato da Cyclen e tert-butil bromoacetato secondo la procedura precedentemente pubblicata 7.
      2. Aggiungere tert-butil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 equiv.) A porzioni nell'arco di 1 ora. Continuare a mescolare il composto in tegli stesse condizioni di reazione per le seguenti 18 ore.
        Nota: butil-2-bromo-4- Tert (4-nitrofenil) butanoato è stato preparato da 4- (4-nitrofenil) Acido -butyric, cloruro di tionile, e bromo secondo la procedura precedentemente pubblicata 8.
      3. Rimuovere DMF mediante bulbo a bulbo distillazione sotto vuoto a 40-60 ° C 9.
      4. Purificare il residuo mediante cromatografia su colonna (gel di silice, 7% metanolo / diclorometano) per ottenere il prodotto 2 come un solido amorfo marrone (1,09 g, 72%) 10.
    2. Sintesi di 4- (4-amminofenil) -2- (tert 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazaciclododec-1-il) butirrico terz butil estere (3).
      1. Sciogliere il nitrobenzene derivato 2 (1.00 g, 1.28 mmol) in etanolo (10 ml) e 7 N soluzione di ammoniaca in metanolo (150 ml). Aggiungere palladio su carbone attivo come catalizzatore (Pd / C, 150 mg, 15% in peso) al solutisopra.
      2. Agitare la miscela eterogenea per 16 ore sotto atmosfera di idrogeno (2,5 bar) nell'apparato idrogenatore Parr.
      3. Preparare una torta di farina fossile sospendendo in etanolo e filtrando la sospensione attraverso un imbuto di vetro sinterizzato. Versare la sospensione dal 1.1.2.2 sopra la torta preparata per rimuovere il catalizzatore Pd / C per filtrazione.
      4. Eliminare il solvente per distillazione delicata su un evaporatore rotante (temperatura del bagno d'acqua ~ 40 ° C) per ottenere composto 3 come solido amorfo marrone (0,91 g, 95%).
    3. Sintesi di 4- (4-isothiocyanatophenyl) -2- (4,7,10-tris- tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- tetraazaciclododec-1-il) butirrico tert-butil estere dell'acido (4).
      1. Aggiungere tiofosgene (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 equiv.) Ad una miscela di 3 (0,91 g, 1,22 mmoli) e trietilammina (0,685 ml, 4,87 mmoli, 4 equiv.) In diclorometano (15 ml).
      2. Vigorosamente smuovere le mi reazionexture con un agitatore magnetico a temperatura ambiente per 16 ore.
      3. Eliminare il solvente per distillazione delicata su un evaporatore rotante (temperatura del bagno d'acqua ~ 40 ° C), e poi purificare il prodotto grezzo mediante cromatografia su colonna (gel di silice, 5% metanolo / diclorometano) per ottenere il prodotto 4 come marrone chiaro solido amorfo (0,51 g, 53%).
  2. Sintesi del DCA dendrimero.
    1. Sintesi del dendrimero 5.
      1. Prendere G4-PAMAM dendrimero (667 mg, 10% soluzione di dendrimero in metanolo, 4,67 mmol), si evapora il metanolo per distillazione delicata su un evaporatore rotante (temperatura del bagno d'acqua ~ 40 ° C), e sciogliere il residuo in DMF (4 ml) .
      2. Aggiungere trietilammina (0,105 ml, 0,75 mmoli, 160 equiv.), Agitare per 45 min a 60 ° C e aggiungere isotiocianato 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 equiv. Rispetto ai gruppi superficiali ammino del dendrimero) a porzioni over 1 hr.
      3. Mescolare la miscela di reazione con un agitatore magnetico a 45 ° C per 48 ore.
      4. Rimuovere il solvente mediante bulbo a bulbo distillazione sotto vuoto a 40-60 ° C.
      5. Purificare il residuo cromatografia di esclusione molecolare utilizzando un mezzo di filtrazione di gel lipofilo e metanolo come eluente. Per comprimere la colonna, gonfiare i mezzi di filtrazione in metanolo per almeno 3 ore a temperatura ambiente (> 4 ml di metanolo per 1 g di polvere) senza applicare pressione. Eseguire separazione per gravità attraverso la raccolta di 1 ml frazioni.
      6. Analizzare le frazioni raccolte con cromatografia su strato sottile (TLC). Sviluppare la piastra TLC in 15% metanolo / diclorometano (solo il punto più polare posto sulla linea di base è derivato dal prodotto dendrimerica). Evaporare frazioni raccolte mediante distillazione delicata su un evaporatore rotante (temperatura del bagno d'acqua ~ 40 ° C) per ottenere prodotti 5 (270 mg, 91%).
    2. Sintesi del dendrimero
    3. Sciogliere il chelante protetta dendrimerica 5 (270 mg, 4,23 mmol) in acido formico (5 ml) e agitare la miscela a 60 ° C per 24 ore.
    4. Evaporare l'acido formico per distillazione su un evaporatore rotante (~ pressione 15 mbar, temperatura del bagnomaria ~ 40 ° C) e liofilizzare il prodotto per dare 6 (pressione ~ 0,2 mbar) 9.
  3. Sintesi del mezzo di contrasto dendrimerica (DCA)
    1. Sciogliere il chelante dendrimerica 6 (4,35 mmol) in acqua e regolare il pH a 7,0 con idrossido di sodio 0,1 M.
    2. Sciogliere GdCl 3 · 6H 2 O (113 mg, 304 mmol) in acqua (1 ml) e inserirlo goccia a goccia alla soluzione di chelante 6 su un periodo di 4 ore; mantenere il pH a 7,0 con una soluzione di idrossido di sodio acquoso (0,05 M), misurando il pH con un pHmetro.
    3. Mescolare la miscela con un agitatore magnetico a Temperature per 24 ore.
    4. Aggiungere acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 158 mg, 426 mmol) a porzioni soluzione oltre 4 ore per rimuovere l'eccesso di Gd (III) mantenendo il pH a 7,0 con una soluzione di idrossido di sodio acquoso (0,05 M). Mescolare la miscela a temperatura ambiente per 24 ore.
    5. Eseguire cromatografia di esclusione molecolare per rimuovere la maggior parte dei GdEDTA e l'eccesso di EDTA. Utilizzare un supporto gel filtrazione idrofila gonfio in acqua per confezionare la colonna. Ridurre la miscela ad un volume adeguato e caricare la colonna. Eluire la colonna con acqua deionizzata senza applicare pressione.
    6. Centrifugare il campione utilizzando un'unità filtro centrifugo 3 kDa per 30 min a centrifuga forza 1.800 xg per rimuovere i residui di GdEDTA e EDTA. Ripetere questo passaggio (circa cinque volte) fino a quando il filtrato mostra l'assenza di EDTA e GdEDTA. Trasferire il campione in una beuta, evaporare, e poi liofilizzare il solvente per ottenere un prodotto quasi bianco come finale DCA (186 mg, 71%).
      NOTA: Controllare l'assenza di EDTA e GdEDTA mediante ESI-MS.
    7. Confermare l'assenza di Gd (III) come ione libera utilizzando il test xilenolo arancio. Sciogliere il filtrato (0,5 ml) in una soluzione tampone acetato (pH 5,8). Aggiungere poche gocce di una soluzione xilenolo arancio e monitorare il cambiamento di colore (colore giallo o viola indica l'assenza o la presenza di libera Gd (III) ioni in soluzione, rispettivamente) 11.

2. In Vitro Caratterizzazione di dendrimerici Prodotti

  1. Stima del numero di macrociclici DOTA-unità accoppiate al dendrimero PAMAM (caricamento del dendrimero con macrocicli DOTA-like)
    1. Stima con 1 H NMR (NMR - spettroscopia di risonanza magnetica nucleare).
      NOTA: Questa procedura è possibile in dendrimeri 5 e 6, ma non su DCA.
      1. Registrare lo spettro 1 H NMR 12.
      2. Integrare la regione aromatico e due regioni distinte alifatici (1. segnali del dendrimero alifatica e protoni macrociclici, 2. segnali dei gruppi t -bu) o solo una regione alifatico per dendrimeri 5 e 6, rispettivamente.
        Nota: Non vi è alcun segnale separato nella regione alifatici origine dai gruppi t -bu in dendrimero 6 in quanto sono stati idrolizzati.
      3. Utilizzare Eq. 1 o Eq. 2 per stimare il numero di unità macrociclici (n), dove R = il rapporto degli integrali (alifatici / aromatici in Eq. 1 o alifatici-dendrimero / aliphatic- T- Bu in eq. 2), H = DEnd il numero di protoni in dendrimero, H Ar = il numero di protoni aromatici, H t Bu = il numero di protoni in gruppi t -bu, e H mac = il numero di protoni in un macrociclo.
        Nota: In entrambi i casi Eq. 1 o Eq. 2 possono essere usati for dendrimero 5, mentre solo Eq. 1 può essere utilizzato per dendrimero 6. Dal momento che i protoni scambiabili (su ammine, amidi, tiouree o carbossilati) sono tipicamente sostituiti con deuterio, che non sono stati assunti nei calcoli. Qui, H DEnd = 1.128 (per 5) o 1000 (per 6), H Ar = 4, e H mac = 27 sono stati utilizzati.
        Equazione 1 (1)
        Equazione 2 (2)
    2. Stima da analisi elementare utilizzando il rapporto di azoto zolfo.
      1. Eseguire l'analisi elementare sul campione dendrimerica solido (DCA in questo lavoro).
      2. Utilizzare Eq. 3 per stimare il numero di unità macrociclici (n), dove R = il rapporto tra determinati% N e S%, N DEnd o S DEnd = il numero diazoto o atomi di zolfo nel dendrimero, e N mac o mac S = il numero di azoto o zolfo atomi in una sola unità macrociclico.
        Nota: Il fattore 2.29 è ottenuto dal rapporto in massa atomica di zolfo e azoto. In questo lavoro, N DEnd = 250, S DEnd = 2, N = 5 Mac e Mac S = 1 sono stati utilizzati.
        Equazione 3 (3)
    3. Stima con matrice laser assistita tempo desorbimento / ionizzazione di volo (MALDI-TOF).
      1. Eseguire l'analisi MALDI-TOF MS 13.
      2. Calcolare il numero di unità macrociclici (n) secondo la Eq. 4, dove M z = massa constatato (m / z), z = la carica della specie, M = DEnd la massa della parte dendrimerica e M mac = la massa di una unità macrociclico.
        NOTE: M DEnd = 14.306 e M mac = 719 sono stati utilizzati in questo lavoro.
        Equazione 4 (4)
  2. Determinazione della DCA concentrazione ([DCA]): misura la suscettibilità magnetica Bulk (BMS)
    1. Sciogliere DCA (5-10 mg) in acqua (360 ml) in una provetta fiala di plastica ([DCA] ~ 5-10 mM).
      NOTA: [DCA] dovrebbe essere nell'intervallo di 5-10 mm per evitare un'eventuale sovrapposizione di risonanze Buoh t- a concentrazioni Campione> 15 mM, con la risonanza d'acqua a δ = 4,7 ppm.
    2. Aggiungere 60 ml di D 2 O: t- miscela BuOH (2: 1 v / v) alla soluzione acquosa di DCA e miscelare la soluzione risultante (420 microlitri) utilizzando un mixer Vortex.
    3. Transfer 400 ml di campione in un tubo NMR esterno e posizionare un tubo NMR inserto coassiale con un BuOH t-: H 2 O miscela (10:90 v / v) nella provetta.
    4. Discolo spettro NMR 1 H e misurare lo spostamento di frequenza tra i segnali di risonanza derivanti da t- BuOH nei tubi NMR interno ed esterno (riferimento) 12.
    5. Utilizzare Eq. 5 per determinare il [DCA], dove T = temperatura assoluta, Δχ = lo spostamento registrato, μ eff = il momento efficace magnetica per uno ione dei lantanidi eff = 7.94 per Gd (III) 14, e s = una costante dipendente dalla forma del campione e la sua posizione nel campo magnetico (0, 1/3, e 1/6 nel caso di una sfera, cilindro parallelo a, e cilindro perpendicolare al campo magnetico, rispettivamente).
      NOTA: Il valore calcolato ottenuto per il [DCA] deve essere corretto alla concentrazione originale dovuto all'aggiunta del D 2 O: t- soluzione BuOH (60 mL).
      Equazione 5 (5)
  3. luce dinamicaScattering (DLS) misurazioni.
    1. Preparare una soluzione DCA filtrata (filtro / PTFE 0,2 micron politetrafluoroetilene, 0,75 mM per Gd (III)) in 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) tampone (25 mM, pH 7.4) e trasferirlo in un provetta per la misura DLS.
    2. Posizionare la cuvetta nell'apparecchiatura DLS e impostare i seguenti parametri: 5 ripetizioni di 15 scansioni (1 scan = 12 sec, indice di rifrazione = 1.345, assorbimento = 1%) senza ritardi tra le scansioni e con equilibrazione temperatura 30 sec prima della registrazione .
    3. Esporta i dati acquisiti ed ottenere l'istogramma distribuzione dimensionale tracciando popolazione (%) in funzione delle dimensioni (diametro idrodinamico).
  4. Misurazione delle relassività longitudinali e trasversali.
    NOTA: Una procedura simile è stata già descritta utilizzando il rilassamento tempo analizzatore 15; questa procedura è stata effettuata utilizzando un NMR spettrometro a 300 MHz con TopspinSoftware.
    1. Preparare una serie di soluzioni DCA in H 2 O: D 2 O (500 ml, il 10% D 2 O in H 2 O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, e 5,0 mm, [HEPES ] = 25 mm) dal campione DCA magazzino (vedi paragrafo 2.2).
    2. Trasferire 450 ml di soluzione in un tubo NMR e posizionarlo nello strumento.
    3. Ottimizzare i parametri di acquisizione (durata 90 ° impulso di eccitazione (p1), e l'irradiazione frequenza di offset (O 1)) e quindi eseguire il T 1 e T 2 esperimenti usando il recupero di inversione (IR) e Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) sequenze di impulsi, rispettivamente.
    4. Determinazione dei tempi T 1 e T 2 di rilassamento.
      1. Selezionare l'indice fornito, processo lo spettro 2D nella dimensione F2, ed eseguire la correzione di fase interattivo.
      2. Selezionare la porzione appropriata (picco con intensità massima) nell'analisi / T 2, integrarlo, ed esportare la regione al modulo relax.
      3. Selezionare la funzione appropriata raccordo (invrec o uxnmrt2 per esperimenti IR e CPMG, rispettivamente) per ottenere i tempi T 1 o T 2 di rilassamento.
    5. Ripetere i passaggi 2.4.4.2-2.4.4.4 per tutti i rimanenti [DCA] soluzioni.
    6. Calcolare i tassi di rilassamento (R 1 e R 2) dai valori T 1 ottenuti (R 1,2 = 1 / T 1,2).
    7. Plot R 1 e R 2 (sec -1) in funzione della concentrazione di Gd (III) in mM.
    8. Determinare le relassività longitudinali e trasversali, r 1 ed r 2 (mM -1 sec -1), dalla pendenza della retta, come definito dall'eq. 6, dove R i, obs = longitudinale (i = 1) o trasversale (i = 2) velocità di rilassamento diamagneticitàl'acqua in assenza di specie paramagnetiche e [Gd] = concentrazione di Gd (III) utilizzato nell'esperimento.
      equazione 6 (6)

3. In Vitro risonanza magnetica; Confronto tra DCA e GdDOTA

  1. Preparazione di fantasmi tubo
    1. Preparare soluzioni acquose di DCA (4 x 350 mL) e GdDOTA (4 x 350 mL) e campioni di acqua (4 x 350 ml) per due serie di esperimenti in cui viene calcolata la concentrazione degli agenti di contrasto: (3.1.1.1) per Gd (III) o (3.1.1.2) per molecola.
      1. Preparare due campioni DCA e due GdDOTA campioni con concentrazioni di 0,5 e 1,0 mm per Gd (III), rispettivamente. Inoltre, preparare due campioni di acqua (come i tubi di controllo).
      2. Preparare due campioni DCA (2,5 e 5,0 mM per Gd (III) o 0,05 e 0,1 mM per molecola dendrimerica), due campioni GdDOTA (0,25, 0,5 mM) e due campioni di acqua (ControL tubi).
        NOTA: Le opportune concentrazioni DCA e GdDOTA devono essere preparati diluendo i rispettivi campioni di riserva con le concentrazioni di determinati con il metodo di BMS (vedi sezione 2.2) con tampone HEPES (pH 7,4). Al fine di semplificare i calcoli, n = 50 è stato ipotizzato per il numero medio di unità macrociclici per molecola dendrimero. Pertanto, il rapporto di DCA: GdDOTA era 1: 5, calcolato su una base per molecola.
    2. Porre i campioni a 300 tubi fiala di plastica microlitri, evitando la presenza di bolle d'aria nella soluzione.
      NOTA: Le dimensioni dei tubi fiala di plastica dipende dal tipo e dimensioni della bobina a radiofrequenza utilizzato (qui, un esempio con la bobina volume è indicato).
    3. Inserire i campioni all'interno di una siringa (60 ml di volume), riempirlo con 1 mM GdDOTA soluzione, e collocarlo nello scanner.
      NOTA: I campioni sono stati collocati nella soluzione acquosa di GdDOTA per evitare gli effetti di suscettibilità (variazioni del campo magnetico strength che si verificano vicino a interfacce tra le sostanze di diversa suscettibilità magnetica).
  2. Ottimizzazione dei parametri e di imaging.
    1. Utilizzare la scansione anatomica (localizzatore / Tripilot) per posizionare la siringa con i campioni nel isocentro del magnete.
    2. Premere il semaforo (scan regolazione) per eseguire regolazioni per spessoramento (regolazione del campo magnetico dell'omogeneità) dell'intero volume, la frequenza centrale (O 1), il guadagno del ricevitore (RG), e il guadagno di trasmissione (TX0 e TX1).
    3. Per T 1 pesate (T 1W) di imaging, selezionare il metodo veloce basso angolo di tiro (FLASH).
    4. Scegli fetta coronale per i campioni disposti verticalmente (siringa in orizzontale) nello scanner utilizzando la scansione Localizer.
    5. Utilizzare Eq. 7 per l'ottimizzazione della (CNR) di acquisizione contrasto-rumore Parametri 16, dove α = angolo della medaglia, TE = il tempo di eco, TR =il tempo di ripetizione, e T 1, A, T 1, B = T 1 volte del campione A (T 1, A) e campione B (T 1, B) per il quale il CNR deve essere massimizzata (lo stesso vale per T 2 volte: T 2, A e T 2, B).
      NOTA: T 1 e T 2 relax volte devono essere impostati a valori ottenuti dalle misure di relassività longitudinale e trasversale (sezione 2.4), mentre TE, TR, e α dovrebbe essere ottenuto dal calcolo di ottimizzazione CNR.
      equazione 7 (7)
    6. Acquisire l'immagine utilizzando i parametri ottenuti nella fase precedente (3.2.5).
    7. Calcolare il rapporto segnale-rumore (SNR).
      1. Caricare l'immagine T 1W acquisita (scansione) nella visualizzazione e di elaborazione delle immaginifinestra, e fare clic su Define regione di interesse (ROI).
      2. Scegliere un ROI circolare e disegnarlo alla posizione del campione e lo sfondo. Successivamente, fai clic sul display per ottenere l'ampiezza media del segnale (segnale S) e la deviazione standard del fondo (rumore S).
      3. Ripetere il passaggio 3.2.7.2 per la DCA, GdDOTA, e campioni di acqua.
      4. Calcolare il SNR utilizzando la formula: SNR = segnale S / S rumore.
    8. A seguito di una procedura leggermente modificata, eseguire T 2 pesate (T 2W) per immagini utilizzando la rapida acquisizione con metodo di valorizzazione di rilassamento (RARE). Per l'ottimizzazione dei parametri di acquisizione CNR, utilizzare Eq. 8.
      equazione 8 (8)

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Representative Results

La preparazione di DCA consisteva di due fasi: 1) sintesi del monomero DOTA-tipo chelante (Figura 1) e 2) accoppiamento del chelante con il dendrimero G4 PAMAM e successiva preparazione del dendrimero Gd (III) (Figura 2) . Nella prima fase, è stato preparato un cyclen basato DOTA-tipo chelante contenente quattro acidi carbossilici e un gruppo ortogonale adatto per ulteriori modifiche sintetici. La preparazione iniziata da 1 (DO3A- tert-butil estere) 7, che era alchilata con tert-butil 2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato 8 per fornire DOTA-derivato 2. L'idrogenazione di palladio-catalizzata ridotto il gruppo nitro aromatici in 2 per produrre anilina 3. La conversione di 3 con tiofosgene portato alla isotiocianato 4, which è stato precedentemente usato come agente amminico reattivo per la preparazione di dendrimero CA 17.

Nella fase successiva, il macrociclo 4 è stato utilizzato come unità monomerica di base in una reazione di accoppiamento al dendrimero PAMAM G4 disponibile in commercio. I gruppi superficiali ammina del dendrimero reagiscono con i gruppi isotiocianato del monomero 4 in presenza di una base. L'eccesso di 4 è stato rimosso mediante cromatografia di esclusione molecolare con un mezzo filtrante gel lipofilo con metanolo come eluente. Gli esteri terz butil sul coniugato dendrimero-macrociclico ottenuto 5 sono stati idrolizzati con acido formico per dare 6, che è stato poi liofilizzato e usato nella fase successiva senza purificazione. La formazione di Gd (III) complessi di DOTA-tipo macrocicli stato eseguito aggiungendo GdCl 3 · 6H 2 O ad una soluzione acquosa of 6 mantenendo il pH a circa 7. L'eccesso di Gd (III) è stato complessato con un acido etilendiamminotetraacetico comune chelante (EDTA). Il GdEDTA EDTA complessa ed eccesso sono stati rimossi dal sistema cromatografia di esclusione molecolare utilizzando un mezzo di filtrazione di gel idrofilo con acqua come eluente. Le impurità di piccole dimensioni rimanenti sono stati rimossi dalla soluzione per centrifugazione utilizzando 3 unità di filtrazione centrifuga kDa.

Dopo la sintesi dei coniugati dendrimero-macrociclo, un approccio analitico combinato è stato impiegato per caratterizzare i prodotti. Per determinare l'occupazione superficie ammina 5 e 6, 1 spettri H NMR sono stati analizzati. I risultati sono stati confrontati e confermati con il prodotto finale (DCA), in cui il caricamento del dendrimero con macrocicli è stato stimato mediante analisi elementare e di spettrometria di massa MALDI-TOF (Figura3). Una combinazione di questi tre metodi in media di 49 macrociclici essere coniugati a dendrimero G4, che corrisponde a ~ 75% di occupazione gruppo amminico superficie.

Ulteriore caratterizzazione del complesso dendrimerica inclusa la determinazione dei valori di relassività, con conseguente 6.2 ± 0.1 mM -1 s -1 per Gd (III) (o all'incirca intorno 300 mM -1 s -1 per dendrimero) per la relassività longitudinale e 30,5 ± 0,6 mM -1 sec -1 per Gd (III) (quasi 1,500 mM -1 sec -1 per dendrimero) per la relassività trasversale. Misurazioni DLS indicato un diametro idrodinamico di 7,2 ± 0,2 nm per DCA (Figura 4).

Infine, per dimostrare l'effetto dell'agente di contrasto MRI dendrimerico, RM è stata eseguita su due serie di fantasmi con DCA e la clinicaalleato disponibile GdDOTA per il confronto (Figura 5). La prima serie di fantasmi sono stati preparati con lo scopo di confrontare questi due agenti di contrasto a concentrazioni uguali Gd (III), mentre il secondo gruppo è stato progettato per dimostrare l'effetto a concentrazioni molecola comparabili dei mezzi di contrasto dendrimerici e monomerici, rispettivamente.

Figura 1
Figura 1: Sintesi del macrociclico DOTA-tipo chelatore 4. Reagenti, condizioni e isolato rendimenti: (i) terz-butil 2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato, K 2 CO 3, DMF, 45 ° C , 16 ore, 72%; (ii) H 2, Pd / C, EtOH, RT, 16 ore, 95%; (iii) CSCL 2, Et 3 N, RT, 2 ore, 53%. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa fi figura.

figura 2
Figura 2: Sintesi del mezzo di contrasto MRI dendrimerica DCA Reagenti e condizioni: (i) 4, Et 3 N, DMF, 45 ° C, 48 ore, 91%;. (Ii) acido formico, 60 ° C, 24 ore, quant; (iii) GdCl 3 ∙ 6H 2 O, pH 7,0, RT, 24 ore, 71%. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Caratterizzazione del prodotto dendrimerica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF Un tipico spettro di massa MALDI-TOF ottenuto per DCA.rget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:.. Caratterizzazione del prodotto dendrimerica mediante dispersione dinamica della luce (DLS) di misura DLS di DCA (HEPES, pH 7,4) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: esperimenti in vitro di risonanza magnetica su fantocci tubo a 7 campo magnetico T (a, b) T 1 pesate e (c, d) T 2 pesate risonanza magnetica di DCA e GdDOTA.. Ogni esperimento è stato eseguito con MRI due diverse concentrazioni di agente di contrasto: (a, c) con Gd comparabili (III) concentrazioni (Hepes, pH 7,4); (B, d) con un DCA: rapporto di concentrazione GdDOTA di 1: 5 (HEPES, pH 7,4). Le concentrazioni sono espresse per molecola ed i valori SNR sono visualizzati tra parentesi. I parametri utilizzati in questi esperimenti sono stati: campo di vista (FOV) = 40 x 40 mm 2, fetta di spessore = 0,5 mm numero di eccitazioni (NEX) = 30; (A) dimensione della matrice (MTX) = 256 x 256, tempo di ripetizione (TR) = 100 msec, tempo di eco (TE) = 2.95 msec, flip angle (FA) = 90 °, tempo di acquisizione (TA) = 12 min 48 sec ; (B) MTX = 256 x 256, TR / TE = 20 / 2.95 msec, FA = 90 °, TA = 2 min 34 sec; (C) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 130 msec, fattore Rare (RF) = 16, TA = 26 min 40 sec; (D) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 100 msec, RF = 16, TA = 26 min 40 sec.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Preparazione del mezzo di contrasto MRI dendrimerica richiede appropriata selezione dell'unità monomerica (cioè, il chelante per Gd (III)). Essi riducono la tossicità di questo ione paramagnetico e, ad oggi, una grande varietà di aciclici e chelanti macrociclici servire a questo scopo 1-3. Tra questi, macrociclici DOTA tipo chelanti possiedono la massima stabilità termodinamica e cinetica inerzia e, quindi, sono la scelta più preferito per la preparazione di agenti di contrasto per MRI inerte 1,18. Inoltre, essi sono soggetti a varie trasformazioni di sintesi, che si traducono in chelanti bifunzionali, in grado di collegare a diverse molecole funzionali (ad esempio, vettori di targeting o nano-vettori), pur formando stabile Gd (III) 19. A tal fine, l'unità monomerica DOTA-tipo descritto in questa procedura è stato preparato da DO3A- estere tert-butil, il precursore comune e facilmente disponibili, e il derivato bromuroil 4- (4-nitrofenil) butanoico. Questa molecola è derivato da DOTA e possiede una struttura simile a coordinare Gd (III). La modifica sintetico mira a rendere questo chelante inclini a reazioni di accoppiamento a varie molecole funzionali e vettori. Vale a dire, la preparazione dei DOTA-modificato risultati molecola in un chelante ancora con quattro gruppi carbossilici disponibili per il coordinamento di Gd (III) per formare un complesso inerte e un gruppo nitrofenil ortogonali, che al momento della conversione attribuisce questo chelante alla superficie dendrimero. Questa procedura permette anche di flessibilità nella scelta del gruppo reattivo ortogonale (per esempio, NH 2 o COOH), che può servire per accoppiare il chelante Gd (III) ad un vettore desiderato in modo preferito.

Il chelante bifunzionale ottenuto può essere accoppiato ad altre molecole in due modi diversi (ad esempio, procedure sintetiche). Quando il gruppo nitro viene ridotto ad un gruppo ammino, l'anilina risultante sotto puòandare una reazione di condensazione con il gruppo di acido carbossilico della altra molecola 8. Inoltre, una ammina primaria gruppo funzionale aromatico in presenza di tiofosgene può essere facilmente convertito in un isotiocianato, un gruppo che reagisce facilmente con ammine in solventi organici polari così come l'acqua, offrendo maggiori possibilità di reazione per l'accoppiamento di unità monomeriche di dendrimeri 17 , 20,21.

Per accoppiare il chelante bifunzionale al vettore dendrimerico, deve essere selezionato un ponteggio dendrimerica appropriata. Diversi fattori legati alla struttura dendrimero coniugato finale e l'applicazione desiderata devono essere contabilizzati in questa fase. Grazie alla vasta disponibilità commerciale dei vettori dendrimerici, prodotti con diverse strutture di base, gruppi di superficie reattiva, o generazioni possono essere scelti. Di conseguenza, la reazione di coniugazione dipenderà gruppo superficie del dendrimero e il gruppo ortogonale del chelante, mentre laconiugato finale può essere neutro, carica, o hanno diverse dimensioni (fino a 15-20 nm, a seconda generazione dendrimero) 22. Tutti questi aspetti devono essere presi in considerazione prima di preparare il CA dendrimerica, dal momento che possono influenzare la solubilità, relassività (MRI segnale di miglioramento), la diffusione, e altre proprietà farmacocinetiche del mezzo di contrasto, che può potenzialmente mettere in pericolo la sua applicazione in risonanza magnetica. Per esempio, dendrimeri cationici possono presentano una tossicità nei sistemi biologici. Tuttavia, questo effetto può essere ridotto mediante coniugazione di gruppi carichi negativamente sulla superficie dendrimero, riducendo così la loro carica positiva complessiva 23.

In questo protocollo, abbiamo preparato il mezzo di contrasto dendrimerica DCA utilizzando la procedura in cui il gruppo isotiocianato del macrociclo monomero 4 è stato accoppiato ad un cistamina-core G4-PAMAM commerciale dotato di 64 gruppi di superficie ammina primaria. La purificazione iniziale del hydrophobic prodotto dendrimerica 5 è stata effettuata mediante cromatografia su gel usando una colonna con un mezzo di filtrazione su gel lipofilo e metanolo come eluente per rimuovere la maggior parte delle unità monomeriche non reagiti. L'idrolisi di esteri t-butil con acido formico è semplice, risultando in un prodotto dendrimero idrosolubile che può essere purificato con cromatografia di esclusione molecolare utilizzando un mezzo di filtrazione di gel idrofilo. La complessazione dei chelanti multimerici e dendrimerici con Gd (III) è stata eseguita mantenendo la soluzione a pH neutro per facilitare la formazione del complesso. Altrimenti, la complessazione di Gd (III) (aggiunto come il sale cloruro) riduce il pH, rallentando la reazione. Infine, è opportuno notare che i gruppi amminici nel nucleo dendrimero tendono a coordinare con Gd (III), ma solo con l'eccesso che non poteva essere chelato con le unità DOTA. Evitare la presenza di Gd (III) fuori dal chelante DOTA è essenziale, dal momento che leakage di Gd (III) dal CA può avere effetti indesiderati; cioè, può indurre tossicità in vivo 18. L'eccesso Gd (III) può essere efficacemente rimosso mediante complessazione con EDTA seguita da ultrafiltrazione del GdEDTA e EDTA gratuitamente utilizzando filtri 3 kDa peso molecolare cut-off (MWCO). filtri MWCO più basso potrebbe essere utilizzata quando i coniugati dendrimerici hanno pesi molecolari più bassi.

Ci sono due principali la risoluzione dei problemi legati alla preparazione dei DCA. A causa della grande effetto di ampliamento di Gd (III) sui segnali NMR, l'analisi dei DCA mediante spettroscopia NMR non è informativo. Invece, questa analisi deve essere eseguita nelle precedenti fasi (composti 5 e 6). Successivamente, la coniugazione delle unità monomacrocyclic alla superficie dendrimero è mai realizzato con conversione 100%, ma è probabilmente compresa tra 50-90% (vedi sotto). Tipicamente, le rese di reazione può essere aumentata aggiungendo una seconda porzione di monomeric unità reattiva dopo la prima coniugazione del dendrimero ed unità monomerica è completata 24. Tuttavia, ogni preparazione lotti risultati in qualche modo diverso numero medio di chelanti coniugati sulla superficie dendrimero, anche quando identiche unità dendrimero e DOTA sono utilizzati come materiali per l'accoppiamento. Anche se la quantità finale di Gd (III) presente in DCA può essere determinata in modo indipendente tramite il metodo BMS (vedi punto 2.2), per una migliore caratterizzazione di coniugati dendrimerici, è necessario effettuare la stima di unità monomeriche legate ogni volta che un nuovo lotto di DCA è preparato (vedi 2.1 e la discussione di seguito).

La caratterizzazione analitica dei prodotti dendrimerici isolato può essere eseguita mediante 1 H NMR (solo per i prodotti 5 e 6), analisi elementare, e MALDI-TOF MS. Le rese di conversione dei gruppi amminici superficiali trovano tra 50-90%, a seconda delle Generati dendrimeroon, il tipo di chelante, e le condizioni di reazione impiegate (solvente e temperatura) 6,20,24,25. In questo caso particolare, le masse calcolate ottenuti dalle analisi combinate corrispondono ad una media di 49 chelati monomeriche essendo accoppiato al dendrimero (cioè, ~ 75% di occupazione delle ammine superficiali dendrimero). Sebbene una leggera mancata corrispondenza del numero finale di gruppi amminici reagiti potrebbe essere previsto tra queste metodologie 25, il confronto diretto offrire sufficienti prove per la formazione della DCA desiderato con un particolare numero medio di unità chelanti allegate.

La caratterizzazione in vitro con l'obiettivo di valutare il potenziale di DCA per migliorare il contrasto in esperimenti di risonanza magnetica consisteva di DLS, relaxometric, e gli esperimenti di risonanza magnetica. Il diametro idrodinamica del DCA è stato determinato in 7,2 ± 0,2 nm da misure DLS, che è in accordo con coniugati precedentemente segnalati di questo tipocon la generazione G4 4 PAMAM dendrimeri 26. Determinazione della relassività longitudinale DCA seguita la procedura precedentemente descritta 15 e rivelato il valore di 6,2 ± 0,1 mM -1 sec -1 per Gd (III). Circa il 50% della valorizzazione nel r 1 di paramagnetico Gd (III) in DCA rispetto alle molecole di piccole dimensioni dello stesso tipo (ad esempio, GdDOTA) può essere spiegato con la dimensione intermedia del mezzo di contrasto dendrimero. Vale a dire, il moto ridotta delle Gd chelati attaccato alla superficie dendrimero aumenta il tempo di correlazione rotazionale e, quindi, r 1; questo effetto può ancora essere osservata a campi magnetici elevati per piccoli agenti di dimensioni nanometriche. Altrimenti, l'aumento del tempo di correlazione rotazionale contribuisce prevalentemente a r 1 enhancement a campi magnetici bassi 27. D'altra parte, la dimensione del mezzo di contrasto dendrimerica avuto un effetto pronunciato sulla rela trasversalexivity 28, determinando il valore di 30,5 ± 0,6 mM -1 sec -1 per Gd (III). In sintesi, i metodi per la valutazione in vitro di DCA sono semplici e richiedono solo un'attenta preparazione del campione, quindi non si prevedono difficoltà durante l'acquisizione dei dati e l'analisi dei risultati.

Per dimostrare le prestazioni del mezzo di contrasto dendrimerica e il suo potere di influenzare il contrasto dell'immagine, abbiamo effettuato esperimenti di risonanza magnetica su fantocci tubo con l'agente di contrasto di recente preparato DCA. Abbiamo anche usato una soluzione di un agente di contrasto MRI commercialmente disponibile e clinicamente approvato, GdDOTA, come confronto e tubi con acqua come controllo. Nel primo T 1 pesate esperimento MRI, quando sono stati usati pari Gd (III) concentrazioni (0,5 o 1 mM di Gd (III) in DCA o GdDOTA), il SNR nei tubi con DCA era già fino al 12% più elevato a causa un aumento di circa il 50% in relassività longitudinale DCA rispetto al GdDOTA (FIGURA 5a). Il secondo T 1 esperimento MRI pesate è stato progettato per dimostrare l'effetto della DCA quando le concentrazioni sono state calcolate per molecola. Sebbene 5 volte meno DCA è stata applicata rispetto al GdDOTA (50 vs. 250 mM o 100 vs. 500 mM DCA vs. GdDOTA rispettivamente), un elevato carico di DCA con Gd (III) ha determinato un incremento significativo del contrasto dell'immagine, che a sua volta portato a valori SNR osservati essendo almeno tre volte superiore nei tubi fantasma riempito con DCA. Come previsto, sia T 2 pesate esperimenti di risonanza magnetica hanno mostrato grandi differenze (3-20 volte) nella SNR tra i tubi fantasma pieni di DCA e GdDOTA.

In conclusione, questo protocollo descrive una comoda preparazione di un dendrimero CA per MRI utilizzando procedure sintetiche comuni per fornire DCA con proprietà migliorate rispetto alle piccole dimensioni CA. mostre DCA preferito stabilità termodinamica e cinetica inerzia rispettoai suoi analoghi CA monomeriche. Tuttavia, la multivalenza di DCA e, quindi, l'alta concentrazione locale di specie paramagnetiche nella regione bersaglio induce alto contrasto nelle immagini MR. Considerando le proprietà farmacocinetiche spesso preferibile (per esempio, il tessuto più tempo di ritenzione) rispetto ai loro analoghi CA monomeriche, o la capacità di trasportare ulteriori funzionalità (ad esempio, vettori mirati), questi coniugati dendrimerici-macrociclo rappresentano una promettente classe e prezioso di mezzi di contrasto per vari MRI futuro e applicazioni di imaging molecolare.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyclen CheMatech C002
tert-Butyl bromoacetate  Alfa Aesar A14917
N,N-Dimethylformamide Fluka 40248
Potassium carbonate Sigma-Aldrich 209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid Aldrich 335339
Thionyl chloride  Acros Organics 382662500 Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine Acros Organics 402841000 Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled 
Diethyl ether any source
Sodium sulphate Acros Organics 196640010
Chloroform  VWR Chemicals 22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate Aldrich 364789 Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate Acros Organics 174560250 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate Acros Organics 424270010
Ethyl-acetate any source For column chromatography
n-Hexane any source For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus Büchi Model type: Glass oven B-585
Silicagel Carl Roth GmbH P090.2
Methanol any source For column chromatography
Dichloromethane  any source For column chromatography
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
Ammonia Acros Organics 428381000 7 N Solution in Methanol
Palladium Aldrich 643181 15% wet
Hydrogenation apparatus PARR PARR Instrument Company
Celite 503 Aldrich 22151
Sintered glass funnel any source
Thiophosgen Aldrich 115150 Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine Alfa Aesar A12646
Dichloromethane  Acros Organics 348460010 Extra dry 
Magnetic stirrer any source
PAMAM G4 Dendrimer Andrews ChemService AuCS - 297 10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20 Sigma LH20100
Thin-layer chromatography plates Merck Millipore 1.05554.0001
Formic acid VWR Chemicals 20318.297
Lophylizer  any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate Aldrich G7532
Sodium hydroxide Acros Organics 134070010
pH meter any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Aldrich E5134
Mass spectrometer (ESI) Agilent Ion trap SL 1100 
Acetate buffer any source pH 5.8
Xylenol orange Aldrich 52097 20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15 GE Healthcare 17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Merck Millipore UFC900324 Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge any source
NMR spectrometer  Bruker Avance III 300 MHz
Topspin Bruker Version 2.1
Combustion analysis instrument EuroVector SpA EuroEA 3000 Elemental Analyser 
MALDI-ToF MS instrument Applied Biosystems Voyager-STR
Deuteriumoxid Carl Roth GmbH 6672.3
tert-Butyl alcohol Carl Roth GmbH AE16.1
Vortex mixer any source
Norell NMR tubes Deutero GmbH 507-HP-7
NMR coaxial tube Deutero GmbH coaxialb-5-7
DLS instrument Malvern Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter  Carl Roth GmbH KC94.1
HEPES Fisher BioReagents BP310
Plastic tube vials any source
Dotarem Guerbet NDC 67684-2000-1
MRI scanner Bruker BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil Bruker Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software) Bruker Version 5.1

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References

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