تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison
Published 2/19/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

لقد قمنا بتصميم جهاز زراعة المستمر للاستخدام مع أنظمة علم البصريات الوراثي لتسليط الضوء على ثقافات الميكروبات والخلايا بانتظام صورة في النفايات السائلة مع مجهر مقلوب. ومؤتمتة للزراعة، وأخذ العينات، والتصوير، وتحليل الصور بشكل كامل بحيث يمكن قياس الاستجابات الحيوية إلى الإضاءة على مدى عدة أيام.

Cite this Article

Copy Citation

Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نظم علم البصريات الوراثي تستخدم البروتينات المشفرة وراثيا التي تغير التشكل ردا على موجات محددة من الضوء على تغيير العمليات الخلوية. هناك حاجة لزراعة وقياس الأنظمة التي تدمج برمجة الإضاءة والتحفيز من أنظمة علم البصريات الوراثي. نقدم بروتوكول لبناء واستخدام جهاز زراعة المستمر لتسليط الضوء على الخلايا الميكروبية بجرعات المبرمجة للضوء، وتلقائيا اكتساب وتحليل الصور من الخلايا في النفايات السائلة. تشغيل هذا الجهاز باعتباره ناظم كيميائي تسمح معدل النمو والبيئة الخلوية إلى أن رقابة مشددة. وأخذ عينات بانتظام النفايات السائلة للثقافة الخلية مستمرة ويتم تصوير الخلايا عن طريق قنوات متعددة المجهر. ومؤتمتة للزراعة، وأخذ العينات، والتصوير، وتحليل الصور بشكل كامل بحيث يتم قياس ردود ديناميكية في كثافة مضان والتشكل الخلوي للخلايا عينات من النفايات السائلة الثقافة على مدى عدة أيامدون تدخل من المستخدم. ونحن لشرح فائدة جهاز زراعة هذا عن طريق حفز إنتاج بروتين حيوي في سلالة من خميرة الخباز هندسيا مع نظام علم البصريات الوراثي الذي ينشط النسخ.

Introduction

نظم علم البصريات الوراثي استخدام ضوء للتحكم في قائمة متزايدة من العمليات الخلوية بما في ذلك التعبير الجيني، 5 توطين البروتين، والنشاط 6 البروتين، 8 بروتين ملزمة و 8 و 9 و 10 و تدهور البروتين. 11 طريقة لزراعة الخلايا في بيئة تسيطر عليها مع التحفيز الضوئي المبرمج ولقياس رد فعلهم على امتداد فترات زمنية ذات الصلة بيولوجيا ضروري لاستغلال إمكانات هذه الأدوات للبحث في بيولوجيا الخلية والتكنولوجيا الحيوية. يأخذ طريقة لدينا ميزة chemostasis للحفاظ على معدل نمو الخلايا مستمر في إعادة خلط جيدا، عبد اللطيفمصنفة، والتحكم في درجة حرارته عاء زجاجي زراعة 12 و 13 التي تتعرض للإضاءة مبرمجة. نحن صورة الخلايا الفردية في النفايات السائلة الثقافة مع مجهر مقلوب لقياس استجابة للثقافة لإضاءة مبرمجة. هي الآلية للزراعة، وأخذ العينات، والتصوير، وتحليل الصور بشكل كامل بحيث يمكن قياس كثافة مضان والتشكل الخلوي للخلية ثقافة النفايات السائلة خلال عدة أيام دون تدخل من المستخدم.

هذا البروتوكول يمكن تنفيذها في معظم المختبرات مألوفة مع زراعة الخلايا النمو والفحص المجهري، وجهاز يستخدم غير مكلفة ومصنوعة من مكونات متوفرة بسهولة. يتم وضع السفينة زراعة شفافة فوق مصفوفة من الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح) قادرة على انبعاث 1 مللي واط / سم 2 -10 ميغاواط / سم 2 للضوء. تزرع الميكروبات في السفينة زراعة باستمرار؛ يستخدم مضخة تحوي واحدة لإضافة وسائل الإعلام فيمعدل التخفيف، يتم استخدام آخر لسحب الثقافة بمعدل أقل لالمجهر، والفرق يهرب من خلال منفذ تجاوز. تحتفظ وسادة التدفئة في درجات الحرارة. يتم ضخ الهواء باستمرار في الإناء زراعة للحفاظ على الضغط إيجابية، وكذلك لخلط وتهوية الثقافة. باستثناء مضخة الهواء، وينظم السلطة لهذه الأجهزة من قبل متحكم الذي يتلقى أيضا المدخلات من الحرارة وجهاز كمبيوتر سطح المكتب المتصل. يتم ضخ ثقافة الخلية النفايات السائلة إلى جهاز ميكروفلويديك على مرحلة مجهر مقلوب. واستحوذت غير الفلورسنت والصور الفلورسنت تلقائيا. وتتميز الخلايا في الصور عن طريق خوارزمية التي يقع كل خلية كمنطقة ذات الاهتمام (ROI) ويقيس خصائص كل العائد على الاستثمار.

لإثبات وجود تطبيق هذا البروتوكول، ونحن قياس استجابة لتفاوت شدة الضوء من خلايا خميرة الخباز هندسيا مع responsi زرقاء ضوءلقد نظام علم البصريات الوراثي التي تسيطر على نسخ من البروتين الفلوري. البيرة س، المعروف باسم خميرة الخباز تم اختيار، لأن النظم علم البصريات الوراثي متعددة للتحكم في التعبير الجيني في هذا النظام موجودة بالفعل 14، 15، 16. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام هذا نموذج حي عادة للدراسات في نظم البيولوجيا 17 وكما هيكل لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية 18، 19، 20. تظهر لنا نتائج ممثل أن هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم للسيطرة النسخ ثقافة على مدى عدة أيام من خلال تغيير شدة الضوء المدخلات وقياس إنتاج مراسل الفلورسنت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

شكل 1

الشكل 1: جهاز زراعة المستمر. ويبين هذا الرسم التخطيطي مبسطة كيف يجب أن يتم تجميعها الجهاز عند استخدامه للثقافة، يضيء، وقياس الخصائص البصرية للميكروبات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: نظرة عامة على البروتوكول. يجب تكرار الخطوات الموجودة في المنطقة المظللة في كل مرة يتم استخدام البروتوكول. سيطرة حلقة مغلقة من الممكن 34، ولكن لم يتم تنفيذها في هذا البروتوكول.

1. تجميع ميزان الحرارة على حلبة المجلس

-page = "1"> الشكل (3)
الرقم 3: اتصالات لقراءة القيم الحرارة. يوضح هذا الرسم البياني كيف يجب أن تكون متصلا ميزان الحرارة الرقمي للثنائي الفينيل متعدد الكلور بحيث متحكم يمكن الحصول على ردود فعل للسيطرة على درجة حرارة الثقافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. لحام الأرضي، البيانات، وخطوط الجهد الإيجابية للميزان الحرارة الرقمي إلى كل منهم من خلال الثقوب التي تحمل العلامة "GD + V".
  2. مقطع من دبوس واحد من الإناث رأس 3-دبوس وتقليم دبابيس المتبقية 2 مع كليبرز الأسلاك، بحيث يمكن أن تندرج في اثنين من خلال الثقوب المسمى "R2" وليس عرقلة متحكم. لحام في هذا المكان. ربط اثنين من المسامير ملحوم عن طريق إدراج أوم المقاوم 4.7 في رأس دبوس.

2. قم بتوصيل كون السلطةمكونات المحول المتعدد العادي لمجلس الدارة

الشكل (4)
الشكل 4: اتصالات للسيطرة على السلطة للسادة التدفئة. يوضح هذا الرسم البياني كيف يجب أن يتم تجميعها ثنائي الفينيل متعدد الكلور والملحقات من أجل السيطرة على السلطة للسادة التدفئة. الأجزاء للسيطرة ترتبط مضخات تحوي بطريقة مماثلة. لاحظ أن مكونات ميزان الحرارة قد أزيلت عن الوضوح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تقليم قبالة 1 سم من دبابيس من خمسة رؤوس 3-دبوس الإناث. لحام هذه لمواقف على لوحة الدوائر المطبوعة (PCB) وضع علامة "# 1"، "رقم 2"، "رقم 3"، "رقم 4"، و "سي بي إي"
  2. تقليم قبالة 1 سم من دبابيس من الإناث 6 دبوس و 8 رأس دبوس. لحام هذه جنبا إلى جنب لعمود من خلال الثقوب وصفت K1 من خلال K14.
  3. ربط لوحة التدفئة لوحات الدوائر الالكترونية.
    1. إدراج نهايات المقاوم أوم 100 في K1 من خلال الثقوب وصفت وK2 على الكلور. اضافة الى وجود الترانزستور معدن أكسيد أشباه الموصلات مجال التأثير (MOSFET) في موقف ملحوظ رقم 1 على ثنائي الفينيل متعدد الكلور، مع تسمية MOSFET التوجه نحو K1 من خلال K14 من خلال الثقوب بحيث دبوس المصدر هو الأقرب إلى "# "التسمية، ودبوس هجرة هو أبعد من" التسمية # ".
    2. قطع الخط الأرضي من (DC) كابل التيار الكهربائي 5 فولت التيار المباشر وذلك لربط J2. ربط خط الأرضي من سادة التدفئة إلى J1. ربط K3 دبوس إلى 3 مع أوم المقاوم 1. يجب أن تتدفق الحالية الآن فقط من J1 إلى J2 عند تعيين دبوس 3 إلى + 5V.z
      ملاحظة: المقاوم / MOSFET مجموعة يعمل بمثابة المفتاح الذي يسمح لتدفق الحالية من J1 دبوس إلى J2 عند تعيين دبوس 3 من متحكم إلى +5 V.
  4. الاتصالمضخة تحوي بطيئة.
    1. إدراج نهايات المقاوم أوم 100 في K4 من خلال الثقوب وصفت وK5 على الكلور. إدراج MOSFET في موقف ملحوظ رقم 2 على ثنائي الفينيل متعدد الكلور، مع تسمية MOSFET التوجه نحو K1 من خلال K14 من خلال الثقوب بحيث دبوس المصدر هو الأقرب إلى التسمية "#"، ودبوس هجرة هو أبعد من "#" ضع الكلمة المناسبة.
    2. قطع الخط الأرضي من العاصمة كابل التيار الكهربائي 12 فولت مضخة تحوي بطيئة. توصيل مضخة تحوي تواجه حد لJ3 وثؤلول جدار تواجه حد لJ4. ربط K6 يعلقون 4 مع أوم المقاوم 1. يجب أن تتدفق الحالية الآن فقط من J3 إلى J4 عند تعيين دبوس 4-5 V.
  5. توصيل مضخة تحوي سريعة
    1. إدراج نهايات المقاوم أوم 100 في K7 من خلال الثقوب وصفت وK9 على الكلور. إدراج MOSFET في موقف ملحوظ رقم 3 على ثنائي الفينيل متعدد الكلور، مع تسمية MOSFET التوجه نحو K1 من خلال K14 من خلال ثقوب الصورة س أن دبوس المصدر هو الأقرب إلى التسمية "#"، ودبوس هجرة هو أبعد من علامة "#".
    2. قطع الخط الأرضي من العاصمة كابل التيار الكهربائي 12 فولت مضخة تحوي سريعة. توصيل مضخة تحوي تواجه حد لJ5 وثؤلول جدار تواجه حد لJ6. ربط K9 يعلقون 5 مع أوم المقاوم 1. يجب أن تتدفق الحالية الآن فقط من J5 إلى J6 عند تعيين دبوس 5-5 V.

3. ربط مصفوفة LED إلى حلبة المجلس

الرقم 5
الرقم 5: اتصالات للسيطرة على الصمام مصفوفة. يوضح هذا الرسم البياني كيف يجب أن تكون متصلا الصمام مصفوفة لثنائي الفينيل متعدد الكلور. كما تبين أن الكلور يمكن أن تكون مكدسة على متحكم. لاحظ أن مكونات ميزان الحرارة والتحكم في التيار المستمر إلى الأجهزة الأخرى قد أزيلت عن الوضوح.وفاق / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. لحام 6 دبوس، 10-دبوس، واثنين من 8 دبوس رؤوس دبوس الإناث في الثقوب من خلال على الجانبين من الكلور بحيث يمكن أن تكون مكدسة على رأس متحكم.
  2. لحام 100 طراز NF والمكثفات μF 10 إلى مواقف ملحوظ على ثنائي الفينيل متعدد الكلور، مشيرا إلى أن السالب لل10 μF مكثف (الرصاص أقصر) يجب أن تكون متصلا من خلال حفرة ملحوظ مع علامة سلبية.
  3. لحام سائق الصمام إلى 2 من 12 مجموعة من خلال الثقوب، مع المسافة البادئة على السائق بعيدا عن طريق ثقوب محفوظة لالصمام مصفوفة.
  4. لحام 2 الأعمدة رؤوس دبوس الذكور إلى الثقوب من خلال وضع علامات لالصمام مصفوفة، وتقليم ينتهي من هذه تحت اللوح بحيث أنها لن تعرقل متحكم. ربط هذه إلى قطعتين 8-سلك من الأسلاك الطائر أنثى / أنثى. ربط مجموعة ثانية من الذكوررؤوس دبوس على الطرف الآخر من الأسلاك الطائر.
  5. إدراج الصمام مصفوفة على مدى متوسط ​​من اللوح، ومن ثم إدراج مجموعة ثانية من رؤوس دبوس إلى الأعمدة على جانبي المصفوفة. تأكد من أن التوصيلات الكهربائية هي نفسها كما لو كان الصمام مصفوفة قد ترتبط مباشرة إلى PCB مع الجانب المسمى المصفوفة الموافق العمود المسمى من خلال الثقوب.
  6. مقطع من دبوس واحد من الإناث رأس 3-دبوس وتقليم دبابيس المتبقية 2 مع كليبرز الأسلاك، بحيث يمكن أن تندرج في اثنين من خلال الثقوب المسمى "R1" وليس عرقلة متحكم. جندى هذا. ربط اثنين من المسامير ملحوم عن طريق إدراج أوم المقاوم 1 في رأس دبوس.
    ملاحظة: سيتم مكدسة السفينة زراعة فوق الصمام مصفوفة. إذا شرائط سلك تعرقل السفينة، ويقابل لهم من المصفوفة. ثم، استخدم سلك نواة صلبة من أجل سد الفجوة بين دبابيس مصفوفة والمسامير الأسلاك الشريط، مثل أن التوصيلات الكهربائية لا CHانجى.

4. تثبيت البرامج والاتصال الأجهزة

  1. كومة من الكلور على متحكم.
  2. اتبع الروابط في قائمة المواد لتحميل بيئة التطوير المتكاملة (IDE) والتعليمات البرمجية المخصصة للمتحكم.
  3. ربط متحكم إلى الكمبيوتر المجهر عبر كابل AB الناقل التسلسلي العالمي (USB). تجميع وتحميل رمز مخصص لمتحكم.
  4. تحميل الصغرى مدير 21 و 22 و 23 في فيجي. تكوين الصغير مدير بمثابة المساعد فيجي عن طريق نسخ جميع ". DLL" الملفات، "mmplugins" الدليل، و "mmautofocus" الدليل من الدليل الذي تم تحميل الصغرى مدير في "Fiji.app" الدليل. أيضا، نسخ "الإضافات / مايكرو-مدير" الدليل في "Fiji.app/plugins" الدليل.
  5. تحميل "BioreactorController.jar" ملف كثافة العملياتس "Fiji.app/mmplugins" الدليل.
  6. فتح مايكرو-Manager من فيجي> ملحقات> الصغرى، مدير> الصغرى، مدير الاستوديو. استخدام معالج تكوين الأجهزة لتكوين برنامج لمراقبة المجهر. تشمل "FreeSerialPort" الجهاز في معالج مع التسمية من المنفذ الذي يتم توصيل كابل USB AB.

5. جعل وتميز ضميمة خفيفة مضادة للسفينة التثقيف

  1. كومة ثلاثة 8 دبوس مآخذ IC لبنات البناء على اللوح في كل ركن من أركان الصمام مصفوفة مثل أن السفينة زراعة يمكن أن يستريح عليها فوق المصفوفة.
  2. ربط جزء من ورقة نشرها تحت الطبقة العليا من مآخذ، بحيث ضوء ضرب السفينة زراعة من الصمام مصفوفة هو منتشر.
  3. قطع ثلاثة 8 "بنسبة 6" أجزاء من رغوة سوداء. قطع جزء هذا هو نفس حجم اللوح الالكتروني (2.3 "× 3.5") من داخل طوماس فيبس الأولس والجزء الذي هو حجم المستطيل الذي أحرزته مآخذ IC (0.9 "× 1.8") من داخل المركز الثالث. كومة هذه الطبقات على الصمام مصفوفة مثل أن الطبقة النهائية التي تحتوي على 0.9 "× 1.8" فتحة تكمن حتى مع الجزء العلوي من مآخذ IC، وتحيط الصمام مصفوفة.
  4. قطع ورقة إضافية من رغوة سوداء في نصف لجعل المستطيل 6 "24". لفة هذا في عمود أجوف من رغوة سوداء أن السفينة زراعة يمكن أن تندرج في غرفة مع الأنابيب والأسلاك، بحيث سوف حراريا وبصريا عزل السفينة زراعة.
  5. توسيط عمود أجوف من رغوة سوداء فوق الصمام مصفوفة، وترسيم الحدود من العمود على طبقة من رغوة سوداء تحتها. وهذه الحدود علامة حيث يجب أن تركز في المستقبل.
  6. قطع 3 "س 3" جزء من رغوة سوداء. استخدام هذا فيما بعد غطاء يمكن أن تكون مسجلة على الجزء العلوي من العمود لحجب الضوء الخارجي.
  7. ونعلق أجهزة الاستشعار السلطة الضوئي إلى th البريد زراعة غطاء السفينة مع الشريط، ونعلق الغطاء، وإدراج السفينة زراعة في العلبة.
  8. في الدقيقة مدير، انتقل إلى الإضافات> التحكم مفاعل حيوي. تعيين مصفوفة لإلقاء الضوء على مجموعة فرعية من مجموعة من شدة ممكنة في الصورة فترات 30.
  9. تسجيل شدة الضوء كما هو معروض على وحدة السلطة متر متصلا استشعار القوة. وهذه القياسات تمكين كثافة الفعلية للضوء أن تكون معروفة عندما تم تعيين عدد من المصابيح التي تضاء و(PWM) الحالي التضمين نبض عرض لتلك المصابيح.

6. إعداد سفينة التثقيف

الشكل (6)
الشكل 6: اتصالات سفينة. يوضح هذا الرسم البياني كيف يجب أن تكون متصلا السفينة وأنابيب من الجهاز قبل أن يتم تعقيمها.على بياض "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. علامة ذروة المقابلة لكل 2 مل زيادة السائل في حدود 10 مل إلى 30 مل في وعاء زراعة. إدراج 10 مل من الماء منزوع الأيونات معقمة، بمناسبة منسوب المياه، إضافة 2 مل، بمناسبة منسوب المياه، وتكرار حتى يتم وضع علامة على مستوى 30 مل. تغطية علامات مع الشريط واضحة بحيث لا تتم إزالتها بسهولة، والتخلص من السائل.
  2. ضع نهاية فترة طويلة من ميناء الألومنيوم من خلال طوقا سيليكون، في الإناء زراعة. المسمار على الغطاء.
  3. تغطية واحد منفذ ميناء القصير الألومنيوم مع 1/16 "أنابيب السيليكون الهوية. قم بتوصيل النهاية البعيدة عن طريق إدخال قفل LUER الإناث ومن ثم توصيل LUER الذكور المكونات القفل. هذا هو منفذ التكميلي، ولن تستخدم (أنبوب 6 في الشكل (6) ).
  4. ربط جزأين قصيرة من 1/16 "أنابيب السيليكون معرف مع الذكور والإناث أقفال LUER بتوصيل أحد طرفي منفذ ميناء القصير الألومنيوم وتوصيل distaل نهاية مع LUER الذكور والإناث LUER المكونات القفل. سيتم تلقيح السفينة من خلال هذا الأنبوب (أنبوب 7 / 7.1 في الشكل 6).
  5. توصيل جهازي 1/16 "أنابيب الهوية لنهايات 1/16" أنابيب تحوي الرقم والموصلات. قم بتوصيل أحد إلى منفذ الألومنيوم قصيرة والمكونات الأخرى (أنبوب 4 في الشكل 6). وفي وقت لاحق، هذا وسيتم ربط إلى القارورة وسائل الإعلام.

7. إعداد قارورة وسائل الإعلام

  1. توصيل "أنبوب قطره الداخلي (ID) سيليكون لأطول ميناء الألومنيوم. الأنبوب يجب أن تكون طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى قارورة سائل الإعلام. توصيل 1/8" 1/16 قفل LUER معرف الذكور إلى قطعة قصيرة من 1/16 " أنابيب الهوية، وربط هذه إلى أنبوب السابقة ،، ثم قم بإدراج هذا الجزء القصير في سدادة مطاطية على قارورة سائل الإعلام (أنبوب 3 في الشكل 6).
  2. المشبك أنبوب. هذا الصدد يسمح بتدفق الهواء من القارورة وسائل الإعلام إلى سفينة الثقافة. عندما يتم ضخ قارورة سائل الإعلام في وقت لاحق مع جو د هذا الأنبوب هو غير مثبت، وثقافة وسوف تكون مختلطة، تهوية، والاحتفاظ بها في ضغط إيجابي من قبل فقاعات واردة.
  3. إدراج "أنبوب معرف طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى قاع القارورة في سدادة، التي سيتم من خلالها نقل وسائل الإعلام. قم بتوصيل آخر 1/16" 1/16 أنبوب معرف لهذه واحدة، وبعد ذلك أنبوب 3/16 "معرف ل أن. هذه المكونات مع "معرف قفل LUER الإناث 3/16 وقابس قفل LUER الذكور (أنبوب 1 / 1.1 في الشكل 6).
  4. يجب ملء الحفرة الثالث في سدادة مع قطعة صغيرة من 1/16 "أنابيب الهوية، متصلة جزأين أخرى من الأنابيب بقطر المتوسط وتوصيله في النهاية البعيدة (أنبوب 2 / 2.1 في الشكل 6). وسيتم ربط هذه لمضخة الفراغ وفي وقت لاحق إلى مضخة ماء.
    ملاحظة: إذا كانت الأنابيب لا يمكن التوفيق بينها بسهولة من خلال الفتحات الموجودة في سدادة مطاطية، وقطع نهايات الأنابيب في الميل. ثم، في نهاية يميل التي دفعت من خلال ثقب يمكن أن تستخدم لسحب ما تبقى من خلال.

SS = "jove_title"> 8. إعداد مياه الصرف قارورة

  1. اضافة الى وجود قفل LUER الذكور في الشريحة من 1/16 "أنابيب السيليكون الهوية، ومن ثم إدراج بحزم 0.022" تترافلوروإيثيلين معرف (PTFE) أنابيب. بشكل منفصل، إرفاق قفل LUER الإناث إلى 1/16 "أنبوب الهوية. ثم، نهاية موضوع واحد على طول الأنبوب PTFE لربط الأقفال والآخر إلى منفذ الألومنيوم قصيرة (أنبوب 5 في الشكل 6).
  2. ربط يتعرض "أنبوب السيليكون معرف إلى 1/50" 1/50 أنبوب تحوي الرقم والموصلات. لهذا، ربط ثلاثة قطاعات من 1/50 "أنابيب الهوية وجزأين من 0.022" أنابيب PTFE الهوية، بالتناوب لهم. ربط هذا إلى قارورة مياه الصرف عبر 1/16 "أنابيب الهوية (أنبوب 5 في الشكل 6).
  3. ربط واحدة من نهاية أنبوب 1/16 "سيليكون معرف لثاني أطول أنبوب من ميناء الألومنيوم والطرف الآخر إلى قارورة مياه الصرف، وهذا أنبوب الألومنيوم يحدد حجم ثقافة، والثقافة الزائدة تجاوزات في وعاء النفايات السائلة (أنبوب 8 في
  4. الأوتوكلاف التجمع زراعة في 121 درجة مئوية و 15 رطل (التعقيم العام) لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: أنابيب من خلالها يتم تعبئة القارورة سائل الإعلام، والتي يتم من خلالها فراغ فضاء القارورة وسائل الإعلام، والتي يتم من خلالها تلقيح السفينة زراعة دينا شرائح متعددة من الأنابيب بحيث إذا ملوثة قطاع البعيدة، ويمكن إزالته لتكشف عن وجود عقيم قطعة.

9. إعداد قناة ميكروفلويديك

  1. مزيج ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) وكيل علاج في 9: 1 نسبة. ديغا وتصب على قالب السيليكون الرئيسي.
  2. علاج PDMS لمدة 2 ساعة عند 65 درجة مئوية ثم تنخفض من قناع بشفرة حلاقة. خفض حول PDMS حتى تطلق من القالب. تجنب دفع إلى أسفل وكسر رقاقة الهش.
  3. استخدام 1.2 ملم معرف حفرة خزعة الناخس لكمة ثقوب في كلا طرفي القناة.
  4. السندات البلازما PDMS إلى غطاء زجاجي 24.
  5. الشريط الطويل ينتهي من الزجاج غطاء للدعم هيكل من الألومنيوم بحيث قناة PDMS يتركز على هيكل من الألومنيوم، ثم يخبز PDMS مرة أخرى لمدة 2 ساعة عند 65 درجة مئوية.

10. ملء قارورة وسائل الإعلام

الرقم 7
الرقم 7: إضافة وسائل الإعلام. يوضح هذا الرسم البياني كيف وسائل الإعلام يجب أن يكون الفراغ التي تمت تصفيتها في قارورة وسائل الإعلام. ومن يضمن أن وسائل الإعلام لا تزال عقيمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. جعل وسائل الإعلام المناسبة. إذا كان سيتم تشغيلها على نظام زراعة المستمر باعتباره ناظم كيميائي، استخدام وسائل الإعلام تقتصر على المواد الغذائية المحددة.
    ملاحظة: أمثلة من تكوين وسائل الاعلام القياسية للدراسات مع البيرة س وقد نشرت سابقا 25،= "XREF"> 26، 27، 28، 29.
  2. نعلق مرشح فراغ زجاجة 100 مل، وإزالة الغطاء الحلمة، ثم إزالة المكونات الأبيض من الحلمة للمرشح الفراغ مع ملاقط معقمة.
  3. ربط أنبوب السيليكون 3/16 "معرف إلى الحلمة، أنبوب الحرة الأخرى قارورة سائل الإعلام إلى مضخة فراغ (أنابيب 1 و 2 في الشكل 7، على التوالي)، والتأكد من أن الأنبوب الذي يربط بين قارورة سائل الإعلام إلى السفينة زراعة يشد اغلاق (أنبوب 3 في الشكل 7).
  4. ملء فلتر مع وسائل الإعلام، بدوره على مضخة فراغ، ومن ثم تصفية بقية وسائل الإعلام. المشبك أنبوب السيليكون 1/16 "معرف متصلة الفراغ (أنبوب 2 في الشكل 7) وإيقاف مضخة فراغ.
  5. إزالة leurs من شريحة متوسطة من 1/16 "أنابيب معرف متصلة مضخة فراغ بحيث حدا غير ملوثة للأنبوب يمكن الوصول إليها. أدخل عشره نهاية الزرقاء العقيمة فلتر الهواء حقنة في هذا الأنبوب.
  6. المشبك أنابيب 3/16 "سيليكون معرف (أنبوب 1 في الشكل 7) وقطع بالتركيبة الذكور منه. افصل القابس من بالتركيبة الإناث من أنبوب مدخل وسائل الاعلام السفينة زراعة في بتوصيل هذه luers الذكور والإناث إلى تمكين وسائل الإعلام أن تكون ضخ السفينة زراعة.
  7. إزالة عامل التصفية فراغ ولحد مل زجاجة 100 من وسائل الإعلام التي كانت تعلق على فلتر فراغ.
  8. قبل يوم واحد سيتم تلقيح السفينة زراعة، تطعيم مستعمرة واحدة من الميكروب علم البصريات الوراثي في ​​أنبوب اختبار مع 4 مل من وسائل الإعلام التي تم جمعها في الخطوة السابقة، وتركها تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية أو أفضل درجة حرارة النمو في درجة الحرارة والثقافة في مع الإثارة.

11. تجميع جهاز حول مجهر

  1. تعيين التجمع زراعة المستمر بالقرب المجهر مع قارورة وسائل الإعلام أعلى من السفينة زراعة وeffluوالأنف والحنجرة قارورة أقل من السفينة زراعة، مثل أن أنبوب يتكون من شرائح 0.022 "أنابيب PTFE معرف (أنبوب 5 في الشكل 6) يمكن أن تصل إلى مرحلة المجهر. الشريط بشكل آمن أسفل سدادات المطاط على قارورة سائل الإعلام وحاويات النفايات السائلة.
  2. افصل طرفي "أنابيب PTFE معرف من 1/50" 0.022 أنبوب السيليكون معرف ربطها (أنبوب 5 في الشكل 6)، والمكونات هذه الغايات في مدخل ومخرج الجهاز ميكروفلويديك.
  3. قم بتوصيل الطرف البيضاء للفلتر الهواء المحقنة إلى مضخة ماء. وضغط الهواء دفع وسائل الاعلام الى السفينة زراعة.
  4. عندما يصل وسائل الإعلام على مستوى ميناء النفايات السائلة، والتفاف 1/16 "وسائل الاعلام معرف أنابيب مدخل والموصلات حول المضخة تحوي بطيئة (أنبوب 4 في الشكل 6) و1/50" معرف عينة منفذ الأنابيب والموصلات حول الصيام مضخة تحوي (أنبوب 5 في الشكل 6).
  5. تهوية وسائل الإعلام من قبل unclamping وتو الهواءما بين القارورة وسائل الإعلام وزراعة السفينة.
  6. الشريط لوحة التدفئة والحرارة إلى السفينة زراعة بحيث يمكن التحكم في درجة الحرارة. لفائف الأنابيب وسائل الإعلام حول السفينة زراعة حتى وسائل الإعلام الدخول سوف تكون على نفس درجة حرارة السفينة.
    ملاحظة: PWM الحالية إلى لوحة التدفئة ينظمها متحكم الذي يستخدم المدخلات من الحرارة للحفاظ على سفينة زراعة في درجة الحرارة المضبوطة مسبقا لها.
  7. إدراج السفينة زراعة في الضميمة رغوة سوداء فوق الصمام مصفوفة، والتأكد من أن الأنابيب لا مقروص.
  8. في الدقيقة مدير، انتقل إلى الإضافات> التحكم مفاعل حيوي. تعيين "نسبة الإعلام مضخة في" حقل إلى 0.1 و"نسبة مضخة عينة على" حقل إلى 0. ومعدل التدفق تكون منخفضة جدا، ولكن أكبر من معدل التبخر.
  9. المشبك أنبوب الهواء واردة بين القارورة وسائل الإعلام وزراعة السفينة. إزالة القابس من أنبوب التلقيح (أنبوب 7 في الشكل
  10. تغطية العلبة بحيث يدخل أي ضوء، والسماح للثقافة تنمو بين عشية وضحاها.

12. معايرة ومعدلات الضخ

  1. في الدقيقة مدير، انتقل إلى الإضافات> التحكم مفاعل حيوي. تعيين "نسبة ضخ وسائل الإعلام على" حقل إلى 0.5 و"نسبة مضخة عينة على" حقل إلى 0.
  2. قطع أنبوب الفائض من القارورة النفايات السائلة (أنبوب 8 في الشكل 6) وأنبوب أخذ العينات من القارورة النفايات السائلة (أنبوب 8 في الشكل 6) وجمع النفايات السائلة في الأوعية منفصلة. جمع النفايات السائلة لمدة 1 ساعة، ابتداء من بعد كانت مضخات لمدة 15 دقيقة.
  3. حساب معدل تدفق وسائل الاعلام في الإناء زراعة من حجم جمعها في وعاء على النحو التالي:
  4. ضبط قيمة "نسبة ضخ وسائل الإعلام حول" الميدانية التي قام بها هذا التقدير الخطي:
    Equaiton 2
    أين
    Equaiton 3
  5. تكرار خلال هذا الإجراء المعايرة حتى الفرق بين معدل التدفق المطلوب ومعدل التدفق قياسه هو <0.2 مل / ساعة، حيث بلغ متوسط ​​معدل التدفق خلال الفترة من 1 ساعة.
  6. زيادة قيمة "نسبة العينة على" حقل ومعايرة بطريقة مماثلة حتى يتم ضخ ما يقرب من 4/5 عشر من حجم مغادرة السفينة زراعة بها مضخة أخذ العينات وتقريبا 1/5 عشر من حجم يترك من خلال ميناء تجاوز.
  7. السماح للكثافة الثقافة في جهاز زراعة المستمر يوازن في ظل هذه الظروف بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: إذا لم يمكن الوصول إلى معدلات تدفق الهدف، وتغيرأنابيب مضخة تحوي. ويتم ضخ السائل بمعدل أعلى عند استخدام أكبر أنابيب قطرها. اتبع الخطوة 14 ثم العودة إلى الخطوة 8.4.

13. مجهر صور اجمع من الميكروبات مثقف

  1. ملء قائمة الوظيفة المرحلة في الدقيقة Manager مع مجموعة من المواقف غير متداخلة في الصور التي الخلايا ضخها في قناة ميكروفلويديك سيكون في المستوى البؤري.
  2. فتح "مفاعل حيوي وحدة تحكم" البرنامج المساعد. تحديد المطلوب بالطبع الصمام مرة المصفوفة، قنوات التصوير، وإعدادات تجريبية أخرى من المطالبات. جمع وتحليل الصور.
  3. أثناء تشغيل التجربة، تأكد من أن وسائل الإعلام في قارورة وسائل الإعلام لا يزال واضحا. إذا كان غائما، ثم تم ملوثة.

14. بعد التجربة

  1. التخلص من وسائل الإعلام، والثقافة الخلايا الزائدة والنفايات السائلة.
  2. إعادة ملء قارورة وسائل الاعلام مع 200 مل من 20٪ ETOH مختلطة مع الماء منزوع الأيونات. تشغيل ناظم كيميائي كما كان في السابقتم تشغيل خلال التجربة لتغسل الحطام الخلية وسائل الإعلام.
  3. عندما حل الكحول استنزفت من القارورة وسائل الإعلام، تفكيك ناظم كيميائي تماما.
  4. غسل الأواني الزجاجية والأنابيب بالماء الدافئ والمنظفات معتدل، وشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات. تترك لتجف.
  5. فتح ملف "microcontrollerRecords.csv" لإعادة النظر في درجة الحرارة وحالة الصمام مصفوفة على مسار التجربة، وملف "Summary.csv" لاستعراض بيانات موجزة من كل مجموعة من الصور و"النتائج <ن> بتنسيق csv" ملفات لمراجعة البيانات التي تلخص كل العائد على الاستثمار من كل فترة زمنية، حيث n هو ن مجموعة البيانات عشر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدم هذا الجهاز لتحفيز ثقافة البيرة س التعبير عن بروتين فلوري أصفر (YFP) ردا على الأزرق الضوء عبر نظام النسخ علم البصريات الوراثي محرض على أساس البروتين زوج CRY2 / CIB1 30. وقد نمت الخلايا chemostatically في وسائل الإعلام محدودة الفوسفات بمتوسط ​​معدل التخفيف من 0.2 ± 0.008. يستخدم الحد الفوسفات عادة في S. تجارب ناظم كيميائي الخباز للسيطرة على معدل النمو وآثار الحد الفوسفات وتتميز أيضا. 31، 32، 33 النفايات السائلة الناتجة من السفينة زراعة تضعف باستمرار، وأخذت عينات لجهاز ميكروفلويديك على مجهر مقلوب. وقد تم تحليل الصور تلقائيا كما هو مبين في الشكل (8). وقد تم تحديد الخلايا الفردية في الصور على النقيض من المرحلة، طرح الخلفية وconcentra YFP بهموقدرت نشوئها من مضان التي تقاس من الصور الفلورسنت طرح الخلفية.

تم تحليل مضان من 169677 الخلايا من 33600 صور من النفايات السائلة تم الحصول عليها من 28 موقعا في الجهاز ميكروفلويديك خلال 70 ساعة من التجربة. كنا مجهر مقلوب مجهزة بنظام مضان إضاءة وكاميرا CMOS. تم الحصول على الصور YFP مع 500/20 نانومتر الإثارة مرشح، مرشح 535/30 نانومتر الانبعاثات، ومزدوج اللون T515lp. وقد أخذت صور مع الهدف النقيض 40X المرحلة، تحت كولر الإضاءة. وسجلت الصور في عمق ألوان 16 بت مع 87 بكسل في ميكرومتر المربعة. تعرضت الثقافة لشدة الضوء الأزرق متفاوتة لمدة 6 فترات ساعة، يليه ظلام دامس لمدة 6 فترات ح. تعرضت الثقافة للضوء قبل القياس الأول، وهذا هو السبب كثافة مضان لها آخذ في التناقص خلال الفترة المظلمة الأولى. </ P>

ويبين الشكل 9 مضان بسبب الإنتاج YFP على تفعيل نظام علم البصريات الوراثي ردا على إلقاء الضوء على سفينة زراعة. ومما يدل على فائدة من القياسات خلية واحدة من مضان على السكان قياسات متوسط-وحيدة الخلية تكشف عن توزيع السكان من كثافة مضان. لاحظ النموذجية في 42 ح 26 دقيقة. وبعد استعراض الصور المقابلة، كان من الواضح أن هناك كتل من الخلايا في معظم الصور المستخدمة لتوليد صورة مركبة من الخلفية، مما أدى إلى الأعمال الفنية التي تشبه الخلايا في صورة طرح الخلفية. أيضا، تم ضخ فقاعة من السفينة زراعة لقناة ميكروفلويديك وكانت أجزاء من أطرافها مخطئون الخلايا عن طريق خوارزمية تحليل الصور. منذ لا فقاعة ولا القطع الأثرية من طرح خلفية يتفق مع خلايا الفعلية، إلا أن كثافة مضان قياسأقل من السيارات ومضان من الخلايا. يوضح هذا الرقم نوعية البيانات التي يمكن الحصول عليها تلقائيا أكثر من 3 د. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8: تصوير المرئي للخوارزمية تحليل الصور. تم اقتصاص هذه الصور وتوسيعها لسهولة المشاهدة. يتم الحصول على (A) ست صور لتوليد صورة المرحلة النقيض من طرح خلفية ثقافة الخلية. بعد حصلت على الصورة الرئيسية، يتم الحصول على خمس صور إضافية مع مضخة مياه الصرف أخذ العينات تحولت لفترة وجيزة في ما بين كل اكتساب لضمان النازحين الخلايا. يتم إنشاء صورة مركبة للخلفية من الصور المكونة الخمسة. قيمة كل بكسلفي خلفية الصورة هو متوسط ​​قيمة من نفس بكسل عبر 5 صور المكون. (ب) ثم يتم تحويل صورة تطرح الخلفية إلى ثنائي. ثم يتم المتوسعة ثنائي وتمتلئ الثقوب داخل أقسام المستمرة للثنائي. الخطوط الصفراء تتوافق مع مناطق مختارة من الفائدة (ROI)، على أساس الحجم ودائرية المعايير. يتم تعيين (C) تلك دوروا على الصورة الفلورية، حيث يتم قياس مضان من كل خلية كقيمة من ألمع بكسل في العائد على الاستثمار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
الرقم 9: توزيع السكان من شدة مضان مع مرور الوقت. في هذه subfigures لوغاريتم فلور قياسيتم عرض escence بعد ممارسة معتادة في التدفق الخلوي. الخط في ألف وباء يدل على شدة الضوء يمتص أو diffracted من الثقافة، والذي يقاس بالفرق في كثافة بين الضوء ينتقل عن طريق وسائل الإعلام معقمة والضوء ينتقل عن طريق زراعة الخلايا في السفينة زراعة. يتم رسم ضد محور تنسيق الثاني. (A) مربع ومؤامرة الطولي (المئين 5 عشر، المئوي ال 25، متوسط، 75 المئين الخامس، 95 المئين الخامس) من لوغاريتم مضان يقاس من السكان مع مرور الوقت. (ب) والرسم البياني 2 الأبعاد من نفس البيانات، حيث يقابل اللون على وتيرة تطبيع الخلايا مع مضان قياس في نطاق بن المقابلة. تم تحجيم الألوان لمجموعة من البيانات دون النموذجية في 42 ساعة شملت 26 دقيقة. وتيرة تطبيع للناشز في أدنى بن مضانهو 0.7. (C) واحدة رسوم بيانية ثلاثية الأبعاد للوغاريتم مضان يقاس من السكان قبل التعرض أول تسجيل للضوء وبعد أعظم من التعرض للضوء. فإنه يدل على أن التعبير التي يسببها خفيفة من YFP في هذه السلالة ذات النسقين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد قمنا بتصميم هذا الجهاز مع المرونة في الاعتبار. جميع الرموز المستخدمة مجاني ومفتوح المصدر. عملية تحليل الصورة الافتراضية إلى خلايا جزء بسيط ويعمل بسرعة. يمكن تنفيذ تحليل مخصصة عن طريق تسجيل مدخلات المستخدم أثناء تحليل صورة تمثيلية مع واجهة المستخدم الرسومية في فيجي، وتحويل المدخلات إلى برنامج نصي بيانشيل، ثم تعيين المساعد لاستدعاء النصي. عندما يطلق عليه، سيتم إرسال هذا السيناريو مجموعة سلسلة تسمى "الصور" التي تحتوي على مسارات الملفات لأحدث مجموعة من الصور، طرح الخلفية. يتم حفظ الصور والبيانات وجمعها بحيث لا تضيع إذا تجربة تنتهي فجأة. وقد تم اختيار مجموعة LED زرقاء لإحداث نظام علم البصريات الوراثي لدينا ولكن يمكن استبدالها مع المصابيح من ألوان مختلفة. هناك المدخلات والمخرجات دبابيس الإضافية المتاحة على متحكم وكذلك من خلال حفرة لتبديل MOSFET إضافية والتبديل التتابع على ثنائي الفينيل متعدد الكلور التي تجعل من السهللهذا النظام أن تتكيف لمزيد من أغراض المعقدة. على سبيل المثال، لجعل هذا الجهاز يعمل على أن يكون turbidostat، استخدام المسامير إضافية على متحكم إلى السلطة الصمام وقراءة القيم من أجهزة الاستشعار خفيفة مربوطة إلى السفينة زراعة، ثم قم بتعديل البرنامج لقياس العكارة وتخفيف السفينة وفقا لذلك .

يجب توخي الحذر لضمان أن الثقافة ليست ملوثة، لحماية المعدات المجهر الحساسة، وضمان أن معدلات تدفق السوائل متناسقة. التلوث قبل عندما يتم تلقيح السفينة زراعة عمدا يمكن الكشف عن طريق الانتظار بضعة أيام قبل بتلقيح السفينة والتأكد من عدم وجود نمو في الداخل. لتجنب إراقة زراعة الخلايا على الهدف المجهر، والتحقق من أن الجهاز ميكروفلويديك لن تسرب من أول زراعة الخلايا الضخ عبره أكثر من قطعة قماش ماصة. إذا كان تدفق وسائل الاعلام في الإناء زراعة غير متناسقة، فإنه عادة ما يكون بسبب أنبوب حولأصبح بكرات من المضخة تحوي فضفاضة جدا. إذا كان تدفق الهواء من مضخة ماء غير متناسقة، تضمن أنه لا توجد الانحناءات على شكل U في أنبوب مياه الصرف الصحي حيث يمكن تجميع السائل ومقاومة غير متسق تدفق الهواء. إذا يصبح الأنابيب المسدودة بعد تجربة لأن وسائل الإعلام قد جفت داخل منه، ونقع الأنابيب المسدودة في حمام الماء الساخن لإذابة تسد.

هناك قيود جوهرية على هذا البروتوكول في الاعتبار عند التخطيط تجربة أو تحليل النتائج. اعتمادا على معدل تخفيف وطول أنبوب المستخدمة، هناك تأخير لحوالي 10 دقيقة يتم خلالها ضخ ثقافة خلية من السفينة زراعة المجهر. ولذلك، فإنه ليس من مناسبة تماما لدراسة الأحداث التي تحدث على فترات زمنية أقصر. أيضا، في حين أن التجربة يمكن تشغيل مستمر لمدة عشرة أيام، وقلة فقط من حجم وسائل الإعلام، يجب النظر في تطور ثقافة الخلية مثل مدة الزيادات التجربة. في حدها الاقصىتينغ المواد الغذائية من وسائل الإعلام لها تأثيرات عميقة على عملية التمثيل الغذائي والتعبير الجيني 35، 36، 37، 38، 39، وبالتالي يجب أن يتم تحديدها على أساس الجانب من علم وظائف الأعضاء قيد الدراسة. عند تحليل النتائج، ينبغي أن نقاط إعادة النظر في الصور وخاصة صور من البيانات البعيدة عن أخطاء في الطريقة التي رويس تم تحديدها من قبل روتين تحليل الصور. فمن الممكن للفقاعات أو الاعمال الفنية ليكون مخطئا لخلايا، وبالتالي انحراف مضان قياس. واحد طريقة بسيطة للقضاء على هذه القياسات الخاطئة هي تجاهل كل رويس مع كثافة مضان تحت كثافة السيارات ومضان.

وهذا البروتوكول أن تكون مفيدة لقياس كثافة مضان و / أو التشكل الخلوي للخلية ثقافة النفايات السائلة في استجابة للضوء في الكائنات الحية التي يمكن أن تنمو في الثقافة مستمرة، وتعيينTLE إلى مستوى التنسيق متناسقة عند لم يحرك ساكنا، ويتم تحديدها تلقائيا بواسطة خوارزمية تحليل الصور. فإن خوارزمية تحديد خلية الافتراضية المستخدمة هنا يكون الأكثر قابلة للتطبيق مباشرة للميكروبات كروية تقريبا، وتماثل في مهدها الخميرة. بديل واحد 40 لهذا البروتوكول هو نمو الميكروبات في مجموعة من الثقافات دفعة، ثم أخذ عينات دفعة واحدة لكل نقطة زمنية وتوصيف العينة التدفق الخلوي. ومع ذلك، ومزايا بروتوكول الموصوفة هنا هي التي تؤخذ من نفس الثقافة العينات، العديد من العينات التي يمكن اتخاذها، والتشغيل الآلي للعملية. يحسن هذا البروتوكول أيضا على طريقة مشابهة الذي الخميرة علم البصريات الوراثي كانت تربيتها بشكل مستمر وتصويرها تحت المجهر 34 من خلال الحصول على صور متعددة بسرعة ولا يتحامل تحديد رويس من قبل مضان. وهناك ميزة كبيرة من هذا البروتوكول هو أن العديد من القياسات من الخلايا الفردية يمكن الحصول عليها بانتظام على مدى عدة أيام withoالتحرير إدخال المستخدم. بعد قياس استجابة للثقافة الجرثومية إلى التعرض للضوء، قد يكون الخطوة التالية لتنفيذ في سيليكون حلقة مغلقة سيطرة الاستجابة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

ونود أن نعترف مولي لازار وفيرونيكا دلغادو للمساعدة في اختبار البروتوكول، كيران سويني لإجراء مناقشات مفيدة والتحرير، وتايلور سكوت يا أحد، adirekkun، وستيفاني جيلر لقراءة نقدية للمخطوطة. ميغان نيكول ماكلين، دكتوراه حاصل على جائزة شهادة في واجهة العلم من صندوق ويلكوم بوروز.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72
For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10, (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58, (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20, (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134, (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11, (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24, (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11, (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27, (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52, (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20, (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112, (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10, (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189, (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14, (1), 144 (2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22, (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90, (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1, (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14, (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104, (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322, (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41, (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23, (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22, (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6, (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19, (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21, (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10, (1), 104 (2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4, (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11, (4), 449-455 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats