设计和自动照明,培养和取样系统实现微生物光遗传学的应用

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison
Bioengineering

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Summary

我们设计用于光遗传学系统一起使用,照亮微生物的培养,并定期图像细胞出水倒置显微镜连续培养装置。培养,取样,成像和图像分析完全自动化,使得光照动态响应可以在几天进行测量。

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Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

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Abstract

光遗传学系统利用改变构响应于特定波长的光,以改变细胞过程遗传编码的蛋白质。有需要用于培养和测量对于包含编程光遗传学系统的照明和刺激系统。我们提出了构建和使用连续培养装置照亮的微生物细胞与编程的剂量的光,并自动采集和分析流出物中的细胞的图像的协议。该装置作为一个恒化器的操作允许的生长速率和细胞的环境中进行严格控制。连续细胞培养物的流出物定期采样,将细胞由多通道显微镜成像。培养,取样,成像和图像分析完全自动化,使得在荧光强度和从培养流出物取样细胞的细胞形态的动态响应多天测量无需用户输入。我们通过动态诱导蛋白生产中与激活转录的光遗传学系统设计的酿酒酵母的菌株证明这种培养装置的效用。

Introduction

光遗传学系统使用光来控制细胞过程,包括基因表达,1,2,3,4,5蛋白质定位,6蛋白活性,6,7,8蛋白结合,8,9,10和蛋白质降解的一个增长的名单。 11,用于在与编程光学刺激受控环境中培养的细胞,并用于测量其响应在生物学相关的时间尺度的方法,有必要利用这些工具的潜力在细胞生物学和生物技术研究。我们的方法利用chemostasis的优势,在充分混合以保持恒定的细胞生长速率,AE额定,并且暴露于编程照度温度控制玻璃培养容器12,13。在倒置显微镜培养流出我们图像单个细胞来测量培养的以编程照明的响应。培养,取样,成像和图像分析完全自动化,使得荧光强度和流出物细胞培养物的细胞形态可以在多天进行测量,而无需用户输入。

这种协议可以在熟悉生长的细胞培养和显微镜检查大多数实验室来实现,并且所使用的装置是廉价且随时提供的组件。透明培养容器被放置的发光二极管(LED)能够发光的1μW/ cm 2的-10毫瓦/厘米2的矩阵的上方。微生物生长在连续培养容器; 1蠕动泵用于在添加媒体稀释率,另一个用于在较小速度到显微镜撤回培养,差值逸出通过溢流出口。一个加热垫维持温度。空气连续地泵入培养容器保持正压以及混合和通气培养。除了空气泵,功率到这些设备是由还接收来自温度计和连接台式计算机输入微控制器调节。流出物细胞培养物被泵送到微流体装置上的倒置显微镜的阶段。非荧光和荧光图像自动获得的。在影像中的细胞是由位于每个小区作为感兴趣区域(ROI)的区域,并测量每个ROI的属性的算法表征。

为了证明该协议的应用,我们测量了蓝光responsi工程酵母细胞的不同光强的响应已经控制荧光蛋白的转录光遗传学系统。 酿酒酵母 ,俗称面包酵母,被选中是因为在这一系统中控制基因表达的多个光遗传学系统已经存在14,15,16。此外,该模型生物体通常在系统生物学17和作为用于生物技术应用18,19,20中的底盘用于研究。我们的代表性的结果表明,该协议可以用于通过改变输入光强度和测量的生产荧光报道的以控制培养多天的转录。

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Protocol

图1

图1:连续培养装置。这简化框图显示了如何,当它被用来培养,照亮该装置应进行组装,并测量微生物的光学性质。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:该协议的综述。在阴影区域中的步骤必须重复每次使用的协议的时间。闭环控制是可能的34,但并不在此协议来实现。

1.组装温度计到电路板


图3:连接到读取温度计的数值。此图显示了数字温度计应如何连接到PCB,使得微控制器可以得到反馈来控制培养物的温度。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 焊接接地,数据和数字温度计的正电压线到其各自的通孔标记“GD + V”。
  2. 从女性3针接头剪掉一个引脚和修剪剩下的2个引脚与断线钳,使得它可以放入标有“R2”两个通孔,而不是阻碍微控制器。到位焊锡这一点。通过插入针头一个4.7kΩ电阻连接两个焊接引脚。

2.连接电源刀豆控制组件电路板

图4
图4:连接到控制电源加热垫。该图显示了印刷电路板和附属部件应以控制电源到加热垫进行组装。的部件,以控制蠕动泵被连接在一个类似的方式。注意,对于温度计的组件已经为了清楚而移除。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 从五女3针接头插针剪掉1厘米。焊接这些在印刷电路板(PCB)标记为“#1”,“#2”,“#3”,“#4的位置”和“CB E”
  2. 从女性的6针和8针接头的针剪掉1厘米。并排焊接这些副作用贯通孔的列通过K14标记K1。
  3. 加热垫连接到电路板上。
    1. 插入一个100kΩ的电阻器的端部在PCB上的通孔标记的K1和K2。插入一个金属氧化物半导体场效应晶体管(MOSFET)到位置PCB上标记#1,朝向K1朝向MOSFET的标签通过K14贯通孔,以使源销最接近“# “的标签,以及漏针最远的是从”#“的标签。
    2. 切5 V直流(DC)电源线的接地线,并将其连接到J2。连接加热垫到J1的接地线。连接K3与1kΩ电阻引脚3。电流现在应该只从J1流到J2当销3被设定为+ 5V.z
      注:电阻/ MOSFET集用作开关,允许电流时,微控制器的引脚3被设定为+5 V从销J1流到J2
  4. 缓慢蠕动泵。
    1. 插入一个100kΩ的电阻器的端部在PCB上的通孔标记K4和K5。插入的MOSFET到位置PCB上标记#2,朝向K1朝向MOSFET的标签通过K14贯通孔,以使源销最接近“#”的标签,和所述漏极销是从最远“#“ 标签。
    2. 切缓慢蠕动泵的12 V直流电源线的接地线。面向连接结束J3和面临结束J4墙疣蠕动泵。 K6连接引脚4与1kΩ电阻。电流现在应该只从J3流到J4时销4被设定为+ 5V。
  5. 连接快速蠕动泵
    1. 插入一个100kΩ的电阻器的端部在PCB上的通孔标记K7和K9。插入的MOSFET到位置通过K14贯通孔S中的PCB上标记#3,朝向K1朝向MOSFET的标签 Ø源引脚是最接近“#”标签,并在漏针最远的是从“#”的标签。
    2. 切快速蠕动泵的12 V直流电源线的接地线。面向连接端J5和面临结束J6墙疣蠕动泵。 K9连接引脚5与1kΩ电阻。电流现在应该只从J5流动到J6当销5被设定为+ 5V。

3. LED矩阵连接到电路板

图5
图5:连接到控制LED矩阵。此图显示了LED矩阵应如何连接到PCB。它还表明,在PCB可以在微控制器进行堆叠。注意,对温度计和用于控制DC电力到其他设备的部件已经为了清楚而移除。ES / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

  1. 焊接6针,10针,并且两个8针母针头插入印刷电路板的两侧,使得它可以在微控制器的顶部堆叠通孔。
  2. 焊接为100 nF和10μF电容到PCB上的标记位置,并指出的10μF的电容(更短的交货),负极应连接到标有一个负号通孔。
  3. 远离焊接LED驱动器2由12组的通孔,与对驾驶员的凹痕的通孔用于LED矩阵保留。
  4. 焊接插针头2列标记为LED矩阵的通孔,并修剪这些末端的线路板,使它们不会阻碍微控制器的下方。连接这些女/女跳线的两个8线带。连接另一组男销头以跨接线的另一端。
  5. 将在线路板的中位数LED矩阵,然后插入第二组排针到列的矩阵的两侧。确保电连接是相同的,如果LED矩阵被直接连接到PCB与基质的相对应的通孔标记的列中的标记的边。
  6. 从女性3针接头剪掉一个引脚和修剪剩下的2个引脚与断线钳,使得它可以放入标有“R1”的两个通孔,而不是阻碍微控制器。焊锡这一点。通过插入针头1kΩ电阻连接两个焊接引脚。
    注意:培养容器将被堆叠在LED矩阵。如果导线色带阻塞该容器中,抵消它们从基质。然后,使用实芯焊丝弥合矩阵销和电线色带销,使得电连接不ch个之间的间隙安格。

4.安装软件和连接硬件

  1. 堆栈的微控制器的PCB。
  2. 按照在物料清单中的链接下载集成开发环境(IDE)和自定义代码的微控制器。
  3. 通过AB通用串行总线(USB)电缆连接微控制器显微镜电脑。编译并上传自定义代码,以微控制器。
  4. 下载微型经理21,22和斐济23。配置微Manager作为通过复制所有的“.DLL”文件,“mmplugins”目录斐济插件,并从那里微观管理器中下载到“Fiji.app”目录的目录中的“mmautofocus”目录。此外,复制“插件/微管理”目录进入“Fiji.app/plugins”目录。
  5. 下载“BioreactorController.jar”文件INT澳“Fiji.app/mmplugins”目录。
  6. 打开微经理从斐济>插件>微型经理>微经理工作室。使用的硬件配置向导来配置软件来控制显微镜。包括向导一起其中AB USB电缆连接的端口的标签“FreeSerialPort”设备。

5.与表征光型外壳的培养用容器

  1. 在LED矩阵,使得培养容器可以在他们休息的矩阵上面的每个角落堆栈中的线路板三个8脚IC插座作为构建块。
  2. 插座的顶层下紧固扩散纸的一部分上,使得来自LED矩阵撞击培养容器中的光漫射。
  3. “6”黑色泡沫的部分切出3个8。切出来自第一总重量的内部的部分,其大小与电子线路板相同(2.3“×3.5”)o及作为由IC插座制成(0.9“×1.8”)从第三内侧的矩形的尺寸的部分。堆叠这些层在LED矩阵,使得含有0.9“×1.8”孔的最终层位于甚至与IC插座的顶部,并围绕LED矩阵。
  4. 切割黑色泡沫的附页中一半做出6“24”矩形。卷成黑色泡沫的中空柱,该培养容器可适应与室管和电线,使得其将热和光学隔离培养容器这一点。
  5. 居中黑色泡沫的中空柱在LED矩阵,和标记的列的边界在它之下黑色泡沫层上。该边界将标志着它应该在将来被居中。
  6. 切出黑色泡沫体的3“×3”的部分。使用此以后为可贴在塔的顶部,以阻止外部光的盖子。
  7. 连接光电二极管功率传感器为th Ë培养船舶用胶带盖,装上盖子,并插入机箱中的培养容器。
  8. 在微管理器,进入插件>生物反应器控制器。设置矩阵在可能的强度的范围的子集,在30秒的间隔发光。
  9. 连接到功率传感器的功率计控制台上显示记录的光强度。这些测量将使时被设定的被点亮的LED的那些LED的数量和脉冲宽度调制(PWM)电流被称为光的实际强度。

6.准备培养容器

图6
图6:船只连接。该图显示了装置的容器和管道应当被高压灭菌之前被连接。空白“>点击此处查看该图的放大版本。

  1. 标记对应于在10毫升的范围内的液体,每2毫升增量到30毫升的培养容器中的高度。刀片10毫升无菌去离子水,标记水位,加入2毫升,标记水位,并重复直到30毫升的水平标记。覆盖透明胶带,使它们不容易去除的标记,和液体的处理。
  2. 将铝口的长端通过硅胶垫片,到培养容器。拧上瓶盖。
  3. 涵盖具有1/16“ID硅管一短铝端口插座。通过插入一个阴路厄锁,然后连接的阳鲁尔锁定插头插入的远端。此出口是补充,并且将不被使用(管6在图6中)。
  4. 连接男性和女性鲁尔锁1/16“ID硅胶管的两个短段。一端连接到一个短铝口插座和插头的DISTA升结束与男性鲁尔和女性鲁尔锁插头。该船将通过该管(管图6 7 / 7.1)接种。
  5. 2 1/16“ID管的1/16的两端”连接ID蠕动泵和连接器。一端连接到一个短铝端口( 如图6管4)将另一。后,这将被连接到媒体烧瓶中。

7.准备媒体瓶

  1. 连接一个1/16“内径(ID)硅氧烷管与最长铝端口,管应足够长以达到媒体烧瓶。一1/8连接”标识阳路厄锁的1/16短段“ ID管,这种连接前述管,,然后插入这个短段插入媒体烧瓶(管3在图6中)的橡胶塞。
  2. 夹住管子。此连接允许空气从媒体烧瓶流动到培养容器中。当媒体烧瓶后与空气抽D该管是松开,将培养将被混合,加气,并保持在由输入的气泡的正压力。
  3. 插入1/16“ID管足够长以到达烧瓶入塞,通过该媒体将被转移的底部。另一个1/16连接”ID管这一个,然后一个3/16“ID管即,用一个3/16“ID阴路厄锁和阳路厄锁塞(管在图6中的1 / 1.1)插此。
  4. 在止动件的第三孔应充满1/16“ID管的短段,连接到介质直径的管子的其他两个片段并插入在远端(管2 如图6 / 2.1),这将连接到真空泵后来到水族馆泵。
    注:如果管道不容易适合通过在橡胶塞中的孔,切管的端部处的斜面。然后,它是通过该孔推倾斜端可用于通过拉的其余部分。

  1. 插入的阳鲁尔锁定到1/16的区段“ID硅胶管,然后用力插入0.022”ID聚四氟乙烯(PTFE)管。另外,将连接的阴鲁尔锁定到1/16“ID管,然后,线程间沿PTFE管端连接的锁和( 图6中管5)另一个短铝端口。
  2. 暴露的1/50“ID硅胶管的1/50”连接ID蠕动管和连接器。对此,连1/50的三段“ID管和0.022的两段”ID PTFE管,交替他们。通过1/16“ID管(管5 图6)将其连接至污水瓶。
  3. 连接一个1/16“ID硅树脂管与铝端口的第二长管,另一端与流出物烧瓶的一端。此铝管设置培养物体积,和过量培养溢出到流出容器(管8中
  4. 高压灭菌培养组件在121℃和15磅(一般灭菌)处理30分钟。
    注意:通过该媒体烧瓶填充的管,通过该媒体烧瓶抽真空,并通过该培养容器中接种有管道的多个区段,这样,如果远侧段被污染,它可以被除去以揭示无菌分割。

9.准备微流体通道

  1. 混合聚二甲基硅氧烷(PDMS)和固化剂在9:1的比例。德加倒到硅母模。
  2. 固化2小时的PDMS在65℃,然后从用刀片掩模剪。周围的PDMS切,直到它从模具释放。避免推下来,打破了脆弱的晶圆。
  3. 使用1.2毫米内径的活检打孔器在通道的两端打孔。
  4. 等离子债券PDMS的玻璃盖24。
  5. 大盘长玻璃盖到支撑铝框,使得所述的PDMS通道的铝框上居中的端部,然后在65℃下再次烘烤PDMS 2小时。

10.填补了媒体瓶

图7
图7:添加媒体。此图显示的媒体应该如何进行真空过滤到媒体烧瓶中。它确保媒体仍然不育。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 做适当的介质。如果连续培养系统将作为恒化器进行操作,使用限定为特定的营养培养基。
    注:用酿酒酵母的研究标准介质组成的例子已经在此前公布的25,=“外部参照”> 26,27,28,29。
  2. 附加真空过滤到100ml瓶,取出乳头盖,然后用无菌镊子将真空过滤器的乳头移除白色插头。
  3. 的3/16“ID硅胶管连接到乳头,媒体烧瓶的其它自由管到真空泵(管1和2在图7中,分别地),并确保连接媒体烧瓶培养容器中的管被夹紧关( 图7中管3)。
  4. 填充介质过滤器,打开真空泵,然后过滤介质的其余部分。钳连接到真空(管2在图7中)的1/16“ID硅胶管并关闭真空泵。
  5. 从1/16“连接到真空泵,使得所述管的未被污染端是可访问的ID管的中间段取出leurs,插入第Ë蓝色无菌注射器空气过滤器进入该管的末端。
  6. 夹紧3/16“ID硅树脂管( 图7中管1),并从它断开阳路厄。从阴路厄氏培养容器的媒体入口管的断开插头。连接这些雌雄luers使媒体成为泵入培养容器中。
  7. 移除真空过滤器和盖的100mL的瓶子,将其连接于真空过滤介质。
  8. 一天的培养容器将被接种前,接种的光遗传学微生物的单菌落在用4mL在前面步骤中收集的介质的试管中,并让它在30℃或培养的最佳温度的生长温度下生长过夜搅拌。

11.组装设备围绕显微镜

  1. 设置连续培养组件显微镜附近与介质烧瓶中比培养容器和efflu更高耳鼻喉科烧瓶比培养容器下部,使得0.022“ID PTFE管(管5在 6中)的链段构成的管可达到显微镜阶段。牢牢胶带向下媒体烧瓶和流出容器的橡胶塞。
  2. 拔出ID硅树脂管的0.022“从1/50 ID PTFE管”的( 6中管5)它们连接的端部,并插入这些端部到微流体装置的入口和出口。
  3. 连接注射器空气过滤器水族馆泵的白色结束。的空气压力将推动介质放入培养容器中。
  4. 当媒体到达出水端口的水平,环绕快1/16“周围的慢蠕动泵(管4在 6)的ID的媒体入口管和连接器和1/50”ID样本出口管道和连接器蠕动泵(管5在 6中)。
  5. 通过松开空气涂通气媒体是介质烧瓶中并培养容器之间。
  6. 胶带将加热垫和温度计的培养容器中,使得它的温度可以被控制。线圈周围的培养容器中的介质管,以便进入的媒体将在相同的温度的容器中。
    注意:PWM电流到加热垫通过其使用输入来自温度计保持培养容器在其设定点温度的微控制器调节。
  7. 将培养容器成黑色泡沫外壳在LED矩阵,并确保该管不夹住。
  8. 在微管理器,进入插件>生物反应器控制器。现场设置比蒸发的速度了“关于媒体泵比”为0.1和字段设置为0的“关于采样泵比”的流量会非常低,但更大。
  9. 夹住介质烧瓶中并培养容器之间的进入空气管中。从接种管(管7 拔下插头
  10. 盖外壳使得没有光线进入,并让文化成长过夜。

12.校准的抽水速度

  1. 在微管理器,进入插件>生物反应器控制器。现场设置了“媒体泵比”0.5和字段设置为0的“关于采样泵比”。
  2. 断开从流出物烧瓶(管8在 6中),并从流出烧瓶( 6中管8)的采样管的溢流管,并在分开的容器收集流出物。收集污水1小时,开始泵一直在15分钟后。
  3. 计算的介质的流动速率成从容器中收集到的体积的培养容器中:
  4. 现场调整这个线性估计的“传媒泵率”的值:
    Equaiton 2
    哪里
    Equaiton 3
  5. 通过该校准过程迭代,直到所需的流速和测量的流量之间的差<0.2毫升/小时,其中的流率被平均在1小时内。
  6. 增加“样品比”字段中的值和校准它以类似的方式,直到大致4/5 容积而使培养容器是由取样泵泵出并大致1/5体积的离开通过溢流口。
  7. 让这些条件下在连续培养装置的培养密度平衡过夜。
    注意:如果目标流量不能达到,变化蠕动泵管。液体以较高的速率泵送当使用更大直径的管道。按照步骤14,然后返回到步骤8.4。

培养微生物的13收集显微镜图像

  1. 与一组非重叠的位置在该泵送到微流体通道细胞的图像将在焦平面的填微管理舞台位置列表。
  2. 打开“生物反应器控制器”插件。选择所需的LED矩阵的时间过程中,成像通道,并从提示其他实验设置。收集和分析图像。
  3. 虽然实验运行,确保在媒体烧瓶媒体依然清晰。如果是阴天,则它已被污染。

14后的实验

  1. 处置的媒体,多余的细胞培养和污水。
  2. 重新填充用200ml 20%的乙醇与去离子水混合的介质烧瓶中。运行恒化,因为它以前有在实验过程中被运行,以洗出细胞碎片和介质。
  3. 当酒精溶液已经从媒体瓶倒掉,完全拆卸恒化。
  4. 洗玻璃器皿和试管用温水和温和的清洁剂,并用去离子水彻底冲洗。离开干。
  5. 打开“microcontrollerRecords.csv”文件以查看在实验过程中的温度和LED矩阵状态中,“Summary.csv”文件审查从每组图像的摘要数据和“结果<N>的.csv”文件审查数据总结从每个时间段,其中n是数据组n每个ROI。

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Representative Results

此装置用于通过基于所述CRY2 / CIB1蛋白对30可诱导光遗传学转录系统刺激酿酒酵母的表达响应于蓝光黄色荧光蛋白(YFP)的培养。细胞在磷酸盐限制培养基chemostatically生长为0.2±0.008的平均稀释率。磷酸盐限制在酿酒酵母恒化实验通常用于控制生长速率和磷酸盐限制的效果很好的特点。 31,32,从连续稀释的培养容器33的流出物进行采样,以在微流体装置上的倒置显微镜。 如图8中的图像进行自动分析。单个细胞中扣除背景的相衬图像和它们的YFP concentra被确定从扣除背景的荧光图像测量和灰是从他们的荧光估计。

169677细胞的荧光,从来自28位置中的微流体装置在实验的70小时获得的流出物的33,600图像进行分析。我们使用装有荧光照明系统和CMOS照相机倒置显微镜。 YFP的图像与二十零分之五百nm激发滤光器,三十零分之五百三十五nm发射滤波器,和一个T515lp分色获得。图像用一个40X相衬物镜,在科勒照明。图片记录了16位色彩深度87像素每平方微米。将培养物暴露于不同的蓝色光的强度为6小时的间隔,随后为6小时的时间间隔完全黑暗。培养已暴露前的第一测量,这也就是为什么它的荧光强度在第一黑暗时期减少点亮。</ P>

图9示出响应于照亮培养容器由于YFP生产经光遗传学系统的激活的荧光。它表明荧光的单小区测量的以上人口平均单小区测量揭示荧光强度的人口分布的效用。注意在42小时26分钟的异常。审查相应的图像后,很明显,有细胞的团块在大多数用于产生背景的合成图像的图像的,导致在类似细胞中扣除背景的图像中的伪影。此外,从培养容器中的泡沫被泵送到微流体通道和其边缘的部分被误认为如通过图像分析算法的细胞。由于既没有气泡也没有从减去背景的器物符合实际的细胞,其测量荧光强度比细胞的自发荧光低。该图演示了数据的质量,可以在3天中自动获取。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8
图8: 图像分析算法的视觉描绘。这些图像裁切和便于观看的扩大。 (A)的六张图像获取以产生细胞培养物的扣除背景的相位对比图像。主图像被获取之后,另外五个图像获取与流出物取样泵每个采集之间简要地接通,以确保细胞位移。背景的复合图像从五个分量图像生成。每个像素的值在背景图像在5成分的图像,同一像素的中间值。 (B)中的扣除背景的图像然后被转换为二进制。则二进制被扩张和二进制的连续部分中的孔填充。黄色轮廓对应于感兴趣的选定区域(ROI),根据尺寸和圆度的标准。 (C)的那些ROI被映射到的荧光图像,其中每个细胞的荧光作为ROI中最亮的像素的值进行测定。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9
图9: 随着时间的推移荧光强度的人口分布 。在这些子图测得氟的对数escence显示,继流式细胞仪的标准做法。在AB的线表示光吸收或文化,这是通过通过细胞培养在培养容器无菌传输媒体和光透射光之间的强度差衍射测定的强度。它绘制在第二纵轴。 (A)盒须情节人口随时间的测量荧光的对数( 5百分位,25 百分位数,中位数,75 百分位数,95 百分位数)。 (B)中相同的数据,其中,颜色对应于细胞与在对应的容器的范围内的测得的荧光的归一化频率的二维直方图。颜色分别在42小时包括26分钟调整为无异常的数据范围。离群的最低荧光纸槽归一化频率为0.7。 ( )人口的第一次记录曝光前的测量荧光的对数的一维直方图和最大曝光后。它表明YFP的在该菌株的光诱导表达是双峰的。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

我们设计时考虑的灵活性本设备。所有使用的代码是自由和开放源码。默认的图像分析过程分割单元简单,运行速度很快。定制分析可以通过记录用户输入,同时与斐济图形用户界面进行分析的代表性图像,所述输入转换为BeanShell的脚本,然后设置插件调用脚本来实现。当它被调用时,该脚本将被送到称为“图像”包含文件路径到最近一套扣除背景的图像的字符串数组。图像和数据,因为它们被收集,这样,如果一个实验突然结束,他们不会丢失保存。蓝色发光二极管阵列被选择用于诱导我们的光遗传学系统,但它可以用不同颜色的LED来代替。有额外MOSFET开关和继电器开关PCB上的微控制器,以及通孔提供额外的输入和输出管脚,可以很容易此系统也可以适于更复杂的用途。例如,为了使该装置作为一恒浊操作,使用额外的引脚上的微控制器来驱动LED和从绑在培养容器中的光传感器读出的值,然后修改来测量浊度的软件,并相应地稀释容器。

必须小心,以确保培养物不被污染,以保护敏感显微镜设备,并确保了流体流速是一致的。现有当培养容器故意接种到污染物可以通过接种容器,并验证里面有没有生长之前等待几天来检测。为了避免在显微镜物镜溢出细胞培养,检查微流体装置不会被第一激发细胞培养,通过过来吸水布泄漏。如果介质流入培养容器是不一致的,这通常是因为管周围蠕动泵的辊已经变得太松。如果空气从水族馆泵流是不一致的,确保有在流出管,其中液体可以汇集和不一致抗蚀空气流没有U形弯曲。如果因为媒体已经在它的内部干涸管成为一个实验堵塞后,浸泡堵塞的管中热水浴溶解堵塞。

有内在的局限性该协议计划的实验或分析结果时要考虑的。取决于稀释率和使用的管的长度,有大约10分钟,在此期间,细胞培养物,从培养容器到显微镜泵送的延迟。因此,不能很好地适合于发生在较短的时间尺度学习事件。此外,在实验可在10天左右,仅通过的介质的体积限定连续运行,所述细胞培养物的进化必须视为的实验的增加的持续时间。该LIMI媒体婷营养对代谢和基因表达35,36,37,38,39深远的影响,因此应根据所研究的生理方面来确定。当分析结果中,该图像 - 特别是从外围数据图像点-应当为在该感兴趣区分别由图像分析程序确定的方式错误审查。这是可能被误认为是细胞的气泡或假象,从而扭曲测量荧光。消除这种错误测量的一个简单方法是丢弃所有ROI与自体荧光强度低于荧光强度。

该协议将是在可在连续培养生长的生物体测量荧光强度和/或流出物细胞培养物的细胞形态响应于光有用,设置TLE到时不搅拌一致焦平面,并且可以通过图像分析算法自动识别。这里使用的默认小区识别算法将是最直接适用于类似于出芽酵母大致球形的微生物。一个替代方案40至该协议是一组分批培养的生长的微生物,然后品尝一批每个时间点,并通过流式细胞表征样品。然而,在这里描述的方案的优点是,来自相同培养采取样品,许多样品可采取,并且处理是自动的。该协议还改进了类似的方法,其中光遗传学酵母是连续培养,通过获得多个图像很快,而不是由荧光施力的ROI识别一个显微镜34下成像。该协议的一个巨大优势是,单个细胞的许多测量可以在几天内被无覆盖定期收购UT用户输入。测量微生物培养物,以光照射的响应之后,下一个步骤可以是响应硅片闭环控制来实现。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgements

我们要感谢莫莉拉扎尔和Veronica德尔加多协助在测试协议,基兰·斯威尼有益的讨论和编辑,和泰勒·斯科特,我的安adirekkun,和斯蒂芬妮盖勒的手稿的批判性阅读。梅根妮可麦克林博士拥有事业奖从宝来惠康基金科学接口。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72
For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

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References

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