Préparation et

Chemistry

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Summary

Ce protocole décrit la préparation et la caractérisation d'une imagerie par résonance magnétique (IRM), l'agent de contraste dendrimère qui porte des chelates macrocycliques à base Cyclen coordinants des ions paramagnétiques de gadolinium. Dans une série d'expériences d' IRM in vitro, cet agent a produit un signal d' IRM amplifié par rapport à l'analogue monomère disponible dans le commerce.

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Gündüz, S., Savić, T., Toljić, Đ., Angelovski, G. Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54776, doi:10.3791/54776 (2016).

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Abstract

complexes paramagnétiques de gadolinium (III) avec acyclique ou chélates macrocycliques sont des agents de contraste les plus couramment utilisés (CA) pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Leur but est d'améliorer la vitesse de protons de l'eau dans les tissus de relaxation, augmentant ainsi le contraste de l'image MR et la spécificité des mesures d'IRM. Les agents de contraste actuels cliniquement approuvés sont des molécules de faible poids moléculaire qui sont rapidement éliminées de l'organisme. L'utilisation de dendrimères en tant que porteurs de chélateurs paramagnétiques peut jouer un rôle important dans le développement futur des plus efficaces agents de contraste IRM. Plus précisément, l'augmentation de la concentration locale des résultats des espèces paramagnétiques dans un contraste de signal plus élevé. En outre, cette AC fournit un plus long temps de rétention du tissu en raison de sa masse moléculaire élevée et leur taille. Ici, nous démontrons une procédure commode pour la préparation d'agents d'IRM macromoléculaires de contraste à base de poly (amidoamine) (PAMAM), les dendrimères monomacrocycliques chélateurs de type DOTA (DOTA - 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétra-acétate). L'unité de chélation a été ajoutée en exploitant la réactivité du groupe isothiocyanate (NCS) vers les groupes de dendrimère PAMAM de surface de type amine pour former des ponts de thiourée. dendrimères produits ont été purifiés et analysés par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, spectrométrie de masse et analyse élémentaire. Enfin, la haute résolution des images RM ont été enregistrées et les contrastes des signaux obtenus à partir du dendrimère préparé et les agents monomères disponibles dans le commerce ont été comparés.

Introduction

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technique d'imagerie puissante et non-ionisant largement utilisé dans la recherche biomédicale et le diagnostic clinique en raison de sa nature non invasive et un excellent contraste des tissus mous intrinsèque. Les méthodes d'IRM les plus couramment utilisés utilisent le signal obtenu à partir de protons de l'eau, fournissant des images à haute résolution et des informations détaillées dans les tissus en fonction des différences dans la densité des signaux d'eau. L'intensité du signal et la spécificité des expériences d'IRM peut être encore améliorée en utilisant des agents de contraste (CA). Ce sont des espèces paramagnétiques ou superparamagnétiques qui affectent le sens longitudinal (T 1) et transversale (T 2) des temps de relaxation, respectivement de 1,2.

Les complexes de gadolinium ion lanthanide avec polyamino ligands acides polycarboxyliques sont 1 OPN les plus couramment utilisés T. Gadolinium (III) réduit la relaxation T 1temps de protons de l' eau, augmentant ainsi le contraste du signal lors d' expériences d' IRM 3. Cependant, le gadolinium ionique est toxique; sa taille se rapproche de celle du calcium (II), et elle affecte sérieusement la signalisation dans les cellules assistées de calcium. Par conséquent, acycliques et macrocycliques chélates sont utilisés pour neutraliser cette toxicité. Divers ligands polydentés ont été développés jusqu'à présent, ce qui entraîne gadolinium (III) ayant une stabilité thermodynamique élevée et l' inertie cinétique 1. Ceux qui sont fondés sur les cyclen azamacrocycle 12 chaînons, en particulier son tétracarboxylique DOTA dérivé (1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétate) sont complexes les plus étudiés et appliqués de cette classe de CA.

Néanmoins, GdDOTA de type CA sont des systèmes de faible poids moléculaire, présentant certains inconvénients, tels que la faible efficacité du contraste et de l'excrétion rénale rapide. Macromoléculaires et multivalent CA peuvent être une bonne solution à ces problèmes 4. Depuis CA biodistribution est principalement déterminée par leur taille, les CA macromoléculaires affichent beaucoup plus longs temps de rétention dans les tissus. Tout aussi important, la polyvalence de ces résultats , des agents à une concentration locale accrue de la sonde monomère MR (par exemple, un complexe GdDOTA), ce qui améliore sensiblement le signal RM acquises et la qualité de la mesure.

Les dendrimères sont parmi les échafauds les plus préférés pour la préparation des multivalent CA pour l' IRM 4,5. Ces macromolécules hautement ramifiées ayant des dimensions bien définies sont sujettes à diverses réactions de couplage sur leur surface. Dans ce travail, nous rapportons la préparation, la purification et la caractérisation d'un CA dendrimères pour l'IRM consistant en une génération 4 (G4) poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimère couplé à chélates GdDOTA-like (DCA). On décrit la synthèse du dérivé réactif du DOTA et son couplage avec le dendrimère PAMAM. Sur complexation avec Gd (III), la caractérisation physico-chimique norme procedure de DCA a été réalisée. Enfin, des expériences d'IRM ont été réalisées pour démontrer la capacité de DCA pour produire des images IRM avec un contraste plus fort que ceux obtenus à partir de bas poids moléculaire AR.

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Protocol

1. Préparation de DCA

  1. Synthèse de l'unité monomère 4 6.
    1. Synthèse du 4- (4-nitrophényl) -2- (tert - 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) ester de l' acide butyrique tert - butyle (2).
      1. Dissoudre le (tert 4,7-bis -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tétraazacyclododécane-cyclododec-1-yl) -acétique tert - butyl ester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) dans du N, N - diméthylformamide ( DMF, 5 ml), on ajoute du carbonate de potassium (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 équiv.) et on agite le mélange à température ambiante pendant 45 min.
        REMARQUE: macrocycle 1 a été préparé à partir Cyclen et de tert - butyle bromoacétate selon le mode opératoire déjà publié 7.
      2. Ajouter le tert - butyl-2-bromo-4- (4-nitrophényl) butanoate de méthyle (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 équiv.) Par portions sur 1 heure. Continuer de remuer le mélange sous til mêmes conditions de réaction pour le 18 heures suivant.
        Remarque: -butyl-2-bromo-4 - tert - (4-nitrophényl) butanoate de méthyle a été préparé à partir de 4- (4-nitrophényl) butyrique, le chlorure de thionyle, et le brome selon le procédé précédemment publié 8.
      3. Éliminer le DMF par distillation sous vide d' ampoule à ampoule à 40-60 ° C 9.
      4. On purifie le résidu par Chromatographie sur colonne (gel de silice, 7% de méthanol / dichlorométhane) pour obtenir le produit 2 sous forme de solide amorphe brun (1,09 g, 72%) 10.
    2. Synthèse du 4- (4-amino-phényl) -2- (tert - 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) ester de l' acide butyrique tert - butyle (3).
      1. Dissoudre le dérivé de 2 nitrobenzène (1,00 g, 1,28 mmol) dans de l' éthanol (10 ml) et 7 une solution d'ammoniac dans du methanol (150 ul). Ajouter du palladium sur charbon activé comme catalyseur (Pd / C, 150 mg, 15% en poids) à la solutisur.
      2. Agiter le mélange hétérogène pendant 16 heures sous une atmosphère d'hydrogène (2,5 bar) dans l'appareil d'hydrogénation de Parr.
      3. Préparer un gâteau de diatomite en suspension dans de l'éthanol et filtration de la suspension à travers un entonnoir en verre fritte. Verser la suspension de 1.1.2.2 sur le gâteau préparé pour éliminer le catalyseur Pd / C par filtration.
      4. Éliminer le solvant par distillation douce sur un évaporateur rotatif (température du bain d' eau à 40 ° C) pour obtenir un composé 3 sous forme de solide amorphe brun (0,91 g, 95%).
    3. Synthèse du 4- (4-isothiocyanatophényl) -2- (4,7,10-tris-tert -butoxycarbonylmethyl 1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-yl) butyrique tert-butyle ester (4).
      1. Ajouter du thiophosgène (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 équiv.) À un mélange de 3 (0,91 g, 1,22 mmol) et de triéthylamine (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 équiv.) Dans du dichlorométhane (15 ml).
      2. Agiter vigoureusement les mi de réactionxture avec un agitateur magnétique à température ambiante pendant 16 heures.
      3. Éliminer le solvant par distillation douce sur un évaporateur rotatif (température de l' eau du bain ~ 40 ° C), puis purifier le produit brut par Chromatographie sur colonne (gel de silice, 5% de méthanol / dichlorométhane) pour obtenir le produit 4 en tant que solide brun clair amorphe (0,51 g, 53%).
  2. Synthèse de la DCA dendrimère.
    1. Synthèse du dendrimère 5.
      1. Prendre G4-dendrimère PAMAM (667 mg, solution de dendrimère 10% dans du methanol, 4,67 pmol), on évapore le méthanol par distillation douce sur un évaporateur rotatif (température du bain d'eau à 40 ° C) et on dissout le résidu dans du DMF (4 ml) .
      2. Ajouter de la triéthylamine (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 éq.), Agiter pendant 45 min à 60 ° C et ajouter de l' isothiocyanate de 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 équiv. Par rapport aux groupes du dendrimère de surface aminé) par portions over 1 h.
      3. On agite le mélange réactionnel avec un agitateur magnétique à 45 ° C pendant 48 heures.
      4. Éliminer le solvant par distillation sous vide d'ampoule à ampoule à 40-60 ° C.
      5. On purifie le résidu par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant un milieu de filtration sur gel lipophile et de methanol comme éluant. Pour emballer la colonne, gonfler les médias de filtration dans le méthanol pendant au moins 3 heures à température ambiante (> 4 ml de méthanol par 1 g de poudre) sans appliquer de pression. Effectuer la séparation par gravité en recueillant fractions de 1 ml.
      6. Analyser les fractions recueillies avec chromatographie sur couche mince (CCM). Développer la plaque CCM dans 15% de méthanol / dichlorométhane (seulement l'endroit le plus polaire situé sur la ligne de base est dérivé du produit dendrimères). Evaporer les fractions recueillies par distillation douce sur un évaporateur rotatif (température du bain d'eau à 40 ° C) pour obtenir un produit 5 (270 mg, 91%).
    2. Synthèse du dendrimère
    3. Dissoudre le chélateur protégé dendrimère 5 (270 mg, 4,23 pmol) dans de l' acide formique (5 ml) et agiter le mélange à 60 ° C pendant 24 heures.
    4. Evaporer l'acide formique par distillation sur un évaporateur rotatif (~ pression de 15 mbar, température du bain d'eau à 40 ° C) et à lyophiliser le produit pour donner 6 (pression ~ 0,2 mbar) 9.
  3. Synthèse de l'agent de contraste dendrimère (DCA)
    1. Dissoudre le chélateur dendrimère 6 (4,35 pmol) dans l' eau et ajuster le pH à 7,0 avec de l' hydroxyde de sodium 0,1 M.
    2. Dissoudre GdCl 3 .6H 2 O (113 mg, 304 pmol) dans l' eau (1 ml) et ajouter goutte à goutte à la solution de chélateur 6 sur une période de 4 h; maintenir le pH à 7,0 avec une solution d'hydroxyde de sodium aqueux (0,05 M) en mesurant le pH avec un pH-mètre.
    3. Incorporer le mélange avec un agitateur magnétique à la chambre tEMPÉRATURE pendant 24 heures.
    4. Ajouter de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 158 mg, 426 pmol) à la solution par portions pendant 4 heures pour éliminer l'excès de Gd (III), tout en maintenant le pH à 7,0 avec une solution d'hydroxyde de sodium aqueux (0,05 M). On agite le mélange à la température ambiante pendant 24 heures.
    5. Effectuer chromatographie d'exclusion pour éliminer la majorité des GdEDTA et l'excès d'EDTA. Utiliser un milieu de filtration sur gel hydrophile gonflé dans l'eau pour emballer la colonne. Réduire le mélange à un volume approprié et de charger la colonne. Eluer la colonne avec de l'eau déminéralisée sans appliquer de pression.
    6. Centrifuger l'échantillon en utilisant une unité de filtre centrifuge 3 kDa pendant 30 min à la force centrifuge de 1800 x g pour éliminer les résidus de GdEDTA et de l'EDTA. Répéter cette étape (environ cinq fois) jusqu'à ce que le filtrat indique l'absence d'EDTA et GdEDTA. Transférer l'échantillon dans un flacon, évaporer, puis lyophiliser le solvant pour obtenir un produit blanc cassé que la finale DCA (186 mg, 71%).
      REMARQUE: Vérifiez l'absence d'EDTA et GdEDTA au moyen d'ESI-MS.
    7. Confirmez l'absence de Gd (III) comme ion libre en utilisant le test xylénol orange. On dissout le filtrat (0,5 ml) dans une solution tampon à l'acétate (pH 5,8). Ajouter quelques gouttes d'une solution xylénol orange et de suivre le changement de couleur (couleur jaune ou violette indique l'absence ou la présence de Gd (III) des ions en solution, respectivement) 11.

2. Caractérisation in vitro des produits dendrimères

  1. Estimation du nombre de macrocycliques DOTA-unités couplées au dendrimère PAMAM (chargement du dendrimère avec des macrocycles DOTA-like)
    1. Estimation de RMN 1 H (RMN - spectroscopie par résonance magnétique nucléaire).
      NOTE: Cette procédure est disponible sur dendrimères 5 et 6, mais pas sur DCA.
      1. Relever le spectre RMN 1 H 12.
      2. Intégrer la région aromatique et les deux régions distinctes aliphatiques (1. signaux des dendrimères et des protons aliphatiques macrocycliques, 2. les signaux des groupes t - Bu) , ou tout simplement une région aliphatique pour dendrimères 5 et 6, respectivement.
        Note: Il n'y a pas de signal distinct dans la région aliphatique provenaient des groupes t - Bu dans dendrimère 6 car ils ont été hydrolysée.
      3. Utilisez Eq. Ou 1 éq. 2 pour estimer le nombre d'unités macrocycliques (n),R = le rapport des intégrales (aliphatique / aromatique dans Eq. 1 ou aliphatiques-dendrimère / Bu aliphatiques T- dans l' équation. 2), H dende = le nombre de protons en dendrimère, H Ar = le nombre de protons aromatiques, H t Bu = le nombre de protons dans les groupes t - Bu, et H mac = le nombre de protons dans un macrocycle.
        Remarque: Soit l'équation. Ou 1 éq. 2 peut être utilisé for dendrimère 5, alors que seulement Eq. 1 peut être utilisé pour dendrimère 6. Etant donné que les protons échangeables (sur des amines, des amides, des thiourées ou des carboxylates) sont généralement remplacés par le deutérium, ils ne sont pas supposés dans les calculs. Ici, H dende = 1,128 (pour 5) ou 1000 (pour 6), H Ar = 4, et H mac = 27 ont été utilisés.
        L'équation 1 (1)
        équation 2 (2)
    2. L'estimation de l'analyse élémentaire en utilisant le rapport de l'azote au soufre.
      1. Effectuer l'analyse élémentaire sur l'échantillon dendrimère solide (DCA dans ce travail).
      2. Utilisez Eq. 3 pour estimer le nombre d'unités macrocycliques (n),R = le rapport de déterminé% N et% S, N ou S divi- dende = le nombre deatomes d' azote ou de soufre dans le dendrimère, et N ou S mac mac = le nombre d'atomes d' azote ou de soufre dans une unité macrocyclique.
        Remarque: Le facteur 2,29 est obtenu à partir du rapport des masses atomiques du soufre et de l'azote. Dans ce travail, N dende = 250, S dende = 2, N mac = 5, et S mac = 1 ont été utilisés.
        l'équation 3 (3)
    3. Estimation avec le laser le temps de désorption / ionisation assistée par matrice de vol (MALDI-TOF).
      1. Effectuer l'analyse MALDI-TOF MS 13.
      2. Calculer le nombre d'unités macrocycliques (n) selon l'équation. 4, où M z = la masse observée (m / z), z = la charge de l'espèce, M dende = la masse de la partie dendrimère, et M mac = la masse d'une unité macrocyclique.
        NONTE: M dende = 14306 et M mac = 719 ont été utilisés dans ce travail.
        l'équation 4 (4)
  2. Détermination de la concentration DCA ([DCA]): mesure de la susceptibilité magnétique en vrac (BMS)
    1. Dissoudre DCA (5-10 mg) dans de l'eau (360 ul) dans un tube flacon en matière plastique ([DCA] ~ 5-10 mM).
      NOTE: [DCA] devrait être de l'ordre de 5-10 mM pour éviter le chevauchement éventuel des résonances de BuOH T- à des concentrations de l' échantillon> 15 mM, avec la résonance de l' eau à δ = 4,7 ppm.
    2. Ajouter 60 ul de D 2 O: T- mélange BuOH (2: 1 v / v) à la solution aqueuse de DCA et mélanger la solution obtenue (420 pi) à l' aide d' un mélangeur Vortex.
    3. Transférer 400 pl de l'échantillon dans un tube RMN extérieur et placer un tube d'insertion de RMN coaxial avec un BuOH T-: mélange de H 2 O (10:90 v / v) dans le tube d'échantillon.
    4. Recordet le spectre de RMN 1 H mesurer le décalage de fréquence entre les signaux de résonance résultant de T- BuOH dans les tubes de RMN intérieure et extérieure (12) de référence.
    5. Utilisez Eq. 5 pour déterminer la [DCA], où T = température absolue, Δχ = le changement enregistré, u eff = le moment efficace magnétique pour un ion lanthanide eff = 7,94 pour Gd (III) 14, et s = une constante dépendant de la forme de l'échantillon et sa position dans le champ magnétique (0, 1/3, et 1/6 dans le cas d'une sphère, d'un cylindre parallèle à cylindre et perpendiculaire au champ magnétique, respectivement).
      REMARQUE: La valeur calculée obtenue pour la [DCA] doit être corrigée à la concentration initiale en raison de l'addition du D 2 O: T- solution BuOH (60 ul).
      l'équation 5 (5)
  3. Une lumière dynamiquediffusion (DLS) mesures.
    1. Préparer une solution DCA filtrée (filtre / PTFE de 0,2 um polytétrafluoroéthylène, 0,75 mM par Gd (III)) en 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) tampon (25 mM, pH 7,4) et le transférer dans un cuve pour la mesure de DLS.
    2. Placez la cuvette dans l'appareil de DLS et définir les paramètres suivants: 5 répétitions de 15 balayages (1 scan = 12 sec, l'indice de réfraction = 1,345, absorption = 1%) sans retards dans entre les balayages et équilibration de la température 30 sec avant l'enregistrement .
    3. Exporter les données acquises et à obtenir l'histogramme de distribution de taille en reportant la population (%) en fonction de la taille (diamètre hydrodynamique).
  4. La mesure des relaxivité longitudinale et transversale.
    NOTE: Une procédure similaire a déjà été décrit en utilisant la relaxation analyseur de temps de 15; cette procédure a été effectuée en utilisant un spectromètre de RMN à 300 MHz avec Topspinlogiciel.
    1. Préparer une série de solutions DCA en H 2 O: D 2 O (500 pi, 10% D 2 O en H 2 O, [DCA] = 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 et 5.0 mM, [HEPES ] = 25 mM) à partir de l'échantillon DCA de stock (voir section 2.2).
    2. Transférer 450 pi d'une solution dans un tube de RMN et le placer dans l'instrument.
    3. Optimiser les paramètres d'acquisition (durée 90 ° impulsion d'excitation (p1), et l' irradiation de décalage de fréquence (O 1)), puis effectuer le T 1 et T 2 expériences en utilisant la récupération d'inversion (IR) et voiture-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) des séquences d'impulsions, respectivement.
    4. Détermination des temps T 1 et T 2 de relaxation.
      1. Sélectionnez la mesure enregistrée, le processus du spectre 2D dans la dimension de F2, et effectuer la correction de phase interactive.
      2. Sélectionnez la tranche appropriée (pic d'intensité maximale) dans l'analyse / T 2 fenêtre de relaxation, intégrer et exporter la région vers le module de relaxation.
      3. Sélectionnez la fonction appropriée de montage (invrec ou uxnmrt2 pour des expériences IR et CPMG, respectivement) pour obtenir les temps T 1 ou T 2 relaxation.
    5. Répétez les étapes 2.4.4.2-2.4.4.4 pour toutes les solutions restantes [DCA].
    6. Calculer les taux de relaxation (R 1 et R 2) à partir des valeurs obtenues T 1 (R 1,2 = 1 / T 1,2).
    7. Parcelle R 1 et R 2 (sec -1) en fonction de Gd (III) , la concentration en mM.
    8. Déterminer les relaxivité longitudinale et transversale, r 1 et r 2 (mM -1 s s) à partir de la pente de la courbe ajustée telle que définie par l' équation. 6, où R i, obs = longitudinal (i = 1) ou transversal (i = 2) Taux de relaxation diamagnétiquel'eau en l'absence d'espèces paramagnétiques et [Gd] = la concentration de Gd (III) utilisé dans l'expérience.
      L'équation 6 (6)

3. IRM in vitro; Comparaison entre DCA et GdDOTA

  1. Préparation de fantômes tube
    1. Préparer des solutions aqueuses de DCA (4 x 350 pi) et GdDOTA (4 x 350 pi), ainsi que des échantillons d'eau (4 x 350 pi) pour les deux séries d'expériences dans lesquelles la concentration des agents de contraste est calculé comme suit: (3.1.1.1) par Gd (III) ou (3.1.1.2) par molécule.
      1. Préparer deux échantillons DCA et deux GdDOTA des échantillons avec des concentrations de 0,5 et 1,0 mM par Gd (III), respectivement. En outre, préparer deux échantillons d'eau (sous forme de tubes de contrôle).
      2. Préparer deux échantillons DCA (2,5 et 5,0 mM par Gd (III) ou 0,05 et 0,1 mM par molécule dendrimère), deux échantillons GdDOTA (0,25, 0,5 mM) et deux échantillons d'eau (control tubes).
        NOTE: Les concentrations de DCA et GdDOTA appropriées devraient être préparées en diluant les échantillons d'actions respectifs avec des concentrations déterminées par la méthode BMS (voir section 2.2) avec un tampon HEPES (pH 7,4). Afin de simplifier les calculs, n = 50 a supposé pour le nombre moyen d'unités macrocycliques par molécule de dendrimère. Par conséquent, le rapport de DCA: GdDOTA était de 1: 5, calculé sur une base par molécule.
    2. Placer les échantillons dans 300 ul de tubes en plastique du flacon, ce qui évite la présence de bulles d'air dans la solution.
      REMARQUE: La taille des tubes en matière plastique du flacon dépend du type et de la taille de la bobine de radiofréquence utilisée (ici, par exemple, avec la bobine de volume est donné).
    3. Insérez les échantillons à l'intérieur d'une seringue (60 ml de volume), le remplir avec 1 mM GdDOTA solution, et placez-le dans le scanner.
      NOTE: Les échantillons ont été placés dans la solution aqueuse de GdDOTA pour éviter les effets de la sensibilité (les variations du champ magnétiqueORCE qui se produisent près des interfaces entre les substances de susceptibilité magnétique différente).
  2. L' optimisation des paramètres et de l' imagerie.
    1. Utilisez l'analyse anatomique (Localizer / TriPilot) pour positionner la seringue avec les échantillons dans l'isocentre de l'aimant.
    2. Appuyez sur le feu de circulation (balayage de réglage) pour effectuer des ajustements pour calant (réglage de magnétique homogénéité du champ) de l'ensemble du volume, la fréquence centrale (O 1), le gain du récepteur (RG), et le gain d'émission (Tx0 et TX1).
    3. Pour pondération T 1 (T 1s) imagerie, sélectionnez la méthode rapide contre-plongée (FLASH).
    4. Choisissez tranche coronale pour les échantillons placés verticalement (seringue horizontalement) dans le scanner à l'aide de l'analyse de Localizer.
    5. Utilisez Eq. 7 pour l' optimisation de la (CNR) acquisition de contraste-bruit paramètres 16,α = l'angle de basculement, TE = le temps d' écho, TR =le temps de répétition, et T 1, A, T 1, b = T 1 fois de l' échantillon A (T 1, A) et l' échantillon B (T 1, B) pour laquelle le CN doit être maximisée (la même chose est valable pour T 2 fois: T 2, A et T 2, B).
      NOTE: T 1 et T 2 relaxation fois devraient être fixés aux valeurs obtenues à partir des mesures de relaxivité longitudinales et transversales (section 2.4), tandis que TE, TR, et α doit être obtenue à partir du calcul d'optimisation CNR.
      L'équation 7 (7)
    6. L'acquisition de l'image en utilisant les paramètres obtenus à l'étape précédente (3.2.5).
    7. Calculer le rapport signal sur bruit (SNR).
      1. Chargez le T 1s image acquise (scan) dans l'affichage et traitement d' imagesfenêtre, puis cliquez sur Définir région d'intérêt (ROI).
      2. Choisissez un ROI circulaire et dessiner à la position de l'échantillon et le fond. Par la suite, cliquez sur l' écran pour obtenir l'amplitude moyenne du signal (signal S) et écart - type de l'arrière - plan (bruit de S).
      3. Répétez l'étape 3.2.7.2 pour la DCA, GdDOTA, et des échantillons d'eau.
      4. Calculer le SNR en utilisant la formule: SNR = bruit de signal S / S.
    8. Après une procédure légèrement modifiée, effectuez T 2 weighted (T 2w) imagerie utilisant l'acquisition rapide avec la méthode d'amélioration de la relaxation (RARE). Pour l'optimisation des paramètres d'acquisition du CN, utiliser l'équation. 8.
      L'équation 8 (8)

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Representative Results

La préparation de DCA est composée de deux étapes: 1) la synthèse du chélateur de type DOTA monomère (figure 1) et 2) le couplage du chélateur avec le dendrimère G4 PAMAM et la préparation subséquente du Gd dendrimère (III) (figure 2) . Dans la première étape, un chélateur de type DOTA à base cyclène contenant quatre acides carboxyliques et d'un groupe orthogonal approprié pour d'autres modifications de synthèse a été préparé. La préparation introduite à partir de 1 (DO3A- tert - butyl ester) 7, qui a été alkylée avec du tert - butyle 2-bromo-4- (4-nitrophényl) butanoate de 8 à fournir DOTA dérivé 2. L'hydrogénation catalysée par le palladium réduit le groupe nitro aromatique en 2 pour donner l'aniline 3. La conversion de 3 avec le thiophosgène a abouti à l'isothiocyanate 4, which a déjà été utilisé en tant qu'agent d'aminé réactif pour la préparation de dendrimère CA 17.

Dans l'étape suivante, le macrocycle 4 a été utilisé comme unité monomère de base dans une réaction de couplage disponible dans le commerce G4 dendrimère PAMAM. Les groupes de dendrimère de surface de type amine réagissent avec les groupes isothiocyanate du monomère 4 en présence d'une base. L'excès de 4 a été éliminée par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant un milieu de filtration sur gel lipophile avec du methanol comme éluant. Les esters de tert - butyle d'sur le dendrimère macrocyclique conjugué obtenu 5 On hydrolyse avec de l' acide formique pour donner 6, qui a été ensuite lyophilisé et utilisé dans l'étape suivante sans purification. La formation de Gd (III) , des complexes de type DOTA macrocycles a été réalisée en ajoutant GdCl 3 .6H 2 O à une solution aqueuse of 6 , tout en maintenant le pH à environ 7. L'excès de Gd (III) a été complexé avec un acide éthylènediaminetétracétique chélateur commun (EDTA). Le complexe EDTA et l'excès GdEDTA ont été retirés du système par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant un milieu de filtration sur gel hydrophile avec de l'eau comme éluant. Les impuretés de petite taille restantes ont été éliminées de la solution par centrifugation à l'aide de 3 kDa unités de filtration centrifuge.

Après la synthèse des conjugués dendrimères-macrocycle, une approche analytique combinée a été utilisée pour caractériser les produits. Pour déterminer le taux d' occupation de surface de l' aminé 5 et 6, 1 H Les spectres de RMN ont été analysés. Les résultats ont été comparés et confirmés avec le produit final (DCA), où le chargement du dendrimère avec des macrocycles a été estimée en utilisant l' analyse élémentaire et MALDI-TOF (fig3). Une combinaison de ces trois méthodes conduit à une moyenne de 49 unités macrocycliques étant conjugué au dendrimère G4, ce qui correspond à environ 75% d'occupation du groupe de surfaces amine.

Une caractérisation plus poussée du complexe dendrimère comprend la détermination des valeurs de relaxivité, ce qui entraîne de 6,2 ± 0,1 mM -1 s -1 par Gd (III) (ou à peu près à environ 300 mM -1 s -1 par dendrimère) pour la relaxivité longitudinale et 30,5 ± 0,6 mM -1 s -1 par Gd (III) ( à peu près 1,500 mM -1 s -1 par dendrimère) pour la relaxation transversale. DLS mesures ont indiqué un diamètre hydrodynamique de 7,2 ± 0,2 nm pour DCA (figure 4).

Enfin, pour démontrer l'effet de l'agent dendrimère de contraste IRM, l'IRM a été réalisée sur deux ensembles de fantômes avec DCA et la cliniqueallié disponible GdDOTA pour la comparaison (Figure 5). La première série de fantômes ont été préparés dans le but de comparer ces deux agents de contraste à Gd (III) des concentrations identiques, tandis que la seconde a été conçu pour démontrer l'effet à des concentrations de molécules comparables des agents de contraste dendrimères et monomères, respectivement.

Figure 1
Figure 1: Synthèse du type DOTA chélateur macrocyclique 4. Les réactifs, les conditions et le rendement isolé: (i) de tert - butyl 2-bromo-4- (4-nitrophényl) butanoate, K 2 CO 3, le DMF, 45 ° C , 16 h, 72%; (ii) H2, Pd / C, EtOH, RT, 16 h, 95%; (iii) CSCL 2, Et 3 N, RT, 2 h, 53%. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette fi gurer.

Figure 2
Figure 2: synthèse du dendrimère agent de contraste IRM DCA réactifs et conditions: (i) 4, Et3N, DMF, 45 ° C, 48 h, 91%. (Ii) l'acide formique, 60 ° C, 24 h, quant; (iii) GdCl 3 ∙ 6H 2 O, pH 7,0, RT, 24 h, 71%. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Caractérisation du produit dendrimère au moyen de MALDI-TOF Un spectre typique de masse MALDI-TOF a obtenu pour le DCA.rget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:.. Caractérisation du produit dendrimère par diffusion dynamique de la lumière (DLS) Mesure de DLS de DCA (HEPES, pH 7,4) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: expériences in vitro IRM sur des fantômes de tube à 7 champ magnétique T (a, b) pondération T 1 et (c, d) T 2 weighted IRM de DCA et GdDOTA.. Chaque expérience a été réalisée avec l'IRM deux concentrations différentes de l'agent de contraste: (a, c) avec comparable Gd (III) des concentrations (HEPES, pH 7,4); (B, d) avec un DCA: rapport de concentration GdDOTA de 1: 5 (HEPES, pH 7,4). Les concentrations sont exprimées par molécule et les valeurs SNR sont affichées dans les parenthèses. Les paramètres utilisés dans ces expériences étaient: champ de vision (FOV) = 40 x 40 mm 2, épaisseur de coupe = 0,5 mm, nombre d'excitations (NEX) = 30; (A) la taille de la matrice (MTX) = 256 x 256, temps de répétition (TR) = 100 ms, temps d' écho (TE) = 2,95 ms, l' angle de bascule (FA) = 90 °, le temps d'acquisition (TA) = 12 min 48 sec ; (B) MTX = 256 x 256 TR / TE = 20 / 2,95 ms, FA = 90 °, TA = 2 min 34 sec; (C) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10 000/130 msec, facteur Rare (RF) = 16, TA = 26 min 40 sec; (D) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10 000/100 msec, RF = 16, TA = 26 min 40 sec.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Préparation de l'agent de contraste IRM dendrimère nécessite une sélection appropriée de l'unité monomère ( par exemple, le chélateur Gd (III)). Ils réduisent la toxicité de cet ion paramagnétique et, à ce jour, une grande variété de chélateurs macrocycliques acyclique et servent à cette fin 03/01. Parmi ceux - ci, des chélateurs macrocycliques de type DOTA possèdent la stabilité thermodynamique plus élevée et l' inertie cinétique et, par conséquent, sont le choix préféré pour la préparation d'IRM inerte agents de contraste 1,18. En outre, elles sont sujettes à diverses transformations synthétiques, qui se traduisent par des chélateurs bifonctionnels capables de se lier à différentes molécules fonctionnelles (par exemple, des vecteurs de ciblage ou des nano-porteuses) , tout en formant stables Gd (III) 19. A cet effet, l'unité monomère de type DOTA décrit dans cette procédure a été préparé à partir d' ester tert DO3A- -butyle, le précurseur commun et facilement disponibles, et le dérivé de bromure dele 4- (4-nitrophényl) butanoïque. Cette molécule est dérivée de DOTA et possède une structure similaire à celle de coordonnées de Gd (III). La modification de synthèse a pour but de faire de ce chélateur sujettes à des réactions de couplage à différentes molécules et les transporteurs fonctionnels. A savoir, la préparation des résultats de la molécule DOTA modifiée dans un chélateur encore avec quatre groupes carboxyliques disponibles pour la coordination de Gd (III) pour former un complexe inerte et d'un groupe nitrophényle orthogonaux, qui, lors de la conversion attache présente chélateur à la surface du dendrimère. Cette procédure permet également de souplesse dans le choix du groupe réactif orthogonal (par exemple, NH2 ou COOH), qui peut servir à coupler le chélateur Gd (III) à un support souhaité d'une manière préférée.

Le chélateur bifonctionnel obtenu peut être couplé à d' autres molécules de deux manières différentes ( par exemple, des procédures synthétiques). Lorsque le groupe nitro est réduit en un groupe amino, l'aniline résultante peut sousfaire une réaction de condensation avec le groupe acide carboxylique de l'autre molécule 8. En outre, un groupe fonctionnel amine primaire aromatique en présence de thiophosgène peut être facilement converti en un isothiocyanate, un groupe qui réagit facilement avec des amines dans des solvants organiques polaires, ainsi que de l' eau, en offrant davantage de possibilités de réaction pour le couplage d'unités monomères de dendrimères 17 , 20,21.

Pour coupler le chélateur bifonctionnel au support dendrimère, un squelette dendrimère approprié doit être sélectionné. Plusieurs facteurs liés à la structure dendrimère conjugué final et l'application souhaitée doivent être pris en compte dans cette étape. En raison de la grande disponibilité commerciale des transporteurs dendrimères, produits avec différentes structures de base, les groupes de surface réactifs, ou les générations peuvent être choisis. Par conséquent, la réaction de conjugaison dépendra du groupe du dendrimère et le groupe chélateur orthogonale de la surface, tandis que leconjugué final peut être neutre, chargée ou avoir des tailles différentes (jusqu'à 15-20 nm, en fonction de la génération de dendrimère) 22. Tous ces aspects doivent être pris en compte avant de préparer le CA dendrimère, car ils peuvent affecter la solubilité, la relaxivité (IRM amélioration du signal), la diffusion, et d'autres propriétés pharmacocinétiques de l'agent de contraste, qui peut mettre en danger son application en IRM. Par exemple, les dendrimères cationiques peuvent présenter une toxicité dans les systèmes biologiques. Cependant, cet effet peut être réduit par la conjugaison des groupes chargés négativement sur la surface du dendrimère, réduisant ainsi leur charge positive globale 23.

Dans ce protocole, nous avons préparé l'agent de contraste dendrimère DCA en utilisant la procédure dans laquelle le groupe isothiocyanate du macrocycle monomère 4 est couplé à un noyau cystamine G4 PAMAM commercial équipé de 64 groupes superficiels amine primaire. La purification initiale du hydrophOBIC produit dendrimère 5 a été réalisée par Chromatographie sur gel en utilisant une colonne d'un milieu de filtration sur gel lipophile et de methanol comme éluant , afin d'éliminer la majeure partie des unités monomères non réagis. L'hydrolyse des esters de t - butyle avec de l' acide formique est simple, ce qui entraîne un produit dendrimère soluble dans l'eau qui peut être purifié par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant un milieu de filtration sur gel hydrophile. La complexation des chélateurs et des multimères dendrimères avec Gd (III) a été réalisée tout en maintenant la solution à un pH neutre afin de faciliter la formation du complexe. Dans le cas contraire, la complexation de Gd (III) (ajouté sous forme de sel de chlorure) abaisse le pH, ce qui ralentit la réaction. Enfin, il est intéressant de noter que des groupes amine dans le noyau des dendrimères ont également tendance à coordonner avec Gd (III), mais seulement avec l'excès qui ne pouvait être chélaté avec les unités DOTA. Éviter la présence de Gd (III) à l'extérieur du chélateur DOTA est essentiel, puisque leAkage de Gd (III) à partir du CA peut avoir des effets indésirables; à savoir, il peut induire une toxicité in vivo 18. L'excès de Gd (III) peut être efficacement éliminé par complexation avec EDTA suivi par ultrafiltration du GdEDTA et de l'EDTA libre en utilisant 3 kDa poids moléculaire de coupure (MWCO) filtres. filtres Lower MWCO pourraient être utilisés lorsque les conjugués dendrimères ont des poids moléculaires inférieurs.

Il y a deux grands problèmes de dépannage liés à la préparation de la DCA. En raison du grand effet d'élargissement du Gd (III) sur les signaux de RMN, l'analyse de DCA par spectroscopie RMN est pas informative. Au contraire, cette analyse doit être réalisée dans les étapes précédentes (composés 5 et 6). Ensuite, la conjugaison des unités monomacrocyclic à la surface du dendrimère ne soit jamais réalisé avec une conversion de 100%, mais elle est susceptible de se situer entre 50 à 90% (voir ci-dessous). Typiquement, les rendements de la réaction peut être augmentée en ajoutant une deuxième partie de la monomeric unité réactive après la première conjugaison des dendrimères et l' unité monomère est terminée 24. Cependant, tous les résultats de la préparation de lots à peu différents nombres moyens de chélateurs conjugués sur la surface du dendrimère, même lorsque les dendrimères et DOTA unités identiques sont utilisées en tant que matériaux pour le couplage. Bien que le montant final de Gd (III) présent dans DCA peut être déterminée indépendamment par la méthode BMS (voir section 2.2), pour une meilleure caractérisation des conjugués dendrimères, il est nécessaire d'effectuer l'estimation des unités monomères liées à chaque fois qu'un nouveau lot de DCA est préparé (voir 2.1 et la discussion ci-dessous).

La caractérisation analytique des produits isolés dendrimères peut être réalisée au moyen de spectroscopie RMN 1 H (seulement pour les produits 5 et 6), l' analyse élémentaire et MALDI-TOF. Les rendements typiques pour la conversion des groupes de surface amino sont compris entre 50 à 90%, selon les dendrimères generatisur le type de chélateur et les conditions de réaction utilisées (solvant et température) 6,20,24,25. Dans ce cas particulier, les masses calculées obtenues à partir des analyses combinées correspondent à une moyenne de 49 chelates monomères étant couplé au dendrimère (ie, ~ 75% d' occupation des amines de surface des dendrimères). Bien qu'un léger décalage dans le nombre final de groupes amino réagi pourrait être attendue entre ces méthodologies 25, leur comparaison directe fournit des preuves raisonnables pour la formation de la DCA désirée avec un nombre moyen notamment d'unités de chélateurs attachés.

La caractérisation in vitro visant à évaluer le potentiel de DCA pour améliorer le contraste dans des expériences d' IRM est composée de DLS, relaxométrique, et des expériences d' IRM. Le diamètre hydrodynamique de DCA a été déterminée à 7,2 ± 0,2 nm par des mesures de DLS, qui est en accord avec des conjugués précédemment rapportés de ce genreavec la génération G4 4 PAMAM dendrimères 26. Détermination de la relaxivité longitudinale de DCA a suivi le mode opératoire décrit précédemment 15 et a révélé la valeur de 6,2 ± 0,1 mM -1 s -1 par Gd (III). Environ 50% de l'amélioration dans le r 1 de paramagnétique Gd (III) dans DCA par rapport aux molécules de petite taille d'un type similaire (par exemple, GdDOTA) peut être expliqué avec la taille intermédiaire de l'agent de contraste dendrimères. A savoir, le mouvement réduit des chelates de Gd fixé à la surface de dendrimère augmente le temps de corrélation rotationnelle et, par conséquent, r 1; cet effet peut encore être observé à des champs magnétiques élevés pour les petits agents de taille nanométrique. Dans le cas contraire, l'augmentation du temps de corrélation rotationnelle contribue à prédominance R 1 à l' amélioration de faibles champs magnétiques 27. D'autre part, la taille de l'agent de contraste dendrimère a eu un effet prononcé sur la transversale relaxivity 28, entraînant la valeur de 30,5 ± 0,6 mM -1 s -1 par Gd (III). En résumé, les méthodes d'évaluation in vitro de DCA sont simples et nécessitent une préparation de l' échantillon seulement prudent, donc pas de difficultés sont attendues lors de l' acquisition des données et l' analyse des résultats.

Pour démontrer les performances de l'agent de contraste dendrimères et son pouvoir d'influer sur le contraste de l'image, nous avons effectué des expériences d'IRM sur des fantômes de tube avec l'agent de contraste nouvellement préparé DCA. Nous avons également utilisé une solution d'un agent de contraste d'IRM disponible dans le commerce et cliniquement approuvé, GdDOTA, à titre de comparaison et les tubes avec de l'eau comme témoin. Dans la première pondération T 1 expérience d' IRM, lorsque D.ieu concentrations (III) égales ont été utilisés (0,5 ou 1 mM de Gd (III) DCA ou GdDOTA), le SNR dans les tubes avec DCA était déjà jusqu'à 12% plus élevé en raison à une augmentation d'environ 50% de la relaxivité longitudinale de DCA par rapport à GdDOTA (Figure 5a). Le deuxième T 1 expérience d' IRM weighted a été conçu pour démontrer l'effet de DCA lorsque les concentrations ont été calculées par molécule. Bien que 5 fois moins DCA a été appliquée par rapport à GdDOTA (50 vs 250 uM ou 100 vs 500 uM DCA vs. GdDOTA, respectivement), une forte charge de DCA avec Gd (III) a entraîné une augmentation significative dans le contraste de l'image, qui à son tour a donné lieu à des valeurs SNR observées étant au moins trois fois plus élevé dans les tubes fantômes remplis de DCA. Expectedly, deux T 2 weighted expériences d'IRM présentaient de grandes (3-20 fois) des différences dans le SNR entre les tubes fantômes remplis de DCA et GdDOTA.

En conclusion, ce protocole décrit une préparation pratique d'un CA dendrimères pour l'IRM en utilisant des procédures de synthèse communes pour fournir DCA avec des propriétés améliorées par rapport à la petite taille des AR. On préfère les expositions DCA stabilité thermodynamique et cinétique d'inertie par rapportà ses monomères analogues CA. Néanmoins, la multivalence de DCA et, par conséquent, la concentration locale élevée de l'espèce paramagnétique dans la région cible induit un fort contraste dans les images RM. Compte tenu des propriétés pharmacocinétiques souvent préférables (par exemple, plus le tissu temps de rétention) par rapport à leurs analogues CA monomères, ou la capacité d'effectuer de nouvelles fonctionnalités (par exemple, des vecteurs ciblés), ces conjugués dendrimères-macrocycle représentent une classe prometteuse et précieuse d'agents de contraste pour diverses IRM avenir et applications d'imagerie moléculaire.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyclen CheMatech C002
tert-Butyl bromoacetate  Alfa Aesar A14917
N,N-Dimethylformamide Fluka 40248
Potassium carbonate Sigma-Aldrich 209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid Aldrich 335339
Thionyl chloride  Acros Organics 382662500 Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine Acros Organics 402841000 Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled 
Diethyl ether any source
Sodium sulphate Acros Organics 196640010
Chloroform  VWR Chemicals 22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate Aldrich 364789 Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate Acros Organics 174560250 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate Acros Organics 424270010
Ethyl-acetate any source For column chromatography
n-Hexane any source For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus Büchi Model type: Glass oven B-585
Silicagel Carl Roth GmbH P090.2
Methanol any source For column chromatography
Dichloromethane  any source For column chromatography
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
Ammonia Acros Organics 428381000 7 N Solution in Methanol
Palladium Aldrich 643181 15% wet
Hydrogenation apparatus PARR PARR Instrument Company
Celite 503 Aldrich 22151
Sintered glass funnel any source
Thiophosgen Aldrich 115150 Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine Alfa Aesar A12646
Dichloromethane  Acros Organics 348460010 Extra dry 
Magnetic stirrer any source
PAMAM G4 Dendrimer Andrews ChemService AuCS - 297 10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20 Sigma LH20100
Thin-layer chromatography plates Merck Millipore 1.05554.0001
Formic acid VWR Chemicals 20318.297
Lophylizer  any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate Aldrich G7532
Sodium hydroxide Acros Organics 134070010
pH meter any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Aldrich E5134
Mass spectrometer (ESI) Agilent Ion trap SL 1100 
Acetate buffer any source pH 5.8
Xylenol orange Aldrich 52097 20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15 GE Healthcare 17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Merck Millipore UFC900324 Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge any source
NMR spectrometer  Bruker Avance III 300 MHz
Topspin Bruker Version 2.1
Combustion analysis instrument EuroVector SpA EuroEA 3000 Elemental Analyser 
MALDI-ToF MS instrument Applied Biosystems Voyager-STR
Deuteriumoxid Carl Roth GmbH 6672.3
tert-Butyl alcohol Carl Roth GmbH AE16.1
Vortex mixer any source
Norell NMR tubes Deutero GmbH 507-HP-7
NMR coaxial tube Deutero GmbH coaxialb-5-7
DLS instrument Malvern Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter  Carl Roth GmbH KC94.1
HEPES Fisher BioReagents BP310
Plastic tube vials any source
Dotarem Guerbet NDC 67684-2000-1
MRI scanner Bruker BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil Bruker Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software) Bruker Version 5.1

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References

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